專利名稱：A型矢車菊苷配基的組合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有A型矢車菊苷配基的組合物和其使用方法，用于人或獸醫(yī)動(dòng)物的預(yù)防或治療處理。
背景技術(shù)：
多酚是一類非常多樣的化合物(Ferriera et al.，Tetrahedron，4810，1743-1803，1992)。它們廣泛存在于各種植物中，其中的一些進(jìn)入了食物鏈。在某些情況下，它們代表了人類食物中一類重要的化合物。盡管某些多酚被認(rèn)為是非營(yíng)養(yǎng)性的，但由于它們對(duì)健康可能具有有益的效果，對(duì)這些化合物的興趣日益增加。例如，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中櫟精(類黃酮)顯示出具有抗癌活性(Deshner et al.，Carcinogenesis，71193-1196，1991；和Kato et al.，Carcinogenesis，4，1301-1305 1983)。(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素(黃烷-3-醇)顯示出抑制白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性(Chu et al.，J.of Natural Prod.，552，179-183，1992)。Nobotanin(一種低聚可水解的鞣質(zhì))也顯示出具有抗腫瘤活性(Okuda et al.，發(fā)表于XVIth International Conference of the Groupe Polyphenols，Lisbon，Portugal，July 13-16，1992)。Kikkoman公司已報(bào)道了矢車菊苷配基低聚物用作抗誘變劑(JP 04190774A，1992年7月7日)。
某些多酚，如B型矢車菊苷配基顯示出對(duì)一氧化氮(NO)釋放具有有益的效果，因此對(duì)治療各種正應(yīng)答NO的健康疾病有效(參見例如Romanczyk等的美國(guó)專利第6,670,390號(hào))。
已知一氧化氮(NO)抑制了血小板聚集、單核細(xì)胞黏附和趨化性，和血管平滑肌組織的增殖，這些與動(dòng)脈粥樣硬化生成過程緊密相關(guān)。由于NO與氧自由基反應(yīng)，NO在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的濃度可降低。由于這些反應(yīng)引起的NO損失導(dǎo)致了血小板增加和炎性細(xì)胞黏附到血管壁，進(jìn)一步損害了NO的松弛機(jī)制。以這種方式，NO的損失可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化過程，導(dǎo)致進(jìn)行性疾病狀態(tài)。
高血壓是血液在血管內(nèi)循環(huán)時(shí)血壓高于正常狀態(tài)的疾病。當(dāng)收縮壓超過150mmHg，或舒張壓超過90mmHg持續(xù)一段時(shí)間時(shí)，將損害機(jī)體。高血壓是血管疾病最主要的原因，血管疾病包括中風(fēng)、心臟病、心力衰竭和腎衰竭。例如，過高的收縮壓可使任何地方的血管破裂。當(dāng)破裂發(fā)生在腦部時(shí)，導(dǎo)致了中風(fēng)。高血壓也可引起血管的肥厚和狹窄，其可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。升高的血壓也可迫使心肌擴(kuò)大，當(dāng)泵出血液時(shí)心肌要更努力工作以克服升高的靜壓(舒張壓)。這種擴(kuò)大可最終產(chǎn)生不規(guī)則的心搏或心力衰竭。因?yàn)樗灰鹑魏伟Y狀，只有當(dāng)檢查血壓時(shí)才可被檢測(cè)到，因此高血壓被稱為“沉默的殺手”。
血壓的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的事件，其中一種機(jī)制涉及組成型Ca+2/鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴型的一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)，這種一氧化氮合酶被稱為內(nèi)皮一氧化氮合酶或eNOS。由這種酶產(chǎn)生的NO產(chǎn)生了血管中的平滑肌松弛(擴(kuò)張)，其降低了血壓。當(dāng)NO產(chǎn)生為抑制劑所阻斷或在病理狀態(tài)如動(dòng)脈粥樣硬化中被阻斷時(shí)，NO的循環(huán)濃度降低，血管肌肉不能松弛到適當(dāng)程度。結(jié)果血管收縮升高了血壓，可引起某些形式的高血壓。
由于大量的病人正遭受高血壓和血管系統(tǒng)相關(guān)的疾病和紊亂，有相當(dāng)?shù)呐d趣尋找治療方法以維持NO池(NO pool)在其正常健康水平。能釋放NO的藥物如硝酸甘油或硝酸異山梨酯仍是血管舒張治療的主要藥物。本發(fā)明申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，A型矢車菊苷配基可用于保留NO池，引起血管舒張和/或治療和/或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病和紊亂。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有A型矢車菊苷配基的組合物和其使用方法，用于人或獸醫(yī)動(dòng)物的預(yù)防或治療處理。
一方面，本發(fā)明涉及包含有效量A型矢車菊苷配基的組合物，如藥物、食品、食品添加劑、食物補(bǔ)充劑。該組合物可任選含有另外的NO調(diào)節(jié)劑和/或心血管保護(hù)或治療劑，或與這種藥物組合給予。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也涉及含有上述組合物和標(biāo)簽和/或說明書的包裝產(chǎn)品，用于治療或預(yù)防NO反應(yīng)性健康疾病，治療高血壓、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病和/或血管循環(huán)紊亂，預(yù)防或降低心臟病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭和/或腎衰竭風(fēng)險(xiǎn)，或改善血流量例如腎血流量。
本發(fā)明的另一方面涉及使用A型矢車菊苷配基以治療和預(yù)防NO反應(yīng)性健康疾病，治療高血壓、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病和/或血管循環(huán)紊亂，預(yù)防或降低心臟病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭和/或腎衰竭風(fēng)險(xiǎn)，或改善血流量例如腎血流量的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-C表示預(yù)收縮的的主動(dòng)脈環(huán)中由A型矢車菊苷配基介導(dǎo)的劑量依賴型松弛A)A2二聚體；B)A1二聚體；和C)A型三聚體。
圖2A-C表示使用A1二聚體的血小板聚集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖3-G表示使用A1二聚體的血小板聚集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
發(fā)明詳述本申請(qǐng)中所有的專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。在任何不一致的情況下，以本公開為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及包含有效量的A型矢車菊苷配基或其藥物可接受鹽或衍生物的組合物。
本發(fā)明的A型矢車菊苷配基是由n個(gè)下式的黃烷-3-醇單體單位組成的低聚物 其中(i)單體單位通過4→6和/或4→8黃烷間鍵連接；(ii)至少兩個(gè)單體單位另外通過A型黃烷間鍵(4→8；2→O→7)或(4→6；2→O→7)連接；(iii)n為2-12。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的是，通過A型黃烷間鍵連接的兩個(gè)黃烷醇單位之一必須在2-和4-位包含2個(gè)鍵。這些鍵都具有α或β立體化學(xué)，即該鍵是2α、4α或2β、4β。這些鍵連接到A型黃烷間鍵所連接的第二個(gè)黃烷醇單位的6-和7-O-位或8-和7-O-位。在C-2或C-4位不包含A型黃烷間鍵的低聚物的黃烷醇組成單位中，C-4位點(diǎn)的鍵可以具有α或β立體化學(xué)。黃烷醇單位C-3位的羥基具有α或β立體化學(xué)。黃烷-3-醇(單體)單位可以是(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素和它們各自的差向異構(gòu)體(例如(-)-兒茶素和(+)-表兒茶素))。
可以在一個(gè)或多個(gè)黃烷-3-醇組成單位上的一個(gè)或多個(gè)羥基上衍生化上述定義的A型矢車菊苷配基，例如酯化。給定的黃烷-3-醇單位可因此在3-、5-、7-、3′-和4′-的一個(gè)或多個(gè)環(huán)位點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)酯基，優(yōu)選沒食子酸酯。具體可以是單、二、三、四、或五沒食子酸化單位。
用于本發(fā)明產(chǎn)品和方法中的化合物的實(shí)例包括以下化合物，其中整數(shù)n為3-12；4-12；5-12；4-10；或5-10。在一些實(shí)施方案中，n為2-4、或2-5，例如n為2或3。
在一個(gè)實(shí)施方案中，A型矢車菊苷配基為表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-兒茶素(即A1二聚體)，或其藥物可接受的鹽或衍生物，具有下式 在另一個(gè)實(shí)施方案中，A型矢車菊苷配基為表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-表兒茶素(即A2二聚體)，具有下式 在又一個(gè)實(shí)施方案中，A型矢車菊苷配基為A型三聚體，具有下式 A型矢車菊苷配基可以是天然來源的或合成制備的。例如，A型矢車菊苷配基可從花生皮中分離，如實(shí)施例1所述，或描述于Lou etal.，Phytochemistry，51297-308(1999)，或Karchesy and Hemingway，J.Agric.Food Chem.，34966-970(1986)，各自的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。成熟的紅花生皮含有約17％重量的矢車菊苷配基，在二聚體矢車菊苷配基中表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-兒茶素占主要部分，有小部分的表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-表兒茶素存在。然而，除了具有(4→8；2→O→7)雙重鍵的矢車菊苷配基外，也在花生皮中發(fā)現(xiàn)了具有(4→6；2→O→7)雙重鍵的矢車菊苷配基。
上述化合物的其它來源為酸果蔓(cranberries)，例如描述于Foo etal.，J.Nat.Prod.，631225-1228，和Prior et al.，J.Agricultural FoodChem.，49(3)1270-76(2001)，各自的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。其它來源包括乳藤(Ecdysanthera utilis)(Lie-Chwen et al.，J.Nat.Prod.，65505-8(2002))和七葉樹(Aesculus hippocastanum)(美國(guó)專利第4,863,956號(hào))，各自的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。
A型化合物也可從B型矢車菊苷配基經(jīng)使用1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)殘基在中性條件下氧化制得，如描述于Kondo et al.，Tetrahedron Lett.，41485(2000)，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。獲得天然或合成的B型矢車菊苷配基的方法為本領(lǐng)域所熟知，例如描述于Romanczyk等的美國(guó)專利第6,670,390號(hào)，Romanczyk等的第6,207,842號(hào)，Romanczyk等的第6,420,572號(hào)；和Romanczyk等的第6,156,912號(hào)。
A型矢車菊苷配基可用于本文描述的組合物中，以包含A型矢車菊苷配基作為主要成分的抽提物形式給予(例如花生皮抽提物)。
A型矢車菊苷配基可以被分離和純化，即它們與共同天然存在的化合物分離(假如A型矢車菊苷配基是天然來源的)，或它們由合成制備，在任一種情況中污染化合物(雜質(zhì))的水平不會(huì)顯著提高或減弱A型矢車菊苷配基的功效。例如，可通過商業(yè)可獲得的純化和分離技術(shù)，從與A1二聚體共同天然存在的A2二聚體中將分離和純化的A1二聚體分離到可用程度。該化合物可以是基本純的，即它們具有通過可用純化、分離和/或合成技術(shù)可達(dá)到的最高均勻性。本文使用的“基本純的A1二聚體”與A2二聚體分離到科技和商業(yè)合理的程度，“基本純的A型三聚體”與其它低聚物分離(到科技和商業(yè)合理的程度)，但可含有若干A型三聚體的混合物。換言之，短語“分離和純化的三聚體”是主要指是一種三聚體，而“基本純的三聚體”可包含三聚體的混合物。
在某些實(shí)施方案中，A型矢車菊苷配基為至少80％純，優(yōu)選至少85％純、至少90％純、至少95％純、至少98％純或至少99％純。這種化合物特別適合于藥物應(yīng)用。
使用方法本申請(qǐng)中描述的任何化合物都可用于實(shí)施本文所述的方法。如實(shí)施例3所示，A型矢車菊苷配基影響了上皮細(xì)胞中的一氧化氮(NO)途徑，有助于保存NO池。不限于理論，通過誘導(dǎo)NO合成和/或減少NO降解保存了NO池。該化合物也引起了收縮血管的舒張。它們也可用于抗血小板治療，如實(shí)施例4所示。
因此，本發(fā)明涉及通過給予需要其的患者有效量的A型矢車菊苷配基低聚物或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病或紊亂的方法，所述低聚物由n個(gè)下式的黃烷-3-醇單體單位組成 其中(i)單體單位通過4→6和/或4→8黃烷間鍵連接；(ii)至少兩個(gè)單體單位另外通過A型黃烷間鍵(4→8；2→O→7)或(4→6；2→O→7)連接；(iii)n為2-12；并且其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
A型矢車菊苷配基可以被分離和純化，或基本純的。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約80％純、至少約85％純、至少約90％純、至少95％純或至少98％純。用于上述方法的化合物實(shí)例包括以下化合物，其中整數(shù)n為3-12；4-12；5-12；4-10；或5-10。在某些實(shí)施方案中，n為2-4、或2-5，例如n為2或3。
本文使用的“NO反應(yīng)性疾病或紊亂”是指對(duì)使用NO治療應(yīng)答的健康疾病。這種疾病的實(shí)例包括但不限于NO介導(dǎo)的或NO依賴的疾病或紊亂，其中疾病/紊亂的病理學(xué)由NO途徑的異常功能引起。這些疾病優(yōu)選包括高血壓、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病和/或血管循環(huán)紊亂、心臟病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭、腎衰竭和腎臟疾病?？蓡为?dú)或與另外的心血管治療劑組合給予A型矢車菊苷配基。
因?yàn)楦哐獕涸黾恿诵呐K病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭和腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，可單獨(dú)或與其它心血管保護(hù)劑組合使用引起血管舒張的A型矢車菊苷配基，以預(yù)防這些疾病。具體適合的患者包括患有高血壓合并有糖尿病、肥胖癥、高膽固醇水平和/或吸煙的患者，其中患者患心臟病發(fā)作和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加了數(shù)倍。
本文使用的“治療”是指例如通過減緩疾病發(fā)展、延長(zhǎng)存活、降低死亡風(fēng)險(xiǎn)、和/或提供疾病參數(shù)的可測(cè)量改善，改善已有的醫(yī)學(xué)疾病，如心血管疾病。
術(shù)語“預(yù)防”是指降低與發(fā)展疾病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，包括減少疾病的發(fā)病。
本文使用的術(shù)語“心血管保護(hù)或治療劑”是指除A型矢車菊苷配基之外的有效治療或保護(hù)心血管系統(tǒng)的藥物。這種藥物的實(shí)例為抗血小板治療劑(例如COX抑制劑，如阿司匹林；B型矢車菊苷配基)；NO調(diào)節(jié)劑，膽固醇降低劑(例如甾醇、二氫睪酮)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下列方法一種通過給予需要其的患者有效量的下式表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-兒茶素(即A1二聚體)或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病或紊亂的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。A1二聚體可以被分離和純化。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
一種通過給予需要其的患者有效量的下式表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-表兒茶素(即A2二聚體)或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病或紊亂的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。A2二聚體可以被分離和純化。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
一種通過給予需要其的患者有效量的下式A型三聚體或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病或紊亂的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。A型三聚體可以被分離和純化，或基本純的。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約80％純、至少約85％純、至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下示例性方法一種通過給予需要其的患者有效量的A型矢車菊苷配基或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療高血壓的方法，所述A型矢車菊苷配基由n個(gè)下式的黃烷-3-醇單體單位組成 其中(i)單體單位通過4→6和/或4→8黃烷間鍵連接；(ii)至少兩個(gè)單體單位另外通過A型黃烷間鍵(4→8；2→O→7)或(4→6；2→O→7)連接；(iii)n為2-12；其中該患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
A型矢車菊苷配基可以是分離或純化的，或基本純的。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可以是至少約80％純、至少約85％純、至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
用于上述方法的化合物實(shí)例包括以下化合物，其中整數(shù)n為3-12；4-12；5-12；4-10；或5-10。在某些實(shí)施方案中，n為2-4、或2-5，例如n為2或3。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括以下示例性方法一種通過給予需要其的患者有效量的下式表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-兒茶素(即A1二聚體)或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療高血壓的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。所述A1二聚體可以被分離和純化。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
一種通過給予需要其的患者有效量的下式表兒茶素-(4β→8；2β→O→7)-表兒茶素(即A2二聚體)或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療高血壓的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。所述A2二聚體可以被分離和純化。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
一種通過給予需要其的患者有效量的下式A型三聚體或其藥物可接受的鹽或衍生物，治療高血壓的方法 其中患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。A型矢車菊苷配基三聚體可以被分離和純化，或基本純的。在某些實(shí)施方案中，上述化合物可為至少約80％純、至少約85％純、至少約90％純、至少95％純或至少98％純。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括了使用本文所述任何化合物，在需要其的患者中改善/治療勃起機(jī)能障礙的方法。
使用本文提供的指導(dǎo)和本領(lǐng)域的一般知識(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可測(cè)定用于上述方法中的有效量。例如，有效量可以例如達(dá)到哺乳動(dòng)物體內(nèi)(例如血液)中生理學(xué)相關(guān)的濃度。這種生理學(xué)相關(guān)的濃度可為至少約10納摩爾(nM)，優(yōu)選至少約20nM，或至少約100nM，更優(yōu)選至少約500nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物如人的血液中達(dá)到至少約1毫摩爾?？山o予本文定義的式An化合物，從約50mg/天至約1000mg/天、優(yōu)選從約100-150mg/天至約900mg/天，最優(yōu)選從約300mg/天至約500mg/天。然而，可使用高于上述的量。
可快速(acutely)給予該化合物，或作為用藥制度持續(xù)治療/預(yù)防給予，即持續(xù)有效時(shí)間周期，例如，每天、每月、隔月、每半年、每年或一些其它制度，需要時(shí)由熟練醫(yī)學(xué)從業(yè)者確定這段時(shí)間。給藥可至少持續(xù)顯示治療/預(yù)防效果所需的一段時(shí)間。優(yōu)選每天給予化合物，更優(yōu)選每天2或3次，例如，早上或晚上給予以維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)有效化合物的水平。為了獲得最佳的效果，可給予組合物至少約30或至少約60天?？芍芷谛灾貜?fù)這些用藥制度。
組合物和制劑可作為藥物、食品、食品添加劑或食物補(bǔ)充劑給予本發(fā)明的化合物。
本文使用的“食品”為基本由蛋白、碳水化合物和/或脂肪組成的物質(zhì)，其用于生物體的機(jī)體以維持生長(zhǎng)、修復(fù)和生命過程并供給能量。食品也可含有補(bǔ)充物質(zhì)，如礦物質(zhì)、維生素和調(diào)味料。參見Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，第10版，1993年。術(shù)語食品包括適合人或動(dòng)物消費(fèi)的飲料。本文使用的“食品添加劑”如FDA于21 C.F.R.170.3(e)(1)所定義，包括直接或間接添加劑。本文使用的“藥物”為醫(yī)學(xué)藥物。參見Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，第10版，1993年。藥物也可以被稱為是醫(yī)藥。本文使用的“食物補(bǔ)充劑”是為了添加到食物中而具有或含有一種或多種下列食用成分的產(chǎn)品維生素、礦物質(zhì)、草藥或其它植物、氨基酸、通過增加總?cè)諗z取量而由人補(bǔ)充到食物中的食用物質(zhì)，或這些成分的濃縮物、代謝物、組成物、抽提物或組合。
含有本發(fā)明化合物的藥物，任選與另外的心血管保護(hù)或治療劑組合，可以各種方式給予，如經(jīng)口、舌下、口頰(bucally)、經(jīng)鼻、直腸、靜脈內(nèi)、胃腸外和局部給予。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能確定合適的給藥方式，以最大遞送A型矢車菊苷配基，其任選與另外的心血管保護(hù)或治療劑組合。因此，適合各種給藥的劑型在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括固體、液體和半固體劑型，如片劑、膠囊劑、明膠膠囊(軟膠囊)、散裝或單位劑量的粉劑或顆粒劑、乳劑、懸浮劑、糊劑、乳膏劑、凝膠劑、泡沫劑、膠凍劑或注射劑型。緩釋劑型也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可如美國(guó)專利5,024,843、5,091,190、5,082,668、4,612,008和4,327,725所述制備，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。合適的藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑通常為本領(lǐng)域已知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定。片劑，例如，可包含含有有效量的A型矢車菊苷配基的組合物和任選載體，如山梨醇、乳糖、纖維素或磷酸二鈣。
使用本領(lǐng)域已知的方法，可制備含有A型矢車菊苷配基和任選的另外心血管保護(hù)或治療劑的食物補(bǔ)充劑，其可包含，例如，營(yíng)養(yǎng)素如磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硝酸鈣、維生素和礦物質(zhì)。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是制造物品，如包含本發(fā)明組合物(例如食品、食物補(bǔ)充劑、藥物)和標(biāo)簽的包裝產(chǎn)品，標(biāo)簽表明存在或含量增加的本發(fā)明化合物或指導(dǎo)使用用于本文所述方法的組合物。
也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是適合用于聯(lián)合治療的制造物品(如包裝產(chǎn)品或藥盒)，其包含至少一個(gè)容器和至少一種A型矢車菊苷配基或其藥物可接受的鹽或衍生物。制造物品還包含至少一種另外的藥物、心血管保護(hù)或治療劑(即A型矢車菊苷配基或其藥物可接受的鹽或衍生物之外的)，這種藥物可在單獨(dú)的容器中作為單獨(dú)組合物提供，或與本發(fā)明的化合物混合。
如上所述，心血管保護(hù)或治療劑有效治療或保護(hù)心血管系統(tǒng)。這種藥物的實(shí)例為抗血小板治療劑(例如COX抑制劑，如阿司匹林)、NO調(diào)節(jié)劑、膽固醇降低劑(例如甾醇、二氫睪酮)。
在某些實(shí)施方案中，任選與A型矢車菊苷配基一起給予的心血管保護(hù)或治療劑可以是B型矢車菊苷配基，例如下述可可黃烷醇和/或矢車菊苷配基。
用于本發(fā)明的B型多酚可以是天然來源的，例如，來源于可可豆或多酚的另外天然來源，或合成制備。例如，B型矢車菊苷配基和它們的衍生物描述于Romanczyk等的美國(guó)專利6,670,390，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于可用性和價(jià)值選擇天然或合成的多酚。多酚可以包含在含有可可多酚的可可成分形式的組合物中，例如，在巧克力中包括巧克力液體，或多酚可被獨(dú)立添加入可可成分，例如，作為抽提物、抽提物部分、分離和純化的個(gè)體化合物、混合的抽提物部分或合成制備的化合物。
術(shù)語“可可成分”是指來自無殼可可碎仁(cocoa nibs)的含可可固體物質(zhì)，如巧克力液體、部分或完全脫脂的可可固體(例如餅或粉)。
B型矢車菊苷配基低聚物可含有2至約18、優(yōu)選2至約12、最優(yōu)選2至約10個(gè)單體單位。或者，低聚物可含有3-18、優(yōu)選3-12、更優(yōu)選3-10個(gè)單體單元；或5-18、優(yōu)選5-12、更優(yōu)選5-10個(gè)單體單位。例如，低聚物可以是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體和十聚體。在該低聚物中，單體通過(4→6)和/或(4→8)黃烷間鍵連接。擁有唯一(4→8)鍵的低聚物是線性的，而存在至少一個(gè)(4→6)鍵導(dǎo)致形成支鏈低聚物。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是包含至少一個(gè)(6→6)、(6→8)和(8→8)非天然鍵的低聚物。這種非天然存在的低聚物的合成描述于2000年10月19日作為WO00/61547公開的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US00/08234，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。
B型矢車菊苷配基可通過從可可豆、可可碎仁或可可成分如巧克力液體、部分脫脂的可可固體、和/或完全脫脂的可可固體制備。抽提物優(yōu)選從完全或部分脫脂的可可粉制備?？墒褂玫目煽啥箒碜訲heobrofyza、Herrania 或其種間和種內(nèi)雜交的任何種。抽提物可從發(fā)酵的、發(fā)酵不足的或未發(fā)酵的可可豆制備，發(fā)酵的豆具有最少量的可可多酚，未發(fā)酵的最多。可基于豆的發(fā)酵因子選擇可可豆，例如可從具有約275或更少的發(fā)酵因子的豆制得抽提物。通過操作發(fā)酵程度，可優(yōu)化可可成分和其抽提物中的多酚水平，描述于作為WO98/09533公開的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/15893，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。
可從可可成分中抽提可可多酚，可可成分使用傳統(tǒng)的可可處理方法加工(例如描述于Industrial Chocolate Manufacture和Use，ed.Beckett，S.T.，Blackie Acad.& Professional，New York，1997，如在第1、5、和6章)，或使用描述于Kealey等的美國(guó)專利第6,015,913號(hào)中的改進(jìn)方法加工，與傳統(tǒng)方法相比這種改進(jìn)的方法保存了可可組分中的多酚(通過阻止它們受到破壞)。這種改進(jìn)的可可加工方法省略了傳統(tǒng)的烘烤步驟。因此，可使用通過以下步驟獲得的可可成分(a)加熱可可豆一段時(shí)間，溫度足以使可可殼松弛而不烘烤可可碎仁；(b)從可可殼中精選可可碎仁；(c)螺旋壓榨可可碎仁；(d)回收可可脂和部分脫脂的可可固體，其含有保存水平的可可多酚。該方法比傳統(tǒng)處理方法保留了更高水平的較高矢車菊苷配基低聚物。通過這種方法生產(chǎn)的可可固體每克脫脂固體可含有超過20,000μg的總黃烷醇和/或矢車菊苷配基；優(yōu)選超過25,000μg/g，更優(yōu)選超過28,000μg/g，最優(yōu)選超過30,000μg/g。對(duì)于本發(fā)明的目的，如實(shí)施例2中的描述測(cè)定總黃烷醇和/或矢車菊苷配基的量。
可從上述來源或任何其它含有多酚或黃烷醇或矢車菊苷配基的來源抽提B型矢車菊苷配基，使用溶劑從中溶解多酚。合適的溶劑包括水或有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和乙酸乙酯。也可使用溶劑混合物。當(dāng)水用作溶劑時(shí)，其可輕微酸化，例如使用乙酸酸化。一些溶劑的實(shí)例為水和有機(jī)溶劑的混合物，例如甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。有機(jī)溶劑的水溶液可含有，例如，約50％至約95％的有機(jī)溶劑。因此，可使用水中的約50％、約60％、約70％、約80％和約90％的有機(jī)溶劑。溶劑也可含有少量的酸如乙酸，例如以約0.5％至約1.0％的量。抽提物的組成，即矢車菊苷配基低聚物的表現(xiàn)(即低聚物性質(zhì))和量取決于所選擇的溶劑。例如，水抽提物主要含有單體，乙酸乙酯抽提物含有單體和低級(jí)低聚物，主要為二聚體和三聚體，甲醇、乙醇、或丙酮水溶液的抽提物含有單體和一定范圍的高級(jí)低聚物。一種抽提單體和高級(jí)低聚物的溶劑為約70％的丙酮。然而，任何含有多酚的抽提物在本發(fā)明中都是有用的?？煽啥喾拥某樘岱椒楸绢I(lǐng)域已知，描述于例如Romanczyk的等美國(guó)專利第5,554,645號(hào)和作為WO97/36497公開的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US97/05693。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將可可豆分解至可可粉、對(duì)粉脫脂、抽提可可多酚和純化抽提物，制備可可抽提物。通過將可可豆和果肉凍干、對(duì)凍干的可可豆去果肉和去殼、粉碎去殼的豆，可制備可可粉。
例如，可通過去除咖啡因和/或可可堿純化B型可可多酚抽提物，并通過凝膠滲透層析和/或高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)一步純化。凝膠滲透層析(例如在Sephadex LH-20上)可用于富集高級(jí)矢車菊苷配基低聚物的抽提物。例如，可不收集含有單體或低級(jí)低聚物的洗脫液，直到選擇的低聚物從柱上洗脫下來。這種抽提的實(shí)例為本領(lǐng)域已知，描述于作為WO97/36497公開的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US97/05693的實(shí)施例5中，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。通過使用制備型HPLC，例如，正相HPLC，可將抽提物分成例如含有至少50％重量單體或特定低聚物的單體和低聚物級(jí)分。當(dāng)具體級(jí)分含有單體或任何低級(jí)低聚物(例如二聚體、三聚體或四聚體級(jí)分)時(shí)，該級(jí)分含有約90-95％重量的具體低聚物部分。在分離之后可合并希望的級(jí)分，以獲得所選擇的低聚物組合，例如含有3-10或5-10的低聚物?？紤]本說明書中的指導(dǎo)、本領(lǐng)域的一般知識(shí)，例如Romanczyk等的美國(guó)專利第5,554,645號(hào)和作為WO97/36497公開的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US97/05693的技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可操作色譜條件以獲得希望的矢車菊苷配基性質(zhì)。
單體級(jí)分典型地含有表兒茶素和兒茶素單體的混合物，低聚物級(jí)分典型地含有二聚體(在二聚體級(jí)分中)、三聚體(在三聚體級(jí)分中)、四聚體(在四聚體級(jí)分中)等的混合物。單體和低聚物的混合物存在于分離的級(jí)分，因?yàn)榭煽珊胁恢挂环N的各種單體、二聚體等。由于為矢車菊苷配基組成部件的表兒茶素和兒茶素兩種單體，以及低聚物中連接單體的化學(xué)鍵的原因，存在低聚物的可變性。因此，可可二聚體主要為B2和B5，各自含有兩個(gè)表兒茶素單體。使用反相HPLC，如使用C18柱，可獲得單獨(dú)的單體和低聚物。
B型可可多酚可作為可可抽提物用于本發(fā)明的組合物，例如溶劑衍生抽提物、可可級(jí)分、分離的化合物和含有有效量的可可黃烷醇和/或矢車菊苷配基的可可成分或巧克力的形式?？墒褂脗鹘y(tǒng)的可可加工方法制備可可成分，但優(yōu)選使用描述于Kealey等的美國(guó)專利第6,015,913號(hào)的方法制備?；蛘?，為了提高可可多酚的水平，可使用從發(fā)酵因子為約275或更低的可可豆制備的巧克力液體和可可固體。這些成分具有的可可多酚含量高于使用傳統(tǒng)加工方法(例如烘烤)和完全發(fā)酵可可豆可獲得的含量?？墒褂贸Ｒ?guī)的技術(shù)從上述成分中制備巧克力，或使用改進(jìn)的方法在巧克力的制造中保存可可多酚，如作為WO99/45788公開的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US99/05414中所述，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。通過至少一種以下非傳統(tǒng)方法制備的巧克力在本文中被認(rèn)為是“具有保存量可可多酚的巧克力”(i)從發(fā)酵不全或未發(fā)酵的可可豆制備可可成分；(ii)在可可成分制造過程中保存可可多酚；(iii)在巧克力的制造過程中保存可可多酚。
也可使用合成的B型矢車菊苷配基，通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如描述于作為WO99/19319公開的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US98/21392中，其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。
黃烷醇和/或矢車菊苷配基也可以是有用的。這些包括單體和低聚物的酯如沒食子酸酯(例如表兒茶素沒食子酸酯和兒茶素沒食子酸酯)；用糖部分如單糖或雙糖部分(例如β-D-葡萄糖)衍生化的化合物、糖基化的單體和低聚物或其混合物；矢車菊苷配基單體和低聚物的代謝物如硫酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、由結(jié)腸微生物群代謝產(chǎn)生的矢車菊苷配基酶裂解產(chǎn)物之外的甲基化形式。這些衍生物可以來自天然來源或合成制備的。
包含A型和/或B型矢車菊苷配基和任選的另外心血管保護(hù)/治療劑的食品可適合于人或獸醫(yī)用途，包括寵物食品。食品可以是甜食之外的，然而，優(yōu)選的降膽固醇食品為甜食如統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(SOI)或非SOI的巧克力，如奶、甜和半甜的巧克力包括黑巧克力、低脂巧克力和糖果(該糖果可以是覆蓋了巧克力的糖果)。其它實(shí)例包括烘烤產(chǎn)品(例如核仁巧克力、烤點(diǎn)心、小甜餅、餅干)、調(diào)味品、雜拌糕條、太妃糖咀嚼物(toffee chew)、代餐棒(meal replacement bar)、涂醬(spread)、糖漿、粉末飲料混合物、可可或巧克力風(fēng)味的飲料、布丁、年糕(ricecake)、拌飯(rice mix)、開胃調(diào)料(savory sauc)等。假如需要，該食品可以是可可或巧克力風(fēng)味的。食品可以是含有堅(jiān)果例如花生、胡桃、杏仁和榛果的巧克力和糖果，如雜拌糕條。應(yīng)當(dāng)注意的是，添加到本文所述食品中的帶皮堅(jiān)果也可增加總多酚的含量，因?yàn)?，例如，花生皮含有約17％黃烷醇和和矢車菊苷配基、杏仁皮含有約30％黃烷醇和矢車菊苷配基。也可向本發(fā)明的組合物添加磨碎花生皮。在一個(gè)實(shí)施方案中，將堅(jiān)果皮如花生皮加到巧克力糖果的奶油杏仁中。
在某些實(shí)施方案中，非巧克力食品含有約至少5mg/g至約10mg/g，例如至少5mg/g食品，優(yōu)選至少10mg/g、更優(yōu)選至少100mg/g的黃烷醇和/或B型矢車菊苷配基和/或A型矢車菊苷配基。假如需要，非巧克力食品可含有的可可矢車菊苷配基水平高于下述巧克力食品中所發(fā)現(xiàn)的。
巧克力糖果可以是牛奶或黑巧克力。在某些實(shí)施方案中，基于產(chǎn)品中脫脂可可固體的總量，每克巧克力包含至少3,600mg、優(yōu)選至少4,000mg、優(yōu)選至少4,500mg、更優(yōu)選至少5,000mg、最優(yōu)選至少5,500mg的黃烷醇和/或B型矢車菊苷配基和/或A型矢車菊苷配基。在其它實(shí)施方案中，基于產(chǎn)品中脫脂可可固體的總量，每克巧克力含有至少6,000mg、優(yōu)選至少6,500、更優(yōu)選至少7,000mg、最優(yōu)選至少8,000mg的黃烷醇和/或B型矢車菊苷配基和/或A型矢車菊苷配基，甚至更優(yōu)選10,000mg/g。
基于牛奶巧克力產(chǎn)品中脫脂可可固體的總量，牛奶巧克力糖果中每克牛奶巧克力可含有至少1,000mg、優(yōu)選至少1,250mg、更優(yōu)選至少1,500mg、最優(yōu)選至少2,000mg的黃烷醇和/或B型矢車菊苷配基和/或A型矢車菊苷配基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于牛奶巧克力產(chǎn)品中脫脂可可固體的總量，每克牛奶巧克力含有至少2,500mg、優(yōu)選至少3,000mg、更優(yōu)選至少4,000mg、最優(yōu)選至少5,000mg的黃烷醇和/或B型矢車菊苷配基和/或A型矢車菊苷配基。
可將L-精氨酸添加到食品中，量可以有所變化。典型地，每100g部分脫脂的可可固體含有1-1.1g的L-精氨酸。它的范圍可在每100g可可0.8-1.5之間。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的巧克力食品含有的L-精氨酸的量高于可可成分中天然存在的L-精氨酸量。知道用于食品的可可成分和L-精氨酸的量，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可輕易確定終產(chǎn)物中L-精氨酸的總量。食品通常含有至少5mg/g、優(yōu)選至少30mg/g或至少60mg/g、甚至更優(yōu)選至少200mg/g食品。
可以以單份提供每日有效量的黃烷醇和/或A型和/或B型矢車菊苷配基。因此，每份糖果(例如巧克力)可含有至少約100mg/份(例如150-200、200-400mg/份)。
在下述非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1——A型矢車菊苷配基的抽提和分離抽提使用正己烷(2×2000mL)對(duì)細(xì)碎的花生皮(498g)脫脂。室溫下通過3500rpm下離心5分鐘除去正己烷，棄去。允許殘留的正己烷蒸發(fā)過夜。第二天使用丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5 v/v/v)(2×2000mL)在室溫下抽提脫脂的花生皮2小時(shí)。通過離心回收抽提物(室溫，3500rpm下5分鐘)。部分壓力下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑(40℃)。通過冷凍干燥去除抽提溶劑的水部分，獲得棕紅色的粗品固體(51.36g)。
花生皮抽提物粗品的凝膠滲透將上述獲得的花生皮抽提物粗品(24g)溶于70％的甲醇(150mL)，冷卻1小時(shí)，渦旋3秒鐘，然后室溫3500rpm下離心5分鐘。將上清裝載于含有預(yù)溶脹于甲醇中的Sephadex LH-20(400g)的大柱頂部。使用100％甲醇洗脫，流速為10mL/分鐘。收集29份級(jí)分，每份250mL，依據(jù)NP-HPLC所測(cè)定的組成合并(Adamson et al.，J.Ag.Food Chem.，474184-4188，1999)，獲得共8種級(jí)分(i-viii)。級(jí)分i含有單體表兒茶素和兒茶素、級(jí)分ii-vii含有二聚體、三聚體或其混合物。級(jí)分v(1.8g)和級(jí)分vii(2.7g)各自主要含有二聚體和三聚體，選擇其進(jìn)一步純化。
A型二聚體和三聚體的純化將級(jí)分v(1.8g)溶于20％甲醇中的0.1％乙酸中(40mg/mL)。注射體積為2mL。在Hypersil ODS(250×23mm)上梯度條件下進(jìn)行分離。流動(dòng)相由水中的0.1％乙酸(流動(dòng)相A)和甲醇中的0.1％乙酸(流動(dòng)相B)組成。梯度條件為0-10分鐘，20％B等度；10-60分鐘，20-40％B線性；60-65分鐘，40-100％B線性。在280nm處監(jiān)控分離。合并數(shù)次制備分離的具有相同保留時(shí)間的級(jí)分，40℃部分真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。獲得5個(gè)級(jí)分(a-e)。級(jí)分d和e各自經(jīng)LCMS鑒定為二聚體A1和A2。除了A1和A2，先前從花生皮中分離到了4種不同的二聚體(Lou et al.，Phytochemistry 51，297-308，1999)。
如上所述純化級(jí)分vii，獲得具有以上表示結(jié)構(gòu)式的帶A鍵的單一三聚體。
通過質(zhì)譜確證純化合物的結(jié)構(gòu)，使用HPLC在UV 280nm處測(cè)定化合物的純度。A1二聚體為95％純，A2二聚體為91％純，A三聚體為84％純。
實(shí)施例2黃烷醇/矢車菊苷配基的測(cè)定如下定量矢車菊苷配基使用商業(yè)獲得的(-)-表兒茶素、通過Hammerstone，J.F.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496；Lazarus，S.A.et al.，J.Ag Food Chem.；1999；47(9)；3693-3701；和Adamson，G.E.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188所述的方法以純態(tài)獲得的二聚體至十聚體制備組分標(biāo)準(zhǔn)。使用描述于先前引用的Adamson參考的正相HPLC方法，分析使用這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)母液，分別在276nm激發(fā)波長(zhǎng)和316nm發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)峰進(jìn)行分組，統(tǒng)計(jì)它們的面積以包括任何一種低聚物內(nèi)所有同分異構(gòu)體的貢獻(xiàn)度，使用二次擬合產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。單體和較小的低聚物具有幾乎線性的圖，該圖與早先使用線性回歸產(chǎn)生基于單體和基于二聚體的標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。
然后將這些標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算如下制備的樣品中的矢車菊苷配基水平首先，使用3份正己烷抽提液(每份45mL)對(duì)可可或巧克力樣品(約8g)脫脂。接著，將1g脫脂材料用5mL丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)抽提。然后通過將來自樣品的HPLC數(shù)據(jù)與上述獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(使用純化的低聚物)比對(duì)，測(cè)定脫脂材料中矢車菊苷配基的量。使用Association of Official Analytical Chemists (AOAC OfficialMethod 920.177)的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定樣品的脂肪百分含量(使用1g樣品量的巧克力或0.5g樣品量的液體)。然后計(jì)算原始樣品(有脂肪)中的總矢車菊苷配基水平的量。在每個(gè)樣品上樣之前進(jìn)行校準(zhǔn)，免除柱與柱變化的影響。
實(shí)施例3——A型矢車菊苷配基對(duì)NO產(chǎn)生和血管舒張的影響使用無血清人臍動(dòng)脈上皮細(xì)胞(HUVEC)試管內(nèi)培養(yǎng)系統(tǒng)和兔離體主動(dòng)脈環(huán)模型，各自研究實(shí)施例1中所述化合物對(duì)一氧化氮(NO)產(chǎn)生和血管舒張的影響。由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO和預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)的松弛是評(píng)估受試化合物心血管效果的兩個(gè)主要標(biāo)記。
試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)將來自單個(gè)供體的HUVEC培養(yǎng)于無血清、低蛋白(0.5g/l)、無抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中，其中添加有必需的生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)素和礦物質(zhì)。當(dāng)生長(zhǎng)至融合時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)記(血管性血友病因子，CD31抗原，Dil-Ac-LDL的攝取)，并展示出典型地“鵝卵石形態(tài)學(xué)”。使用脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶取代細(xì)胞培養(yǎng)基，排除受試化合物的次級(jí)效應(yīng)，包括它們自動(dòng)氧化介導(dǎo)的過氧化氫形成。
評(píng)估受試化合物急性(2小時(shí))和慢性(24小時(shí)周期內(nèi)給予5次劑量)調(diào)節(jié)NO產(chǎn)生的潛力。在所有實(shí)驗(yàn)中包括陽性對(duì)照(乙酰膽堿和/或組胺)和陰性對(duì)照L-NNMA(NO合酶抑制劑)。細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白用于評(píng)估批內(nèi)變化。也監(jiān)控受試化合物潛在的毒性作用(測(cè)量MTT的減少)。
通過測(cè)量存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的所有主要一氧化氮終產(chǎn)物(NOx，包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、亞硝酸硫醇)的總量評(píng)估NO產(chǎn)生。對(duì)于此目的，氯化釩(III)/鹽酸在95℃下直接還原NOx產(chǎn)生NO。隨后使用NO分析儀(Sievers Instruments，Inc.Boulder，CO)，通過測(cè)量臭氧和NO之間化學(xué)計(jì)算性反應(yīng)期間發(fā)出的化學(xué)熒光，評(píng)估從培養(yǎng)基中釋放的NO的量。
從三次實(shí)驗(yàn)中獲得本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，表達(dá)為存在于培養(yǎng)基中的NO濃度(以μmol/l)(為NOx)+/-標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)內(nèi)在存在于完全補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基中的NOx校正數(shù)據(jù)，根據(jù)從中取樣的培養(yǎng)基體積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Student′s t-檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，可信度95％。等于或小于0.005的P值定義為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
對(duì)于急性作用測(cè)試，37℃和5％CO2下使用100nM、1μM和10μM濃度的單劑量A2二聚體和A型三聚體孵育HUVEC 2和24小時(shí)。2小時(shí)后觀察到對(duì)NO產(chǎn)生無任何效果。單劑量后24小時(shí)，1μM濃度下觀察到無任何效果。兩種測(cè)試化合物在10μM濃度下都比對(duì)照水平增加了NO的產(chǎn)生(兩者都，A2更佳)，但都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的水平?；贛TT測(cè)定，受試化合物沒有毒性作用。
對(duì)于慢性作用測(cè)試，使用受試化合物的5次后繼劑量各自孵育HUVEC 24小時(shí)。每24小時(shí)處理后，置換培養(yǎng)基。測(cè)試了A2二聚體和A型三聚體。A型三聚體在NO產(chǎn)生中展示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(P＝0.041).
離體實(shí)驗(yàn)如先前由Karim et al.，J.Nutrl Suppl.，130(8S)2105S-2108S(2000)所述(其相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中)，在離體實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了A型矢車菊苷配基對(duì)內(nèi)皮依賴性松弛的影響。使用這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于它評(píng)估了功能性心血管終點(diǎn)。該方法只能評(píng)估急性事件，不允許用于藥物誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)/活性的鑒定。
總之，從雄性新西蘭白兔中獲取兔主動(dòng)脈環(huán)。隨后分離，將環(huán)裝于充氧的Kreb′s緩沖液，使用NE(10-6M)預(yù)收縮。當(dāng)張力達(dá)到穩(wěn)定態(tài)時(shí)，應(yīng)用受試化合物的累積濃度(10-9至10-4M)。
本實(shí)驗(yàn)中包括陽性對(duì)照乙酰膽堿(10-6M)和陰性對(duì)照L-NAME。L-NAME為NO合酶(NOS)抑制劑，其使用允許區(qū)分內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性松弛事件。主動(dòng)脈環(huán)的剝?nèi)ゴ砹讼嗨茖?duì)照。在添加各個(gè)受試化合物之前，往主動(dòng)脈浴中加入400U/mL的過氧化氫酶，以保證觀察到的效果不是由培養(yǎng)基中產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)引起的。將松弛反應(yīng)測(cè)量為主動(dòng)脈環(huán)顯示張力降低對(duì)于時(shí)間的函數(shù)。獲得的數(shù)據(jù)表達(dá)為去甲腎上腺素(NE)收縮環(huán)的松弛百分率。使用與如上所述相同的統(tǒng)計(jì)方法。通過對(duì)平均松弛百分率(+/-SE)對(duì)使用的濃度作圖，獲得劑量效應(yīng)曲線。
離體篩選的結(jié)果證明A1和A2二聚體以及A型三聚體在10-4M濃度都誘導(dǎo)了血管舒張?jiān)诖藵舛華1二聚體誘導(dǎo)了93.20+/-3.46％的血管舒張，A2二聚體誘導(dǎo)了85.00+/-2.91％血管舒張，A型三聚體誘導(dǎo)56.5+/-16.56％的松弛。此外，A1和A2二聚體都是比陽性對(duì)照(乙酰膽堿)更有效的松弛劑，對(duì)A1二聚體在P＝0.005時(shí)差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
當(dāng)裸露血管或使用L-NAME預(yù)處理血管時(shí)，弱化了松弛反應(yīng)。乙酰膽堿典型地在10-7M濃度下產(chǎn)生了松弛反應(yīng)，10-6M濃度下達(dá)到最大松弛。當(dāng)使用載體單獨(dú)處理血管時(shí)沒有觀察到任何效應(yīng)。
圖1A-C中表示由受試化合物介導(dǎo)的劑量依賴性松弛。
實(shí)施例4在全血中A1二聚體對(duì)血小板的影響使用血小板計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量A1二聚體[A1D]的血小板聚集，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定血小板/單核細(xì)胞綴合物(P/M)和血小板/中性粒細(xì)胞綴合物(P/N)的形成。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，也測(cè)量了與白細(xì)胞(CD62P)有關(guān)的血小板的激活態(tài)，以及白細(xì)胞本身(CD11b)的激活態(tài)。
材料和方法將A1二聚體[A1D]溶于乙醇。一旦在溶液中，用鹽水進(jìn)一步稀釋變得可能。從Novartis(Basel，Switzerland)獲得水蛭素(RevascTM)，-20℃下存儲(chǔ)在玻璃瓶中，為5mg/ml鹽水溶液。膠原(Nycomed)來自Axis Shield Diagnostics(Dundee，UK)。使用由制造商提供的等滲葡萄糖緩沖液從母液(1mg/ml)制備濃縮液。阿司匹林(乙酰水楊酸-ASA)、二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)和腎上腺素來自Sigma。固定液由含有0.16％w/v甲醛的140mMNaCl、4.6mM Na2EDTA、4.5mM Na2HPO4和1.6mM KH2PO4組成，pH7.4。
使用由Medical Engineering Unit(諾丁漢大學(xué))生產(chǎn)的多樣攪拌器(MSA)研究血樣。MSA用于維持血樣在37℃，需要時(shí)在1000rpm攪拌速度下攪拌少量血樣。
使用商業(yè)可獲得的熒光標(biāo)記抗體，在裝備有5W激光(在15mW功率、488nm波長(zhǎng)操作)的Facscan上(Becton Dickinson，UK)或在裝備另外的Trigon激光器(在633nm波長(zhǎng)操作)的LSRII流式細(xì)胞器(BectonDickinson，UK)上，進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量。
血液收集血液來自健康的志愿者，其否認(rèn)前10天內(nèi)攝入過任何阿司匹林或非甾體抗炎藥。將這些血分裝于含有水蛭素和少量待研究黃烷或乙醇(作為對(duì)照)的有刻度聚苯乙烯管中(終濃度50μg/ml)。血液中乙醇的終濃度始終為0.3％。在某些實(shí)驗(yàn)中，試管中也包括了作為對(duì)照的阿司匹林(ASA)或鹽水。然后在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，將這些試管封蓋，倒置3次以保證適當(dāng)混合，然后37℃下置于MSA中30分鐘，在此期間血液保留原狀。將另一份血樣置于商業(yè)制備的含有K2EDTA抗凝血?jiǎng)┑恼婵詹裳苤?vacutainer tube)。
血小板聚集預(yù)孵育30分鐘后，將血液(480μl)分裝于小聚苯乙烯試管中，每管都含有攪拌子，在MSA中攪拌2分鐘。2分鐘后，將激動(dòng)劑或載體對(duì)照溶液(20μl)加到試管中。然后在MSA中攪拌最多10分鐘，此時(shí)通過將小子樣與固定液以1∶2(v/v)的比例混合，固定血小板聚集物。使用UltraFlo-100全血血小板計(jì)數(shù)器測(cè)定固定樣品中的血小板數(shù)。參照EDTA樣品的血小板計(jì)數(shù)，作為單一血小板損失百分率計(jì)算血小板聚集。
血小板-白細(xì)胞綴合物形成在與用于測(cè)量血小板聚集的樣品相同的攪拌樣品中測(cè)量血小板-白細(xì)胞綴合物形成。加入激動(dòng)劑后4分鐘或10分鐘取子樣，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)目贵w或抗體混合物中。然后在黑暗中室溫孵育不低于20分鐘。紅細(xì)胞融解并洗滌處理后，將細(xì)胞懸液應(yīng)用于FACScan或LSRII流式細(xì)胞器。通過線性放大獲得的前向散射(細(xì)胞尺寸)和側(cè)向散射(細(xì)胞粒度)性質(zhì)的點(diǎn)圖，由邏輯門鑒定白細(xì)胞。通過它們的前向散射-側(cè)向散射性質(zhì)和CD14(PE)陽性鑒定單核細(xì)胞，而以相同方式但CD14表達(dá)為陰性鑒定中性粒細(xì)胞?！皃an”白細(xì)胞標(biāo)記CD45(PerCP)也用于鑒定白細(xì)胞群。要求熒光參數(shù)用對(duì)數(shù)放大。將血小板單核細(xì)胞(P/M)和血小板中性粒細(xì)胞(P/N)綴合物定量為單核細(xì)胞(P/M mf)和中性粒細(xì)胞群(P/N mf)的CD42a(FITC)熒光中值。通過CD11b(AlexaFluor647)表達(dá)測(cè)量白細(xì)胞的活化(對(duì)單核細(xì)胞為CD11b-M，對(duì)中性粒細(xì)胞為CD11b-N)。通過與白細(xì)胞有關(guān)的血小板CD62P(PE)陽性，測(cè)量血小板活化(P-選擇蛋白表達(dá))(在P/M上為CD62P-M，在P/N上為CD62P-N)。
FACScan用于測(cè)量實(shí)驗(yàn)中的熒光探針，其中共使用3種顏色，但為了研究4種顏色需要LSRII。LSRII是比FACScan更敏感的儀器并產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光值(mf)。FACScan上獲得的結(jié)果不能直接與LSRII上獲得結(jié)果比較。
結(jié)果A1二聚體對(duì)聚集、P/M和P/N的影響血液取自3名不同志愿者，測(cè)量應(yīng)答膠原(0、0.125、0.25和0.5μg/ml)的血小板聚集和血小板/白細(xì)胞綴合物形成。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用的阿司匹林濃度為100μM，使用的A1二聚體為0.3mM。在添加激動(dòng)劑后4分鐘和10分鐘測(cè)量聚集，只在10分鐘后測(cè)量血小板/白細(xì)胞綴合物形成。
來自不同志愿者的血液對(duì)膠原的絕對(duì)應(yīng)答是變化的。這就意味著黃烷醇的相對(duì)抑制效果依賴于志愿者對(duì)使用的具體膠原濃度的反應(yīng)性。由于此原因，為了比較，決定分析結(jié)果的合適方法是計(jì)算與使用的膠原濃度無關(guān)的A1二聚體平均值。結(jié)果顯示于圖2中。(在這些實(shí)驗(yàn)中，也測(cè)試了A型矢車菊苷配基之外的某些化合物，但因?yàn)樗鼈兣c本文的討論無關(guān)，就沒有對(duì)它們進(jìn)行鑒定)。因?yàn)閷?duì)3個(gè)血樣的每一個(gè)都使用了3種膠原濃度，結(jié)果各自為9個(gè)個(gè)別值的平均值(±sem)。
A1二聚體抑制了膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。ASA對(duì)照也有效地抑制了聚集、P/M和P/N。
從這一點(diǎn)決定包括測(cè)量綴合物中血小板和白細(xì)胞兩者活化的程度，該綴合物在膠原添加至血液后形成。在形成的綴合物中在與白細(xì)胞有關(guān)的血小板上測(cè)量P-選擇蛋白(CD62P)。白細(xì)胞活化測(cè)量為表達(dá)的CD11b的量。使用4顏色分析。
黃烷醇對(duì)膠原誘導(dǎo)的聚集、P/M、P/N、CD62P-M、CD62P-N、CD11b-M和CD11b-N影響的比較血樣取自3名不同志愿者，測(cè)量應(yīng)答膠原(0、0.125、0.25和0.5μg/ml)血小板聚集(4分鐘)和血小板/白細(xì)胞綴合物形成(10分鐘)。同一時(shí)間通過與CD62P和CD11b抗體溫育，測(cè)量綴合物中血小板和白細(xì)胞的活化。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用的阿司匹林濃度為100μM，使用的A1二聚體為0.3mM。結(jié)果顯示于圖3。(在這些實(shí)驗(yàn)中也測(cè)試了A型矢車菊苷配基之外的某些化合物，但因?yàn)樗鼈兣c本文的討論無關(guān)，就沒有對(duì)它們進(jìn)行鑒定)。如上所述，通過包括3種膠原濃度的所有結(jié)果并計(jì)算平均值(±sem，n＝9)，進(jìn)行分析。
A1二聚體抑制了膠原誘導(dǎo)的聚集。然而，值得注意的是，A1D并不抑制白細(xì)胞的活化(單核細(xì)胞和白細(xì)胞上的CD11b)。阿司匹林對(duì)CD11b也沒有效果。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防NO反應(yīng)性疾病或紊亂的方法，所述方法通過給予需要其的患者有效量的A型矢車菊苷配基或其藥物可接受的鹽或衍生物，所述A型矢車菊苷配基由n個(gè)下式的單體單位組成 其中(i)所述單體單位通過4→6和/或4→8黃烷間鍵連接；(ii)至少兩個(gè)所述單體單位另外通過A型黃烷間鍵(4→8；2→O→7)或(4→6；2→O→7)連接；(iii)n為2-12；并且其中所述患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基被分離和純化。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A1二聚體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述A1二聚體被分離和純化。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A2二聚體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述A2二聚體被分離和純化。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A型三聚體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述A型三聚體是基本純的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型三聚體具有下式
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述NO反應(yīng)性疾病或紊亂為高血壓、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、血管循環(huán)紊亂和/或腎臟疾病。
11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述患者具有心臟病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭和/或腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。
12.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述患者患有高血壓合并下列任何疾病糖尿病、肥胖癥、高膽固醇水平和/或吸煙。
13.一種治療高血壓的方法，所述方法通過給予需要其的患者有效量的A型矢車菊苷配基或其藥物可接受的鹽或衍生物，所述A型矢車菊苷配基由n個(gè)下式的單體單位組成 其中(i)所述單體單位通過4→6和/或4→8黃烷間鍵連接；(ii)至少兩個(gè)所述單體單位另外通過A型黃烷間鍵(4→8；2→O→7)或(4→6；2→O→7)連接；(iii)n為2-12；并且其中所述患者為人或獸醫(yī)動(dòng)物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基被分離和純化。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A1二聚體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述A1二聚體被分離和純化。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A2二聚體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述A2二聚體被分離和純化。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述A型矢車菊苷配基為A型三聚體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述A型三聚體是基本純的。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述A型三聚體具有下式
22.權(quán)利要求13-21任一項(xiàng)的方法，其中所述患者患有任何下列疾病糖尿病、肥胖癥、高膽固醇水平和/或吸煙。
23.一種包含分離和純化的A1二聚體的藥物組合物。
24.一種含有分離和純化的A2二聚體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有A型矢車菊苷配基的組合物，如藥物、食品、食品添加劑、食物補(bǔ)充劑，及其使用方法，用于人或獸醫(yī)動(dòng)物的預(yù)防或治療，以治療或預(yù)防反應(yīng)性健康疾病，治療高血壓、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病和/或血管循環(huán)紊亂，預(yù)防或降低心臟病發(fā)作、中風(fēng)、充血性心力衰竭和/或腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，或改善血流量例如腎臟血流量。這種組合物可任選含有另外的NO調(diào)節(jié)劑和/或心血管保護(hù)或治療劑，或可與這種藥物組合給予。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK1938015SQ200580009421
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月28日
發(fā)明者H·H·施米茨, C·L·克維克－烏里貝, M·A·凱姆, J·F·小哈默斯通 申請(qǐng)人:馬爾斯公司