專利名稱：：治療黑素瘤的組合方法和組合物的制作方法治療黑素瘤的組合方法和組合物相關(guān)申請的交叉參考本申請要求申請日為2004年3月19曰的臨時(shí)申請系列號(hào)60/554,509的優(yōu)先權(quán)，所述申請全文并入本文作參考。資助本申請由Foreman黑素瘤研究基金會(huì)和美國癌癥協(xié)會(huì)提供支持(RSG畫04-053-01-GMC)。
背景技術(shù)：
：在三種主要的皮膚癌癥中，惡性黑素瘤由于轉(zhuǎn)移而具有最高的死亡危險(xiǎn)(Schalicketal.，BlackwellScience,Inc.Malden，MA180-348(1998);Jemaletal.，J,Nat.CancerInst.93:678-683(2001);和Jemaletal.，Ca:aCancerJournalforClinicians52:23-47(2002))。這種疾病晚期的患者的預(yù)后非常差，平均存活時(shí)間為6—10個(gè)月(Jemaletal.，Ca:ACancerJournalforClinicians52:23-47(2002);禾口Soengasetal.，Oncogen22:3138-3151(2003))。目前盡管有許多測試從手術(shù)至免疫治療、放療和化療等各種治療方法效力的臨床實(shí)驗(yàn)，但還沒有有效的長期治療這一癌癥的晚期患者的方法(Soengasetal.，Oncogen22:3138-3151(2003);Serroneetal.，MelanomaRes9:51-58(1999);Grossmanetal.，CancerMetastasisRev20:3-11(2001);Helmbachetal.，IntJCancer93:617-622(2001);Balloetal.，SurgicalClinicsNorthAm83:323-342(2003);及Hersey，P.，IntMedJ33:33-43(2003》。缺少有效的治療方案部分是由于缺少關(guān)于在黑素瘤發(fā)育期間發(fā)生改變的主要基因及特異性耙向校正這些缺陷的治療方法的信息(Serroneetal.，JExpClinCancerRes19:21-34(2000);及Atkinsetal.，NatureRev.DrugDis1:491-492(2002))。患有轉(zhuǎn)移性(IV期)惡性黑素瘤的患者的平均存活時(shí)間為大約1年(Balchetal.，1993;Koh，1991)。目前標(biāo)準(zhǔn)的治療方法包括用一些藥劑如順鉑、DTIC和BCNU組合化療，并且伴有或不伴有細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-2(IL-2)或者干擾素-a(IFN-a)(Balcheta1.，1993;Koh，1991;Legha和Buzaid，1993)。據(jù)報(bào)道對化療的應(yīng)答率高如60%，但是無論治療方案如何，只有5%的患者長期存活。常規(guī)的化療是通過靶向快速生長的細(xì)胞而控制癌癥的生長。然而，這一功能不是特異性的，因?yàn)樵S多正常細(xì)胞如骨髓細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞也具有基礎(chǔ)增殖水平。因此，機(jī)體的許多正常細(xì)胞也受到化療的毒性作用的影響，常規(guī)的化療可導(dǎo)致患者一定程度的發(fā)病率。顯然，需要提供治療轉(zhuǎn)移的黑素瘤的新方法。Akt蛋白激酶家族由三個(gè)成員組成Aktl/PKBa、Akt2/PKB卩和Akt3/PKBy，它們呈現(xiàn)高度的結(jié)構(gòu)相似性(Braziletal.，Cell111:293-303(2002);及Nicholsonetal.，clllSignal14:381-395(2002))。家族成員彼此呈現(xiàn)廣泛的結(jié)構(gòu)相似性，在氨基酸水平呈現(xiàn)高于80%的同源性(NicholsonKM，AndersonNG.CellSignal.14(5):381-95(2002)，DattaSRetal.GenesDev.13(22):2卯5-27(1999))。所有Akt同種型均呈現(xiàn)主要的結(jié)構(gòu)特征，具有三個(gè)獨(dú)特的功能域(TestaJR，Bellacosa.A.ProcNatlAcadSciUSA.98(20):10983-5(2001)，NicholsonKM，AndersonNG.CellSignal.14(5):381-95(2002)，ScheidMP，WoodgettJR.NatRevMolCellBiol.2(10):760畫8(2001)，ScheidMP，WoodgettJR.FEBSLett.546(1):108-12(2003)，BellacosaAetal.CancerBiolTher.3(3):268-75.Epub2004(2004)，BrazilDPetal.TrendsBiochemSci.29(5):233-42(2004)，Brazil,D.P.etai.Cell111:293-303(2002)，BrazilDP,HemmingsBA.TrendsBiochemSci.26(ll):657-64(2001)，DattaSRetal.GenesDev.13(22):2905-27(1999))。一個(gè)是氨基末端普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性結(jié)構(gòu)域(PH)，其介導(dǎo)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)一脂質(zhì)之間的相互作用。這個(gè)結(jié)構(gòu)域由大約100個(gè)氨基酸組成，類似其它信號(hào)傳導(dǎo)分子中的三個(gè)磷酸肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LietzkeSEetal.MolCell.6(2):385-94(2000)，F(xiàn)ergusonKMetal.MolCell.6(2):373-84(2000))。第二個(gè)功能域是羧基末端激酶催化區(qū)，其介導(dǎo)底物蛋白的磷酸化。其示出與蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)中的那些結(jié)構(gòu)域的高度相似性(JonesPFetal.CellRegul.2(12):1001-9(1991)，AndjelkovicM，JonesPF，GrossniklausU，CronP，SchierAF，DickM，BilbeG，HemmingsBA.DevelopmentalregulationofexpressionandactivityofmultipleformsoftheDrosophilaRACproteinkinase.JBiolChem.270(8):4066-75(1995))。第三個(gè)功能域是具有重要調(diào)節(jié)作用的尾部區(qū)。這個(gè)區(qū)域有時(shí)稱作尾或者調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。在后兩個(gè)區(qū)域中有絲氨酸和蘇氨酸殘基，其磷酸化是Akt激活所必需的。這些位點(diǎn)根據(jù)特定的Akt同種型而略有不同。在所有三個(gè)同種型上的第一個(gè)位點(diǎn)是分別在Aktl/2/3上的第308/309/305氨基酸位的蘇氨酸。第二個(gè)位點(diǎn)是分別在Aktl/2/3的第473/474/472氨基酸位的疏水性C末端尾部內(nèi)存在的絲氨酸。應(yīng)答生長因子或者其它胞外刺激物而發(fā)生的這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化是最大程度激活A(yù)kt所必需的(AlessiDR，AndjelkovicM，CaudwellB，CronP，MorriceN，CohenP，HemmingsBA.MechanismofactivationofproteinkinaseBbyinsulinandIGF-1.EMBOJ.15(23):6541-51(1996))。Akt也可以在其它殘基磷酸化；然而這種磷酸化的功能意義有待持續(xù)研究(AlessiDR，AndjelkovicM，CaudwellB，CronP，MorriceN，CohenP，HemmingsBA.MechanismofactivationofproteinkinaseBbyinsulinandIGF-1.EMBOJ.15(23):6541-51(1996))。同樣，盡管已經(jīng)鑒別了缺少第472位絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的Akt3剪接變體，但是這個(gè)變體的細(xì)胞學(xué)作用還不清楚(BrodbeckD，HillMM，HemmingsBA.JBiolChem.276(31):29550腳8.Epub2001(2001))。這個(gè)變體在黑素瘤細(xì)胞中是否存在或者起何種作用也未知。雖然所有同種型均可以在特定細(xì)胞類型中表達(dá)，但是只有某些同種型可以是活性的。另外看起來每個(gè)同種型可以在細(xì)胞中發(fā)揮獨(dú)特和共同的功能(Braziletal.，Cell111:293-303(2002);andNicholsonetal.，CellSignal14:381-395(2002);Chenetal.，GenesDev15:2203-2208(2001);及Choetal.，Science292:1728-1731(2001))。缺少Aktl的敲除小鼠生長延遲并且在睪丸和胸腺中自發(fā)凋亡的比率增加(Chenetal.，GenesDev15:2203-2208(2001);Choetal.，JBiolChem276:38349-38352(2001);Pengetal.，GenesDev17:1352-1365(2003))。才目反，Akt2敲除小鼠具有被削弱的胰島素調(diào)節(jié)功能，由此由于胰島素對肝臟和骨骼肌的作用的缺乏而導(dǎo)致降低血糖水平的能力不足(Choetal.,Science292:1728-1731(2001);Pengetal.，GenesDev17:1352-1365(2003))。目前還沒有描述與Akt3敲除小鼠相關(guān)的表型的公開報(bào)道，因此關(guān)于Akt3的特異性功能或者其對于人類癌癥的作用還了解的很少。增加Aktl或Akt2表達(dá)的基因擴(kuò)增已經(jīng)在胃癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌中報(bào)道(Staal，S.R，ProcNatAcadSciencesUSA84:5034-5037(1987);Chengetal.，ProcNatAcadSciencesUSA89:9267-9271(1992);Chengetal.，ProcNatAcadSciencesUSA93:3636-3641(1996);Luetal.，Chung-HuaIHsuehTsaChih[ChineseMedicalJournal]75:679-682(1995);Bellacosaetal.，IntJCancer64:280-285(1995);及vanDekkenetal.，CancerRes59:749-752(1999))。雖然在黑素瘤中未鑒別Akt的激活突變(Waldmannetal.，ArchDermatolRes293:368-372(2001);Waldmannetal.，MelanomaRes12:45-50(2002))，但是由(用P13K抑制劑Wortmarmin或者LY-294002)耙向P13K而阻斷總Akt功能抑制細(xì)胞增殖并降低黑素瘤細(xì)胞對UV輻射的敏感性(Krasilnikovetal.，MolCarcinogenesis24:64-69(1999))?？偟腁kt活性也已經(jīng)使用免疫組織化學(xué)方法在黑素瘤中測定，從而證實(shí)全部磷酸化的Akt的水平在嚴(yán)重的發(fā)育異常痣和轉(zhuǎn)移的黑素瘤中與在正常或者中等發(fā)育異常的痣中相比是增加的(Dhawanetal.，CancerRes62:7335-7342(2002))。然而，在黑素瘤中各個(gè)Akt同種型發(fā)揮的作用及導(dǎo)致特定Akt同種型的失調(diào)的機(jī)制還未知。最近發(fā)現(xiàn)磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在黑素瘤腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。發(fā)現(xiàn)通過喪失PTEN磷酸酶(P13K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)物)而失調(diào)的Akt活性降低黑素瘤細(xì)胞的凋亡能力并從而調(diào)節(jié)黑素瘤腫瘤發(fā)生(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。Raf蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶家族由三個(gè)成員組成A-Raf，B-Raf和C畫Raf(Merceretal.，BiochimBiophysActa1653:25-40(2003))。Raf家族成員在MAPK(Ras/Raf/MAPK激酶(MEK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶(ERK)途徑中是中間分子，這個(gè)途徑是通過有序的一系列連續(xù)磷酸化事件將胞外信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Merceretal.，BiochimBiophysActa1653:25-40(2003)，Smalley.IntJCancer104:527-32(2003))。典型地，胞外配體與其酪氨酸激酶受體結(jié)合，導(dǎo)致Ras激活和一系列磷酸化事件的開始(Merceretal.，BiochimBiophysActa1653:25-40(2003)，Smalley.IntJCancer104:527-32(2003))。激活的Ras導(dǎo)致Raf的磷酸化和激活，接著磷酸化和激活MEK1和MEK2。MEK激酶接著磷酸化和激活ERK1和ERK2(Chongetal，CellSignal15:163-69(2003))，其磷酸化一些胞質(zhì)和細(xì)胞核耙位，最后導(dǎo)致在細(xì)胞生長和存活中起重要作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)(Changetal.，IntJOncol22:469-80(2003))。導(dǎo)致B-Raf激活的突變在大多數(shù)散發(fā)黑素瘤中發(fā)現(xiàn)，在黑素瘤中主要是B-RAF是最突變的基因，突變率范圍為60_90%(Daviesetal.，Nature417:949-54(2002);Pollocketal.,NatGenet33:19-20(2003);Broseetal.，CancerRes62:6997-7000(2002);及Yazdietal.，JInvestDermatol121:1160-62(2003))。大多數(shù)B-RAF突變是作為使第1796位核苷酸的T轉(zhuǎn)變?yōu)锳的單堿基錯(cuò)義取代的結(jié)果而發(fā)生，這樣外顯子15中密碼子599的纈氨酸被取代為谷氨酸(V599E)(Daviesetal.,Nature417:949-54(2002))。這種突變增加了B-Raf的基礎(chǔ)激酶活性，導(dǎo)致MAPK途徑的超反應(yīng)性，這可通過下游激酶MEK和ERK的水平組成型增加而表明(Daviesetal.,Nature417:949-54(2002))。B-RAF突變是獲得性的、體細(xì)胞性的、合子后(post-zygotic)事件，在家族遺傳的黑素瘤中未被鑒別(Langetal.，HumMutat21:327-30(2003);Laudetal"CancerRes63:3061-65(2003》Meyeretal"IntJCancer106:78-80(2003))。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA實(shí)現(xiàn)的多核苷酸序列特異性的、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其導(dǎo)致特異性信使RNA(mRNA)降解，從而降低該mRNA編碼的希望的靶多肽表達(dá)(見例如W099/32619,WO01/75164,美國專利No.6506559，F(xiàn)ireetal.,Nature391:806-11(1998);Sharp,GenesDev.13:139-41(1999);Elbashiretal.，Nature411:494-98(2001);Harborthetal.，J.CellSci.114:4557-65(2001))。RNAi是由雙鏈多核苷酸介導(dǎo)的，所述雙鏈多核苷酸如下文所描述，例如是具有相應(yīng)于編碼其表達(dá)被損害的多肽部分的外顯子序列的序列的雙鏈RNA(dsRNA)。據(jù)報(bào)道RNAi不由與內(nèi)含子或者啟動(dòng)子序列具有序列相同性的雙鏈RNA多核苷酸實(shí)現(xiàn)(Elbashiretal.，2001)。RNAi途徑在果蠅和線蟲(Caewor/w^/zto中已經(jīng)充分鑒定，但是在高等真核動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(包括人)中干擾特異性多肽表達(dá)的"小干擾RNA"(siRNA)多核苷酸也已經(jīng)被考慮(例如，Tuschl，2001Chembiochem.2:239-245;Sharp,2001GenesDev.15:485;Bernsteinetal.，2001RNA7:1509;Zamore，2002Science296:1265;Plaster,2002Science296:1263;Zamore2001Nat.Struct.Biol.8:746;Matzkeetal.，2001Science293:1080;Scaddenetal.，2001EMBORep.2:1107所述)。根據(jù)目前的非限制性模型，RNAi途徑是通過長dsRNA的ATP-依賴性進(jìn)行性裂解成被稱作小干擾RNA(siRNA)的長度為大約18—27(例如19、20、21、22、23、24、25、26等)個(gè)核苷酸堿基對的雙鏈片段而啟動(dòng)的(參見Hutvagneretal.，Curr.Opin.Gen.Dev.12:225-32(2002);Elbashiretal.，2001;Nyknenetal.，Cell107:309-21(2001);Bass，Cell101:235-38(2000));Zamoreetal.，Cell101:25-33(2000))。在果蠅中，稱作"Dicer"的酶將較長的雙鏈RNA切割成siRNA;Dicer屬于dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶的RNaselll家族(WOO1/68836;Bernsteinetal.，Nature409:363-66(2001))。另外根據(jù)這個(gè)非限制性模型，siRNA雙鏈被摻入到蛋白質(zhì)復(fù)合物中，隨后是ATP依賴性解旋siRNA，由此產(chǎn)生活性的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)(W001/68836)。該復(fù)合物識(shí)別并切割與siRNA導(dǎo)鏈互補(bǔ)的靶RNA，因此干擾特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)(Hutvagneretal.，如前)。在線蟲和果蠅中，RNAi可以通過長的雙鏈RNA多核苷酸介導(dǎo)(W099/32619;WOO1/75164;Fireetal.，1998;Clemensetal.，Prac.Natl.Acad.Sci.USA97:6499-6503(2000);Kisielowetal.，Biochem.J.363:1-5(2002);也見于WOO1/92513(在酵母中RNAi介導(dǎo)的沉默)所述)。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，用長dsRNA多核苷酸(即大于30bp)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致非特異性序列應(yīng)答激活，其全局阻斷蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致mRNA降解(Bass，Nature411:428-29(2001))。用長度為大約18—27個(gè)核苷酸堿基對的雙鏈RNA轉(zhuǎn)染人及其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞以序列特異性方式干擾由含有相應(yīng)核苷酸序列的信使RNA(mRNA)編碼的特定多肽的表達(dá)(WO01/75164;Elbashiretal.，2001;Elbashiretal.，GenesDev.15:188-200(2001));Harborthetal.，J.CellSci.114:4557-65(2001);Carthewetal.，Curr.Opin.CellBiol.13:244-48(2001);Mailandetal.，NatureCellBiol.AdvanceOnlinePublication(Mar,18，2002);Mailandetal.2002NatureCellBiol.4:317)。siRNA多核苷酸在序列特異性改變或者調(diào)節(jié)基因表達(dá)以產(chǎn)生變化水平的所編碼的多肽產(chǎn)物中的應(yīng)用中優(yōu)于本領(lǐng)域已知的其它多核苷酸。這些優(yōu)勢包括相對于這些其它多核苷酸(例如反義核酶或者三鏈體多核苷酸)的降低的siRNA多核苷酸有效濃度、增強(qiáng)的siRNA多核苷酸穩(wěn)定性及較短的siRNA多核苷酸長度。簡而言之，"反義"多核苷酸以序列特異性方式結(jié)合靶核酸如mRNA或者DNA，以防止DNA轉(zhuǎn)錄或者mRNA翻譯(見例如美國專利No.5,168,053;美國專利No.5，l卯，931;美國專利No.5,135,917;美國專利No.5，087，617;也見例如Clusdetal.，1993Nucl.AcidsRes.21:3405-11，其描述了"啞鈴形"反義寡核苷酸)。"核酶"多核苷酸可靶向任何RNA轉(zhuǎn)錄物并且能催化裂解這些轉(zhuǎn)錄物，因此削弱mRNA的翻譯(見例如美國專利No.5，272，262;美國專利No.5，144,019;及美國專利Nos.5,168,053，5,180,818，5,116,742和5,093,246;U.S.2002/193579)。"三鏈體"DNA分子是指單鏈DNA結(jié)合雙鏈DNA形成的一種線性三鏈體分子，從而防止轉(zhuǎn)錄(見例如美國專利No.5,176,996,其描述了制備結(jié)合雙鏈體DNA上的耙位點(diǎn)的合成寡核苷酸的方法)。這種三鏈體結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的，并且僅在生理?xiàng)l件下短暫形成。因?yàn)閱捂湺嗪塑账岵灰子跀U(kuò)散進(jìn)細(xì)胞中并因此易于被核酸酶消化，因此開發(fā)用于反義或者三鏈體技術(shù)的單鏈DNA通常需要化學(xué)修飾核苷酸以改良穩(wěn)定性和被細(xì)胞吸收的能力。相反，siRNA易于被完整的細(xì)胞吸收，在低于反義或者核酶多核苷酸所需要的濃度幾個(gè)數(shù)量級的濃度即可有效干擾特異性多肽的表達(dá)，并且不需要使用化學(xué)修飾的核苷酸。惡性黑素瘤是一種皮膚癌，最主要發(fā)生在男性，由于發(fā)生轉(zhuǎn)移而具有死亡的高度危險(xiǎn)。發(fā)生率和死亡率逐年持續(xù)上升，目前還沒有有效的長期治療方法。這種情況部分反映出缺少關(guān)鍵基因的鑒別及靶向這些缺陷的特異性治療。因此，本領(lǐng)域需要鑒別所涉及的關(guān)鍵基因及耙向糾正這些缺陷的特異性治療方法及靶向降低被鑒別為PI3K/Akt和MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用的基因。鑒別作為選擇性靶的基因?yàn)楹谒亓龌颊咛峁┝诵碌闹委煓C(jī)會(huì)。因此，本發(fā)明的主要目的、特征或者優(yōu)勢是改良現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。本發(fā)明的另一目的、特征或者優(yōu)勢是提供降低癌細(xì)胞中Akt3活性、從而使癌細(xì)胞恢復(fù)正常凋亡敏感性的方法。本發(fā)明的另一目的、特征或者優(yōu)勢是提供一種用降低Akt3活性的藥劑誘導(dǎo)癌細(xì)胞中凋亡的方法。本發(fā)明的另一目的、特征或者優(yōu)勢是提供一種治療黑素瘤的組合方法，其通過使黑素瘤腫瘤細(xì)胞恢復(fù)正常凋亡敏感性、降低黑素瘤腫瘤細(xì)胞的增殖和生長以及抑制黑素瘤腫瘤細(xì)胞的血管形成而進(jìn)行治療。本發(fā)明的另一目的、特征或者優(yōu)勢是提供一種治療黑素瘤的方法，該方法與常規(guī)方法相比更有效地縮小腫瘤大小。本發(fā)明的另一目的、特征或者優(yōu)勢是提供一種治療黑素瘤的方法，該方法使用較低濃度的化療劑，從而降低對患者的毒性。這些及其它目的、特征或者優(yōu)勢通過如下本發(fā)明的描述將顯而易見。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種將靶向治療方法與選擇的化療劑進(jìn)行組合的合理基礎(chǔ)，其目前未用于治療黑素瘤。本發(fā)明基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)Akt3調(diào)節(jié)凋亡以及V599EB-Raf調(diào)節(jié)黑素瘤中的生長和血管發(fā)育。本發(fā)明人首先提出了用于治療黑素瘤的有效組合靶向治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過降低Akt3活性在黑素瘤腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在黑素瘤腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括將黑素瘤腫瘤細(xì)胞與降低Akt3活性的藥劑接觸。因此，所提供的方法使黑素瘤腫瘤細(xì)胞恢復(fù)正常的凋亡敏感性，從而使得可以給予較低濃度的化療劑，由此對患者的毒性降低。本發(fā)明人提供了一種治療哺乳動(dòng)物黑素瘤腫瘤的方法，包括將有效量的藥劑給予黑素瘤腫瘤以誘導(dǎo)凋亡；將有效量的藥劑給予黑素瘤腫瘤以降低血管發(fā)生和細(xì)胞增殖。本發(fā)明還揭示了一種治療哺乳動(dòng)物中的黑素瘤的方法，包括將有效量的降低Akt3活性的藥劑給予哺乳動(dòng)物中的黑素瘤腫瘤；將有效量的降低V599EB-Raf活性的藥劑給予哺乳動(dòng)物中的黑素瘤腫瘤，從而治療黑素瘤腫瘤。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療黑素瘤腫瘤的藥物組合物，其包含一種降低Akt3活性的藥劑及一種載體。本發(fā)明的這些及其它實(shí)施方案通過參考如下詳細(xì)描述將顯而易見。本文示出的所有參考文獻(xiàn)均以全文并入?yún)⒖?。附圖簡述圖1示出了關(guān)于Akt3參與惡性黑素瘤的鑒別。A:黑素瘤細(xì)胞系UACC903中Akt活性由PTEN調(diào)節(jié)。Western印跡分析示出磷酸化的Akt、總Akt、PTEN及a-烯醇化酶(加樣對照)的表達(dá)。36A、29A和37A細(xì)胞系是從表達(dá)PTEN的UACC903親代細(xì)胞系中產(chǎn)生的遺傳相關(guān)細(xì)胞系。衍生自36A細(xì)胞系的致瘤性回復(fù)體細(xì)胞系被認(rèn)為是同基因的，僅在PTEN表達(dá)方面不同。黑素細(xì)胞被用作為正常細(xì)胞對照。圖形表示來自3個(gè)獨(dú)立的Western印跡的密度計(jì)量掃描以定量證實(shí)每個(gè)細(xì)胞系中磷酸化的Akt相對于總Akt的水平；條桿，土SEM;統(tǒng)計(jì)學(xué)，One-WayANOVA，隨后為相對于黑素細(xì)胞對照的Dunnet's多重比較(MultipleComparisons),*P<0.5。B:針對每個(gè)Akt同種型的siRNA證實(shí)在UACC903細(xì)胞系中每個(gè)異位表達(dá)的Akt同種型敲弱(knockdown)的特異性。表達(dá)標(biāo)記的HA-Aktl、HA-Akt2或者HA-Akt3的構(gòu)建體與特異于Aktl、Akt2或者Akt3的siRNA—起共核轉(zhuǎn)染(co-nucleofect)進(jìn)UACC903細(xì)胞中。對照是未被核轉(zhuǎn)染或者僅用載體核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。Western印跡用HA的抗體探查以檢測異位表達(dá)的蛋白質(zhì)以及作為加樣對照的a-烯醇化酶。C:siRNA介導(dǎo)的Akt3的敲弱而非Akt2或者Akt2的敲弱在黑素瘤細(xì)胞系UACC903、WMl15和SK-MEL-24中改變磷酸化Akt(活性)的水平。Western印跡分析示出在用50(左側(cè))或者100pmole(右側(cè))各自的siRNA轉(zhuǎn)染后，磷酸化的Akt、Akt3、Akt2及a-烯醇化酶的表達(dá)。對照是未被核轉(zhuǎn)染或者用混雜的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。數(shù)據(jù)是最少2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。這些實(shí)驗(yàn)的加樣對照是a-烯醇化酶。D:當(dāng)UACC903(PTEN)致瘤模型中存在PTEN蛋白質(zhì)時(shí)，磷酸化的Akt3減少。Akt3和Akt2從UACC903(PTEN)致瘤模型的細(xì)胞系中免疫沉淀，通過用識(shí)別磷酸化Akt的抗體進(jìn)行Western印跡而分析。表達(dá)PTEN的36A、29A和37A細(xì)胞系衍生自缺少PTEN蛋白的UACC903親代細(xì)胞系。兩種致瘤性回復(fù)體細(xì)胞系衍生自36A細(xì)胞系中并且不再表達(dá)PTEN。圖中示出了陰性抗原對照及Akt3和Akt2陽性和陰性對照。Akt3和Akt2的對照分別是未處理的(陽性)或者經(jīng)LY-294002處理的(陰性)HEK298T或者LNCaP細(xì)胞，LY-294002是P13K的抑制劑。E.在UACC903(PTEN)致瘤模型中Akt3活性在存在PTEN條件下降低。免疫沉淀的Akt3用于體外激酶分析，其中Crosstide被Akt3磷酸化以評估活性。圖中示出在減去無抗原對照之后的活性；條桿，±SEM;統(tǒng)計(jì)學(xué)，One-WayANOVA，隨后為相對于黑素細(xì)胞對照的Dunnet's多重比較，*P<0.05。圖2示出在黑素瘤腫瘤進(jìn)展期間發(fā)生增加的Akt3表達(dá)和活性。A:在黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型中放射狀生長期期間發(fā)生磷酸化(活性)Akt水平增加。Western印跡比較了黑素細(xì)胞中的磷酸化Akt的量與從處于放射生長期(WM35和WM3211)和垂直生長期(WM115、WM98.1和WM278)的原發(fā)腫瘤中建立的低代次黑素瘤細(xì)胞系中的磷酸化Akt的量?？侫kt作為對照示出。B:在黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型中Akt3與Akt2表達(dá)比較。Western印跡示出Akt3和Akt2及作為加樣對照的a-烯醇化酶的表達(dá)水平。C:與Akt2相比，Akt3在黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型的細(xì)胞系中優(yōu)先被激活。將Akt3或者Akt2從每個(gè)細(xì)胞系中免疫沉淀并進(jìn)行Western印跡分析以測定免疫沉淀物中磷酸化Akt的量。D:與黑素細(xì)胞相比，Akt3在人類患者的轉(zhuǎn)移的黑素瘤中優(yōu)先過表達(dá)。從衍生自31個(gè)腫瘤的轉(zhuǎn)移的黑素瘤中測定Akt3和Akt2表達(dá)。將Akt3和Akt2表達(dá)根據(jù)a-烯醇化酶表達(dá)歸化。該圖定量比較了每個(gè)腫瘤與黑素細(xì)胞中Akt3或者Akt2的表達(dá)水平。條桿代表3個(gè)獨(dú)立Western印跡的密度計(jì)量掃描的平均值。條桿，土SEM。數(shù)值上方代表比在黑素細(xì)胞中發(fā)生的表達(dá)增加的倍數(shù)；只有相差^2倍的差異被認(rèn)為是顯著的。E:與在黑素細(xì)胞中相比，Akt3而非Akt2的表達(dá)和活性在黑素瘤患者的腫瘤中增加?；钚酝ㄟ^免疫沉淀Akt3和Akt2，隨后通過Western印跡分析而確定，Western印跡分析使用識(shí)別磷酸化Akt的抗體進(jìn)行以確定其中可以檢測到磷酸化(活性)Akt3或者Akt2的腫瘤的百分比；統(tǒng)計(jì)學(xué)，t-檢驗(yàn)，*P<0.05。圖3示出在惡性黑素瘤中失調(diào)的Akt3活性的機(jī)制。A:降低的PTEN表達(dá)(活性)在黑素細(xì)胞中特異性增加Akt3活性。B:放射生長期的WM35(放射生長期)細(xì)胞。圖中示出了siRNA介導(dǎo)的PTEN的降低，單獨(dú)siRNA(對照)或者與混雜的siRNA或者針對Aktl、Akt2或者Akt3的siRNA組合。Western印跡分析示出磷酸化的Akt、Akt3、Akt2及PTEN的表達(dá)。a-烯醇化酶作為加樣對照。C.在人黑素細(xì)胞中Akt3的過表達(dá)增加磷酸化Akt的水平。野生型Akt3、失活的Akt3(無活性)或者肉豆蔻?；腁kt3(活性)被核轉(zhuǎn)染進(jìn)黑素細(xì)胞中。Akt2的類似構(gòu)建體作為對照(數(shù)據(jù)未示出)。Akt磷酸化(活性)通過Western印跡分析測定磷酸化的Akt的水平而測定。箭頭(arrowhead)指示內(nèi)源激活的Akt3的位置，箭號(hào)(arrow)指示異位表達(dá)的活性的HA木示記的Akt3。圖4示出增加的Akt3活性通過降低凋亡率而促進(jìn)黑素瘤腫瘤發(fā)育。A:PTEN-介導(dǎo)的Akt3活性降低抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育。在注射進(jìn)裸鼠IO天后，測定親代UACC卯3黑素瘤細(xì)胞、同基因36A(保留PATEN)和回復(fù)體細(xì)胞系(缺少PTEN)形成的腫瘤的大小。數(shù)值是每個(gè)細(xì)胞系三只小鼠中最少6個(gè)注射部位的平均值，條桿，土SEM;統(tǒng)計(jì)學(xué)，One-WayANOVA，隨后為相對于UACC903的Dunnet's多重比較，*P<0.05。B:siRNA介導(dǎo)的Akt3減量調(diào)節(jié)降低UACC903黑素瘤細(xì)胞的致瘤潛力。將針對Akt3、Akt2和Aktl的siRNA核轉(zhuǎn)染進(jìn)UACC903細(xì)胞中，48小時(shí)后將細(xì)胞注射進(jìn)裸鼠中。10天后測定腫瘤的大小。對照是僅用緩沖液或者混雜的siRNA核轉(zhuǎn)染的UACC903細(xì)胞。數(shù)值是每個(gè)細(xì)胞系三只小鼠中最少6個(gè)注射部位的平均值；條桿，土SEM;統(tǒng)計(jì)學(xué)，One-WayANOVA，隨后為針對UACC卯3的Dunnet's多重比較，*P<0.05。C:D:E:F:PTEN或者siRNA介導(dǎo)的Akt3降低使在裸鼠中生長的腫瘤凋亡增加。對衍生自表達(dá)PTEN(36A)的或者用siAkt3和siAkt2的siRNA核轉(zhuǎn)染的UACC903細(xì)胞的腫瘤塊中TUNEL陽性細(xì)胞的量化(C，D)和照片(E，F(xiàn))。條桿，士SEM;統(tǒng)計(jì)學(xué)，Kruskal-Wallis，隨后為相對于UACC卯3的Dunnet's多重比較，*P<0.05。在將細(xì)胞注射進(jìn)裸鼠中4天后，分析腫瘤；放大倍率，200X。對照是UACC903細(xì)胞或者僅用緩沖液核轉(zhuǎn)染的UACC903細(xì)胞。白色核表示經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞。圖5示出脂質(zhì)體單獨(dú)對黑素瘤細(xì)胞無毒的實(shí)證。加入各種濃度的脂質(zhì)體均不降低存活細(xì)胞的數(shù)目。事實(shí)上，它們在所有濃度在48小時(shí)均增加細(xì)胞的存活力。方法脂質(zhì)體的毒性在1205Lu中在加入6.25、12.5、25和50pM濃度的脂質(zhì)體之后24、48禾卩72小時(shí)使用MTS分析評估。圖6示出黑素瘤細(xì)胞易于吸收脂質(zhì)體的實(shí)證。方法將標(biāo)記的脂質(zhì)體(綠色)加入在培養(yǎng)基中生長的AUCC903黑素瘤細(xì)胞中。圖中示出細(xì)胞核在左側(cè)(用DAPI復(fù)染)，已經(jīng)吸收標(biāo)記的脂質(zhì)體的細(xì)胞在右側(cè)；放大倍率，40X。大約99%的細(xì)胞吸收脂質(zhì)體。圖7示出黑素瘤細(xì)胞吸收的脂質(zhì)體的量化。方法將標(biāo)記的脂質(zhì)體或者含有標(biāo)記的siRNA的脂質(zhì)體以20nM濃度加入在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中。l小時(shí)后，將細(xì)胞用5%多聚甲醛固定，用DAPI復(fù)染，計(jì)算吸收標(biāo)記的產(chǎn)物的細(xì)胞百分比。圖8示出脂質(zhì)體的大小一致性和大小分布。方法左側(cè)，掃描電子顯微圖示出脂質(zhì)體的一致大小。右側(cè)，通過光散射分析確定的脂質(zhì)體大小分布。圖中示出了脂質(zhì)體的大小范圍，平均大小為70—80nm。圖9示出脂質(zhì)體將siRNA集合輸送至黑素瘤細(xì)胞的實(shí)證。方法將紅色和綠色標(biāo)記的siRNA加入在培養(yǎng)基中生長的黑素瘤細(xì)胞中。在吸收l小時(shí)后，將細(xì)胞在4X多聚甲醛中固定并用DAPI復(fù)染。左側(cè)示出由紅色siRNA和綠色siRNA染成藍(lán)色的細(xì)胞核。最后一欄是拼接圖像，放大倍率40X。圖10示出在1205Lu黑素瘤細(xì)胞中StealthsiRNA敲弱的蛋白質(zhì)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間的實(shí)證。方法由Invitrogen的StealthsiRNA所致的對蛋白質(zhì)的敲弱的持續(xù)時(shí)間經(jīng)確定為超過8天。將siRNA通過核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移進(jìn)1205Lu黑素瘤細(xì)胞系中。間隔2天對B-Raf蛋白質(zhì)水平進(jìn)行Western印跡分析測定，直至第8天。抗C-Raf的siRNA作為對照。除了降低B-Raf表達(dá)之外，信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游的pErk1V2活性也被降低8天時(shí)間。Erk-2作為蛋白質(zhì)加樣對照。圖11示出在脂質(zhì)體介導(dǎo)的將siRNA輸送至黑素瘤細(xì)胞中之后，蛋白質(zhì)表達(dá)被敲弱的實(shí)證。靶向突變體B-Raf的siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物在200nM濃度可以敲弱50%的蛋白質(zhì)表達(dá)。這表示一基線，更高的濃度將增加敲弱。方法將siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物以100或200nM濃度加入細(xì)胞中。72小時(shí)后收集裂解物并通過Western印跡分析。圖12示出siRNA介導(dǎo)的突變體V599EB-Raf的降低在黑素瘤中降低下游MEK和ERK的活性。在黑素瘤細(xì)胞系UACC903(A)、1205Lu(B)和C8161(C)中核轉(zhuǎn)染之后24和48小時(shí)SiRNA介導(dǎo)的B-Raf和C-Raf的敲弱降低各自蛋白質(zhì)的水平?；祀s的siRNA用作對照，而核纖層蛋白A/CsiRNA用作UACC903細(xì)胞的額外對照。只有針對B-Raf的siRNA降低含有突變體V599EB-Raf的UACC903和1205LU細(xì)胞中B-Raf下游的活性(磷酸化)MEK和ERK的水平。ERK2用作加樣對照。圖13示出黑素瘤腫瘤發(fā)育被vs鄉(xiāng)B-Raf而非C-RAF的siRNA或者混雜的siRNA抑制。在核轉(zhuǎn)染進(jìn)在培養(yǎng)基中生長的UACC903(A)和1205Lu(B)細(xì)胞系中之后，siRNA介導(dǎo)的B-Raf蛋白質(zhì)的敲弱持續(xù)6—8天。觀察到磷酸化ERK1/ERK2水平相應(yīng)降低(B)。ERK2作為加樣對照。siRNA介導(dǎo)的B-Raf降低導(dǎo)致UACC卯3(C)和1205Lu(D)細(xì)胞的致瘤潛力下降。將針對B-Raf、C-Raf的siRNA和混雜的siRNA導(dǎo)入U(xiǎn)AC903或者1205Lu細(xì)胞中(白色箭頭)，36小時(shí)后將細(xì)胞注射進(jìn)裸鼠中(黑色箭頭)。以2天間隔測定腫瘤大小。siRNA介導(dǎo)的B-Raf的減量調(diào)節(jié)降低了UACC903和1205Lu黑素瘤細(xì)胞的致瘤潛力。對照細(xì)胞用緩沖液單獨(dú)、混雜的siRNA或者針對C-Raf的siRNA核轉(zhuǎn)染。數(shù)值是兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的6只小鼠中最少12個(gè)注射部位的平均值。條桿，士SE。圖14示出使用BAY43-9005對B-Raf活性的藥理學(xué)抑制可抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育。A:BAY43-9006既抑制野生型也抑制突變體V599EB-Raf活性。將HA標(biāo)記的野生型或者突變體V599EB-Raf在暴露于5pmol/LBAY43-9006或者DMSO載體的HEK293T細(xì)胞中表達(dá)。HA表明異位表達(dá)的B-Raf蛋白質(zhì)。MAPK途徑的激活或者抑制通過比較pMEK和pERK的水平確定，ERK2作為加樣對照。B:BAY43-9006在含有突變體V599EB-Raf的UACC903黑素瘤細(xì)胞中以劑量應(yīng)答方式降低pMEK和PERK(活性)水平。經(jīng)Western印跡分析隨著增加濃度的BAY43-9006，UACC卯3細(xì)胞中pMEK和PERK水平的降低。加樣對照是ERK2。C:用BAY43-卯06對小鼠預(yù)處理抑制黑素瘤腫瘤的發(fā)育。在注射5X1()S個(gè)UACC903細(xì)胞之前4天，將小鼠每2天經(jīng)腹膜內(nèi)注射50mg/kgBAY43-9006或者DMSO載體而進(jìn)行預(yù)處理兩次(箭頭所指)。間隔2天示出腫瘤大小直至第22天。條桿，±SE。D:降低的腫瘤細(xì)胞增殖伴隨siRNA-介導(dǎo)的黑素瘤腫瘤發(fā)育的抑制。在siRNA介導(dǎo)的B-Raf而非C-Raf或者混雜的siRNA抑制后，在溴脫氧尿苷陽性細(xì)胞中發(fā)生5—8倍的降低。*P<0.05。各欄每個(gè)腫瘤4一6個(gè)視野計(jì)數(shù)的6個(gè)不同腫瘤的平均值；條桿，±SE。圖15示出使用BAY43-9006抑制B-Raf活性可抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育。圖中示出了BAY43-9006處理對UACC903(A)和1205Lu(B)腫瘤發(fā)育的作用。將UACC903禾Q1205Lu細(xì)胞注射進(jìn)裸鼠中，使腫瘤發(fā)育至第6天，此時(shí)每2天經(jīng)腹膜內(nèi)注射溶解于DMSO中的BAY43-9006(箭頭所指)。對照條件是僅用DMSO處理。Raf激酶抑制劑BAY43-9006在》50mg/kg濃度降低含有突變體V599EB-Raf蛋白的黑素瘤細(xì)胞的致瘤潛力。C:在用BAY43-9006處理后的那些細(xì)胞中觀察到磷酸化(活性)ERK的量降低，而用載體處理的則否。對用50mg/kgBAY43-9006(于DMSO中)或者只用DMSO載體處理的UACC903腫瘤切片中pERK陽性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行免疫組織化學(xué)比較。在載體對照和BAY43-9006處理的細(xì)胞之間檢測到3倍的差異(D)。*.P<0.05。各欄每個(gè)腫瘤4一6個(gè)視野計(jì)數(shù)的6個(gè)不同腫瘤的平均值；條桿，±SE。圖16示出在黑素瘤腫瘤中經(jīng)藥理學(xué)或者siRNA介導(dǎo)的突變體V599EB-Raf抑制后，黑素瘤腫瘤發(fā)育受到抑制的機(jī)制。圖中示出了暴露于BAY43-9006或者載體(DMSO)的時(shí)空匹配的腫瘤的血管發(fā)生(A)、凋亡(B)和增殖率(C)的比較。比較平行發(fā)育的大小和時(shí)間匹配的腫瘤，以鑒別B-Raf抑制對腫瘤發(fā)育的作用。在用BAY43-9006對UACC903腫瘤進(jìn)行處理后，首先觀察到血管發(fā)育方面的差異是顯著差異(*，P<0.05)，隨后觀察到增加的凋亡(*，PO.05)和降低的細(xì)胞增殖(*;P<0.05)。各欄兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)4一6個(gè)視野的6個(gè)腫瘤被分析；條桿，±SE。圖17示出siRNA和藥理學(xué)抑制V599EB-Raf降低黑素瘤細(xì)胞分泌VEGF。VEGF分泌是在用B-Raf或者VEGFsiRNA(A)核轉(zhuǎn)染后或者用增加濃度的BAY43-9006(B)處理后，通過ELISA試驗(yàn)從在培養(yǎng)基中生長的UACC903或者1205Lu細(xì)胞中測定。C-Raf和混雜的siRNA作為對照。條桿±SD。圖中示出了降低的VEGF表達(dá)對UACC903(C)和1205Lu(D)腫瘤發(fā)育的作用。以2天間隔示出腫瘤大小直至第17.5天。VEGF表達(dá)降低以在V599EB-Raf表達(dá)降低后出現(xiàn)的方式抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育。各點(diǎn)6個(gè)不同腫瘤的平均值；條桿，±SE。圖18示出導(dǎo)致在黑素瘤中優(yōu)先激活的Akt3區(qū)域。激活以磷酸化的水平測定，較黑的條帶表示較高的活性。較靠下的條帶表示內(nèi)源Akt活性。將Akt3的結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)換為Akt2的結(jié)構(gòu)域，將含有這些嵌合構(gòu)建體的構(gòu)建體核轉(zhuǎn)染進(jìn)黑素瘤細(xì)胞系WM35中。肉豆蔻?；腁kt3禾卩Akt2作為陽性對照。無活性的Akt3(T305A/S472A)和Akt2(T309A/S474A)作為陰性對照。野生型Akt3的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致活性增加，而野生型Akt2不導(dǎo)致活性增加。其中來自Akt3的普列克底物蛋白同源性(PH)結(jié)構(gòu)域(第1—110位氨基酸)被轉(zhuǎn)換為來自Akt2的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體被用于鑒別導(dǎo)致在黑素瘤細(xì)胞中激活的Akt3的區(qū)域。注意只有含有Akt3的催化和調(diào)節(jié)(C/R)結(jié)構(gòu)域(第111—497位氨基酸)的構(gòu)建體才導(dǎo)致激活。這樣示出了第Hl—497位氨基酸區(qū)域?qū)τ谌撕谒亓鲋蠥kt3的激活是關(guān)鍵的區(qū)域。這是特異性防止黑素瘤中Akt3激活的治療性靶向關(guān)鍵的部位。方法通過轉(zhuǎn)換普列克底物蛋白同源性(PH)結(jié)構(gòu)域(第1一110位氨基酸)和催化結(jié)構(gòu)域(對于Akt3為第111—479位氨基酸，對于Akt2為第111—481位氨基酸)而制備HA標(biāo)記的野生型構(gòu)建體和嵌合構(gòu)建體PH畫Akt3-C/R-Akt2及PH-Akt2-C/R-Akt3。使用AmaxaNHEM-NEO核轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建體核轉(zhuǎn)染進(jìn)WM35黑素瘤細(xì)胞系中，48小時(shí)后，通過Western印跡經(jīng)Akt的ser-473的抗體探査進(jìn)行分析。優(yōu)選的實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明部分涉及如下發(fā)現(xiàn)Akt3是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并且在黑素瘤存活中起作用，由此使得黑素瘤腫瘤細(xì)胞對凋亡有抗性。使用了一種反映Akt在黑素瘤腫瘤生成中的重要性的黑素瘤模型鑒別Akt3是在黑素瘤腫瘤生成期間失調(diào)的主要同種型。如本文所證實(shí)的，Akt3而非Aktl或者Akt2的選擇性敲弱降低總磷酸化Akt的水平，并且降低黑素瘤細(xì)胞的致瘤潛力。因此，Akt3提供了黑素瘤癌的治療靶位。本發(fā)明還部分涉及如下發(fā)現(xiàn)V599EB-Raf在黑素瘤生長和增殖中起作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)B-Raf表達(dá)的抑制或者降低可以降低腫瘤細(xì)胞增殖和新血管形成(血管發(fā)生)。應(yīng)注意由于錯(cuò)誤的序列數(shù)據(jù)，在B-Raf中纈氨酸(V)被取代為谷氨酸(E)實(shí)際上相應(yīng)于NCBI基因庫登記號(hào)NT_007914所示的正確版本中的密碼子600和第1799位核苷酸(非第1796位)(Kumaretal.，ClinicalCancerResearch，9:3362-3368(2003))。然而，在本申請中，由于歷史和熟知的原因，我們還是使用了不正確的核苷酸和密碼子編號(hào)。本發(fā)明人提出了治療腫瘤細(xì)胞的組合治療方法，包括誘導(dǎo)凋亡和降低細(xì)胞增殖和血管發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡是通過降低Akt3活性和細(xì)胞增殖而誘導(dǎo)的，血管發(fā)生是通過降低V599EB-Raf活性而降低的。本發(fā)明人還提出了在腫瘤細(xì)胞中降低Akt3活性可降低腫瘤細(xì)胞尤其是黑素瘤細(xì)胞的凋亡閾值，使得可以應(yīng)用比常規(guī)治療劑量低得多的化療劑劑量。因此，患者得以接受更有效的治療及較少的毒性化療藥物的副作用。為了幫助理解本說明書和權(quán)利要求書，提供了如下定義。定義如本文所用，術(shù)語"siRNA"是指(i)雙鏈RNA寡核苷酸或者多核苷酸，即長度為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個(gè)堿基對，并且能干擾Akt3多肽或者Akt3多肽的變體的表達(dá)和活性，其中siRNA的一個(gè)單鏈包含編碼Akt3多肽、其變體的RNA多核苷酸序列的一部分或者其互補(bǔ)序列；(ii)單鏈寡核苷酸或多核苷酸，其長度為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個(gè)核苷酸，并且能干擾靶Akt3多肽或者Akt3多肽的變體的表達(dá)和/或活性，或者與互補(bǔ)序列退火而產(chǎn)生能干擾靶多肽表達(dá)的dsRNA，其中這種單鏈寡核苷酸包含編碼PTP-1B多肽、其變體的RNA多核苷酸序列的一部分或者其互補(bǔ)序列；或者(iii)上述(i)或者(ii)任一的寡核苷酸或者多核苷酸，其中這種寡核苷酸或者多核苷酸中具有l(wèi)、2、3或者4個(gè)核酸改變或者取代。本文所用術(shù)語"核酸"或者"多核苷酸"是指含有嘌呤和嘧啶的任何長度的聚合物，可以是聚核糖核苷酸或者聚脫氧核糖核苷酸或者混合的聚核糖-聚脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈和雙鏈的分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，以及通過堿基與氨基酸主鏈的綴合形成的"蛋白質(zhì)核酸(PNA)"。這還包括含有修飾的堿基的核酸。"基因"是指編碼多肽的核苷酸的裝配，包括cDNA和基因組DNA核酸。"載體"是指將核酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中的任何工具。載體可以是一種復(fù)制子，該復(fù)制子可附著另一個(gè)DNA節(jié)段以復(fù)制該附著的節(jié)段的復(fù)制子。"復(fù)制子"是在體內(nèi)具有自發(fā)DNA復(fù)制單位功能的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)，即能在其自身控制下復(fù)制。術(shù)語"載體"包括將核酸于體外、離體(exvivo)或者體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞中的病毒性和非病毒性工具。病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、Epstein-Barr病毒和腺病毒載體。非病毒載體包括但不限于質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電的脂質(zhì)(cytofectins)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物及雙聚合物。除了核酸之外，載體也可以含有一或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域和/或用于選擇、測定和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移至哪些組織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間等等)的選擇標(biāo)記。"盒"是指可以插入載體的特異性限制位點(diǎn)中的DNA節(jié)段。該DNA節(jié)段編碼感興趣的多肽，所述盒和限制位點(diǎn)設(shè)計(jì)為保證所述盒插入正確的讀框中以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。當(dāng)外源或異源的DNA被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部時(shí)，則該細(xì)胞被這種DNA"轉(zhuǎn)染"。當(dāng)轉(zhuǎn)染的DNA使得表型改變時(shí)，則該細(xì)胞被外源或異源DNA"轉(zhuǎn)化"。轉(zhuǎn)化DNA可以整合(共價(jià)連接)進(jìn)染色體DNA中，組成細(xì)胞的基因組。"核酸分子"是指單鏈形式或者雙鏈螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或者胞苷；"RNA分子")或者脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或者脫氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式或者其任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯。雙鏈的DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋形式是可能的。術(shù)語核酸分子、特別是DNA或者RNA分子，只是指該分子的初級和二級結(jié)構(gòu)，不限制其于任何特定的三級形式。因此，這一術(shù)語包括在線性或者環(huán)形DNA分子(例如限制片段)、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在論述特定的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，序列是根據(jù)慣例以沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即具有與mRNA同源的序列的鏈)以5'至3'方向描述的。"重組DNA分子"是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。本發(fā)明涵蓋從黑素瘤中分離編碼本發(fā)明的人Akt3蛋白或多肽的基因，包括Akt3的全長或者天然發(fā)生的形式及其任何人Akt3特異性抗原片段。如本文所用，"Akt3"是指Akt3多肽，"akt3"是指編碼Akt3多肽的基因。術(shù)語"Akt3"是指Akt3核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)(或者多肽)、其多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同系物，它們具有(i)與如下登記號(hào)的核苷酸序列有相當(dāng)大的核苷酸序列同源性登記號(hào)AJ245709(HomosapiensmRNA，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt-3(Akt3基因)gi|5804885|emb|AJ245709.1|HSA245709[5804885]);登記號(hào)AF135794(HomosapiensAKT3蛋白激酶mRNA，completecdsgi|4574743|gb|AF135794.1|AF135794[4574743]);登記號(hào)NM—005465(Homosapiensv-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3(蛋白激酶B，力(AKT3)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNAgi|32307164|ref!NM—005465.3|[32307164]);登記號(hào)NM—181690(Homosapiensv-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3(蛋白激酶B，力(AKT3)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNAgi|32307162|refjNM—181690.1|[32307162]);登記號(hào)AY005799(Homosapiens蛋白激酶BYl(AKT3)mRNA，completecds，可變剪接的gi|15072339|gb|AY005799.1|[15072339]);登記號(hào)AF124141(Homosapiens蛋白激酶BymRNA，completecdsgi|4757578|gb|AF12414U|AF124141[4757578]);或者(ii)與如下登記號(hào)的編碼氨基酸序列相當(dāng)大的序列同源性登記號(hào)CAB53537(Akt-3蛋白[Homosapiens]gi|5804886|emb|CAB53537.1|[5804886]);登記號(hào)AAD24196(AKT3蛋白激酶[Homosapiens]gi|4574744|gb|AAD24196.1|AF135794—1[4574744]);登記號(hào)AAF91073(蛋白激酶By1[Homosapiens]gi|15072340|gb|AAF91073.1|[15072340]);登記號(hào)AAD29089(蛋白激酶By[Homosapiens]gi|4757579|gb|AAD29089.1|AF124141—1[4757579]);登記號(hào)NP—005456(v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3同種型l;蛋白激酶By，RAC-y絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt-3[Homosapiens]gi|488549|ref]NP_005456.1|[4885549]);登記號(hào)NP一859029(v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3同種型2;蛋白激酵By;RAC-y絲氨酸Z蘇氨酸蛋白激酶；絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt-3[Homosapiens]gi|32307163|ref|NP—859029.1|[32307163])。術(shù)語"B-Raf"是指B-Raf核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)(或者多肽)、其多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同系物，它們具有(i)與在Genbank(NM一004333)中發(fā)現(xiàn)的B-Raf的核苷酸序列Homosapiensv-mf鼠肉瘤病毒致癌基因同系物B1(BRAF)，mRNA，gil33188458|reflNM_00433.2|[33188458]相當(dāng)大的核苷酸序列同源性。B-Raf的相關(guān)蛋白質(zhì)序列是GenBank登記號(hào)P15056。在GenBank中發(fā)現(xiàn)的一種B-Raf是M95712HomosapiensB-Raf蛋白(BRAF)mRNA，completecdsgi|41387219|gb|M95712.2|HUMBRAF[41387219]。"對照樣本"是指健康的無癌癥動(dòng)物的生物學(xué)材料樣本。希望的是，對照樣本中Akt3或者B-Raf的水平或者編碼相應(yīng)基因拷貝數(shù)是同物種正常的無癌癥對象的一般群體的典型水平或拷貝數(shù)。這種樣本可以從用于本發(fā)明方法中的動(dòng)物中收集，或者可以是為其它原因而獲得但適于本發(fā)明方法使用的正常的無癌癥動(dòng)物的任何生物學(xué)材料。對照也可以得自患有或者懷疑患有癌癥的動(dòng)物的正常組織。對照樣本也可以是預(yù)先基于正常無癌癥對象的測量值而確定的給定水平的Akt3?；蛘?，生物學(xué)對照樣本可以是得自不同個(gè)體的樣本或者是基于得自群體的基線數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值。另外，對照樣本可以由特定年齡、性別、種族或者其它種群統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)而限定。在一些情況中，對照是特定的測定內(nèi)含的。一種內(nèi)含對照的例子是其中當(dāng)存在比正常無癌癥對象典型水平高的水平時(shí)，檢測方法只可檢測Akt3或者相應(yīng)基因拷貝數(shù)。基因的典型對照水平是每個(gè)細(xì)胞兩個(gè)拷貝。另一個(gè)實(shí)例是在免疫組織化學(xué)分析背景下，其中分析的對照水平是已知的。這種對照的其它實(shí)例屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范疇內(nèi)。在對照樣本中"期望的"Akt3或B-Raf多肽或者多核苷酸的水平是典型的無癌癥樣本的代表性水平，從這個(gè)水平可以辨別Akt3多肽或多核苷酸的升高的或診斷性的存在。優(yōu)選地，"期望的"水平受到哺乳動(dòng)物的年齡、性別、病史等因素以及測試的特定生物學(xué)對象的影響。術(shù)語"腫瘤細(xì)胞"是指對象中構(gòu)成腫瘤成分的細(xì)胞，或者經(jīng)確定趨于成為腫瘤成分的細(xì)胞，即是在對象癌前病變成分的細(xì)胞。"cDNA"是指通過RNA依賴性DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)的作用從RNA模板產(chǎn)生的互補(bǔ)或者拷貝DNA。因此，"cDNA克隆"是指在克隆載體中攜帶的或者PCR擴(kuò)增的與感興趣RNA分子互補(bǔ)的雙鏈DNA序列。這個(gè)術(shù)語包括從中除去了間插序列的基因。"克隆載體"是指能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)?；蚴删wDNA或者其它DNA序列?？寺≥d體的特征在于一或多個(gè)核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)這類DNA序列可以以預(yù)定的方式被切割而不喪失DNA的基本生物學(xué)功能，其可以含有適用于鑒別轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。"表達(dá)載體"是指與克隆載體相似但是能在轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主之后表達(dá)克隆進(jìn)其中的核酸序列的運(yùn)載體或載體。當(dāng)核酸序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA序列時(shí)，則該序列被"表達(dá)"。在大多數(shù)情況中，這種轉(zhuǎn)錄物被翻譯產(chǎn)生氨基酸序列?？寺〉幕蛲ǔＶ糜诒磉_(dá)控制序列的控制下(即與表達(dá)控制序列可操縱地連接)。"表達(dá)控制序列"或者"調(diào)節(jié)序列"是指當(dāng)與結(jié)構(gòu)基因可操縱地連接時(shí)控制或調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的核苷酸序列。這些包括例如lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、噬菌體X的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域，fd外殼蛋白的控制區(qū)及已知在原核或真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的其它序列。表達(dá)控制序列根據(jù)載體是否被設(shè)計(jì)為在原核或者真核宿主中表達(dá)可操縱地連接的基因而變化，并且含有轉(zhuǎn)錄元件如增強(qiáng)子元件、終止序列、組織特異性元件或者翻譯起始和終止位點(diǎn)。"可操縱地連接"是指啟動(dòng)子控制基因表達(dá)的起始。如果在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)啟動(dòng)子決定一最接近的DNA序列轉(zhuǎn)錄為一或多個(gè)物種的RNA，則啟動(dòng)子與該最接近的DNA序列是可操縱地連接的。如果啟動(dòng)子能起始一DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與該DNA序列是可操縱地連接的。"宿主"是指真核細(xì)胞，該術(shù)語包括是可復(fù)制的表達(dá)載體受體的生物體或細(xì)胞。通過本領(lǐng)域己知的任何方法包括本文描述的那些方法將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中稱作"轉(zhuǎn)化"。其中已經(jīng)導(dǎo)入上述核酸的細(xì)胞也包括這種細(xì)胞的子代。稱作"分離的"核酸是指從其來源(例如存在于細(xì)胞或者核酸混合物如文庫中)的基因組DNA或者細(xì)胞RNA的核酸中分離的并且可能已經(jīng)被進(jìn)一步加工的核酸。本文所用術(shù)語"分離的"是指不含有至少60%、優(yōu)選至少75%、最優(yōu)選至少90%的天然伴隨的其它成分的核酸或者氨基酸序列。"分離的"核酸(多核苷酸)包括通過本文所述方法、類似的方法或者其它合適方法獲得的核酸，包括實(shí)質(zhì)上純的核酸、通過化學(xué)合成產(chǎn)生的核酸、通過生物學(xué)和化學(xué)方法組合產(chǎn)生的核酸、及分離的重組核酸。在本文稱作"重組"的核酸是通過重組DNA方法學(xué)產(chǎn)生的核酸，包括由基于人工復(fù)制的方法、如聚合酶鏈反應(yīng)(PAL2)或者使用限制酶克隆進(jìn)載體中而產(chǎn)生的那些核酸。"重組"核酸也包括那些得自重組事件的核酸，所述重組事件是通過細(xì)胞的天然機(jī)制發(fā)生的，但是被選擇以便在將設(shè)計(jì)的核酸導(dǎo)入細(xì)胞之后可以產(chǎn)生希望的重組事件。編碼具有一定功能的多肽的分離的核酸的部分可以通過例如Jasin，M.等的美國專利No.4，952，501所述方法鑒別和分離。如本文所用，術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"是同義的。"肽"是指多肽的片段或者部分，優(yōu)選具有完整多肽序列的至少一種功能活性(例如蛋白酶解、粘附、融合，抗原性或者細(xì)胞內(nèi)活性)的片段或部分。術(shù)語"患者"或"對象(subject)"可互換使用，是指哺乳動(dòng)物如人和非人靈長類動(dòng)物，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如兔，大鼠和小鼠，及其它動(dòng)物。本文所用術(shù)語"生物學(xué)樣本"是指含有Akt3和/或B-Raf核酸或多肽的生物學(xué)組織或液體的樣本，例如黑素瘤癌癥蛋白、多核苷酸或轉(zhuǎn)錄物的樣本。這種樣本包括但不限于分離自人體的組織。生物學(xué)樣本也包括組織如活檢組織或尸檢組織樣本的切片、進(jìn)行組織學(xué)分析的冷凍切片、血液、血漿、血清、唾液、糞便、淚液、粘液、毛發(fā)、皮膚，等等。生物學(xué)樣本還包括外植體和得自患者組織的原始和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。生物學(xué)樣本典型地得自真核生物，優(yōu)選真核生物如真菌、植物、昆蟲、原生動(dòng)物、鳥類、魚類、爬行動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或者兔，最優(yōu)選靈長類動(dòng)物如黑猩猩或者人。"癌癥"或者"惡性腫瘤"是同義術(shù)語，是指特征在于細(xì)胞不受控制的異常增殖、病變細(xì)胞的局部傳播或者通過血液和淋巴系統(tǒng)播散至機(jī)體其它部分(即轉(zhuǎn)移)的能力以及許多特征性結(jié)構(gòu)和/或分子學(xué)特征的任一種疾病。"癌癥"或者"惡性腫瘤"細(xì)胞是指具有特異性結(jié)構(gòu)性質(zhì)、缺少分化并且能浸潤和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。癌癥例如是皮膚癌，腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌(見DeVita，V.etal.(eds.)，2001，CancerPrinciplesandPracticeofOncology,6th.Ed.，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia,Pa.;這個(gè)參考文獻(xiàn)在本文以其全文并入?yún)⒖?。術(shù)語"凋亡"和"編程性細(xì)胞死亡(PCD)"是同義術(shù)語，描述了導(dǎo)致受控細(xì)胞自身破壞的分子和形態(tài)學(xué)過程(見例如KerrJ.F.R.etal.，1972，BrJCancer.26:239-257)。凋亡性細(xì)胞死亡可以由許多剌激誘導(dǎo)，如細(xì)胞表面受體的連接、饑餓、生長因子/存活因子耗竭、熱激、缺氧、DNA損傷、病毒感染和胞毒劑/化療劑。凋亡過程參與胚胎發(fā)生，分化、增殖/穩(wěn)態(tài)、缺陷的并因此有害的細(xì)胞的除去，特別是參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和功能。因此，凋亡程序的功能障礙或者失調(diào)牽涉許多病理狀況，如免疫缺陷、自身免疫疾病、神經(jīng)變性疾病和癌癥。凋亡的細(xì)胞可以通過立體形態(tài)學(xué)改變而識(shí)別細(xì)胞皺縮，變形及與相鄰細(xì)胞接觸松散。其染色質(zhì)濃縮，最終細(xì)胞斷裂成致密的膜包裹結(jié)構(gòu)，稱作"凋亡小體"，其含有胞質(zhì)溶膠、濃縮的染色質(zhì)和細(xì)胞器。凋亡小體由巨噬細(xì)胞吞噬，因此從組織中除去而不導(dǎo)致炎癥應(yīng)答。這與細(xì)胞死亡的壞死模式相反，在細(xì)胞壞死情況中，細(xì)胞受到大的損害，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性喪失，細(xì)胞膨脹并且被破壞。在壞死期間，細(xì)胞內(nèi)容物不受控制地釋入細(xì)胞環(huán)境中，導(dǎo)致周圍細(xì)胞損害及在相應(yīng)的組織中產(chǎn)生強(qiáng)烈炎癥應(yīng)答。見例如TomeiL.D.andCopeF.O.，eds.，1991，Apoptosis:TheMolecularBasisofCellDeath,Plainville，N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress;IsaacsJ.T.，1993，EnvironHealthPerspect.101(suppl5):27-33;所述文獻(xiàn)在此均以其全文并入?yún)⒖肌１绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知許多凋亡的測定方法(例如DNA片段化分析，放射性增殖分析，對處理的細(xì)胞的DNA階梯分析，4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的細(xì)胞測定的熒光顯微鏡鏡檢，等等)。"保守修飾的變體"是針對氨基酸和核酸序列而言。對于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同或者基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)所述核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，是指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并，有大量功能相同的核酸編碼任一給定的多肽。例如，密碼子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA禾QAGG均編碼氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密碼子限定的每個(gè)位置，該密碼子均可以被改變?yōu)樗鋈魏蜗鄳?yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。這種核酸變異是"沉默取代"或者"沉默變異"，其是保守修飾的變體的一種。除非特別指出，本文所述的編碼多肽的每個(gè)多核苷酸序列也描述了每種可能的沉默變體。因此，沉默取代是編碼氨基酸的每種核酸序列的一個(gè)暗含的特征。技術(shù)人員意識(shí)到核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG之外，其通常僅是甲硫氨酸的密碼子)均可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)修飾，產(chǎn)生功能相同的分子。在一些實(shí)施方案中，編碼酶的核苷酸序列優(yōu)選進(jìn)行優(yōu)化以在特定的宿主細(xì)胞(例如酵母、哺乳動(dòng)物、植物、真菌，等等)中表達(dá)，用于產(chǎn)生所述酶。對于氨基酸序列，技術(shù)人員意識(shí)到在所編碼的序列中改變、添加或者缺失一個(gè)氨基酸或者少部分氨基酸的核酸、肽、多肽或者蛋白質(zhì)序列中的各種取代、缺失或者添加是"保守修飾的變體"，其中所述改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸由化學(xué)相似的另一個(gè)氨基酸取代。本領(lǐng)域熟知提供功能相似的氮基酸的保守取代表。見例如Davisetal.，BasicMethodsinMolecularBiology"Appleton&Lange，Norwalk，Connecticut(1994)所述。這種保守修飾的變體不除外本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同系物及等位基因。如下8組各含有彼此保守取代的氨基酸l)丙氨酸(A)，甘氨酸(G);2沃冬氨酸(D)，谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y)，色氨酸(W);7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見例如Creighton，1984，Proteins)。文中關(guān)于兩或多個(gè)核酸或者多肽序列使用的術(shù)語"相同"或者"相同性百分比"是指使用下述默認(rèn)參數(shù)的BLAST或者BLAST2.0序列比較算法測定或者通過人工排列比較和觀察，兩或多個(gè)序列或者亞序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸殘基或者核苷酸是相同的(即在指定區(qū)域(例如黑素瘤相關(guān)的Akt3基因的序列)比較和比對比較窗或者指定區(qū)域的最大相應(yīng)性時(shí)，具有大約70%相同性，優(yōu)選75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或者更高的相同性)。這種序列然后被稱作是"實(shí)質(zhì)上相同的"。這種定義也指測試序列的互補(bǔ)序列。這種定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所描述，優(yōu)選的算法可考慮到缺口。優(yōu)選地，在長度為至少大約25個(gè)氨基酸或者核苷酸的區(qū)域、更優(yōu)選長度為大約50—100個(gè)氨基酸或者核苷酸的區(qū)域存在相同性。為了進(jìn)行序列比較，典型地將一個(gè)序列作為參考序列，將測試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，測試和參考序列均輸入計(jì)算機(jī)中，如果需要，指定亞序列坐標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定另外的參數(shù)。隨后序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測試序列與參考序列的相同性百分比。如本文所用術(shù)語"比較窗"包括參考選自20—600、常為大約50一200、更優(yōu)選大約100—150個(gè)連續(xù)位置數(shù)目的節(jié)段，其中在將一個(gè)序列與參考序列優(yōu)化排列后，可以與具有相同連續(xù)位置數(shù)目的參考序列比較。本領(lǐng)域熟知序列比對而進(jìn)行比較的方法。序列優(yōu)化排列的比較可例如通過Smith&Waterman的局部同源性算法(1991,Adv.Appi.Math.2:482)，通過Needleman&Wunsch的同源性比對算法(1970，J.Mol.Biol.48:443)，通過Pearson&Lipman的檢索相似性方法(1988，Proc.NatI.Acad.Sci.USA85:2444)，通過這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(GAP，BESTFIT,PASTA和TFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，Wis.)，或者通過人工比對和目測方法(見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubeletal.，eds.1995supplement)進(jìn)行。適于確定序列相同性百分比和序列相似性的算法的另一實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，分別由Altschuletal.，1977，Nuc.AcidsRes.25:3389-3402禾口Altschuletal.，1990，J.Mol.Biol.215:403-410描述。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國立生物技術(shù)信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。這個(gè)算法包括首先通過鑒別查詢序列中短字長W以鑒別高分值的序列對(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比較時(shí)，這些HSP匹配或者滿足一些陽性值的閾值T。T是指相鄰字分值閾值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschuletal.，如前)。這些最初的相鄰wordhit可作為種子以啟動(dòng)檢索來尋找含有它們的較長的HSP。這些wordhit沿著每個(gè)序列的兩端延伸直至可以增加累積比對分值。累積分值對于核苷酸序列使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎(jiǎng)分(rewardscore);總是>0)和N(匹配殘基的罰分(penaltyscore);總是O)計(jì)算。對于氨基酸序列，使用得分矩陣計(jì)算累積分值。當(dāng)出現(xiàn)如下情況時(shí)停止每端wordhit的延伸累積比對分值從其最大獲得數(shù)值降低了數(shù)量X;由于一或多個(gè)負(fù)得分殘基比對的累積導(dǎo)致累積分值為0或之下；或者達(dá)到每個(gè)序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)默認(rèn)的字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N:4及雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)的字長為3，期望值(E)為10，BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff&Henikoff，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比對(B)為50，期望值(E)為109M=5，N=-4，雙鏈比較。BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見例如Karlin&Altschul，1993，Pro"Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或者氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率指征。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小和概率小于大約0.2、優(yōu)選小于大約O.Ol、最優(yōu)選小于大約0.001，則認(rèn)為該核酸與參考序列是相似的。兩個(gè)核酸序列或者多肽是基本上相同的指征是由第一個(gè)核酸編碼的多肽與針對第二個(gè)核酸編碼的多肽的抗體免疫學(xué)交叉反應(yīng)，如下所述。因此，在例如兩個(gè)多肽僅是通過保守取代而有所不同的情況中，這兩個(gè)多肽典型地是基本上相同的。兩個(gè)核酸序列是基本上相同的另一個(gè)指征是這兩個(gè)分子或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下彼此雜交，如下所述。兩個(gè)核酸序列是基本上相同的另一個(gè)指征是可以使用相同的引物擴(kuò)增序列。短語"選擇性(或者特異性)雜交"是指當(dāng)所述序列存在于復(fù)合混合物中(例如總細(xì)胞或者文庫DNA或者RNA)時(shí)，一種分子僅與特定的核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下結(jié)合、形成雙鏈體或者雜交。短語"嚴(yán)格雜交條件"是指在這種條件下探針與典型地在核酸的復(fù)合混合物中的其靶亞序列雜交但與其它序列不雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的情況中而有所不同。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的指導(dǎo)見Tijssen，1993，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"inTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes所述。通常地，選擇的嚴(yán)格條件是比在指定離子強(qiáng)度、pH下特定序列的熱解鏈點(diǎn)(TM)低大約5—1(TC的條件。Tm是50%的與耙互補(bǔ)的探針與靶序列平衡雜交的溫度(在指定離子強(qiáng)度，pH和核酸濃度)(由于靶序列過量存在，因此在Tm下，50%的探針在平衡狀態(tài))。嚴(yán)格條件是其中鹽濃度低于大約1.0M鈉離子，典型為大約0.01—1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0—8.3，對于短探針(例如10—50個(gè)核苷酸)溫度為至少大約30°C，對于長探針(例如多于50個(gè)核苷酸)溫度為至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。對于選擇性或者特異性雜交，陽性信號(hào)為背景雜交的至少兩倍，任選10倍。舉例性嚴(yán)格雜交條件可以如下所示50%甲酰胺，5XSSC，和1%SDS，在42。C保溫，或者5XSSC,1%SDS，在65。C保溫，在0,2XSSC和0.1。/。SDS中在65。C洗滌。這類洗滌可以進(jìn)行5、15、30、60、120或者更多分鐘。對于PCR，大約36'C的溫度典型地是用于低嚴(yán)格性擴(kuò)增，當(dāng)然退火溫度根據(jù)引物長度可以在大約32—48。C之間變化。對于高嚴(yán)格性PCR擴(kuò)增，大約62r的溫度是典型的，當(dāng)然根據(jù)引物長度和特異性高嚴(yán)格退火溫度可在大約50卩一65i:之間變化。對于高和低嚴(yán)格性擴(kuò)增而言，典型的循環(huán)條件包括在90—95t:變性30秒一2分鐘，退火持續(xù)30秒一2分鐘，延伸是在大約72"C進(jìn)行l(wèi)一2分鐘。在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸如果其編碼的多肽是相同的則其也是基本上相同的。這種情況在例如當(dāng)核酸的拷貝數(shù)使用遺傳密碼許可的最大密碼子簡并時(shí)發(fā)生。在這種情況中，所述核酸典型在中等嚴(yán)格雜交條件下雜交。"中等嚴(yán)格雜交條件"例如包括在37"在40%甲酰胺，1MNaCl，P/。SDS緩沖液中雜交，及在45。C在1XSSC中洗滌。這類洗滌可以進(jìn)行5、15、30、60、120或更多分鐘。陽性雜交是背景的至少兩倍。技術(shù)人員易于意識(shí)到可以利用另外的雜交和洗滌條件以提供相似的嚴(yán)格條件。關(guān)于重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括J.Sambrooketal.，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N,Y;RB.Kaufmanetal.，(eds)，1995，HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton;M.J.McPherson(ed)，1991，DirectedMutagenesis:APracticalApproach,IRLPress,Oxford;J.Jones，1992，AminoAcidandPeptideSynthesis,OxfordSciencePublications,Oxford;B.M.AustenandO.M.R.Westwood,1991，ProteinTargetingandSecretion,IRLPress,Oxford;D.NGlover(ed)，1985,DNACloning,VolumesIandII;M丄Gait(ed)，1984，OligonucleotideSynthesis;B.D.HamesandS.J.Higgins(eds)，1984，NucleicAcidHybridization;WuandGrossman(eds)，MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.),Vol.154andVol.155;QuirkeandTaylor(eds)，1991，PCR-APracticalApproach;HamesandHiggins(eds)，1984，TranscriptionandTranslation;R.I.Freshney(ed)，1986，AnimalCellCulture;ImmobilizedCellsandEnzymes,1986，IRLPress;Perbal，1984，APracticalGuidetoMolecularCloning;J.H.MillerandM.P.Calos(eds)，1987，GeneTransferVectorsforMammalianCells,ColdSpringHarborLaboratoryPress;M丄Bishop(ed)，1998，GuidetoHumanGenomeComputing,2dEd.，AcademicPress，SanDiego，Calif.;L.F.PemskiandA.H.Pemski，1997，TheInternetandtheNewBiology:ToolsforGenomicandMolecularResearch，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C。本文所用術(shù)語"降低Akt3活性"是指Akt3活性降低大約25%至大約100%。本發(fā)明涵蓋了通過如下任何物質(zhì)抑制Akt3:(a)—種物質(zhì)，當(dāng)其被給予細(xì)胞時(shí)降低Akt3mRNA的水平或者Akt3蛋白的水平，或者(b)—種物質(zhì)，當(dāng)其被給予細(xì)胞時(shí)影響Akt3mRNA或者蛋白質(zhì)水平，通過PDK/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致Akt3mRNA水平或者細(xì)胞產(chǎn)生的Akt3蛋白質(zhì)的水平降低，或者(c)如通過磷酸化或者去磷酸化而降低Akt3活性的任何物質(zhì)。這個(gè)術(shù)語還包括降低除去Akt3活性產(chǎn)物的下游途徑的活性及降低提供Akt3的反應(yīng)物的上游途徑的活性的物質(zhì)。Akt3活性的降低或變化可通過任何已知方法測定，包括但不限于激酶分析、Western印跡中的磷酸化狀態(tài)、或者蛋白質(zhì)表達(dá)水平。本文所用術(shù)語"降低V599EB-Raf活性"是指B-Raf活性降低大約25%至大約100%。本發(fā)明涵蓋了通過如下任何物質(zhì)抑制B-Raf:(a)—種物質(zhì)，當(dāng)其被給予細(xì)胞時(shí)降低V599EB-RafmRNA的水平或者V599E蛋白的水平，或者(b)—種物質(zhì)，當(dāng)其被給予細(xì)胞時(shí)影響B(tài)-RafmRNA或者蛋白質(zhì)水平，通過MAPK或者ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致V599EB-RafmRNA水平或者細(xì)胞產(chǎn)生的V599E蛋白質(zhì)的水平降低，或者(c)如通過磷酸化或者去磷酸化而降低B-Raf活性的任何物質(zhì)。這個(gè)術(shù)語還包括降低除去V599EB-Raf活性產(chǎn)物的下游途徑的活性及降低提供V599EB-Raf的反應(yīng)物的上游途徑的活性的物質(zhì)。B-Raf活性的降低或變化可通過任何已知方法測定，包括但不限于激酶分析、Western印跡中的磷酸化狀態(tài)、或者蛋白質(zhì)表達(dá)水平。本文所用術(shù)語"治療黑素瘤"是指阻止、減輕、改善、停止、遏制、減緩或者逆轉(zhuǎn)腫瘤進(jìn)展，或者降低哺乳動(dòng)物中的腫瘤發(fā)育和增加凋亡率，或者在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。如本文所用，術(shù)語"血管發(fā)生"當(dāng)用于描述降低血管形成時(shí)，是指在一種物質(zhì)的存在下發(fā)生的新血管形成的量低于不存在外源加入的物質(zhì)時(shí)發(fā)生的血管形成的量。確定組織中血管形成的量的方法包括免疫組織化學(xué)方法為本領(lǐng)域所熟知，它們是通過量化CD-31抗原染色陽性的血管的數(shù)目或者腫瘤中由CD-31陽性血管占據(jù)的面積而確定。Akt3和/或B-Raf核酸的檢測在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用編碼衍生自黑素瘤細(xì)胞的Akt3或B-Raf多肽、包括全長Akt3或B-Raf蛋白或其任何衍生物、變體、同系物或者片段的核酸。這種核酸可用于多種應(yīng)用中，包括用于產(chǎn)生Akt3或B-Raf蛋白、用于診斷分析、用于治療性應(yīng)用、用于Akt3-特異性或B-Raf-特異性探針、用于分析Akt3或B-Raf結(jié)合和/或調(diào)節(jié)化合物、用于從其它物種或者小鼠中鑒別和減分離Akt3或B-Raf同系物，及其它應(yīng)用。A.通用重組DNA方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的多種應(yīng)用包括克隆、合成、維持、誘變及其它核酸序列的操作，它們可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。揭示本發(fā)明使用的常規(guī)方法的基礎(chǔ)文獻(xiàn)包括Sambrooketal.，MolecularCloning,aLaboratoryManual(2nEd.1989);Kriegler,1990，GeneTransferandExpression:aLaboratoryManual;及CurrentProtocolsinMo〗ecuarBiology,1995，(Ausubeletal.，eds.)。對于核酸，大小是以千堿基(kb)或者堿基對(bp)表示。這些是得自瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、核酸測序、或者公布的DNA序列中估計(jì)值。對于蛋白質(zhì)，大小是以千道爾頓(kDa)或者氨基酸殘基數(shù)目表示。蛋白質(zhì)大小是從凝膠電泳、蛋白質(zhì)測序、衍生的氨基酸序列，或者公布的蛋白質(zhì)序列中估算的。不可商購的寡核苷酸可以根據(jù)首先由Beaucage&Caruthers，1981，TetrahedronLetts.22:1859-1862描述的固相phosphoramiditetriester方法使用自動(dòng)合成儀化學(xué)合成，如VanDevanteretal.,1984，NucleicAcidsRes.12:6159-6168所述。寡核苷酸的純化通過天然丙烯酰胺凝膠電泳或者通過陰離子交換HPLC進(jìn)行，如Pearson&Reanier，1983，J.Chrom.255:137-149描述。克隆的基因和合成的寡核苷酸的序列可以使用例如Wallaceetal.，1981，Genel6:21-26所述的用于雙鏈模板測序的鏈終止方法核實(shí)。B.分離和檢測Akt3和/或B-Raf核苷酸序列在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用重組方法分離和克隆Akt3和/或B-Raf核酸。這些實(shí)施方案用于例如分離Akt3禾d/或B-Raf多核苷酸以進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，或者在變體、衍生物、表達(dá)盒或者衍生自Akt3禾口/或B-Raf的其它序列的產(chǎn)生期間，用于監(jiān)測Akt3和/或B-Raf基因表達(dá)以確定各種物種中的Akt3和域B-Raf序列，用于診斷患者，即檢測Akt3和/或B-Raf中的突變，或者用于基因分型和/或法醫(yī)應(yīng)用。與Akt3或B-Raf基因基本上相同的多態(tài)性變體、等位基因及種間同系物和核酸可以使用Akt3或B-Raf核酸探針和寡核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下篩選文庫而分離?；蛘?，通過用針對Akt3或B-Raf多肽制備的也識(shí)別并選擇性結(jié)合Akt3或B-Raf同系物的抗血清或純化的抗體免疫學(xué)檢測表達(dá)的同系物，表達(dá)文庫可被用于克隆Akt3或B-Raf蛋白、多態(tài)性變體、等位基因和種間同系物。為了產(chǎn)生Akt3cDNA文庫，應(yīng)該選擇富含Akt3RNA的來源。為了產(chǎn)生B-RafcDNA文庫，應(yīng)該選擇富含B-RafRNA的來源。然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA制成cDNA，連接進(jìn)重組載體中，并轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主中以進(jìn)行增殖、篩選和克隆。產(chǎn)生和篩選cDNA文庫的方法是本領(lǐng)域熟知的(見例如Gubler&Hoffman,1983，Gene25:263-269;Sambrooketal.，如前；Ausubeletal.，如前)。對于基因組文庫，從組織中提取DNA，通過機(jī)械剪切或者酶促消化產(chǎn)生大約12—20kb的片段。然后將片段通過梯度離心從不希望的大小中分離出，并構(gòu)建在噬菌體X載體中。這些載體和噬菌體在體外包裝。將重組噬菌體通過如Benton&Davis，1977，Science196:180-182所述的噬斑雜交分析。菌落雜交如Grunsteinetal.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72:3961-3965所述進(jìn)行。更遠(yuǎn)緣相關(guān)的Akt3或B-Raf同系物可以使用本領(lǐng)域熟知的任何方法鑒別，包括在中等嚴(yán)格條件下將Akt3探針或者B-Raf探針與基因組或cDNA文庫雜交，或者在低嚴(yán)格條件下使用針對Akt3或者B-Raf選擇的區(qū)域的探針，例如產(chǎn)生的針對C末端結(jié)構(gòu)域的特異性探針。同樣，遠(yuǎn)緣的同系物可以使用簡并引物組從核酸文庫中擴(kuò)增，所述引物是特別基于一段高度保守的氨基酸序列摻入編碼一給定的氨基酸序列的所有可能密碼子的引物。這類引物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可利用多種程序例如從互聯(lián)網(wǎng)上獲得的程序設(shè)計(jì)簡并引物。在某些實(shí)施方案中，使用基于雜交的方法檢測Akt3或B-Raf多核苷酸，以確定例如Akt3或B-RafRNA水平，或者檢測特定的DNA序列例如用于進(jìn)行診斷。例如，Akt3禾口/或B-Raf的基因表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)分析，例如mRNANorthern印跡，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，包括使用實(shí)時(shí)PCR程序定量PCR分析mRNA水平(例如逆轉(zhuǎn)錄酶-TAQMAN擴(kuò)增)，斑點(diǎn)印跡，原位雜交，RNase保護(hù)，探查DNA微芯片陣列等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用高密度寡核苷酸分析技術(shù)(例如基因芯片)以鑒別Akt3和/或B-Raf的直向同源物、等位基因、保守修飾的變體和多態(tài)性變體，或者監(jiān)測Akt3禾P/或B-RafmRNA的水平。在同系物與己知疾病例如黑素瘤相關(guān)的情況中，它們可與GeneChip一起用作診斷工具，以在生物學(xué)樣本中檢測黑素瘤，見例如Gunthandetal.，1998，AIDSRes.Hum.Retroviruses14:869-876;Kozaletal.，1996，Nat.Med,2:753-759;Matsonetal.,1995，Anal.Biochem.224:110-106;Lockhartetal.，1996，Nat.Biotechnol.14:1675-1680;Gingemsetal,，1998，GenomeRes.8:435-448;Haciaetal.，1998，NucleicAcidsRes.26:3865-3866所述。Akt3和/或B-Raf多核苷酸和多肽的檢測可包括所述多肽或多核苷酸的定量或定性檢測，可以包括與對照值的真實(shí)比較，或者可以進(jìn)行檢測以便檢測自身固有地表明Akt3禾B/或B-Raf增加的水平。在某些實(shí)施方案中，例如在診斷黑素瘤中，對Akt3和域B-Raf多核苷酸、多肽或者蛋白質(zhì)活性進(jìn)行量化。在這種實(shí)施方案中，增高的Akt3和/或B-Raf水平與正常對照水平之間的差異優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。典型地，Akt3和減B-Raf多肽或核酸的診斷存在即過表達(dá)或增加，代表所述生物學(xué)樣本中Akt3和/或B-Raf多肽或多核苷酸水平與非癌樣本中的水平相比增加至少大約1.5、2、3、5、IO或更多倍。Akt3和/或B-Raf的檢測可以在體外即在取自患者的生物學(xué)樣本的細(xì)胞中進(jìn)行或者在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，Akt3禾P/或B-Raf的水平增高分別用作Akt3和域B-Raf診斷標(biāo)記。如本文所用，"診斷存在"是指高于非癌樣本中Akt3或B-Raf水平的任何水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，在其中Akt3或B-Raf多肽或多核苷酸的正常水平(即非癌(無癌)樣本中的水平)檢測不到的條件下，對生物學(xué)樣本中的Akt3或B-Raf多肽或者多核苷酸進(jìn)行分析。因此，在這種分析中，生物學(xué)樣本中檢測到任何Akt3和/或B-Raf多肽或核酸均表示診斷存在或者水平增加。如下所述，可以使用檢測Akt3禾tl/或B-Raf的任何方法。Akt3和/或B-Raf多核苷酸水平可以通過檢測任何關(guān)連Akt3或B-RafDNA或RNA、包括Akt3基因組DNA、mRNA和cDNA而檢領(lǐng)iJ。Akt3或B-Raf多肽可以通過檢測Akt3和/或B-Raf多肽自身，或者通過檢測Akt3和/或B-Raf蛋白質(zhì)活性而進(jìn)行檢測。檢測可包括量化Akt3和/或B-Raf的水平(例如基因組DNA、cDNA、mRNA或者蛋白質(zhì)水平或者蛋白質(zhì)活性)，或者可以定性評估Akt3和減B-Raf水平或者其存在與否，特別是與對照水平進(jìn)行比較。可以使用檢測上述方面的任何方法。這些方法包括例如雜交、擴(kuò)增及其它分析方法。在某些實(shí)施方案中，檢測細(xì)胞中水平增加或者診斷存在的能力用作在體內(nèi)或者在體外檢測癌細(xì)胞的標(biāo)記，即監(jiān)測患者癌細(xì)胞的數(shù)目或者定位。典型地，本文檢測的Akt3多核苷酸或多肽與天然發(fā)生的Akt3基因在一段至少大約50、100、200或更多個(gè)核苷酸或者20、50、100或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域是至少大約70%相同的，優(yōu)選75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同性的或更高相同性的。這些多核苷酸或多肽可以代表功能性或非功能性形式的Akt3或其任何變體、衍生物或片段。l.拷貝數(shù)的檢測在一個(gè)例如診斷癌癥存在與否的實(shí)施方案中，確定拷貝數(shù)、即細(xì)胞中Akt3基因的數(shù)目。通常地，對于給定的G常染色體基因，動(dòng)物的每個(gè)基因均具有兩個(gè)拷貝。然而，拷貝數(shù)可以通過基因擴(kuò)增或者復(fù)制而增加，例如在癌細(xì)胞中，或者通過缺失而降低。確定特定基因拷貝數(shù)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括基于雜交和擴(kuò)增的測定。a)基于雜交的測定可以使用任何基于雜交的測定以檢測生物學(xué)樣本的細(xì)胞中Akt3基因的拷貝數(shù)。一種這樣的方法是Southern印跡。在Southern印跡中，典型地將基因組DNA片段化，經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)移至膜上，隨后與Akt3特異性探針雜交。為了確定拷貝數(shù)，將所述探針與靶區(qū)域的雜交信號(hào)與對照探針與正?；蚪MDNA(例如相同或相關(guān)細(xì)胞、組織、器官等的未擴(kuò)增部分)的雜交信號(hào)進(jìn)行比較，可以估計(jì)相對的Akt3拷貝數(shù)。Southern印跡方法學(xué)為本領(lǐng)域所熟知，在例如Ausubeletal.或者Sambrooketal.(如前述)中描述。確定樣本中Akt3基因拷貝數(shù)的另一種方法是原位雜交，例如熒光原位雜交或者FISH。原位雜交分析為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如Angerer，1987，Meth.Enzymol152:649)。通常地，原位雜交方法包括如下主要步驟(l)固定要分析的組織或者生物學(xué)結(jié)構(gòu)；(2)對所述生物學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)雜交處理以增加靶DNA的可及性及降低非特異性結(jié)合；(3)核酸混合物與生物學(xué)結(jié)構(gòu)或組織中的核酸雜交；(4)雜交后洗滌以除去在雜交中未結(jié)合的核酸片段；(5)檢測雜交的核酸片段。這類應(yīng)用中使用的探針典型地是標(biāo)記的，例如用放射性同位素或者熒光報(bào)道基因標(biāo)記。優(yōu)選的探針是足夠長的，例如長度為從大約50、100或200個(gè)核苷酸至大約1000或更多個(gè)核苷酸，以與靶核酸在嚴(yán)格條件下特異性雜交。本發(fā)明涉及"比較探針"方法，例如比較基因組雜交(CGH)，用于檢測Akt3基因擴(kuò)增。在比較基因組雜交方法中，"測試"核酸的集合用第一種標(biāo)記物標(biāo)記，而第二個(gè)集合(例如來自健康細(xì)胞或組織)用第二種標(biāo)記物標(biāo)記。核酸的雜交率通過第一個(gè)和第二個(gè)標(biāo)記物結(jié)合陣列中每個(gè)纖維的比率而確定。檢測由在測試集合中基因擴(kuò)增導(dǎo)致的來自兩個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)比率的差異，該比率提供了一種測定Akt3基因拷貝數(shù)的方法。適用于本發(fā)明的方法的雜交方案例如在Albertson，1984，EMBOJ.3:1227-1234;Pinkel，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:9138-9142;EPOPub.No.430，402;MethodsinMolecularBiology,Vol.33:InSituHybridizationProtocols,Choo，Ed.，1994，HumanaPress,Totowa，N.J.等文獻(xiàn)中描述。b)基于擴(kuò)增的測定在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于擴(kuò)增的測定檢測Akt3或者測定Akt3基因的拷貝數(shù)。在這類測定中，Akt3核酸序列在擴(kuò)增反應(yīng)中作為模板(例如聚合酶鏈反應(yīng)或者PCR)。在定量擴(kuò)增中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與原始樣本中模板的量成比例。與合適的對照相比提供了一種測定Akt3基因拷貝數(shù)的方法。定量擴(kuò)增的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。關(guān)于定量PCR的詳細(xì)方案例如由Innisetal.，1990，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,Inc.N.Y.所提供。Akt3的核酸序列足以使得技術(shù)人員可以常規(guī)選擇引物以擴(kuò)增該基因的任何部分。在一些實(shí)施方案中，使用基于TaqMan的測定量化Akt3多核苷酸。基于TaqMan的測定使用含有5'熒光染料和3'猝滅劑的產(chǎn)生熒光的寡核苷酸探針。所述探針與PCR產(chǎn)物雜交，但由于在3，末端的阻斷劑而不能自身延伸。當(dāng)PCR產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中被擴(kuò)增時(shí)，聚合酶例如AmpliTaq的5'核酸酶活性導(dǎo)致TaqMan探針被裂解。這種裂解分離了5'熒光染料和3'猝滅劑，從而導(dǎo)致作為擴(kuò)增的函數(shù)的熒光增加(見例如Perkin-Elmer提供的文獻(xiàn)，例如www.perkin-elmei-.com)。本發(fā)明涵蓋的其它合適的擴(kuò)增方法包括但不限于連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(見WuandWallace,1989，Genomics4:560，Landegrenetal.，1988，Science241:1077，andBarringeretal.，19卯，Gene89:117)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwohetal.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173)，自身持續(xù)序列復(fù)制(Guatellietal.，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:1874)，dotPCR和接頭銜接子PCR等等。2.Akt3和/或B-Raf表達(dá)的檢測a)基于直接雜交的測定使用核酸雜交技術(shù)檢測和/或量化Akt3禾n/或B-Raf基因轉(zhuǎn)錄物(從中產(chǎn)生的mRNA或者cDNA)水平的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知(見Sambrooketal.，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2DEd.，Vols1-3，ColdSpringHarborPress,NewYork)。例如，一種評價(jià)Akt3cDNA的存在與否或者數(shù)量的方法包括Northern印跡。簡而言之，在典型的實(shí)施方案中，從給定的生物學(xué)樣本中分離mRNA，進(jìn)行電泳以分離mRNA種類，并從凝膠中轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜中。然后將標(biāo)記的Akt3探針與該膜雜交以鑒別和/或量化mRNA。b)基于擴(kuò)增的測定在另一個(gè)實(shí)施方案中，Akt3禾B/或B-Raf轉(zhuǎn)錄物(例如Akt3mRNA)使用基于擴(kuò)增的方法檢測(例如RT-PCR)。RT-PCR方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見例如Ausubeletal.，如前)。優(yōu)選地，使用定量RT-PCR，從而使得可以將樣本中mRNA的水平與對照樣本或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較。3.Akt3和/或B-Raf多肽表達(dá)的檢測除了使用核酸雜交技術(shù)檢測Akt3和/或B-Raf基因和基因表達(dá)之夕卜，Akt3和/或B-Raf水平也可以通過檢測或量化多肽而檢測和/或量化。Akt3或B-Raf多肽通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法檢測和量化。這些方法包括分析生物化學(xué)方法例如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散層析等等，或者各種免疫學(xué)方法例如液體或者凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、免疫熒光測定、Western印跡等等。Akt3多肽的檢測如前所述。C.在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的表達(dá)在一些實(shí)施方案中，使用重組技術(shù)產(chǎn)生Akt3和/或B-Raf多肽。為了獲得克隆的基因或者核酸如編碼Akt3或B-Raf多肽的cDNA的高水平表達(dá)，將Akt3或B-Raf序列典型地亞克隆進(jìn)表達(dá)載體中，所述載體中含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子、及如果對于編碼蛋白質(zhì)的核酸則還含有翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。合適的細(xì)菌啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知，例如由Sambrook等和Aiisubel等描述。表達(dá)Akt3蛋白的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可例如在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌中獲得(Palvaetal.,1983,Gene22:229-235;Mosbachetal.，1983，Nature302:543-545)。這類表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可商購。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知，并且也可以商購。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞表達(dá)載體是一種腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、或者反轉(zhuǎn)錄病毒載體。對于治療性應(yīng)用，Akt3和/或B-Raf核酸用任何各種各樣的方法在體外、體內(nèi)或者離體導(dǎo)入細(xì)胞中，這些方法包括但不限于病毒載體感染、基于脂質(zhì)體的方法、biolistic粒子加速器(基因槍)和裸DNA注射。這些治療有益的核酸包括但不限于全長Akt3或B-Raf的編碼序列、Akt3或B-Raf片段、結(jié)構(gòu)域、衍生物或者變體的編碼序列、Akt3或B-Raf反義序列、Akt3或B-RafsiRNA序列、及Akt3或B-Raf核酶。典型地，這些序列與啟動(dòng)子可操縱地連接，但是在許多應(yīng)用中，被給予細(xì)胞的核酸其自身具有直接的治療效力，例如某些反義核酸，siRNA，或者核酶分子。用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動(dòng)子取決于特定的應(yīng)用。所述啟動(dòng)子任選地位于距異源轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與其在其天然狀態(tài)距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相同距離的位置。然而，如本領(lǐng)域所已知，可以對這個(gè)距離進(jìn)行一些改變而不喪失啟動(dòng)子功能。除了啟動(dòng)子之外，表達(dá)載體典型地還含有轉(zhuǎn)錄單位或者表達(dá)盒，其含有Akt3編碼核酸或者B-Raf編碼核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需要的所有額外元件。因此典型的表達(dá)盒含有與編碼Akt3或B-Raf多肽的核酸序列可操縱地連接的啟動(dòng)子、及轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化所需要的信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及翻譯終止子。編碼Akt3或B-Raf多肽的核酸序列可以與可裂解的信號(hào)肽序列連接，促進(jìn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌編碼的蛋白質(zhì)。如果基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因，則表達(dá)盒的額外元件可包括增強(qiáng)子及具有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。除了啟動(dòng)子序列之外，表達(dá)盒也應(yīng)含有結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效的終止。所述終止區(qū)可以得自與啟動(dòng)子序列相同的基因或者可以得自不同的基因。用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的特定表達(dá)載體不是特別關(guān)鍵的。可以使用用于在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的任何常規(guī)載體。有用的表達(dá)載體例如可由染色體、非染色體和合成DNA序列的節(jié)段組成。合適的載體包括SV40衍生物及已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌質(zhì)粒colEl，pCRI，pBR322，pMal-C2，pET，pGEX(Smithetal.，1988，Gene67:31-40)，pMB9及其衍生物，質(zhì)粒如RP4;噬菌體DNAS，例如噬菌體l的眾多衍生物，例如，NM989，及其它噬菌體DNA，例如MB和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA;酵母質(zhì)粒如2m質(zhì)?；蚱溲苌铮挥糜谡婧思?xì)胞中的載體，如用于昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，如已經(jīng)被修飾以采用噬菌體DNA或者其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；等等。例如，本發(fā)明使用的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動(dòng)子的載體，例如具有DHFR表達(dá)載體的任何表達(dá)載體，或者DHFR/氨甲喋呤共擴(kuò)增載體，如pED(Pstl，Sall，Sbal,Smal和EcoRI克隆位點(diǎn)，表達(dá)克隆的基因和DHFR的載體；見Kaufman,CurrentProtocolsinMolecularBiology,16.12(1991)?；蛘?，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸sulfoximine共擴(kuò)增載體，如pEE14(HindIII，Xbal，Smal，Sbal，EcoRI，和Bell克隆位點(diǎn)，其中所述載體表達(dá)谷氨酰胺合成酶和克隆的基因；Celltech)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用在埃博拉病毒(EBV)控制下指導(dǎo)附加型表達(dá)的載體，如pREP4(BamHl，Sfil，Xhol，Notl，Nhel，HindIII，Nhel，PvuII和Kpnl克隆位點(diǎn)，組成型Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)(RSV-LTR)啟動(dòng)子，潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)，pCEP4(BamHl，Sfil，Xhol，Notl，Nhel，HindIII，Nhel，PvuII和Kpnl克隆位點(diǎn)，組成型人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期基因，潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)，pMEP4(Kpnl，Pvul，Nhel，HindIII，Notl，Xhol，Sfil，BamHI克隆位點(diǎn)，誘導(dǎo)型金屬硫蛋白IIa基因啟動(dòng)子，潮霉素可選擇標(biāo)記:Invitrogen)，pREP8(BamHl，Xhol，Notl，HindIII，Nhel和KpnI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，組氨酸選擇標(biāo)記；Invitrogen)，pREP9(Kpnl，Nhel，HindIII，Notl，Xhol，Sfil和BamHI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)，和pEBVHis(RSV-LTR啟動(dòng)子，潮霉素選擇標(biāo)記，通過ProBond樹脂可純化的及通過腸激酶可切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本發(fā)明的可選擇的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括但不限于pRc/CMV(HindlH，BstXI，Notl，Sbal禾QApal克隆位點(diǎn)，G418選擇;Invitrogen)，pRc/RSV(HindIII，Spel，BstXI，Notl，Xbal克隆位點(diǎn)，G418選擇；Invitrogen)及其它載體。本發(fā)明涵蓋的痘苗病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(見Kaufman,1991，如前)包括但不限于pSCll(Smal克隆位點(diǎn)，TK-和beta,gal選擇)，pMJ601(SalI，Smal，Afll，Nari，BspMII，BamHI，Apal，Nhel，SacII，Kpnl和HindIII克隆位點(diǎn)；TK-和beta(p)-gal選擇)和pTKgptFlS(EcoRI，Pstl，Sall，Accl，HindII，Sbal，BamHII和Hpa克隆位點(diǎn)，TK或XPRT選擇)。表達(dá)載體中典型包括的元件還包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制子，編碼抗生素抗性使得可以選擇攜帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌的基因，及在質(zhì)粒的非必需區(qū)域中使得可以插入真核細(xì)胞序列的獨(dú)特限制位點(diǎn)。選擇的特定的抗生素抗性基因不是關(guān)鍵的，本領(lǐng)域已知的任何抗性基因均是合適的。如果需要，任選地選擇原核細(xì)胞序列，由此不干擾DNA在真核細(xì)胞中的復(fù)制。一旦鑒別并分離了特定的重組DNA分子，可以使用本領(lǐng)域己知的一些方法使其增殖。一旦確立合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，可以大量增殖和制備重組表達(dá)載體?？梢允褂玫谋磉_(dá)載體包括但不限于如下載體及其衍生物人或動(dòng)物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如X噬菌體)，及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，等等，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或者以希望的特殊方式修飾和加工所述基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞菌株。不同的宿主細(xì)胞具有翻譯和翻譯后加工和蛋白質(zhì)修飾的特征性和特異性機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或者宿主系統(tǒng)以保證表達(dá)的外源蛋白質(zhì)得到希望的修飾和加工。在酵母中表達(dá)可以產(chǎn)生生物學(xué)活性的產(chǎn)物。在真核細(xì)胞中表達(dá)可增加"天然"折疊的可能性。另外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可提供重建或者構(gòu)成Akt3和域B-Raf在黑素瘤中的活性的工具。另外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可不同程度影響加工反應(yīng)，如蛋白酶解。使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生表達(dá)大量Akt3或B-Raf蛋白的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母或者昆蟲細(xì)胞系，這些蛋白然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化(見例如Colleyetal.，1989，J.Biol.Chem.264:17619-17622;"GuidetoProteinPurification"inMethodsinEnzymology，Vol.182，1990(Deutscher，Ed.)。真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(見例如Morrison,1977，J.Bact.132:349-351;Clark-Curtiss&Curtiss，MethodsinEnzymology101:347-362，1983(Wuetal.，eds.)?？梢允褂萌魏问熘姆椒▽⑼庠春塑账嵝蛄袑?dǎo)入宿主細(xì)胞中。這些方法包括使用試劑如Superfect(Qiagen)，脂質(zhì)體，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，polybrene，原生質(zhì)體融合，電穿孔，顯微注射，質(zhì)粒載體，病毒載體，biolistic粒子加速器(基因槍)，或者將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或者其它外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的其它熟知方法(見例如Sambraoketal.，如前)。在表達(dá)載體被導(dǎo)入細(xì)胞中之后，在有利于Akt3和/或B-Raf多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使用下文標(biāo)明的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收所述多肽。培養(yǎng)原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域所熟知，并例如Ausubeletal.，Sambrooketal.，及Freshney，1993，CultureofAnimalCells,3.sup.rd.Ed.，AWiley-LissPublication所教導(dǎo)?？梢允褂萌魏问熘膶⑼庠春塑账嵝蛄袑?dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法將載體例如定向載體導(dǎo)入細(xì)胞中?？梢允褂萌魏问熘膶⑼庠春塑账嵝蛄袑?dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法。如前所述，本發(fā)明的核酸可以通過任何基因轉(zhuǎn)移機(jī)制導(dǎo)入細(xì)胞中，例如通過病毒介導(dǎo)的基因輸送，磷酸鈣介導(dǎo)的基因輸送，電穿孔，顯微注射或者蛋白質(zhì)脂質(zhì)體進(jìn)行。然后轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞或者組織類型通過標(biāo)準(zhǔn)方法注入(例如于藥物可接受的載體中)或者等位(homotopically)移植進(jìn)對象中。在對象中移植或者注入各種細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的。將核酸或者載體輸送至細(xì)胞可以通過各種機(jī)制進(jìn)行。例如，可以通過脂質(zhì)體進(jìn)行，使用可商購的脂質(zhì)體制品如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc,，Gaithersbuxg，Md.)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.固en，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.,Madison,Wis.)，以及根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的其它脂質(zhì)體。另外，本發(fā)明的核酸或者載體可以在體內(nèi)通過電穿孔輸送，這個(gè)技術(shù)可得自Genetronics，Inc.(SanDiego，Calif.)，以及利用SONOPORATION設(shè)備(marxPharmaceuticalCorp.,Tucson，Ariz.)進(jìn)行輸送。例如，載體輸送可通過病毒系統(tǒng)進(jìn)行，如可包裝重組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)(見例如62，63)。然后該重組反轉(zhuǎn)錄病毒可用于感染細(xì)胞并從而將核酸輸送至感染的細(xì)胞。將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的具體方法當(dāng)然不限于使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體。對于這個(gè)程序可利用的其它技術(shù)包括使用腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，慢病毒載體，假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。也可以使用物理學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，如脂質(zhì)體輸送和受體介導(dǎo)的及其它胞吞機(jī)制。本發(fā)明可以與任何這些或其它常用的基因轉(zhuǎn)移方法聯(lián)合應(yīng)用。通過降低細(xì)胞中Akt3活性水平在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在黑素瘤腫瘤細(xì)胞中通過將細(xì)胞與降低Akt3活性的物質(zhì)接觸而誘導(dǎo)凋亡的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子。siRNA多核苷酸是一種介導(dǎo)RNA干擾作用(一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制)的RNA核酸分子。siRNA多核苷酸優(yōu)選包含雙鏈的RNA(dsRNA)，但是不限于此，并可包括單鏈的RNA(見例如Martinezetal.Cell110:563-74(2002))。siRNA多核苷酸可包含其它天然發(fā)生的重組或合成的單鏈或雙鏈的核苷酸(核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸或者這兩者的組合)和/或本文提供的核苷酸類似物(例如寡核苷酸或者多核苷酸等等，典型地在5，至3'磷酸二酯鍵中)的聚合物。因此，應(yīng)意識(shí)到鑒于充分確定的互補(bǔ)核苷酸堿基配對的原理，本發(fā)明作為能指導(dǎo)本發(fā)明siRNA多核苷酸轉(zhuǎn)錄的DNA序列而舉例說明的某些序列也意在描述相應(yīng)的RNA序列及其互補(bǔ)序列。siRNA可以使用含有RNA聚合酶啟動(dòng)子例如U6啟動(dòng)子或者HIRNA聚合酶III啟動(dòng)子的模板DNA(基因組DNA，cDNA或者合成的DNA)轉(zhuǎn)錄，或者siRNA可以是合成產(chǎn)生的RNA分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA多核苷酸可具有平端，即雙鏈體的一個(gè)鏈中的每個(gè)核苷酸與相反鏈的核苷酸均完全互補(bǔ)(例如通過Watson-Crick堿基配對)。在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA多核苷酸的至少一個(gè)鏈具有在siRNA的一個(gè)鏈或者優(yōu)選兩個(gè)鏈的3'末端"突出"(即與相反鏈中互補(bǔ)堿基不配對)的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案中，siRNA多核苷酸雙鏈體的每個(gè)鏈在3'末端均具有兩個(gè)核苷酸突出，突出的這兩個(gè)核苷酸優(yōu)選是胸苷二核苷酸(TT)，但也可包括其它堿基，例如TC二核苷酸或者TG二核苷酸，或者其它二核苷酸。關(guān)于siRNA的3'末端的論述見例如WO01/75164所述。優(yōu)選的siRNA多核苷酸包含大約18—30個(gè)核苷酸堿基對，優(yōu)選大約18、19、20、21、22、23、24、25、26或者27個(gè)堿基對的雙鏈寡聚核苷酸，在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中優(yōu)選大約19、20、21、22或23個(gè)堿基對，或者大約27個(gè)堿基對，上述"大約"是指在某些實(shí)施方案中在一定條件下可產(chǎn)生能干擾選擇的多肽表達(dá)的功能性siRNA多核苷酸的裂解步驟可能不是絕對有效的。因此，例如"大約"18、19、20、21、22、23、24或者25個(gè)堿基對的siRNA多核苷酸可包括(不限于)由于在加工、生物合成或者人工合成中的可變性而導(dǎo)致在長度上有l(wèi)、2、3或4個(gè)堿基對不同(例如核苷酸插入或者缺失)的一或多個(gè)siRNA多核苷酸分子。本發(fā)明期望的siRNA多核苷酸也可包含這樣的多核苷酸序列，其與特定序列有l(wèi)、2、3或4個(gè)核苷酸不同(例如由于核苷酸取代，包括轉(zhuǎn)換和顛換所致)而呈現(xiàn)出可變性，所示差異根據(jù)分子的長度、位于雙鏈多核苷酸的有義還是反義鏈中而發(fā)生在特定siRNA多核苷酸序列的第l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19位的任何位置或者在siRNA多核苷酸序列的第20、21、22、23、24、25、26或者27位。核苷酸取代可僅見于雙鏈多核苷酸的一條鏈中，例如在反義鏈中，取代的核苷酸與其形成氫鍵堿基配對的互補(bǔ)核苷酸在相應(yīng)有義鏈中不需要取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，siRNA與特異的核苷酸序列同質(zhì)。如本文所述，優(yōu)選siRNA干擾本發(fā)明的Akt3多肽的表達(dá)。這些多核苷酸還可用作探針或引物。作為本發(fā)明的siRNA多核苷酸的多核苷酸在某些實(shí)施方案中可衍生自單鏈多核苷酸，其包含單鏈寡核苷酸片段(例如大約18—30個(gè)核苷酸，應(yīng)理解為包括18—30之間任一整數(shù)個(gè)核苷酸)及其反向互補(bǔ)序列，典型由間隔序列分隔開。根據(jù)某些這樣的實(shí)施方案，間隔區(qū)的裂解提供單鏈寡核苷酸及其反向互補(bǔ)序列，由此它們可退火形成(任選組合可導(dǎo)致在一或這兩條鏈的3'末端和/或5'末端添加或除去1、2、3或多個(gè)核苷酸的額外處理步驟)本發(fā)明的雙鏈siRNA多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)的長度是能使得在間隔區(qū)裂解(和任選地，可導(dǎo)致在一或這兩條鏈的3'末端和/或5'末端添加或除去1、2、3、4或多個(gè)核苷酸的隨后的處理步驟)之前片段與其反向互補(bǔ)序列退火并形成雙鏈結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾多核苷酸)的長度。因此所述間隔區(qū)序列可以是位于兩個(gè)當(dāng)退火為雙鏈核酸時(shí)包含siRNA多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸序列區(qū)域之間的本文提供的任何多核苷酸序列。優(yōu)選地，間隔區(qū)序列包含至少4個(gè)核苷酸，在某些實(shí)施方案中，間隔區(qū)可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21—25、26—30、31—40、41—50、51—70、71—90、91—110、111—150、151—200或更多個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了衍生自包含由間隔區(qū)分隔的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列的一單核苷酸鏈的siRNA多核苷酸(例如Brummelkampetal"2002Science296:550;Paddisonetal.，2002GenesDevelop.16:948;Pauletal.,Nat.Biotechnol.20:505-508(2002);Grabareketal"BioTechniques34:734-44(2003))。多核苷酸變體可含有一或多個(gè)取代、添加、缺失和/或插入，由此siRNA多核苷酸的活性基本上未被消除，如上所述。對siRNA活性的作用通?？扇绫疚乃龌蛘呤褂贸Ｒ?guī)方法確定。變體優(yōu)選與編碼天然Akt3的多核苷酸序列的一部分具有至少大約75%、78%、80%、85%、87%、88%或者89%相同性，更優(yōu)選具有至少大約90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性。相同性百分比可易于通過將所述多核苷酸序列與全長Akt3多核苷酸的相應(yīng)部分(如本領(lǐng)域己知及本文引用的那些)相比較而確定，這種確定使用任何方法，包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)算機(jī)程序如Align或者BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219:555-565，1991;HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919,1992)，這些程序可在NCBI網(wǎng)站獲得(見[online]Internet:<URL:http:〃www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)?？梢允褂媚J(rèn)參數(shù)。某些siRNA多核苷酸變體與天然PTP1B基因的一部分基本上同源。(例如通過熱變性)衍生自這類多核苷酸變體的單鏈核酸能在中等嚴(yán)格條件下與天然發(fā)生的編碼Akt3多肽的DNA或者RNA序列(或其互補(bǔ)序列)雜交。在中等嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸可具有包括與特定多核苷酸互補(bǔ)的至少IO個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種序列(或其互補(bǔ)序列)是希望被干擾表達(dá)的Akt多肽所特有的，在某些其它實(shí)施方案中，所述序列(或其互補(bǔ)序列)可以是希望被干擾表達(dá)的Akt3和一或多種Akt同種型共有的。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種序列(或其互補(bǔ)序列)是希望被干擾表達(dá)的B-Raf多肽特有的，在某些其它實(shí)施方案中，所述序列(或其互補(bǔ)序列)可以是希望被干擾表達(dá)的B-Raf和一或多種Raf同種型共有的。合適的中等嚴(yán)格條件包括例如在5XSSC，0.5%SDS，1.0mMEDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在50—7(TC、5XSSC中雜交1一16小時(shí)(例如過夜)；隨后在22—65'C用一或多種含有0.05-0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC每種洗滌20—40分鐘，洗滌一或兩次(washingonceortwiceat22-65°Cfor20-40minuteswithoneormoreeachof2x，0.5xand0.2xSSCcontaining0.05-0.1%SDS)。對于額外的嚴(yán)格性，條件可包括在50—6(TC在0.1XSSC和0.1。/。SDS中洗滌15—40分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，雜交條件嚴(yán)格性的變化可以通過改變用于預(yù)雜交、雜交和洗滌步驟的時(shí)間、溫度和/或溶液濃度而實(shí)現(xiàn)。合適的條件也可部分依賴于所用探針、印跡的先證核酸樣本的特定核苷酸序列。因此，當(dāng)鑒別了探針的希望的選擇性時(shí)，基于其與一或多個(gè)先證序列雜交而與某些其它先證序列不雜交的能力，可易于選擇合適的嚴(yán)格條件而不用進(jìn)行過度的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的序列特異性siRNA多核苷酸可以使用一或多種標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)。例如，為設(shè)計(jì)具有與編碼感興趣的多肽(例如Akt3及本文所述其它多肽)的序列相同的19個(gè)連續(xù)核苷酸的siRNA多核苷酸，所述多核苷酸序列的開放讀框被掃描以獲取具有如下一或多個(gè)特征的21個(gè)堿基的序列(1)A+T/G+C比率為大約l:l，但不高于2:1或者L2;(2)AA二核苷酸或者CA二核苷酸在5'末端；(3)內(nèi)部發(fā)夾環(huán)解鏈溫度低于55°C;(4)同源二聚體解鏈溫度低于37°C((3)和(4)所述的解鏈溫度計(jì)算可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)算機(jī)軟件確定)；(5)至少16個(gè)連續(xù)核苷酸的序列未被鑒別為在任何其它已知多核苷酸序列中存在(這種評估可使用技術(shù)人員可利用的計(jì)算機(jī)程序確定，例如使用BLAST檢索公共數(shù)據(jù)庫)?；蛘?，可以使用購自各個(gè)商家的計(jì)算機(jī)軟件(例如OligoEngine.TM.(Seattle,Wash.);Dharmacon,Inc,(Lafayette，Colo.);AmbionInc.(Austin,Tex.);QIAGEN，Inc.(Valencia,Calif.))設(shè)計(jì)及選擇siRNA多核苷酸序列。(也見于Elbashiretal.，Gene&Development15:188-200(2000);Elbashiretal.，Nature411:494-98(2001);[online]Internet:URL<http:〃www.mp-ibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/Tuschl-MIV2(3).sub,2002.pdf.)。然后可以使用本領(lǐng)域已知的和本文所述的方法測試siRNA多核苷酸干擾靶多肽表達(dá)的能力。確定siRNA多核苷酸的效力不僅包括確認(rèn)其干擾多肽表達(dá)的能力，還包括確認(rèn)siRNA多核苷酸是否表現(xiàn)不希望的毒性作用，例如細(xì)胞的凋亡，這種細(xì)胞死亡不是RNA干擾所希望的作用(例如干擾細(xì)胞中Akt3的表達(dá))。本領(lǐng)域技術(shù)人員也易于意識(shí)到由于遺傳密碼簡并的結(jié)果，本文所述的多肽可以由許多核苷酸序列編碼。即一個(gè)氨基酸可以由一些不同的密碼子之一編碼，本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于確定盡管一個(gè)特定核苷酸序列可與另一個(gè)序列不同(其可通過本文所述及本領(lǐng)域已知的比對方法確定)，但是所述序列可以編碼具有相同氨基酸序列的多肽。例如，多肽中的亮氨酸可以由6個(gè)不同的密碼子之一編碼(TTA，TTG，CTT，CTC，CTA禾卩CTG)，絲氛酸也如此(TCT，TCC，TCA，TCG，AGT和AGC)。其它氨基酸，如脯氨酸、丙氨酸和纈氨酸，可以由4個(gè)不同的密碼子任一個(gè)編碼(對于脯氨酸為CCT，CCC，CCA，CCG;對于丙氨酸為GCT，GCC，GCA，GCG;對于纈氨酸為GTT，GTC，GTA，GTG)。一些這樣的多核苷酸與任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。但是，本發(fā)明特別涵蓋了由于密碼子利用不同而不同的多核苷酸。多核苷酸，包括靶多核苷酸(例如能編碼感興趣的靶多肽的多核苷酸)，可以使用各種技術(shù)制備，這些技術(shù)可用于制備特別希望的siRNA多核苷酸及用于鑒別和選擇適合用于siRNA多核苷酸中的序列。例如，多核苷酸可以從合適類型的細(xì)胞或者組織中制備的cDNA中擴(kuò)增。這類多核苷酸可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。對于這種方法，可以基于本文提供的序列設(shè)計(jì)序列特異性引物，或者所述引物可以商購或者合成。擴(kuò)增的部分可用于使用熟知技術(shù)從合適的文庫(例如人黑素瘤cDNA)中分離全長基因或者其希望的一部分。在這類技術(shù)中，使用適于擴(kuò)增的一或多種多核苷酸探針或者引物篩選文庫(cDNA或基因組)。優(yōu)選地，根據(jù)大小選擇文庫以包括較大的分子。也可以優(yōu)選隨機(jī)產(chǎn)生的文庫以鑒別基因的5'和上游區(qū)域。優(yōu)選基因組文庫以獲得內(nèi)含子和延伸的5'序列。對于本發(fā)明涵蓋的siRNA多核苷酸的合適序列也可選自siRNA多核苷酸序列的文庫。對于雜交技術(shù)，可以使用熟知的技術(shù)對部分序列進(jìn)行標(biāo)記(例如通過切口平移或者用32P末端標(biāo)記)。然后可以通過將含有變性的細(xì)菌菌落(或者含有噬菌體噬斑的菌苔)的濾膜與標(biāo)記的探針雜交而篩選細(xì)菌或者噬菌體文庫(見例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,N.Y.，2001)。選擇雜交菌落或噬斑并擴(kuò)增，分離DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過例如使用所述來自部分序列的引物和來自載體的引物進(jìn)行PCR，對菌落進(jìn)行分析以確定額外的序列的量?？梢援a(chǎn)生限制性圖譜和部分序列以鑒別一或多個(gè)重疊克隆。全長cDNA分子可以通過使用熟知的技術(shù)連接合適的片段而產(chǎn)生?；蛘?，本領(lǐng)域已知許多從部分cDNA序列中獲得全長編碼序列的擴(kuò)增技術(shù)。在這些技術(shù)中，擴(kuò)增通常通過PCR進(jìn)行。一種這樣的技術(shù)稱作"cDNA末端的快速擴(kuò)增"或者RACE。這種技術(shù)包括使用內(nèi)部引物和外部引物，其與聚A區(qū)域或者載體序列雜交，以鑒別已知序列的5，和3'序列?？梢允褂萌魏蔚目缮藤彽脑噭┖羞M(jìn)行擴(kuò)增步驟。引物可以使用例如本領(lǐng)域熟知的軟件設(shè)計(jì)。引物(或者進(jìn)行本發(fā)明期望的其它用途的寡核苷酸，包括例如探針和反義寡核苷酸)優(yōu)選長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或者32個(gè)核苷酸，GC含量為至少40。/。并且在大約54—72X:與耙序列退火。擴(kuò)增的區(qū)域可以如上述測序，重疊序列裝配為連續(xù)序列。本發(fā)明一些實(shí)施方案中的某些寡核苷酸的長度為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33-35、35-40、41-45、46-50、56-60、61-70、71-80、81-90或者更多個(gè)核苷酸。本文描述的核苷酸序列可以通過使用熟知的重組DNA技術(shù)而與各種其它核苷酸序列結(jié)合。例如，多核苷酸可以克隆進(jìn)各種載體中，包括質(zhì)粒、噬菌粒，^噬菌體衍生物和粘粒。特別感興趣的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。通常地，合適的載體含有在至少一種生物體中起作用的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，便利的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，及一或多個(gè)選擇標(biāo)記(見例如WO01/96584;WO01/29058;美國專利No.6，326,193;U.S.2002/0007051)。其它元件取決于希望的用途，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見。例如，本發(fā)明提供了siRNA多核苷酸序列在制備重組核酸構(gòu)建體中的應(yīng)用，所述重組構(gòu)建體包括干擾希望的靶多肽如Akt3或B-Raf多肽在體內(nèi)表達(dá)的載體；本發(fā)明還提供了siRNA轉(zhuǎn)基因的或者"敲除"的動(dòng)物和細(xì)胞(例如其中一或多個(gè)希望的多肽(例如靶多肽)的表達(dá)被完全或者部分損害的細(xì)胞、細(xì)胞克隆、細(xì)胞系或譜系，或者生物體)的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的能干擾希望的多肽(例如靶多肽)表達(dá)的siRNA多核苷酸因此包括符合如下條件的任何siRNA多核苷酸，即當(dāng)其與本發(fā)明提供的對象或者生物學(xué)來源在足以在無siRNA多核苷酸存在時(shí)發(fā)生耙多肽表達(dá)的條件下接觸一定的時(shí)間時(shí)，導(dǎo)致可以檢測到靶多肽的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地降低(或者稱作表達(dá)"敲弱")。優(yōu)選地，使用本領(lǐng)域已知的及本發(fā)明提供的確定多肽表達(dá)的常規(guī)方法，相對于在沒有siRNA的情況中檢測到的多肽表達(dá)水平所述降低大于10%，更優(yōu)選大于20%，更優(yōu)選大于30%，更優(yōu)選大于40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或者98%。優(yōu)選地，siRNA在細(xì)胞中的存在不導(dǎo)致或者引起任何不希望的毒性作用，例如在凋亡不是希望的RNA干擾作用的細(xì)胞中所述細(xì)胞的凋亡或者死亡。本文揭示的Akt3siRNA的19mer序列例如是人Akt3(NM005465):Akt3duplex2:CUAUCUACAUUCCGGAAAG;Akt3duplex4:GAAUUUACAGCUCAGACUA;禾口Akt3duplex5:CAGCUCAGACUAUUACAAU。本文揭示的Akt3siRNA的25mer序列如下所示:引物名稱序列Akt3#|2有義CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAGAkt3#2反義CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAGAkt3斜有義GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUAAkt3#4反義UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUCAkt3#5有義AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAUAkt3#5反義AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU本文所示的B-RafsiRNA的舉例性25mer序列是針對人突變體B-Raf的序歹ij:5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'及針對人野生型B-Raf的序列:5，GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3，。本發(fā)明還涉及病毒介導(dǎo)的策略的應(yīng)用，其導(dǎo)致靶基因PTEN通過siRNA沉默。使用這個(gè)策略導(dǎo)致PTEN表達(dá)明顯降低，從而導(dǎo)致總的磷酸化Akt增加。這種病毒介導(dǎo)的策略可用于鑒別黑素瘤中Akt3失調(diào)的機(jī)制，以建立該生物學(xué)過程的模型或者提供對這種癌癥的治療方法。本發(fā)明還涉及包括或者編碼本發(fā)明的siRNA多核苷酸的載體和構(gòu)建體，特別涉及"重組核酸構(gòu)建體"，其包括可被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生上述本發(fā)明的Akt3多核苷酸特異性siRNA多核苷酸的任何核酸，如DNA多核苷酸節(jié)段；本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的載體和/或構(gòu)建體遺傳工程化的宿主細(xì)胞；本發(fā)明還涉及通過重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的siRNA多核苷酸、多肽和/或融合蛋白或其片段或變體。本文作為RNA多核苷酸揭示的siRNA序列可以使用熟知的方法如本文所述方法工程化以產(chǎn)生相應(yīng)的DNA序列。因此，例如DNA多核苷酸可以從本文所述的任何siRNA序列中產(chǎn)生，由此本發(fā)明的siRNA序列被認(rèn)為也提供相應(yīng)的DNA多核苷酸(及其互補(bǔ)序列)。這些DNA多核苷酸因此涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)，例如摻入本發(fā)明的重組核酸構(gòu)建體中，從中siRNA可以被轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'CUAUCUACAUUCCGGAAAG3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'GAAUUUACAGCUCAGACUA3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'CAGCUCAGACUAUUACAAU3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述si上;v二3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3'序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5'AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3，序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5，AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3，序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用任何熟知的方法將所述物質(zhì)與細(xì)胞接觸，以將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。這些包括脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體(nanoliposome)、含有神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、纟內(nèi)米顆粒(nanoparticulate)、磷硅酸f丐(calciumphosphor-silicate)纟內(nèi)米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒(nanocrystalineparticulate)、半導(dǎo)體納米顆粒、納米樹狀物(nanodendrimer)、病毒、磷酸鈣介導(dǎo)的核苷酸輸送、聚(D-精氨酸)、電穿孔和顯微注射。納米脂質(zhì)體、納米顆粒、納米樹狀物將物質(zhì)輸送至細(xì)胞中的應(yīng)用在圖5—11中表明，并進(jìn)一步在2004年4月26日申請的專利申請系列No.10/835,520中迸一步描述，在此并入?yún)⒖肌７戳x多核苷酸在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種反義多核苷酸。本發(fā)明特別涉及的實(shí)施方案涉及通過使用反義多核苷酸減量調(diào)節(jié)Akt3活性，所述反義多核苷酸是互補(bǔ)于并且優(yōu)選能與編碼mRNA核酸序列例如Akt3mRNA或者其亞序列特異性雜交的核酸。反義核苷酸與Akt3mRNA的結(jié)合降低Akt3或者B-RafmRNA的翻譯和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，反義多核苷酸可包含天然發(fā)生的核苷酸，或者從天然發(fā)生的亞單位或其密切相關(guān)的同系物中形成的合成形式的核苷酸。反義多核苷酸也可以具有改變的糖組分或者糖間鍵。這些例如是本領(lǐng)域熟知的硫代磷酸酯及其它含硫化合物。只要它們發(fā)揮有效雜交Akt3或B-RafmRNA的功能，所有這些類似物均包含在本發(fā)明中。這方面的綜述見例如JackCohen，Oligodeoxynucleotides，AntisenseInhibitorsofGeneExpression,CRCPress,1989;禾BSynthesis1:卜5(1988)所述。拮抗劑本發(fā)明還涉及一個(gè)實(shí)施方案，其中降低Akt3活性的物質(zhì)是一種反義多核苷酸。本發(fā)明還涉及作為Akt3拮抗劑的Akt3蛋白的變體。Akt3蛋白的變體可以通過誘變產(chǎn)生(例如定點(diǎn)誘變或者Akt3蛋白的截短)。通過例如競爭性結(jié)合包括Akt3蛋白的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)級聯(lián)的上游或者下游成員，Akt3蛋白的拮抗劑可以抑制天然發(fā)生的Akt3蛋白的一或多種活性。因此，特異性生物學(xué)作用可以通過用有限功能的變體處理而激發(fā)。本發(fā)明預(yù)期用具有一亞集合的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的變體處理對象與用天然發(fā)生的Akt3蛋白處理對象相比，在所述對象中具有較少的副作用。具有Akt3拮抗劑功能的Akt3蛋白的變體可以通過篩選組合的Akt3蛋白突變體(例如截短突變體)文庫的Akt3拮抗劑活性而鑒別。本發(fā)明預(yù)期Akt3變體的多樣化文庫是通過在核酸水平的組合誘變產(chǎn)生的，并且是由多樣化基因文庫編碼的。Akt3變體的多樣化文庫可以如下產(chǎn)生，例如將合成的寡核苷酸混合物經(jīng)酶促連接進(jìn)基因序列中，由此簡并的潛在Akt3序列集合可以表達(dá)為各個(gè)多肽，或者表達(dá)為含有Akt3序列的較大融合蛋白的集合(例如用于噬菌體展示)。有許多方法可用于從簡并的寡核苷酸序列中產(chǎn)生潛在的Akt3變體的文庫。簡并的基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)化DNA合成儀中進(jìn)行，然后合成的基因被連接進(jìn)合適的表達(dá)載體中。使用簡并的基因集合使得可以在一種混合物中提供編碼希望的潛在Akt3序列集合的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域所熟知。見例如Narang，1983.Tetrahedron39:3;Itakura，etal.，1984.A腿.Rev.Biochem.53:323;Itakura，etal.，1984.Science198:1056;Ike，etal.，1983.Nucl.AcidsRes.11:477。核酶在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種核酶。核酶可用于靶向及抑制Akt3的轉(zhuǎn)錄。核酶是一種RNA分子，其催化裂解其它RNA分子。已經(jīng)描述了不同性質(zhì)的核酶，包括I組核酶，錘頭狀核酶，發(fā)夾核酶，RNAaseP，及axhead核酶(核酶的性質(zhì)的綜述參見例如Cast細(xì)ttoetal.1994，Adv.InPharmacology25:289-317)。發(fā)夾核酶的一般特征在例如Hampeletal.，1990，Nucl.AcidsRes.，18:299-304;Hampeletal.，1990，歐洲專利出版物No.0360257;美國專利No.5，254，678中描述。制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟失口(見例如Wong-Staaletal.，WO94/26877;Ojwangetal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6340-6344;Yamadaetal.，1994，HumanGeneTherapy1:39-45;Leavittetal.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92:699-703;Leavittetal.，1994，HumanGeneTherapy5:1151-120;及Yamadaetal.，1994，Virology205:121-126)。Akt3多肽活性的抑制劑在另一個(gè)實(shí)施方案中，Akt3活性被Akt3多肽的抑制劑這種物質(zhì)降低。這個(gè)結(jié)果可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)，包括提供一種顯性陰性Akt3多肽，例如其自身無活性但與功能性Akt3存在于同一細(xì)胞中時(shí)可以降低或消除功能性Akt3的Akt3活性的一種Akt3形式。顯性陰性形式的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如Herskowitz，1987，Nature，329:219-22所述。另外，例如通過篩選抑制Akt3活性的能力，也可以使用失活的多肽變體(突變蛋白)。產(chǎn)生突變蛋白的方法為本領(lǐng)域所熟知(見例如美國專利No.5,486,463，5,422,260，5,116,943，4，752,585，4,518,504)。另外，可以篩選任何小分子例如任何肽、氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物，或者任何其它有機(jī)或無機(jī)分子結(jié)合或者抑制Akt3活性的能力。肽在另一個(gè)實(shí)施方案中，相應(yīng)于普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域或者Akt3的催化或者調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的連續(xù)氨基酸序列的肽這種物質(zhì)降低Akt3活性。不希望受這種理論的限制，所述肽預(yù)期作為假底物或者競爭性抑制劑起作用，從而抑制Akt3活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽作為Akt3催化或者調(diào)節(jié)(尾部)結(jié)構(gòu)域的假底物而起作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑起作用。本發(fā)明人還預(yù)期所述肽作為普列克底物蛋白Akt3同源性結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑起作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽作為Akt3調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑起作用。技術(shù)人員可易于設(shè)計(jì)和確定一種肽是否降低Akt3的活性。ObataTetal.JBiolChem.275(46):36108-15(2000)，NivMYetal.JBiolChem.279(2):1242-55.Epub2003(2004)，LuoYetal.Biochemistry.43(5):1254-63(2004)。例如，將細(xì)胞與肽在適于測定Akt3活性的條件下保溫。評估Akt3的活性并與合適對照物(例如在沒有所述肽或混雜的肽的情況下在相同條件下保溫的相同細(xì)胞的活性)比較，使用識(shí)別蘇氨酸305或者絲氨酸472的抗體進(jìn)行Western印跡分析進(jìn)行這種評估和比較。識(shí)別Akt3的抗體可購自許多公司，包括Stratagene(LaJolla，CA)和IGeneX，Inc.(PaloAlto)。或者，Akt3活性可以通過免疫沉淀Akt3并使用免疫沉淀物在體外激酶測定中進(jìn)行評估，其中Crosstide(Akt3的一種合成的月太底物，購自DiscoverRxCorporation,Fremont,CA)通過Akt3磷酸化而評估活性。與對照相比較高或者較低的磷酸化活性表明測試肽降低所述Akt3的活性。肽包含大約5—30個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選10—20個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的肽序列可以通過固相肽合成(例如BOC或FMOC)方法，通過液相合成方法，或者通過其它合適技術(shù)包括組合前述方法合成。已經(jīng)確立并廣泛使用的BOC和FMOC方法由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.88:2149(1963);Meienhofer，HormonalProteinsandPeptides，C.H.Li，Ed.，AcademicPress,1983，pp.48-267;及BaranyandMerrifield，inThePeptides,E.GrossandJ.Meienhofer,Eds.，AcademicPress,NewYork,1980，pp.3-285描述。固相肽合成方法在Merrifield，R.B.，Science,232:341(1986》Carpino，L.A.andHan，G.Y.，J.Org.Chem.，37:3404(1972);和Gauspohl，H.etal,，Synthesis,5:315(1992))中描述。這些參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)在此并入?yún)⒖?。小分子本發(fā)明還涉及一個(gè)實(shí)施方案，其中降低Akt3活性的物質(zhì)是一種小分子。小分子也可以用于調(diào)節(jié)例如所揭示的激酶、激酶受體、與激酶受體相互作用的分子及激酶受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的分子的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣產(chǎn)生這種類型的小分子、文庫及分離小分子調(diào)節(jié)物的方法。如本文所用，術(shù)語"小分子"優(yōu)選結(jié)合Akt3和域B-Raf并抑制其至少一種功能。調(diào)節(jié)物和結(jié)合化合物作為Akt3和/或B-Raf蛋白的調(diào)節(jié)物測試的化合物可以是任何小化合物，或者生物學(xué)實(shí)體，如蛋白質(zhì)、糖、核酸或者脂質(zhì)。典型地，測試化合物是小化學(xué)分子和肽?；旧先魏位衔镌诒景l(fā)明的分析試驗(yàn)中均可用作潛在的調(diào)節(jié)物或者結(jié)合化合物，盡管通常大多數(shù)化合物可以溶解在水或有機(jī)(尤其是基于DMSO的)溶液中。設(shè)計(jì)測定以通過自動(dòng)進(jìn)行分析步驟及將任何常規(guī)來源的化合物提供給測定來篩選大的化學(xué)文庫，典型地平行進(jìn)行試驗(yàn)(例如呈在自動(dòng)化測定中的微滴板上微滴定的格式)。應(yīng)意識(shí)到有許多化合物的供應(yīng)商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)，Aldrich(St.Louis，Mo.)，Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)，F(xiàn)lukaChemika-BiochemicaAnalytik'(Buchs，Switzerland)等等。本發(fā)明涉及高通量篩選方法，包括提供含有大量潛在治療性化合物(潛在的調(diào)節(jié)或結(jié)合化合物)的組合化學(xué)或肽文庫。然后以本文所述的一或多種測定篩選這種"組合化學(xué)文庫"，以鑒別具有希望的特有活性的那些文庫成員(特定化學(xué)種類或亞類)。由此鑒別的化合物可作為常規(guī)的"先導(dǎo)化合物"或者其自身即可用作潛在的或者實(shí)際的治療劑。組合化學(xué)文庫是通過化學(xué)合成或者生物學(xué)合成，通過組合許多化學(xué)"構(gòu)建模塊"如試劑而產(chǎn)生的不同化合物的集合。例如，線性組合化學(xué)文庫如多肽文庫是通過以給定化合物長度(即多肽化合物中的氨基酸數(shù))的每種可能方式組合一系列化學(xué)構(gòu)建模塊(氨基酸)形成的。通過這種組合混合化學(xué)構(gòu)建模塊可以合成數(shù)百萬個(gè)化合物。組合化學(xué)文庫的制備和篩選為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。這種組合化學(xué)文庫包括但不限于肽文庫(見例如美國專利No.5，010，175，F(xiàn)urka，1991，Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493禾口Houghtonetal.,1991，Nature354:84-88)。也可以使用產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的其它化學(xué)。這種化學(xué)包括但不限于肽(例如PCT出版物No.W091/19735)，編碼的肽(例如PCT出版物No.WO93/20242),隨機(jī)的生物寡聚體(例如PCT出版物No.WO92/00091),苯二氮卓類(benzodiazepines)(例如美國專利No.5,288，514)，diversomers如乙內(nèi)酰脲、苯二氮卓和二肽(Hobbsetal.，1993，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:6909-6913),vinylogous多肽(Hagiharaetal.，1992，J.Amer.Chem.Soc.114:6568)，具有葡萄糖骨架的非肽肽模擬物(Hirschmannetal.，1992，J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218)，小化合物文庫的類似有機(jī)合成(Chenetal.，1994，J.Amer.Chem.Soc.116:2661)，寡氨基甲酸酯(Choetal.，1993，Science261:1303)，禾口/或肽基膦酸酯(Campbe11etal.，1994，J.Org.Chem.59:658)，核酸文庫(見Ausubel，BergerandSambrook，如前)，肽核酸文庫(見例如美國專利No.5,539,083)，抗體文庫(見例如Vaughnetal.，1996，NatureBiotechnology,14:309-314和PCT/US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如Liangetal.，1996，Science,274:1520-1522和U.S.Pat.No.5，593，853)，小的有機(jī)分子文庫(見例如苯二氮，Baum，1993，C&EN，January18，page33;類異戊二烯，美國專利No.5,569,588;thiazolidinones和metathiazanones，美國專利No.5,549,974;吡咯烷，美國專利No.5,525,735和5,519,134;morpholino化合物，美國專利No.5，506，337;苯二氮，美國專利No.5,288,514，等等)。制備組合文庫的設(shè)備可商購(見例如357MPS，390MPS，AdvancedChemTech，LouisvilleSky.，Symphony,Rainin，Woburn，Mass.，433AAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，Calif.，9050Plus,Millipore，Bedford,Mass.)。另外，許多組合文庫可商購(見例如ComGenex，Princeton,N.J.，Tripos，1C.9St.Louis，Mo.，3DPharmaceuticals,Exton，Pa.，MartekBiosciences,Columbia,Md.，etc.)?；焺┰诹硪粋€(gè)實(shí)施方案中，凋亡是通過降低Akt3活性聯(lián)合化療劑誘導(dǎo)的。如本文所用，化療包括用單一的化療劑或者用組合的藥劑治療。本發(fā)明可以使用的化療劑包括但不限于垸化劑、抗代謝物、抗生素、天然產(chǎn)物或者植物衍生的產(chǎn)物、激素和類固醇(包括合成類似物)，及鉑制齊U，如SoengasMS，LoweSW.ApoptosisandMelanomaChemoresistance.Oncogene.2003May19;22(20):3138-51所述。這些種類的藥劑實(shí)例在下文示出。垸化劑包括但不限于例如亞硝基脲、氮芥和三氮烯。亞硝基脲包括但不限于例如卡氮芥，洛莫司汀(lomustine)和司莫司汀(semustine)。氮芥包括但不限于例如環(huán)磷酰胺。三氮烯包括但不限于例如達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)。FDA已經(jīng)許可達(dá)卡巴嗪用于治療黑素瘤。抗代謝物包括但不限于葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制劑氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌吟、磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabinephosphate)、pentostatine禾卩吉西f也i賓(gemdtabine)。本發(fā)明可以使用的抗生素包括但不限于蒽環(huán)類。蒽環(huán)類包括但不限于阿霉素。本發(fā)明可使用的天然或者植物衍生的產(chǎn)物包括但不限于例如長春花屬生物堿(vincaalkaloid)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、taxanes。長春花屬生物堿例如包括但不限于長春新堿和長春堿。表鬼臼毒素例如包括包括但不限于topside。Taxanes例如包括但不限于taxol、paditaxel和docetaxel。本發(fā)明可以使用的激素類似物和類固醇例如包括但不限于抗雌激素、17-a-炔雌醇(Ethinylestradiol)、二乙基已烯雌酚、睪酮、強(qiáng)的松、氟羚甲基睪丸素、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、睪內(nèi)酉旨(testolactone)、甲地孕酮(megestrolacetate)、三苯氧胺、甲基強(qiáng)的松龍、甲基睪酮、脫氫皮質(zhì)(甾)醇、氟羥脫氫皮質(zhì)甾醇、三對甲氧苯氯乙烯、羥基孕酮、氨苯哌酮(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、諾雷德(zoladex)。本發(fā)明可以使用的鉑制劑藥物例如包括但不限于順鉑、卡鉑(carboplatin)、羥基脲、安吖啶(amsacrine)、甲基芐肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、左旋咪唑、和六甲基三聚氰胺。安全及有效地給予大多數(shù)這些化療劑的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。另外，這些化療劑的給予在標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中描述。例如，許多化療劑的給予方法在例如Physicians'DeskReference(PDR)，1996版本(MedicalEconomicsCompany,Montvale，N.J.07645-1742，USA)中描述；在此并入?yún)⒖?。放射放射可任選加入本發(fā)明的治療方案中。如本文所用，術(shù)語"放射"具有其常規(guī)的含義，并且僅限于X射線具有足夠的能量穿透機(jī)體并且能誘導(dǎo)腫瘤特異性抗原在體內(nèi)釋放的程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知破壞特定類型腫瘤的最佳放射強(qiáng)度。凋亡本領(lǐng)域技術(shù)人員己知使用各種方法怎樣檢測和/或測定凋亡，例如使用Dengleretal.，(1995)AnticancerDrugs.6:522-32所述的碘化丙啶(propidiumiodide)流式細(xì)胞計(jì)量分析，或者Gorozyva，(1993)CancerRes53:1945-51所述的原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和切口平移分析(TUNEL分析)。治療黑素瘤腫瘤本發(fā)明部分基于本發(fā)明人的觀察結(jié)果，即Akt3調(diào)節(jié)凋亡并且V599EB-Raf調(diào)節(jié)生長和血管發(fā)育。這是一個(gè)有意義的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠涫状舞b別了有效的組合靶向治療黑素瘤的方法。如前所述，降低Akt3活性可增加黑素瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性；因此，當(dāng)黑素瘤中Akt3活性被降低時(shí)，通過凋亡起作用的物質(zhì)如常規(guī)的化療劑是更有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物黑素瘤的方法，包括將有效量的降低V599EB-Raf活性的物質(zhì)給予腫瘤；將有效量的降低Akt3活性的物質(zhì)給予腫瘤，從而縮小腫瘤大小。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，降低Akt3活性的物質(zhì)是一種siRNA分子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中降低Akt3活性的siRNA分子包含一種具有如下序列的多核苷酸5，GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'，5'CUAUCUACAUUCCGGAAAG3'，5'GAAUUUACAGCUCAGACUA3'，5'CAGCUCAGACUAUUACAAU3'，5'CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3'，5'CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG3'，5'GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3'，5'UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3'，5'AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3'，5'AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3'或者其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，降低B-Raf活性的物質(zhì)是一種siRNA分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種siRNA分子，其中降低B-Raf活性的siRNA分子包含一種具有如下序列的多核苷酸5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'，和/或5'GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3'。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用熟知的方法將降低Akt3活性的物質(zhì)與細(xì)胞接觸以將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。這些包括脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸f5納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、納米樹狀物、病毒、磷酸鈣介導(dǎo)的核苷酸輸送、聚(D-精氨酸)、電穿孔和顯微注射。納米脂質(zhì)體、納米顆粒、納米樹狀物將物質(zhì)輸送至細(xì)胞中的應(yīng)用在圖5—11中表明，并進(jìn)一步在2004年4月26日提請的專利申請系列No.10/835,520中描述，該申請?jiān)诖瞬⑷雲(yún)⒖?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用任何熟知的方法將降低B-Raf活性的物質(zhì)與細(xì)胞接觸，以將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些包括脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸轉(zhuǎn)納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、納米樹狀物、病毒、磷酸鈣介導(dǎo)的核苷酸輸送、聚(D-精氨酸)、電穿孔和顯微注射。納米脂質(zhì)體、納米顆粒、納米樹狀物將物質(zhì)輸送至細(xì)胞中的應(yīng)用在圖5—11中表明，在2004年4月26日提請的專利申請系列No.10/835520中進(jìn)一步闡述，該申請?jiān)诖瞬⑷雲(yún)⒖?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用納米技術(shù)給予多種物質(zhì)以抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育及增加或者誘導(dǎo)凋亡的方法。將Akt3月太的組合;Akt3siRNA，V599EB-RafsiRNA，Paclitaxel，卡鉑，亞硝脲氮芥，達(dá)卡巴嗪或者長春堿同時(shí)裝載在非毒性脂質(zhì)體中。這些脂質(zhì)體有效地將這些裝載物輸送至培養(yǎng)生長的黑素瘤細(xì)胞中。這是首次證實(shí)了使用單一的輸送劑將不同的治療劑同時(shí)輸送至癌細(xì)胞中。攜帶組合治療劑的脂質(zhì)體在血液中行進(jìn)，進(jìn)入腫瘤血管中，由暴露的黑素瘤細(xì)胞吸收。這樣導(dǎo)致靶向殺死黑素瘤細(xì)胞，使得腫瘤衰減。這種方法的臨床效用是將組合的治療劑輸送至腫瘤中?？笴D63抗體與從所述脂質(zhì)體伸出的pegalation節(jié)段的共價(jià)連接導(dǎo)致被黑素瘤細(xì)胞優(yōu)先吸收。因此，基質(zhì)組織吸收很少的或者不吸收脂質(zhì)體，表明脂質(zhì)體的靶向輸送。相對于吸收進(jìn)對照基質(zhì)組織中，所述免疫脂質(zhì)體可以增強(qiáng)吸收進(jìn)黑素瘤腫瘤細(xì)胞中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低Akt3活性的物質(zhì)是一種反義多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，降低B-Raf活性的物質(zhì)是一種反義多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低Akt3活性的物質(zhì)是一種核酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低B-Raf活性的物質(zhì)是一種核酶。核酶可用于靶向及抑制Akt3、B—Raf或者這兩者的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Akt3活性是通過Akt3多肽抑制劑降低的。這可以通過許多方式實(shí)現(xiàn)，包括提供顯性陰性的Akt3多肽，例如自身無活性但當(dāng)與功能性Akt3存在于同一細(xì)胞中時(shí)降低或者消除功能性Akt3的活性的一種Akt3形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf活性是通過B-Raf多肽的抑制劑降低的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，B-Raf抑制劑是BAY43-卯06。B-Raf的抑制劑包括但不限于BAY43-9006(可商購自BAYER)或者其它可商購的B-Raf抑制劑。B-Raf的抑制劑可另外包括競爭性和非競爭性B-Raf抑制劑。競爭性B-Raf抑制劑是以相互專有的底物結(jié)合的方式結(jié)合B-Raf酶的分子。典型地，B-Raf的競爭性抑制劑結(jié)合活性位點(diǎn)。非競爭性B-Raf抑制劑可以是抑制B-Raf合成，但其與所述酶的結(jié)合不是相互專有的底物結(jié)合。本發(fā)明涉及的B-Raf抑制劑是至少在相當(dāng)濃度降低動(dòng)物細(xì)胞中B-Raf活性而對其它細(xì)胞活性無任何明顯作用的化合物。然而，這種抑制可以通過各種方式實(shí)現(xiàn)，包括提供顯性陰性B-Raf多肽，例如其自身無活性但是當(dāng)與功能性B-Raf存在于同一細(xì)胞中時(shí)降低或消除功能性B-Raf的活性的一種B-Raf形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低Akt3活性的物質(zhì)是相應(yīng)于Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域或者催化或調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的連續(xù)氨基酸序列的肽。本發(fā)明還涉及其中降低Akt3活性的物質(zhì)是小分子的實(shí)施方案。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及其中降低B-Raf活性的物質(zhì)是小分子的實(shí)施方案。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療黑素瘤的方法包括給予化療劑。如本文所用，化療包括用單一的化療劑治療或者組合多種藥劑治療?？捎糜诒景l(fā)明的化療劑包括但不限于烷化劑、抗代謝物、抗生素、天然或者植物衍生的產(chǎn)物、激素和類固醇(包括合成的類似物)及鉑藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療哺乳動(dòng)物黑素瘤的方法包括放射療法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可通過對細(xì)胞死亡(例如通過凋亡)以及增殖和血管發(fā)生具有顯著作用而用于治療黑素瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知測定腫瘤大小以測定例如腫瘤大小的退化或縮減、血管發(fā)生和凋亡的方法。有益地，化療劑可以相對低的劑量(和/或較低的頻率)給予，以使得對正常的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的毒副作用最小。因此，本發(fā)明還提供了在黑素瘤患者中誘導(dǎo)顯著水平的癌細(xì)胞死亡(例如凋亡)及抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育的方法，所述方法包括同時(shí)或者相繼給予有效量的降低Akt3活性的物質(zhì)及降低B-Raf活性的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"同時(shí)"是指在同一時(shí)間，或者在一通用治療計(jì)劃期間的不同時(shí)間；"相繼"是給予降低Akt3或B-Raf活性的物質(zhì)之一，再給予降低B-Raf或Akt3活性的另一種物質(zhì)，其中第二種物質(zhì)可以在給予第一種物質(zhì)之后立即給予，或者第二種物質(zhì)可以在給予第一種物質(zhì)有效時(shí)間之后再給予；所述有效時(shí)間是給予第一種物質(zhì)后實(shí)現(xiàn)最大益處的時(shí)間量。耙向Akt3與突變體V599EB-Raf及選擇的化療方法與單獨(dú)的靶向方法比較具有增效、更強(qiáng)力和延長的作用。這提供了組合靶向治療與選擇的化療方法的理論基礎(chǔ)，這種組合方法目前還未用于黑素瘤的治療中。Akt3和/或B-Raf蛋白及Akt3相關(guān)和/或/B-Raf相關(guān)的蛋白質(zhì)的應(yīng)用本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有許多特別的用途。Akt3和B-Raf均是造成黑素瘤發(fā)育的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。Akt3和/或B-Raf蛋白及Akt3或B-Raf相關(guān)蛋白用于評定正常組織和癌組織中Akt3和/或B-Raf基因產(chǎn)物的狀態(tài)，從而闡明惡性腫瘤的表型。典型地，來自Akt3或B-Raf蛋白特定區(qū)域的多肽可用于評定那些區(qū)域(如含有一或多個(gè)基序的區(qū)域)中干擾的存在情況(如缺失、插入、點(diǎn)突變等等)。非限制性實(shí)例包括使用靶向Akt3禾口/或B-Raf蛋白和分別含有Akt3禾口/或B-Raf蛋白質(zhì)序列內(nèi)所含的一或多個(gè)生物學(xué)基序的氨基酸殘基的Akt3相關(guān)和/或B-Raf相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體，以評估正常組織與癌組織中這個(gè)區(qū)域的特征或者激發(fā)對表位的免疫應(yīng)答。或者，分別含有Akt3和域B-Raf蛋白質(zhì)中一或多個(gè)生物學(xué)基序的氨基酸殘基的Akt3相關(guān)和/或B-Raf相關(guān)蛋白質(zhì)用于篩選與Akt3和/或B-Raf的該區(qū)域相互作用的因子。Akt3和B-Raf蛋白片段/亞序列特別有用于產(chǎn)生和鑒定結(jié)構(gòu)域特異性抗體(例如識(shí)別Akt3或B-Raf蛋白的胞外或者胞內(nèi)表位的抗體)，用于鑒別結(jié)合Akt3或B-Raf或者其特定結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)或細(xì)胞因子，及用于各種治療和診斷、包括但不限于診斷測定、癌癥疫苗和制備這些疫苗的方法中。由Akt3和/或B-Raf基因或其類似物、同系物或者片段編碼的蛋白質(zhì)具有許多用途，包括但不限于產(chǎn)生抗體及用于鑒別結(jié)合Akt3和/或B-Raf基因產(chǎn)物的配體和其它物質(zhì)和細(xì)胞組分的方法中。針對Akt3或B-Raf蛋白質(zhì)或其片段產(chǎn)生的抗體可用于控制特征在于Akt3或B-Raf蛋白表達(dá)的人黑素瘤的診斷和預(yù)后測定及成像方法學(xué)中?？梢允褂糜糜跈z測Akt3和/或B-Raf蛋白的各種免疫學(xué)測定，包括但不限于各種類型的放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定(ELIFA)、免疫細(xì)胞化學(xué)方法，等等?？贵w可以加以標(biāo)記并用作能檢測Akt3或B-Raf表達(dá)細(xì)胞的免疫學(xué)成像試劑。黑素瘤中Akt3和/或B-Raf的抗體根據(jù)本發(fā)明，在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的分別由Akt3同種型或者B-Raf同種型編碼的Akt3和/或B-Raf多肽包括其片段，包括融合蛋白，可以用作抗原或者免疫原以產(chǎn)生抗體。優(yōu)選地，抗體特異性結(jié)合人Akt3同種型，但不結(jié)合其它形式的Akt。優(yōu)選地，抗體特異性結(jié)合人B-Raf同種型，但不結(jié)合其它形式的B-Raf。當(dāng)分子能與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子如免疫球蛋白(抗體)或者T細(xì)胞抗原受體特異性相互作用時(shí)，該分子是"抗原性的"?？乖远嚯幕螂暮兄辽俅蠹s5個(gè)、優(yōu)選至少大約10個(gè)氨基酸。分子的抗原性部分可以是對于抗體或者T細(xì)胞受體識(shí)別免疫顯性的部分，或者可以是通過將該抗原性部分與載體分子綴合進(jìn)行免疫而用于產(chǎn)生該分子的抗體的那部分?？乖苑肿硬恍枰陨硎敲庖咴缘?，免疫原性是指能不用載體即能激發(fā)免疫應(yīng)答。這類抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫。本發(fā)明的抗Akt3抗體可以是交叉反應(yīng)性的，例如它們可以識(shí)別不同物種的Akt3。相似地，本發(fā)明的抗B-Raf抗體可以是交叉反應(yīng)性的，例如它們可以識(shí)別不同物種的B-Raf。多克隆抗體具有較高的交叉反應(yīng)可能性?；蛘?，本發(fā)明的抗體可以特異于單鏈形式的Akt3或B-Raf。優(yōu)選地，這種抗體特異于人黑素瘤Akt3或B-Raf。可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生多克隆抗體。對于抗體的產(chǎn)生，可以將各種宿主動(dòng)物通過注射Akt3或B-Raf多肽或其衍生物(例如片段或者融合蛋白)而進(jìn)行免疫，宿主動(dòng)物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，Akt3或B-Raf多肽或其片段可以與一種免疫原性載體綴合，例如與牛血清白蛋白(BSA)或者匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)綴合。根據(jù)宿主物種可以使用各種佐劑以增加免疫學(xué)應(yīng)答，佐劑包括但不限于弗式佐劑(完全和不完全佐劑)、無機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳狀液、匙孔嘁血藍(lán)蛋白、二硝基酚及潛在有用的人的佐劑如BCG(bacilleCalmette-Guerin)和短小棒桿菌。為了制備Akt3或B-Raf多肽的單克隆抗體、其片段、類似物或者衍生物，可以使用連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體的任何技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于最初由Kahler禾BMilstein揭示的雜交瘤技術(shù)(Nature256:495-497(1975)，以及trioma技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozboretal"Imm畫logyToday4:721983;Coteetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030(1983))，及產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Coleetal"inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanRLiss,Inc.,pp77-96(1985))。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體可以在無菌動(dòng)物中產(chǎn)生(國際專利出版物No.W089/12690，1989年12月28日公布)。事實(shí)上根據(jù)本發(fā)明可以使用用于通過剪接來自特異于Akt3多肽的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因而生產(chǎn)"嵌合抗體"而開發(fā)的技術(shù)[Morrisonetal.,J.Bcateriol159:870(1984);Neubergeretal"Nature312:604-608(1984);Takedaetal.，Nature314:452-454(1985)];這類抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類人或人源化的嵌合抗體優(yōu)選用于治療人類疾病(如下所述)，因?yàn)槿嘶蛉嗽椿贵w與異種抗體相比自身誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、特別是變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答的可能性低得多?？梢哉{(diào)整用于單鏈Fv(scFv)抗體產(chǎn)生的技術(shù)[Huston的美國專利No.5,476,786和5,132,405;美國專利No.4，946,778]而用于產(chǎn)生Akt3多肽特異性單鏈抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案利用用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù)[Huseetal.，Science246:1275-1281(1989)]，以快速和簡便地鑒別具有對Akt3多肽或其衍生物或類似物的希望的特異性的單克隆Fab片段。含有抗體分子的獨(dú)特型的抗體片段可以通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這種片段包括但不限于F(ab')2片段，其可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生；Fab'片段，其可以通過還原F(ab')2片段的二硫鍵而產(chǎn)生；Fab片段，其可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生。在抗體的產(chǎn)生中，篩選希望的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成，例如放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、"夾心"免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定(例如使用膠體金、酶或者放射性同位素標(biāo)記)、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定(例如凝膠凝集測定、血凝集測定)、補(bǔ)體固定測定、免疫熒光測定、蛋白質(zhì)A測定、及免疫電泳測定，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合通過檢測初級抗體上的標(biāo)記而檢測。在另一個(gè)實(shí)施方案中，初級抗體是通過檢測二級抗體或者試劑與初級抗體的結(jié)合而檢測。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二級抗體是標(biāo)記的。本領(lǐng)域已知許多方式在免疫測定中檢測結(jié)合，這些都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，為了選擇識(shí)別Akt3或者B-Raf多肽或肽的特異性表位的抗體，可以測定產(chǎn)生的雜交瘤的結(jié)合含有這種表位的Akt3或B-Raf多肽片段的產(chǎn)物。為了選擇特異于來自一特定物種動(dòng)物的Akt3或B-Raf多肽的抗體，可以基于與由所述物種動(dòng)物的細(xì)胞表達(dá)的或者分離自其中的Akt3或B-Raf多肽或肽的陽性結(jié)合而進(jìn)行選擇。與Akt3或者B-Raf相互作用的分子的鑒別在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的Akt3和B-Raf蛋白質(zhì)和核酸序列使得技術(shù)人員可以鑒別與Akt3或者B-Raf相互作用的蛋白質(zhì)、小分子及其它物質(zhì)，以及由Akt3或者B-Raf通過任一種公認(rèn)的方案激活的途徑。例如，技術(shù)人員可利用一種所謂的相互作用捕獲系統(tǒng)(也稱作"雙雜交測定")。在這種系統(tǒng)中，分子相互作用并重建一種轉(zhuǎn)錄因子，其指導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)，基于此測定報(bào)道基因的表達(dá)。其它系統(tǒng)通過重建真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活物而鑒別體內(nèi)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用，見例如1999年9月21日授權(quán)的美國專利No.5,955，280，1999年7月20日授權(quán)的美國專利No.5,925,523，1998年12月8日授權(quán)的美國專利No.5,846,722及1999年12月21日授權(quán)的美國專利No.6,004,746所述?；诨蚪M推測蛋白質(zhì)功能的算法在本領(lǐng)域也可獲得(見例如Marcotte，etal.，Nature402:4November1999，83-86所述)?；蛘?，可以篩選肽文庫以鑒別與Akt3或者B-Raf蛋白質(zhì)序列相互作用的分子。在這種方法中，與Akt3或者B-Raf結(jié)合的肽通過篩選編碼隨機(jī)或者受控的氨基酸集合的文庫而鑒別。由所述文庫編碼的肽作為噬菌體外殼蛋白的融合蛋白而表達(dá)，然后分別針對Akt3或者B-Raf蛋白篩選噬菌體顆粒。因此，不需要任何先前的關(guān)于預(yù)期的配體或者受體分子的結(jié)構(gòu)信息，就鑒別了具有廣泛用途如用作治療、預(yù)測或診斷試劑的肽。藥物組合物在一個(gè)實(shí)施方案中，治療黑素瘤的藥物組合物包含一種降低Akt3活性的物質(zhì)及一種載體。適用于本發(fā)明的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。這些載體包括但不限于脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸鈣納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、聚(D-精氨酸)、納米樹狀物、病毒、及磷酸鈣介導(dǎo)的核苷酸輸送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含一種物質(zhì)，其包括但不限于siRNA分子、反義分子、拮抗劑、核酶、抑制劑、肽及小分子。在其它實(shí)施方案中，小干擾RNA(siRNA)分子包括如下多核苷酸5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3',5'CUAUCUACAUUCCGGAAAG3'，5'GAAUUUACAGCUCAGACUA3'，5'CAGCUCAGACUAUUACAAU3'，5'CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3'，5'CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG3'，5'GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3'，5'UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3'，5'AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3'，5'AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3'或者其互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含一種物質(zhì)，其是作為Akt3的假底物的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域的假底物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低Akt3活性的物質(zhì)是作為Akt3競爭性抑制劑的一種肽。所述肽可作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域、Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域和/或Akt3的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括降低B-Raf活性的物質(zhì)。所述物質(zhì)包括siRNA分子、反義分子、拮抗劑、核酶、肽、及小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低B-Raf活性的物質(zhì)是小干擾RNA(siRNA)分子，其包含多核苷酸5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'或者其互補(bǔ)序列，或者多核苷酸5'GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3'或者其互補(bǔ)序列。如下實(shí)施例只是例證了本發(fā)明而無限制本發(fā)明之意。關(guān)于Akt3的實(shí)施例材料和方法實(shí)施例1:siRNA介導(dǎo)的Akt同種型的下調(diào)為了證實(shí)針對Aktl、Akt2和Akt3(Dharmacon)的siRNA在UACC卯3細(xì)胞中的特異性，將HA-標(biāo)記的Aktl、Akt2或者Akt3構(gòu)建體與各自的siRNA—起共核轉(zhuǎn)染(co-nucleofected)。用于這些研究的Akt構(gòu)建體先前已經(jīng)描述(Sunetal.，AmJPath159:431-437(2001);Mits腦hietal.，JCellularBiochem70:433-441(1998);及Brodbecketal.，JBiolChem274:9133-9136(1999))。將每種構(gòu)建體(5昭)，單獨(dú)或與lOOpmol或200pmol各自siRNA組合，使用AmaxaNucleofector通過核轉(zhuǎn)染導(dǎo)入7xl05UACC903細(xì)胞中。使用表達(dá)GFO的構(gòu)建體的所得轉(zhuǎn)染效率>60%。72小時(shí)后收獲蛋白質(zhì)裂解物，如前所述進(jìn)行Western印跡分析(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。還使用siRNA核轉(zhuǎn)染以敲弱Akt同種型和/或PTEN(Dharmacon)在黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞系UACC903、SK-MEL-24、WM115和WM35中的內(nèi)源表達(dá)。對于WM35使用Amaxa核轉(zhuǎn)染試劑和黑素細(xì)胞核轉(zhuǎn)染方案，而其它細(xì)胞系使用Amaxa溶液R/程序K-17進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞系的生長條件先前已經(jīng)描述(Stahletal.,CancerRes63:2891-2897(2003);Hsuetal.，InHumanCellCulture,J.R.W.M.a.B.PaIsson，editor.GreatBritain:KluwerAcademicPublishers.259-274(1999》。實(shí)施例2:Western印跡、免疫沉淀和激酶分析Western印跡方法和使用的抗體，除了Akt2(SantaCruz)和Akt3(UpstateBiotech)之外，先前均已報(bào)道(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。對于免疫沉淀，在向細(xì)胞平板中加入蛋白質(zhì)裂解緩沖液(50mMTris-HClpH7.5，0.1%TritonX匿IOO，1mMEDTA，ImMEGTA，50mMNaCl，lOmM卩甘油磷酸鈉，5mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉，0.1%2-巰基乙醇和0.5%蛋白酶抑制劑混合物(Sigma))之后收集蛋白質(zhì)，隨后在液氮中速凍。細(xì)胞碎片通過離心(^10,000Xg)裂解物沉淀，使用BioRadBCA蛋白質(zhì)分析量化蛋白質(zhì)濃度。將免疫沉淀的蛋白質(zhì)(100嗎)與2嗎的Akt2或者5pl的Akt3抗體在4'C持續(xù)混合保溫過夜。接著，將15^1平衡的GammaBindG瓊脂糖珠(AmershamBiosciences)加入每個(gè)試管中，在4"C持續(xù)混合保溫2小時(shí)。將沉淀的珠用裂解緩沖液洗滌兩次以除去未結(jié)合的抗體和蛋白質(zhì)。然后將樣品重懸及根據(jù)InvitrogenLifeTechnologies提供的方案使用NuPageGelSystem在還原條件下電泳。Western印跡用磷-Akt探查并通過如前所述密度計(jì)量方法量化(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。對于Akt激酶分析，將15^1平衡的GammaBindG瓊脂糖珠用200pl裂解緩沖液洗滌，然后與2略Akt2或者5plAkt3抗體在400pl體積中在4"C持續(xù)混合保溫^2小時(shí)。將MPBiomedicals的微囊藻素(1HM)加入裂解緩沖液中以保證細(xì)胞PP1和PP2磷酸酶完全失活。將抗體/瓊脂糖復(fù)合物用750^1裂解緩沖液洗滌兩次，然后與IOO嗎蛋白質(zhì)在400pl體積中在4。C持續(xù)混合保溫^1.5h小時(shí)。將該復(fù)合物用500^1裂解緩沖液洗滌(3X)，然后用500|il的分析稀釋緩沖液(20mMMOPS，pH7.2，25mMia-磷酸甘油，1mM原釩酸鈉和1mMDTT)洗一次。向試管中加入SantaCruz的于分析稀釋緩沖液中的PKA抑制劑肽(lOpM)、37.5^MATP、17mMMgCl2、0.25^iCi/|il32p-ATP和90|iMAkt特異性底物Crosstide(得自UIpstateBiotechnology),在35。C持續(xù)混合保溫10分鐘。接著，將20pl液體移至磷酸纖維素紙上，其用40ml0.75%磷酸洗滌3次5分鐘。隨后用丙酮洗滌5分鐘，將磷酸纖維素干燥，移至具有5mlAmershamBiosciences閃爍液的閃爍瓶中，在BeckmanCoulterLS3801液體閃爍系統(tǒng)中測定cpm。實(shí)施例3:腫瘤研究及凋亡測定豐艮據(jù)PennStateHumanSubjectsProtectionOffice,theDana-FarberCancerInstituteProtocolAdministrationOffice及CooperativeHumanTissueNetwork許可的方案從病人收集黑素瘤腫瘤。使用經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的歸檔黑素瘤樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，以測定磷酸化的Akt。使用63個(gè)福爾馬林固定、石蠟包埋的歸檔的黑素細(xì)胞損害樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，使用磷-Akt(Ser473)單克隆抗體(CellSignalingTechnology)以l:50效價(jià)根據(jù)廠商推薦的方案進(jìn)行。通過定性比較每個(gè)樣本中存在的內(nèi)部血管內(nèi)皮、鱗狀上皮或者平滑肌控制，確定染色的特異性和密度。通過使用在液氮中冷卻的研缽和研杵研磨由>60%腫瘤材料組成的、在液氮中速凍的腫瘤樣本，收集用于進(jìn)行Western印跡或者免疫沉淀的腫瘤蛋白質(zhì)。向每200mg組織粉末中加入1ml蛋白質(zhì)裂解緩沖液，在充滿冰的超聲器中超聲2分鐘(間隔15秒)。樣本在4t:離心(~12,000Xg)10分鐘。將上清移至干凈的試管中，使用BioRadBCA蛋白質(zhì)分析進(jìn)行量化。豐艮據(jù)PennsylvaniaStateCollegeofMedicine白勺InstitutionalAnimalCareandUseCommittee許可的方案進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。無胸腺雌性裸鼠購自HarlanSpragueDawley，通過在4一6周齡裸鼠小鼠的左側(cè)和右側(cè)胸腔上部sc注射于含有10%FBS的0.2mlDMEM中^106個(gè)細(xì)胞來測定腫瘤動(dòng)力學(xué)。為了進(jìn)行涉及siRNA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將lxl06UACC903細(xì)胞用Akt同種型的siRNA核轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后將于含有10%FBS的0.2mlDMEM中的核轉(zhuǎn)染細(xì)胞sc注射至裸鼠小鼠的左側(cè)和右側(cè)胸腔上部。使用測徑器隔天測定發(fā)生的腫瘤的直徑。當(dāng)測定凋亡時(shí)，每個(gè)部位注射5《106細(xì)胞，4天后收獲4一6個(gè)腫瘤。使用如前所述的RocheTUNELTMRRed凋亡試劑盒(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))對福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤切片進(jìn)行凋亡測定。從三或四個(gè)不同的腫瘤切片中計(jì)數(shù)最少8個(gè)視野，TUNNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目以凋亡細(xì)胞的百分比表示。實(shí)施例4:統(tǒng)計(jì)學(xué)為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Student'st-檢驗(yàn)進(jìn)行成對比較及使用One-wayANOVA或者KmskalWallisANOVAonRank進(jìn)行成組比較，隨后進(jìn)行合適的后續(xù)檢驗(yàn)(Du皿ett's或者Dunn's)。當(dāng)P值為0.05時(shí)認(rèn)為結(jié)果是顯著的。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>1腫瘤細(xì)胞染色為與腫瘤切片中血管鄰近的周細(xì)胞中的密度相似的密度。2腫瘤細(xì)胞染色為高于腫瘤切片中血管鄰近的周細(xì)胞中的密度。統(tǒng)計(jì)學(xué)，對于a與c、d及b與d，P<0.5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例5:同種型特異性siRNA鑒別Akt3參與黑素瘤在最近描述的實(shí)驗(yàn)性遺傳黑素瘤模型中(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))，證實(shí)了失調(diào)的Akt活性(通過PTEN喪失)在黑素瘤腫瘤發(fā)生中通過降低黑素瘤細(xì)胞的凋亡能力而起重要作用(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。我們推論既然這個(gè)模型反映了Akt在黑素瘤腫瘤發(fā)生中的重要性，則該模型可由于鑒別其失調(diào)的活性控制黑素瘤腫瘤發(fā)育的特異性Akt同種型。先前的結(jié)果(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))確認(rèn)親代UACC903(-PATEN)細(xì)胞具有增高的全部磷酸化的Akt表達(dá)(活性測定)(圖1A)。PTEN在UACC903細(xì)胞中的表達(dá)在三個(gè)獨(dú)立衍生的細(xì)胞系(36A、29A和37A)中均導(dǎo)致Akt活性降低，其表達(dá)在腫瘤發(fā)生期間在喪失功能性PTEN活性的回復(fù)細(xì)胞系(36A回復(fù)體)中則相反為了鑒別在黑素瘤中有活性的主要Akt同種型，我們使用特異于每個(gè)Akt同種型的siRNA以確定每個(gè)同種型使親代UACC903(-PTEN)細(xì)胞系中磷酸化(活性)Akt的量降低的程度。在UACC903細(xì)胞中每個(gè)對于每個(gè)Akt同種型的敲弱表達(dá)的特異性通過共核轉(zhuǎn)染表達(dá)標(biāo)記的HA-Aktl、HA-Akt2或者HA-Akt3的構(gòu)建體與特異于每個(gè)同種型的siRNA而確定。經(jīng)證實(shí)是特異性，發(fā)現(xiàn)每個(gè)AktsiRNA僅降低其相應(yīng)的Akt同種型的表達(dá)，如圖1B所示。接著，將每個(gè)Akt同種型的siRNA核轉(zhuǎn)染進(jìn)UACC903細(xì)胞系以及兩個(gè)額外獨(dú)立衍生的黑素瘤細(xì)胞系(WM115和SK-MEL-24)中，以確定哪個(gè)siRNA降低這些細(xì)胞中磷酸化(活性)Akt的水平(圖1C)。雖然Aktl或Akt2的siRNA僅具有可忽略不計(jì)的無意義的作用，但是Akt3的siRNA顯著降低總的磷酸化Akt的水平，提示在UACC903(PTEN)模型中Akt3是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)育的同種型(Stahletal.,CancerRes63:2891-2897(2003))。由于所有3個(gè)獨(dú)立衍生的黑素瘤細(xì)胞系均表明Akt3在黑素瘤中是主要的活性同種型，因此隨后的實(shí)驗(yàn)針對檢測Akt3的失調(diào)，使用Akt2作為對比對照，因?yàn)閾?jù)報(bào)道其在多種類型的癌癥中是擴(kuò)增的(Chenetal.,ProcNatAcadSciencesUSA89:9267-9271(1992);Chengetal.,ProcNatAcadSciencesUSA93:3636-3641(1996);Luetal.,Chung-OHuaIHsuehTsaChin[ChineseMedicalJournal]75:679-682(1995);Bellacosaetal.,IntJCancer64:280-285(1995);及vanDekkenetal.，CancerRes59:748-752(1999))。為了進(jìn)一步證實(shí)Akt3是在UACC903(PATEN)腫瘤發(fā)生模型中活性被PTEN特異性降低的主要同種型，通過從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀全部Akt3或者Akt2、隨后通過Western印跡評估免疫沉淀的磷酸化(活性)Akt的量來測定Akt3的活性(圖1D)。是磷酸化Akt3而非Akt2的水平在親代UACC卯3細(xì)胞系以及沒有PTEN的兩種腫瘤發(fā)生回復(fù)體36A細(xì)胞系中是增高的。相反，在具有低水平Akt活性的36A、29A或者37A細(xì)胞系中幾乎觀察不到能檢測到的磷酸化Akt3水平，表面上看來是由于PTEN表達(dá)所致(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。為了證實(shí)磷酸化Akt3的水平反映活性Akt，將免疫沉淀的Akt3和Akt2在體外激酶分析中分析，Akt3的分析結(jié)果示于圖1E。與表達(dá)PTEN的細(xì)胞比較，在回復(fù)體(-PATEN)中鑒別到Akt3(圖1E)而非Akt2(數(shù)據(jù)未示出)活性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P0.05)?？傊@些結(jié)果表明Akt3活性在UACC903(PATEN)腫瘤發(fā)生模型中是由PTEN特異性調(diào)節(jié)的。實(shí)施例6:在黑素瘤腫瘤進(jìn)展期間早期出現(xiàn)Akt3活性增加認(rèn)為黑素細(xì)胞能直接轉(zhuǎn)化進(jìn)黑素瘤中(Herlyn，M.，Molecularandcellularbiologyofmelanoma:Austin:R.GLandesCo.(1993))?；蛘?，黑素細(xì)胞可以符合一個(gè)腫瘤進(jìn)展模型，其中它們可以從普通痣、非典型痣逐步原位進(jìn)化為黑素瘤(徑向及垂直生長期(Radialandverticalgrowthphases)),最后形成轉(zhuǎn)移黑素瘤(Herlyn，M.，Molecularandcellularbiologyofmelanoma:Austin:R.G.LandesCo.(1993))。無論過程如何，更具侵潤性的腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化需要積累影響腫瘤抑制基因和致癌基因的改變。這樣產(chǎn)生更加具有選擇性生長或存活優(yōu)勢的細(xì)胞亞群，促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)程。為了提供在黑素瘤腫瘤進(jìn)展期間選擇性涉及Akt3的證據(jù)，在黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型中測定Akt3和Akt2表達(dá)和活性(由Dr.MeenhardHerlyn惠贈(zèng))(Herlyn，M.，Molecularandcellularbiologyofmelanoma:Austin:R.G.LandesCo.(1993);Hsuetal.，InHumanCellCultureJ.R,W,M.a.B.Palsson，editor.GreatBritain:KluwerAcademicPublishers.259-274(1999))。在這個(gè)進(jìn)展模型中，將黑素細(xì)胞與從原發(fā)黑素瘤腫瘤中在徑向(WM35和WM3211)和垂直生長期(WM115、WM98.l和WM278)中建立的低傳代細(xì)胞系比較。在與黑素細(xì)胞的比較中，圖2A示出兩個(gè)徑向生長期之一和所有三個(gè)垂直生長期細(xì)胞系具有增高的磷酸化Akt，提示Akt活性在原發(fā)黑素瘤發(fā)生早期在徑向生長期既已增加。接著，通過Western印跡檢測Akt3同種型的表達(dá)，并與Akt2在這些細(xì)胞系中的表達(dá)相比較(圖2B)。發(fā)現(xiàn)與黑素細(xì)胞比較，Akt3表達(dá)在除了WM98.1徑向生長期細(xì)胞系之外的所有細(xì)胞系中均增高。由于表達(dá)不必需反映活性，通過對Akt3或者Akt2進(jìn)行免疫沉淀、隨后通過Western印跡分析測定免疫沉淀物中磷酸化Akt的水平來檢測活性Akt3的量。與黑素細(xì)胞相比較，Akt3活性在除了WM35徑向生長期細(xì)胞系之外的所有細(xì)胞系中均增高(圖2C)。注意即使在WM98.1垂直生長期細(xì)胞系中Akt3蛋白表達(dá)與在黑素細(xì)胞中觀察到的表達(dá)相似，但是Akt3活性顯著較高。與Akt3的結(jié)果相反，與黑素細(xì)胞比較Akt2表達(dá)僅在徑向生長期細(xì)胞系中增高(圖2C)。然而，與黑素細(xì)胞比較時(shí)，僅僅WM3211徑向生長期細(xì)胞系具有相應(yīng)增加的Akt2活性，但是也具有增高的Akt3活性。這些數(shù)據(jù)提示Atk3是在黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型中主要涉及的活性Akt同種型。實(shí)施例7:在黑素瘤患者腫瘤中Akt3失調(diào)的頻率由于前述實(shí)驗(yàn)鑒別了Akt3在UACC卯3(PTEN)月中瘤發(fā)生和黑素瘤腫瘤進(jìn)展模型中是主要的活性Akt同種型，接著在體內(nèi)研究中針對確定黑素瘤患者腫瘤中Akt3失調(diào)的頻率。首先通過免疫組織化學(xué)分析普通痣、發(fā)育異常的痣、黑素瘤患者的原發(fā)黑素瘤和轉(zhuǎn)移瘤估定在黑素細(xì)胞損害處總磷酸化Akt的相對密度以確定Akt激活的頻率(表1)。在100%的普通痣中檢測到中等水平的染色，在12%的發(fā)育異常痣、53%的原發(fā)黑素瘤和67%的轉(zhuǎn)移黑素瘤中觀察到強(qiáng)染色。這些結(jié)果提示Akt活性在痣的發(fā)展中可以發(fā)揮一些未經(jīng)確認(rèn)的作用，失調(diào)的Akt活性是在晚期階段的黑素瘤中起更重要作用的指征。從公布的報(bào)道(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998))中對含有Aktl、Akt2和Akt3基因的基因組區(qū)域的分析未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增。然而，含有Akt3的lq43-44區(qū)域經(jīng)歷拷貝數(shù)增加(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.，CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997))，這提示過表達(dá)是造成黑素瘤中Akt3活性增加的機(jī)制。相反，含有Aktl的14q32區(qū)域和含有Akt2的19ql3區(qū)域保持無改變或者趨于喪失(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.，CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997))。為了確定增加的Akt3表達(dá)是否是導(dǎo)致活性增加的一個(gè)選擇性機(jī)制，從黑素瘤患者腫瘤提取蛋白質(zhì)裂解物以比較Akt3和Akt2的表達(dá)和活性水平。從31個(gè)轉(zhuǎn)移黑素瘤中提取蛋白質(zhì)并通過Western印跡分析以確定腫瘤材料中Akt3和Akt2的表達(dá)和活性水平。使用三個(gè)獨(dú)立的Western印跡量化每個(gè)樣品中的表達(dá)，然后與在黑素細(xì)胞中的表達(dá)相比較(圖2D)?？偟膩碚f，61%(19/31)的腫瘤具有增高的Akt3蛋白質(zhì)表達(dá)，與Akt2的10%(3/31)相比，其比在黑素細(xì)胞中觀察到的表達(dá)水平增加2—9倍。這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的在黑素瘤腫瘤中發(fā)生的、含有Akt3基因的染色體lq43—44區(qū)域拷貝數(shù)增加的類型一致(Bastianetal.CancerRes58:2170-2175;Thomsonetal.，CancerGenterCytogenet83:93-104(1995);禾卩Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997))。大約55%(6/11)的原發(fā)部位黑素瘤和65%(13/20)轉(zhuǎn)移黑素瘤具有增加的Akt3表達(dá)。相反，當(dāng)比較腫瘤與黑素細(xì)胞中Akt2的表達(dá)時(shí)，僅觀察到可忽略不計(jì)的波動(dòng)(圖2D)。接著，通過量化在Akt3或者Akt2免疫沉淀中磷酸化的Akt測定活性水平。驚人地，磷酸化的(活性)Akt3在62士0.02。/。(SE)的樣品中檢測至lJ(圖2E)。相反，在這些腫瘤中檢測非磷酸化的Akt2(除了陽性對照之外)。另外，與培養(yǎng)生長的黑素細(xì)胞比較，大約35%的腫瘤具有增高的Akt3活性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)>60%的晚期階段的黑素瘤患者的腫瘤中涉及Akt3失調(diào)，提示增加的表達(dá)是造成黑素瘤中Akt3活性失調(diào)的機(jī)制之一。實(shí)施例8:黑素瘤中Akt3失調(diào)的機(jī)制前述實(shí)驗(yàn)鑒別了Akt3在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型和體內(nèi)患者腫瘤中是主要的活性同種型。因此，我們接下來針對確定在黑素瘤中導(dǎo)致失調(diào)的Akt3活性的機(jī)制。由于最初的UACC903(PTEN)月中瘤發(fā)生模型提示PTEN在調(diào)節(jié)黑素瘤中Akt活性中起重要作用，我們檢測了降低PTEN表達(dá)是否直接及特異性增加Akt3活性。為了達(dá)到這個(gè)目的，在黑素細(xì)胞和徑向生長期原代黑素瘤細(xì)胞(WM35)中通過siRNA敲弱PTEN表達(dá)(活性)，以測定對磷酸化Akt水平的影響。選擇WM35細(xì)胞系是因?yàn)檫@些細(xì)胞具有可忽略不計(jì)的基本Akt3活性并且表達(dá)PTEN蛋白(見圖1C)。正如所預(yù)測的，圖3A和圖3B示出siRNA-介導(dǎo)的對PTEN的下調(diào)導(dǎo)致總的磷酸化Akt4增加(泳道4和11)，而混雜的siRNA對照組呈現(xiàn)可忽略不計(jì)的無意義的作用(泳道2和9)。在PTEN下調(diào)后激活的主要Akt同種型通過用針對PTEN的siRNA與Aktl(泳道5和12)、Akt2(泳道6和13)或者Akt3(泳道7和14)的siRNA—起共核轉(zhuǎn)染而確定。只有針對Akt3的siRNA(泳道7和14)將磷酸化Akt的水平降低至在非核轉(zhuǎn)染細(xì)胞(泳道1和8)或者只用混雜的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(泳道2和9)中觀察到的水平。相反，Aktl或者Akt2蛋白水平的降低不降低磷酸化Akt的量。再一次證明Akt3失調(diào)的選擇性。因此，通過PTEN對Akt3活性的選擇性調(diào)節(jié)是在黑素瘤中激活A(yù)kt3的主要機(jī)制。因?yàn)镻TEN的喪失可以增加Akt3的活性而不用過表達(dá)。因此，PTEN降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞PIP3(磷脂酰肌醇3,4，5-三磷酸)濃度增力Q，這可以在黑素瘤中有效地特異性增加Akt3活性。這種特異性的機(jī)制目前還未知。來自黑素瘤患者的腫瘤材料的研究表明增加的Akt3表達(dá)在黑素瘤中可能也起增強(qiáng)Akt3活性的重要作用。為了研究這種可能性，將Akt3在表達(dá)PTEN蛋白的黑素細(xì)胞和WM35細(xì)胞(未示出)中過表達(dá)。將HA-標(biāo)記的野生型Akt3在黑素細(xì)胞中過表達(dá)(圖3C)，其是Akt3T305A/S472A(失活))或者豆蔻?；腁kt3(活性)的失活形式。然后將細(xì)胞斷絕生長因子24小時(shí)，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，IO分鐘后收獲裂解物。Akt2的相等構(gòu)建體用作對照(數(shù)據(jù)未示出)。與載體或者用激酶失活的Akt3核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，野生型Akt3和豆蔻?；腁kt3的過表達(dá)導(dǎo)致總體磷酸化的Akt水平增加。另外，與單獨(dú)野生型Akt3表達(dá)比較(數(shù)據(jù)未示出)，siRNA-介導(dǎo)的PTEN敲弱與Akt3的過表達(dá)一起導(dǎo)致較高的磷酸化Akt水平。因此，單獨(dú)Akt3的過表達(dá)或者組合PTEN喪失是在黑素瘤中導(dǎo)致增加Akt3活性的另一種機(jī)制。實(shí)施例9:增加的Akt3活性通過降低凋亡促進(jìn)黑素瘤腫瘤發(fā)生由于在黑素瘤腫瘤中一致觀察到失調(diào)的Akt3活性，因此隨后的研究針對確定增加的Akt3活性促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制。使用UACC903(PTEN)腫瘤發(fā)生模型細(xì)胞系證實(shí)在裸鼠模型中增加的Akt3活性促進(jìn)黑素瘤腫瘤發(fā)生。將親代UACC903(-PTEN)、36A(+PATEN)或者36A回復(fù)體(-PTEN)細(xì)胞系的一百萬個(gè)細(xì)胞注射進(jìn)4一6周齡雌性裸鼠的皮下，10天后測定形成的腫瘤大小。圖4A示出具有降低的Akt3活性的36A細(xì)胞與具有增高的Akt3活性的親代UACC903和回復(fù)體36A細(xì)胞比較是非致腫瘤發(fā)生的(P0.5)。雖然36A回復(fù)體細(xì)胞與36A細(xì)胞比較腫瘤發(fā)生潛力顯著增加，但由于用于產(chǎn)生這個(gè)模型的染色體10上的另一個(gè)黑素瘤阻抑基因的保持而導(dǎo)致腫瘤發(fā)育遲緩(Robertsonetal.，CancerRes59:3596-3601(1999))。為了證實(shí)這些觀察結(jié)果并證實(shí)Akt3參與黑素瘤腫瘤發(fā)生的特異性，我們使用siRNA產(chǎn)生UACC903(Akt)模型。圖4B所示與僅用緩沖液、混雜的siRNA或者針對Akt2或Aktl的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，在UACC903細(xì)胞中siRNA-介導(dǎo)的Akt3表達(dá)(活性)明顯減慢腫瘤發(fā)育(P0.05)。因此，使用針對Akt3的siRNA特異性降低Akt3活性(圖4B)或者增加PTEN表達(dá)(圖4A)在裸鼠中均抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育。為了確定增加的凋亡是否是在Akt活性降低后在體內(nèi)抑制腫瘤的主要機(jī)制(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))，在Akt3活性不同的UACC903(PATEN)(圖4C、4E)和UACC903(Akt)(圖4D、4F)模型中檢測凋亡。將非致腫瘤發(fā)生的36A和致腫瘤發(fā)生的UACC903和36A回復(fù)體細(xì)胞系皮下注射進(jìn)裸鼠中，4天后收獲每個(gè)細(xì)胞類型的平行組中產(chǎn)生的時(shí)間和空間匹配的腫瘤實(shí)體，通過TUNNEL評估比較凋亡的程度(Stahletal.，CancerRes63:2891-2897(2003))。與具有高Akt3活性的親代UACC903(-PATEN)或者36A回復(fù)體(-PATEN)細(xì)胞系形成的腫瘤比較，在具有低Akt3活性的36A(+PTEN)腫瘤實(shí)體中觀察到明顯較大數(shù)目的凋亡細(xì)胞(圖4C，4E)(P<0.05)。在其中針對Akt3的siRNA用于降低Akt3表達(dá)(活性)的UACC903細(xì)胞中觀察到相似結(jié)果。用緩沖液或者針對Akt2的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與用針對Akt3的siRNA處理的UACC903細(xì)胞比較具有低大約5—7倍的凋亡細(xì)胞(圖4D，4F)(P<0.05)。因此，這些結(jié)果表明Akt3活性優(yōu)先調(diào)節(jié)凋亡的程度，從而有助于黑素瘤細(xì)胞存活并促進(jìn)腫瘤發(fā)生。對于Akt3的實(shí)驗(yàn)討論在本發(fā)明中，本發(fā)明人證實(shí)了Akt3是一種重要的存活激酶，部分與黑素瘤發(fā)育相關(guān)。使用反映Akt在黑素瘤腫瘤發(fā)生中重要性的UACC903(PTEN)黑素瘤模型鑒別Akt3是在黑素瘤腫瘤發(fā)生期間失調(diào)的主要同種型。使用siRNA證實(shí)Akt3而非Aktl或者Akt2的選擇性敲弱較低總體磷酸化的Akt水平及降低黑素瘤細(xì)胞的腫瘤發(fā)生潛力。在兩個(gè)獨(dú)立衍生的黑素瘤細(xì)胞系(WM115和SK-MEL-24)中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，進(jìn)一步支持了這種發(fā)現(xiàn)的重要性。這個(gè)觀察結(jié)果的臨床實(shí)用性通過證實(shí)選擇性抑制Akt3表達(dá)(通過siRNA敲弱)或者活性(通過PTEN表達(dá))顯著降低黑素瘤腫瘤發(fā)育而驗(yàn)證。在這項(xiàng)研究中鑒別了導(dǎo)致黑素瘤中Akt3激活的兩種獨(dú)特機(jī)制。第一種機(jī)制依賴于結(jié)構(gòu)正常的Akt3蛋白的過表達(dá)。對處于晚期階段的黑素瘤病人進(jìn)行分析示出在>60%的情況中Akt3表達(dá)增加。黑素細(xì)胞和WM35細(xì)胞中Akt3的過表達(dá)導(dǎo)致活性增加，證實(shí)人體腫瘤結(jié)果。Akt的過表達(dá)不是黑素瘤特有的，在報(bào)道Akt同種型的擴(kuò)增的許多研究中在一些人體癌癥中也已經(jīng)報(bào)道。Aktl的擴(kuò)增在胃癌中報(bào)道(Staal，S.O.，ProcNatAcadSciencesUSA84:5034-5037(1987))，而Akt2基因擴(kuò)增在卵巢、胰腺、胃和乳腺癌中報(bào)道(Chengetal.，ProcNatAcadSciencesUSA89:9267-9271(1992);Ghentetal.，ProcNatAcadSciencesUSA93:3636-3641(1996);Luetal.，Chung-HuaIHsuehTsaChih[ChineseMedicalJournal]75:679-682(1995);Bellacosaetal.，IntJCancer64:280-285(1995);vanDekkenetal.，CancerRes59:748-752(1999))。含有Akt基因的基因組區(qū)域的擴(kuò)增在黑素瘤中無報(bào)道，一些報(bào)道描述了含有Akt3基因的染色體1的長臂拷貝數(shù)增加(Bastianetal.,CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.，CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997))。相反，分別含有Aktl和Akt2基因的染色體14和染色體19的長臂趨于無改變或者喪失(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.，CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.,CancerRes57:2765-2780(1997))。因此，Akt3基因的拷貝數(shù)增加是在黑素瘤發(fā)育中Akt3的表達(dá)和活性增加的機(jī)制之一。第二種機(jī)制鑒別了在UACC903(PTEN)模型中選擇性Akt3激活部分是由于降低的PTEN活性所致。在黑素細(xì)胞和保持PTEN表達(dá)表達(dá)的原代黑素瘤細(xì)胞(WM35)中的相關(guān)觀察結(jié)果示出siRNA-介導(dǎo)的PTEN降低特異性增加Akt3磷酸化(活性)，進(jìn)一步鞏固了Akt3參與黑素瘤發(fā)生的意義。鑒定了在得自黑素瘤患者的腫瘤材料中發(fā)生的遺傳改變的公開研究提供了對于降低的PTEN表達(dá)在早期黑素瘤發(fā)生中起重要作用的額外支持(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.,CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997);Parmiteretal.，CancerGenetCytogenet30:313-317(1988))。特別地，在早期黑素瘤中由于染色體10的全部拷貝的喪失通常發(fā)生PTEN的一個(gè)等位基因喪失或者PTEN單倍體不足(haploinsu伍ciency)(Bastianetal.，CancerRes58:2170-2175(1998);Thomsonetal.，CancerGenetCytogenet83:93-104(1995);Mertensetal.，CancerRes57:2765-2780(1997);Parmiteretal.,CancerGenetCytogenet30:313-317(1988))。在這種情況下，推測染色體10的喪失在進(jìn)展的黑素瘤細(xì)胞的一個(gè)亞群中降低PTEN表達(dá)，導(dǎo)致Akt3激活增加，為這些細(xì)胞提供選擇性生長和存活優(yōu)勢。因此，由于黑素瘤中PTEN的單倍體不足或者活性喪失所致的表達(dá)降低在黑素瘤腫瘤進(jìn)展中通過特異性增加Akt3活性而起重要作用。在黑素瘤中PTEN表達(dá)降低之后Akt3而非Aktl和Art2的選擇性激活的分子基礎(chǔ)還未知。然而，我們推測導(dǎo)致這種特異性的機(jī)制涉及PIP3或者其它蛋白質(zhì)與普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)先相互作用。氨基末端PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)及PIP3脂質(zhì)一蛋白質(zhì)之間的相互作用。人Akt3的PH結(jié)構(gòu)域長度為大約104個(gè)氨基酸(NCBI登記號(hào):NP一005456)，與Aktl和Akt2的相同性分別為84%和78%(Braziletal.，Cell111:293-303(2002);Nicholsonetal.，CellSignal14:381-395(2002))。另外，PH結(jié)構(gòu)域中磷酸化位點(diǎn)在Akt同種型之間不同，還未鑒定其功能。例如，在第34位蘇氨酸(在PH結(jié)構(gòu)域內(nèi))的神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的、PKCzeta-依賴性磷酸化位點(diǎn)通過阻止與PIP3結(jié)合而導(dǎo)致Aktl失活(Powelletal.，MolCellBiol23:7794-7808(2003))。另一方面，Akt2和Akt3在這個(gè)位置是絲氨酸，其可以被磷酸化及不同調(diào)節(jié)。我們對三個(gè)Akt同種型的PH結(jié)構(gòu)域中其它潛在磷酸化位點(diǎn)的分析鑒別了三個(gè)潛在的獨(dú)特Akt3位點(diǎn)。Akt3的第21位殘基是天冬酰胺，而Aktl和Akt2的等同位點(diǎn)上是蘇氨酸。另外，還發(fā)現(xiàn)Akt3的第31位蘇氨酸和第49位酪氨酸與其它兩個(gè)Akt同種型不同(Aktl和Akt2分別為Asn31和Ser31;Aktl和Akt2分別為Ala50和Pro50)。因此，對于PIP3脂質(zhì)結(jié)合PH結(jié)構(gòu)域中推定的磷酸化位點(diǎn)的差別調(diào)節(jié)可為黑素瘤中Akt3激活的特異性提供基礎(chǔ)?？赡芤阎掳┗蛑g的未為人知的相互作用可以選擇性調(diào)節(jié)黑素瘤中Akt同種型的激活。例如，已經(jīng)示出TCL1選擇性結(jié)合Akt3PH結(jié)構(gòu)域并且促進(jìn)Aktl與Akt3的異源寡聚化，導(dǎo)致Akt分子在白血病發(fā)生中的轉(zhuǎn)磷酸作用(Laineetal.，JBiolChem277:3743-3751(2002))。黑素瘤細(xì)胞中TCL1或者其它未鑒定的因子可以相似方式促進(jìn)選擇性Akt3激活。增加的Akt3激活在進(jìn)展的至晚期侵潤性的腫瘤中也起顯著作用。在轉(zhuǎn)移黑素瘤中Akt3表達(dá)和活性的檢測表明在>60°/。的晚期階段轉(zhuǎn)移黑素瘤中出現(xiàn)Akt3表達(dá)或活性失常。然而，目前還未知升高的Akt3活性是否可預(yù)測疾病預(yù)后或者治療方案的結(jié)果。在黑素瘤中Akt3激活的測定提供了作為一種新的、更精確的疾病預(yù)后指標(biāo)的希望，這種指標(biāo)優(yōu)于目前使用的組織病理學(xué)測定如Breslow深度(即從粒細(xì)胞層至最深的腫瘤細(xì)胞的以毫米測定的距離)和潰瘍(即喪失覆蓋黑素瘤的表皮)。評定黑素細(xì)胞損害中Akt3的激活狀態(tài)的一種基于分子的測試比組織學(xué)評估可以更敏感并且主觀性較低。這種方法也可用于選擇合適的患者以利用設(shè)計(jì)為靶向激活的Akt3或者這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑其它成員的藥物進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)研究示出使用siRNA或者表達(dá)PTEN降低Akt3活性可以通過改變凋亡敏感性而有效地降低黑素瘤細(xì)胞的腫瘤發(fā)生潛力。因此，具有高水平Akt3活性的黑素瘤細(xì)胞更適于在體內(nèi)腫瘤環(huán)境中存活，并且直接抑制或者通過干擾其上游調(diào)節(jié)子抑制Akt3活性很可能是對黑素瘤患者的一種有效的抗癌策略(Soengasetal.，Oncogen22:3138-3151(2003);Johnstoneetal.，Cell108:153-164(2002))。事實(shí)上，大多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)凋亡而起作用的，因此可推測抑制Akt3可降低有效的化療或放療所需要的藥物或者放射的閾值劑量，這提供了一種選擇性靶向黑素瘤細(xì)胞的機(jī)制(Soengasetal.，Oncogen22:3138-3151(2003))。因此，單獨(dú)或者組合化療藥物治療性靶向Akt3活性對于黑素瘤患者可以是一種潛在的重要治療方法(Soengasetal.，Oncogen22:3138-3151(2003))?？傊覀円呀?jīng)鑒別了Akt3是一種特異性促存活激酶，其在黑素瘤腫瘤中增加的活性與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，并且提供了對于增殖和存活環(huán)境應(yīng)激具有選擇性優(yōu)勢的細(xì)胞。B-RAF實(shí)施例材料和方法實(shí)施例10:細(xì)胞系、培養(yǎng)條件和B-Raf突變狀況將人黑素瘤細(xì)胞系UACC903、1205Lu和C8161以及HEK293T細(xì)胞在補(bǔ)加了10%FBS(Hyclone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中維持。如先前所述在UACC903和C8161細(xì)胞系中確定T1796AB-RAF突變的存在與否(MillerCJetal.JInvestDermatol.123:990-2(2004))。另外，先前已經(jīng)報(bào)道了在UACC903禾B1205Lu細(xì)胞中存在這種突變(MillerCJetal.JInvestDermatol.123:990-2(2004)，TsaoHetal.JInvestDermatol.122:337-41(2004)，KrasilnikovMetal.Oncogene.22:4092-101(2003))。實(shí)施例11:體外siRNA研究將siRNA(100pmol)導(dǎo)入經(jīng)AmaxaNucleofector(Koeln，Germany)核轉(zhuǎn)染的lxl06UACC903、1205Lu或者C8161細(xì)胞中，使用如參考文獻(xiàn)(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004))所述方案R/程序K-17進(jìn)行。所得核轉(zhuǎn)染效力>90%。在核轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞再鋪板24一48小時(shí)，之后收獲蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行Western印跡分析。為了測定siRNA敲弱的持續(xù)時(shí)間，在用B-Raf或者C-Raf的siRNA核轉(zhuǎn)染后第0、2、4、6和8天收獲細(xì)胞，進(jìn)行Western印跡分析。這些研究使用DuplexeStealthsiRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根據(jù)參考文獻(xiàn)(HingoraniSRetal.CancerRes.;63:5198-202(2003))修飾B-Raf序列。使用的siRNA序列如下\\0^-/^尸((:0]^4或4)-GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU;MUT(MuA或A)-GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU;CiMF-GGUCAAUGUGCGAAAUGGAAUGAGC;"M/AM/C-GAGGAACUGGACUUCCAGAAGAACA;及GCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTA。實(shí)施例12:Western印跡分析為了進(jìn)行Western印跡分析，通過加入含有如下成分的裂解緩沖液在培養(yǎng)皿中收獲細(xì)胞裂解物50mMHEPES(pH7.5)、150mMNaCl、10mMEDTA、10%甘油、1%TritonX-100、lmM原釩酸鈉、O.lmM鉬酸鈉、ImM苯甲基磺酰氟、20昭/ml的抑酶肽及5嗎/ml的亮抑蛋白酶肽。將全部細(xì)胞裂解物在4"C離心(^10，000Xg)10分鐘以除去細(xì)胞碎片。蛋白質(zhì)使用Pierce(Rockford，IL)的BCA分析量化，將30昭裂解物/泳道加樣于NuPageGelLifeTechnologies,Inc.(Carlsbad,CA)上。在電泳之后，將樣品移至聚偏二氟乙烯膜(PallCorporation,Pensacola，F(xiàn)L)。根據(jù)每個(gè)供應(yīng)商的推薦用抗體探查印跡抗-pErk和抗-pMek來自CellSignalingTechnologies(Beverly,MA);B-Raf、C-Raf、Erk2和a-烯醇化酶的抗體來自SantaCruzBiotechnology(SantaCmz，CA);及LaminA/C的抗體來自BiomedaCorp(FosterCity，CA)。將二級抗體與辣根過氧化物酶綴合，所述抗體得自SantaCruzBiotechnology。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)顯色免疫印跡。實(shí)施例13:體內(nèi)SiRNA研究豐艮據(jù)InstitutionalAnimalCareandUseCommitteei午可的方案在ThePennsylvaniaStateUniversityCollegeofMedicine進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過在6只4—6周齡裸鼠(HarlanSpragueDawley，Indianopolis.IN)的左側(cè)和右側(cè)胸腔皮下注射用siRNA核轉(zhuǎn)染的、于補(bǔ)加了10%FBS的0.2mlDMEM中的lxl06UACC903或者1205Lu細(xì)胞來測定腫瘤動(dòng)力學(xué)。發(fā)育腫瘤的直徑使用測徑器隔天測定。為進(jìn)行機(jī)制研究，將用siRNA核轉(zhuǎn)染的5xl06UACC903細(xì)胞注射進(jìn)小鼠并在注射細(xì)胞4天后收獲腫瘤以測定細(xì)胞增殖和凋亡的變化，如前述(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004)，StahlJMetal.CancerRes.63:2881-90(2003))。實(shí)施例14:體外和體內(nèi)BAY43-9006研究用于這些研究的BAY43-9006化合物如參考文獻(xiàn)(BankstonDetal.OrganicProcessResDev.6:777-81(2002))所述合成。為了評價(jià)BAY43-9006對野生型和突變體B-Raf的抑制作用，將HEK293T細(xì)胞用HA標(biāo)記的野生型B-RAF、突變體V599EB-RAF或者載體(pcDNA3)轉(zhuǎn)染，使用如前述磷酸鈣進(jìn)行(RobertsonGPetal.ProcNatlAcadSciUSA.95:9418-23(1998))。在轉(zhuǎn)染后(72小時(shí))，將培養(yǎng)基用補(bǔ)加了10%FBS和5pMBAY43-9006或者DMSO載體的DMEM培養(yǎng)基更換。2小時(shí)后，收集蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行Western印跡分析。磷酸化的Mek和Erk的水平從3個(gè)獨(dú)立的印跡中量化，在不同條件下的折疊差異在針對Erk2加樣對照標(biāo)準(zhǔn)化之后評估。BAY43-9006對腫瘤發(fā)育的作用通過將5X106UACC903或者1X1061205Lu細(xì)胞皮下注射進(jìn)裸鼠中而測定。6天后當(dāng)小腫瘤(50—100mm"產(chǎn)生時(shí)，隔天為小鼠腹膜內(nèi)注射50pl載體(DMSO)或者藥物BAY43-9006，對于UACC903細(xì)胞濃度為10、50或者100mg/kg體重，對于1205Lu細(xì)胞濃度為50mg/kg體重。為了進(jìn)行涉及用BAY43-9006預(yù)處理的研究，在皮下注射UACC卯3或者1205Lu細(xì)胞之前，經(jīng)腹膜內(nèi)注射兩次50mg/kg體重的藥物(前4天和前2天)。藥理學(xué)抑制突變體vs"EB-Raf可延遲腫瘤發(fā)育的機(jī)制通過比較平行實(shí)驗(yàn)組中產(chǎn)生的相同大小的腫瘤而鑒別。這是通過皮下注射5X1(^UACC卯3細(xì)胞，隨后從第6天每2天經(jīng)腹膜內(nèi)注射50mg/kg的BAY43-卯06而實(shí)現(xiàn)。為了對照組DMSO與藥物處理的腫瘤的時(shí)間和空間上的匹配，皮下注射1X106、2.5xl06或者5xl()6個(gè)UACC903細(xì)胞并從第6天開始每2天腹膜內(nèi)注射DMS0載體進(jìn)行處理。在第9、11、13和15天收獲平行實(shí)驗(yàn)組中產(chǎn)生的相同大小的經(jīng)藥物或者載體處理的腫瘤進(jìn)行比較。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲經(jīng)載體或者藥物處理的小鼠的腫瘤分析細(xì)胞增殖、凋亡和血管發(fā)生情況，如前述(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004)，StahlJMetal.CancerRes.63:2881-卯(2003))。實(shí)施例15:腫瘤中凋亡、細(xì)胞增殖和血管密度測定使用Roche公司(Manheim，Germany)的TUNELTMRRedApoptosis試劑盒對福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤切片進(jìn)行凋亡測定，如前述(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004)，StahlJMetal.CancerRes.63:2881-90(2003))。在福爾馬林固定的腫瘤切片中細(xì)胞增殖率使用RPN20細(xì)胞增殖試劑盒(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)測定，其利用BrdU摻入和免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行。在處死之前2小時(shí)，將0.2mlBrdU經(jīng)腹膜內(nèi)注射進(jìn)小鼠中并根據(jù)增殖試劑盒的使用說明處理腫瘤。計(jì)算BrdU染色的細(xì)胞的數(shù)目占用BAY43-9006或者載體(DMSO)處理的全部腫瘤細(xì)胞的百分比。如前述使用純化的大鼠抗小鼠CD31(PECAM-l)單克隆抗體(Pharmingen，SanDiego，CA)量化血管密度(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004)，StahlJMetal.CancerRes.63:2881-90(2003))。使用IPLabimaging軟件程序計(jì)算整個(gè)區(qū)域中血管占據(jù)腫瘤的區(qū)域的比例。對于所有腫瘤分析，均使用4一6個(gè)視野/腫瘤分析最少6個(gè)不同的腫瘤，結(jié)果以平均值土SEM表示。實(shí)施例16:體內(nèi)pErk測定為了量化在福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤切片中pErk水平的變化，在95。C水浴中用0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)進(jìn)行20分鐘抗原挽回(antigenretrieval)。將載玻片冷卻20分鐘，在PBS中漂洗，然后在3%&02中保溫10分鐘以猝滅內(nèi)源過氧化物酶活性。接著，將切片用1%BSA封閉30分鐘，與1:100稀釋的抗pERK抗體(CellSignalingTechnologies,Beverly,MA)在4。C保溫過夜。在PBS中漂洗后，將切片與生物素?；目雇肐gG保溫1小時(shí)，再次在PBS中漂洗，與過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白保溫30分鐘。使用AEC(氨乙基咔唑)底物試劑盒顯色5—10分鐘(ZymedlaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco,CA)，在使用水相封固溶液對蓋玻片封固之前用蘇木精復(fù)染核。用4一6視野/腫瘤從最少6個(gè)不同腫瘤中計(jì)數(shù)pErk染色陽性的細(xì)胞士SEM的平均百分比。實(shí)施例17:體外倍增時(shí)間和體內(nèi)腫瘤潛伏期用siRNA核轉(zhuǎn)染的UACC卯3細(xì)胞的體外倍增時(shí)間通過將5X103個(gè)細(xì)胞/孔鋪板于5個(gè)96孔平板的多排孔(補(bǔ)加了10%FBS的200^1DMEM)中進(jìn)行估計(jì)。使用SulforhodamineB(SRB)結(jié)合分析(SigmaChemicalCo.，StLouis，MO)每天通過進(jìn)行比色法分析對一個(gè)平板每24小時(shí)測定一次生長情況，共測定5天，倍增時(shí)間如前述計(jì)算(StahlJMetal.CancerRes.63:2881-90(2003))。體內(nèi)腫瘤潛伏期通過估計(jì)平均腫瘤大小達(dá)到10mm3需要的天數(shù)而測定。實(shí)施例18:BAY43-9006生長抑制/UACC903黑素瘤細(xì)胞的IC-50為了測定BAY43-9006對UACC卯3細(xì)胞的生長抑制作用或者IC-50,將5Xl()S個(gè)細(xì)胞/孔鋪板于96孔平板中。24小時(shí)后，向平板中8條孔中一式兩份加入不同濃度的BAY43-9006(0、0.02、0.K0.4、1.6、6.3、25或者100nM)。在37。C在5%0)2濕潤環(huán)境中生長72小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基并將細(xì)胞固定在10%三氯乙酸中。在每種濃度藥物中存活的細(xì)胞使用SRB結(jié)合分析(StahlJMetal.CancerRes,63:2881-90(2003))計(jì)算。使用Western印跡分析證實(shí)在暴露于藥物2小時(shí)后，增加濃度的BAY43-9006(5、10、15或者20pM)對UACC903細(xì)胞中Mekl/2和Erkl/2磷酸化水平的作用。實(shí)施例19:VEGF表達(dá)分析為了確定在siRNA介導(dǎo)的B-Raf蛋白敲弱之后或者在用BAY43-9006處理之后細(xì)胞分泌的VEGF的量，使用人VEGFQuantikine試劑盒(DVE00)(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)。將用不同siRNA核轉(zhuǎn)染的UACC903或者1205Lu細(xì)胞(5X105)鋪板在60mm有蓋培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后將培養(yǎng)基用含有2%FBS的DMEM更換。再過24小時(shí)后，將培養(yǎng)基再次更換，在24和48小時(shí)后收集進(jìn)行ELISA分析的條件培養(yǎng)基。為了進(jìn)行BAY43-9006研究，將3X105的UACC903或者1205Lu細(xì)胞鋪板于60mm有蓋培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為含有2MFBS的DMEM。再過24小時(shí)后，將培養(yǎng)基用只補(bǔ)加2%FBS或者組合了BAY43-9006(5、10、15pM)或DMSO載體的DMEM更換。12或者24小時(shí)后，收集條件培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA分析。培養(yǎng)基通過以14,000rpm(4。C)離心5分鐘而澄清，在一80。C貯存。在一式兩份實(shí)驗(yàn)中根據(jù)廠商指導(dǎo)一式三份進(jìn)行VEGFELISA分析。實(shí)施例20:統(tǒng)計(jì)學(xué)為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Student'st-檢驗(yàn)進(jìn)行成對比較及使用One-wayAnalysisofVariance(ANOVA)或者使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行成組分析，隨后進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖潞髾z驗(yàn)(Dunnett's，Tukey's或者Dunn's)。在P值<0.05時(shí)認(rèn)為結(jié)果是顯著的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例21:SiRNA介導(dǎo)的靶向突變體V599EB-Raf抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育表2、用針對B-Raf、C-Raf的siRNA或者混雜的siRNA處理的UACC903細(xì)胞的生長性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>腫瘤形成潛伏期定義為平均腫瘤大小達(dá)到10mm3所需的天數(shù)目前還未知突變體V599EB-Raf在黑素瘤腫瘤發(fā)生中的作用。為了解決這個(gè)問題，我們認(rèn)為突變體V599EB-Raf蛋白的表達(dá)或者活性的抑制可用于鑒別這個(gè)蛋白質(zhì)在黑素瘤腫瘤發(fā)生中的作用。使用siRNA介導(dǎo)的方法在含有突變蛋白的UACC903和1205Lu細(xì)胞系中敲弱突變體V599EB-Raf的表達(dá)或者在沒有T1796A突變的C8161細(xì)胞系中敲弱B-Raf的表達(dá)。設(shè)計(jì)MuA或者AsiRNA以降低野生型和突變蛋白的表達(dá)，而Com4或者4siRNA僅降低突變蛋白的表達(dá)，如前述(HingoraniSRetal.CancerRes.;63:5198-202(2003))。將這些研究中的siRNA通過核轉(zhuǎn)染導(dǎo)入所述細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染效率>90%(數(shù)據(jù)未示出)(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004))。核轉(zhuǎn)染后siRNA在UACC903(圖12A)、1205Lu(圖12B)和C8161(圖12C)細(xì)胞中降低B-Raf和C-Raf蛋白表達(dá)的效力通過Western印跡分析測定。在核轉(zhuǎn)染24和48小時(shí)后，每種siRNA只降低其針對而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而表明siRNA敲弱在這些每個(gè)細(xì)胞系中每一種中的特異性和效力。在UACC903和1205Lu細(xì)胞中，只有B-Raf的siRNA降低下游耙Mek和Erk的磷酸化(活性)水平，而混雜的siRNA或者C-Raf的siRNA對這些蛋白質(zhì)無作用(圖12A和圖12B)。在核轉(zhuǎn)染48小時(shí)104后在UACC卯3和1205Lu細(xì)胞中觀察到最大的Mek和Erk磷酸化(活性)水平降低。相反，在C8161細(xì)胞中降低的B-Raf或者C-Raf表達(dá)對磷酸化的Mek和Erk的水平具有可忽略的不顯著作用(圖12C)。因此，含有突變蛋白的黑素瘤細(xì)胞系中vs"EB-Raf表達(dá)的抑制導(dǎo)致Mek和Erk的活性降低，而在沒有T1796A突變的黑素瘤細(xì)胞中降低B-Raf蛋白的表達(dá)對下游靶的活性無影響。為了測定降低的V599EB-Raf表達(dá)(活性)對黑素瘤腫瘤發(fā)育的作用，通過皮下注射小鼠使用瞬時(shí)敲弱方法將UACC903和1205Lu細(xì)胞系中V599EB-Raf表達(dá)用siRNA抑制，如前述(StahlJMetal.CancerRes.64:7002-10(2004))。SiRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)的敲弱在UACC903(圖13A)和1205Lu(圖13B)細(xì)胞中持續(xù)最少8天。另外，在相同時(shí)期還觀察到pErk水平相應(yīng)降低(圖13B)。隔天測定產(chǎn)生的腫瘤的大小直至核轉(zhuǎn)染后第17.5天，確定B-Raf敲弱對黑素瘤腫瘤發(fā)生的作用。在其中突變體""EB-Raf表達(dá)己經(jīng)敲弱的UACC903(圖13C)和1205Lu(圖13D)細(xì)胞中均觀察到腫瘤發(fā)育降低。相反，siRNA介導(dǎo)的C-Raf抑制，混雜的siRNA或者緩沖液對照組不改變腫瘤發(fā)育。在敲弱C-Raf之后無作用，提示通過V599EB-Raf的信號(hào)傳導(dǎo)是腫瘤發(fā)育特異需要的。因此，在注射小鼠之前siRNA-介導(dǎo)的黑素瘤細(xì)胞中vs艦B-Raf表達(dá)(活性)的降低抑制腫瘤發(fā)生。使用稱作BAY43-9006的Raf激酶抑制劑進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)，以抑制UACC903、1205Lu或者C8161細(xì)胞中B-Raf蛋白的活性。這種化合物最初是在篩選Raf激酶抑制劑中鑒別的，其有效抑制野生型B-Raf蛋白的活性(LowingerTBetal.CurrPharmDes.8:2269-78(2002)，LyonsJFetal.EndocrRelatCancer.8:219-25(2001))。最初我們確定了BAY43-9006使UACC903細(xì)胞存活率降低一半(也稱作IC50)的濃度，發(fā)現(xiàn)該濃度為5—6pM(數(shù)據(jù)未示出)。因此，選擇5pM濃度進(jìn)行隨后的體外研究。接著，我們通過在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)HA標(biāo)記的野生型或者突變體V599EB-Raf構(gòu)建體而證實(shí)了BAY43-9006以相似程度抑制突變體和野生型B-Raf蛋白的活性(圖14A)。如前述，我們觀察到磷酸化的(活性)Erk或者M(jìn)ek在表達(dá)V599EB-Raf的細(xì)胞中的水平比在僅用野生型B-RAF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的水平高5—7倍(DaviesHetal.Nature.417:949-54(2002))。然后將表達(dá)野生型或者突變體，犯B-Raf蛋白的HEK293T細(xì)胞暴露于5|iM的BAY43-9006有2小時(shí)，檢測對信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性的作用。暴露于BAY43-9006分別使表達(dá)野生型或者突變體V599EB-Raf蛋白的細(xì)胞中磷酸化的Mek和Erk的水平降低5—6倍和3—4倍(圖14A)。因此，BAY43-9006抑制野生型和突變體B-Raf的活性。為了證實(shí)BAY43-9006抑制突變體V599EB-Raf蛋白在UACC卯3細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，將體外培養(yǎng)物暴露于增加濃度的BAY43-9006有2小時(shí)。BAY43-9006在UACC卯3細(xì)胞中以劑量應(yīng)答方式降低磷酸化的(活性)Mek和Erk的水平(圖14B)。在UACC903和1205Lu細(xì)胞系中BAY43-9006對MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用持續(xù)至少2—3天(數(shù)據(jù)未示出)。我們接著評價(jià)在皮下注射UACC903或者1205Lu細(xì)胞之前用BAY43-9006對動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理的作用。對于這些實(shí)驗(yàn)，將小鼠暴露于50mg/kgBAY43-9006共4天，之后皮下注射5X106個(gè)細(xì)胞，隨后每2或3天經(jīng)腹膜內(nèi)注射藥物直至22天。UACC卯3(圖14C)和1205Lu(未示出)腫瘤發(fā)育均被明顯抑制(Student'st-檢驗(yàn)；p<0.05)，大小匹配的UACC903腫瘤的比較表明與載體處理的對照組(未示出)比較在BAY43-9006處理的腫瘤中增殖降低及血管發(fā)生減少。另夕卜，腫瘤大小緩慢增加至第8天，之后穩(wěn)定，在隨后的腫瘤測定中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ANOVA;P>0.05)。因此，通過用BAY43-9006對宿主動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理而對突變體vs"EB-Raf活性的藥理學(xué)抑制作用顯著降低表達(dá)突變體w"EB-Raf的黑素瘤細(xì)胞的腫瘤發(fā)生潛力。為了鑒別在用siRNA預(yù)處理以敲弱V599EB-Raf活性的細(xì)胞中導(dǎo)致腫瘤抑制的機(jī)制，在皮下注射4天后在UACC903腫瘤中測定腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡率。使用TUNNEL分析檢測到凋亡率(l—2%)無差異(數(shù)據(jù)未示出)。然而，用針對B-Raf的siRNA處理的UACC903細(xì)胞與僅用緩沖液、混雜的siRNA或者C-WFsiRNA核轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞比較，增殖細(xì)胞低5—6倍(圖14D)。接著，比較UACC903細(xì)胞系的體外倍增時(shí)間、體內(nèi)增殖速度和腫瘤潛伏期以確定降低的生長是否是腫瘤發(fā)育延遲的原因(表2)。用C-WF的siRNA或者混雜的siRNA核轉(zhuǎn)染的UACC903細(xì)胞在體外每1.2天(或者29小時(shí))數(shù)目倍增一次，而用針對6-WF的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞每1.65天(或者~40小時(shí))倍增一次，延遲大約38%。相反，與用針對B-Raf的siRNA核轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞(具有2—3%增殖細(xì)胞)比較，腫瘤中增殖細(xì)胞分析示出用C-Raf的siRNA或者混雜的siRNA核轉(zhuǎn)染的對照腫瘤(具有10-15%增殖細(xì)胞)之間具有顯著差異(ANOVA;p<0.05)。用S-7MFsiRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖能力降低大約82%可以是造成腫瘤發(fā)育潛伏期延長的原因。因此，對于在第5天與對照組相同大小的腫瘤，用針對萬-iL4F的siRNA核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需要再過10天才可以形成相同大小的腫瘤(表2)。由于腫瘤發(fā)育被延遲>200%，因此在體外和體內(nèi)觀察到的降低的生長速度可以是造成這些細(xì)胞腫瘤發(fā)生潛力降低的原因。因此，在腫瘤形成之前在黑素瘤細(xì)胞中抑制突變體vs"EB-Raf表達(dá)(活性)顯著降低細(xì)胞的體內(nèi)生長潛力，從而延遲腫瘤發(fā)生。實(shí)施例22:通過在預(yù)先存在的腫瘤中靶向突變體V599EB-Raf而抑制黑素瘤腫瘤發(fā)育目前還未知在確定已經(jīng)存在的黑素瘤腫瘤中靶向突變體V599EB-Raf是否可以延遲腫瘤發(fā)育，如果是這樣，也未知該機(jī)制與在腫瘤形成之前靶向細(xì)胞中vs"EB-Raf時(shí)的機(jī)制是否相同。因此，我們接著檢測了在已經(jīng)存在的黑素瘤腫瘤中藥理學(xué)靶向B-Raf是否可通過相似機(jī)制抑制腫瘤發(fā)育。將5百萬個(gè)UACC903細(xì)胞、1百萬個(gè)1205Lu細(xì)胞或者5百萬個(gè)C8161細(xì)胞經(jīng)皮下注射進(jìn)4一6周齡的雌性裸鼠中。在第6天，每48小時(shí)通過腹膜內(nèi)注射給予小鼠載體(DMSO)或者溶解于載體中的BAY43-卯06化合物(10、50或者100mg/kg)。選擇給予藥物之間間隔48小時(shí)是因?yàn)檫@是在UACC903、1205Lu和C8161細(xì)胞中對MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制作用持續(xù)的最少時(shí)間(數(shù)據(jù)未示出)。發(fā)生的腫瘤的大小使用測徑器隔天測定，對于UACC903細(xì)胞的結(jié)果示于圖4A，對于1205Lu細(xì)胞的結(jié)果示于圖15B。雖然所有濃度的BAY43-9006化合物均減緩UACC卯3腫瘤發(fā)育，但是只有^50mg/kg濃度使得腫瘤在開始處理7天后進(jìn)入平臺(tái)期(圖4B)。用10mg/kg的BAY43-9006處理的小鼠中腫瘤發(fā)育延遲1周，但是UACC903腫瘤的大小不斷增加，在第27天當(dāng)腫瘤達(dá)到》,400mm3時(shí)對小鼠行安樂死。對于UACC903細(xì)胞，直至第13天腫瘤大小還略有增加，然而在藥物處理1周后，腫瘤大小穩(wěn)定并且在第13—31天腫瘤大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(圖15A)(AN0VA;P>0.05)。用50mg/kgBAY43-卯06處理1205Lu腫瘤在第17—31天也以使得腫瘤大小進(jìn)入平臺(tái)期的相似方式降低腫瘤發(fā)育(圖15B))(ANOVA;P=0.12)。相反，雖然BAY43-9006在C8161細(xì)胞中抑制pMek和pErk水平，但是在腫瘤形成的動(dòng)力學(xué)中觀察到無差異(數(shù)據(jù)未示出)。因此，對突變體vs"EB-Raf活性的藥理學(xué)抑制在已經(jīng)存在的黑素瘤腫瘤中延遲腫瘤發(fā)育，但是不導(dǎo)致腫瘤消退。相反，在沒有T1796A突變的黑素瘤細(xì)胞中抑制B-Raf看起來不改變腫瘤發(fā)生潛力。為了證實(shí)BAY43-卯06化合物影響腫瘤中突變體V599EB-Raf信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性，在用載體(DMSO)或者含有50mg/kgBAY43-9006的載體開始處理9天后，為小鼠腫瘤中磷酸化的Erk表達(dá)水平增加的細(xì)胞百分比評分(圖15C)。對pErk陽性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行量化，示出BAY43-9006處理的腫瘤比對照載體處理的腫瘤少3倍的pErk陽性細(xì)胞(圖15D)(Student'st-檢驗(yàn)；P<0.05)。在載體處理的腫瘤中顯著較多的磷酸化Erk陽性細(xì)胞的數(shù)目表明BAY43-9006在體內(nèi)抑制突變體，兆B-Raf信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性。因此，這些結(jié)果表明用BAY43-9006對突變體V599EB-Raf進(jìn)行藥理學(xué)抑制降低腫瘤中MAP激酶途徑信號(hào)傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)腫瘤抑制作用。實(shí)施例23:從機(jī)制上，BAY43-9006抑制預(yù)先存在的黑素瘤腫瘤的血管發(fā)生，導(dǎo)致凋亡增加前述的實(shí)驗(yàn)示出突變體vs"EB-Raf活性的抑制與降低的腫瘤發(fā)育之間的一致關(guān)系，因此，隨后的研究集中在鑒別這種現(xiàn)象在已經(jīng)存在的黑素瘤中發(fā)生的機(jī)制方面。在這些研究中，對暴露于載體或者BAY43-9006的時(shí)空匹配的UACC903腫瘤分析其血管發(fā)生情況以及凋亡和增殖率，以鑒別延遲已確定存在的腫瘤生長的關(guān)鍵事件。從第9天開始至第15天結(jié)束，每兩天收獲匹配的腫瘤，比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡、生長和血管發(fā)生率(圖16)。在第9天觀察到在載體和BAY43-卯06處理的腫瘤之間血管發(fā)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(圖5A)(Student'st-檢驗(yàn)；P<0.05)。相反，在對照和BAY43-卯06處理的腫瘤之間，在第9天檢測到在腫瘤塊中增殖細(xì)胞的數(shù)目(Student'st-檢驗(yàn)；P-0.61)或者凋亡面積(Student'st-檢驗(yàn)；P-0.15)方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(圖16B和圖16C)。然而，對于從第11天起的所有分析，在對照和藥物處理的腫瘤之間均觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(Student'st-檢驗(yàn)；P<0.05)?？傊?，這些數(shù)據(jù)提示在BAY43-9006處理的腫瘤中在第9天觀察到的顯著降低的血管發(fā)生是導(dǎo)致腫瘤生長延遲的始發(fā)事件。在BAY43-9006處理的腫瘤中凋亡在第11天變得明顯，在第15天占腫瘤面積的高達(dá)25%(圖16B)。在第20天，大約50%的腫瘤面積正經(jīng)歷凋亡(數(shù)據(jù)未示出)。BAY43-9006還影響預(yù)先存在的腫瘤的腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致增殖細(xì)胞的百分比降低32—57%(圖16C)?？傊?，根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論血管發(fā)生的抑制是導(dǎo)致預(yù)先存在的黑素瘤腫瘤的生長抑制的關(guān)鍵事件。由于腫瘤中血管發(fā)生通過血管發(fā)生機(jī)制或者從周圍血管床中生長新的血管而產(chǎn)生，并且由腫瘤細(xì)胞分泌的血管發(fā)生因子觸發(fā)(CarmelietP，JainRK.Nature.407:249-57(2000))，因此我們推測BAY43-9006和siRNA介導(dǎo)的V599EB-Raf抑制降低關(guān)鍵性血管發(fā)生因子的活性，從而降低血管發(fā)育(KranenburgOetal.BiochimBiophysActa.1654:23-37(2004)，JainRK.SeminOncol.29:3-9(2002))。為了檢查這種可能性，使用ELISA分析確定在V599EB-RAF抑制后VEGF分泌是否降低。最初檢查了其中V599EB-Raf表達(dá)用siRNA抑制的UACC卯3和1205Lu細(xì)胞，并揭示與對照比較VEGF分泌顯著降低(圖17A)。接著，檢査V599EB-RafUACC903和1205Lu細(xì)胞的BAY43-9006介導(dǎo)的抑制作用，也發(fā)現(xiàn)以劑量依賴性方式降低VEGF分泌(圖17B)。為了確定siRNA介導(dǎo)的VEGF降低是否導(dǎo)致與V599EB-Raf抑制后相似的腫瘤抑制，將針對VEGF的siRNA核轉(zhuǎn)染進(jìn)UACC903或者1205Lu細(xì)胞中。使用VEGF特異性siRNA觀察到降低的VEGF表達(dá)(圖17A)，其以與vs"EB-Raf表達(dá)降低后一致的方式降低UACC卯3(圖17C)和1205Lu(圖17D)細(xì)胞的致腫瘤發(fā)育潛力。因此，由降低的V599EB-Raf活性介導(dǎo)的降低的VEGF分泌導(dǎo)致血管發(fā)育受抑制，隨之影響黑素瘤腫瘤的發(fā)育。對B-Raf的實(shí)驗(yàn)討論這項(xiàng)研究證實(shí)使用siRNA抑制或者藥理學(xué)抑制突變體V599EB-Raf表達(dá)(活性)可以通過降低腫瘤細(xì)胞的增殖和/或血管生成能力而有效降低黑素瘤細(xì)胞的致腫瘤發(fā)育潛力。由此，具有突變體^"EB-Raf的黑素瘤更適于在體內(nèi)腫瘤環(huán)境中增殖。我們揭示了在腫瘤發(fā)育之前黑素瘤細(xì)胞中V599EB-Raf表達(dá)(活性)的靶向降低顯著降低了黑素瘤細(xì)胞的生長潛力，從而抑制腫瘤發(fā)育。相反，凋亡在這個(gè)過程中無明顯作用。另外，腫瘤發(fā)育的抑制僅在突變體vs"EB-Raf表達(dá)已經(jīng)被敲弱的細(xì)胞中觀察到，而在敲弱C-Raf之后或在缺少T1796AB-i^F突變的黑素瘤細(xì)胞中敲弱B-Raf之后未觀察到如此結(jié)果。因此，顯然通過V599EB-Raf的信號(hào)傳導(dǎo)是黑素瘤腫瘤發(fā)育所特別需要的。這些數(shù)據(jù)與我們先前證實(shí)在WM793黑素瘤細(xì)胞中siRNA介導(dǎo)的V599EB-Raf的抑制降低這些細(xì)胞的體外生長潛力的研究結(jié)果一致(HingoraniSRetal.CancerRes.;63:5198-202(2003))。與使用UACC903細(xì)胞的體外研究相似，這篇報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)這些早期的觀察結(jié)果。突變體V599EB-Raf表達(dá)(活性)的敲弱還特異性降低組成型Erk信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致生長降低，這種情況在敲弱C-Raf后未出現(xiàn)。因此，突變體vs"EB-Raf在體外和體內(nèi)均促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的生長，另外，在腫瘤發(fā)育之前的靶向抑制通過腫瘤細(xì)胞生長降低而抑制腫瘤發(fā)育。在預(yù)先存在的腫瘤中靶向突變體V599EB-Raf使得腫瘤生長減緩，然而在這個(gè)過程中生長抑制僅起部分作用。更明顯地，大小與時(shí)間匹配的腫瘤的比較表明血管發(fā)育的抑制在延遲腫瘤生長中起啟動(dòng)作用。在所有實(shí)體瘤中，血管發(fā)育是通過血管發(fā)生機(jī)制產(chǎn)生的，其中新血管從周圍血管床的生長是由腫瘤細(xì)胞分泌的血管發(fā)生因子驅(qū)動(dòng)的(CarmelietP，JainRK.Nature.407:249-57(2000))。在這個(gè)研究中，我們發(fā)現(xiàn)V599EB-Raf的抑制降低了UACC903和1205Lu黑素瘤細(xì)胞分泌VEGF。據(jù)報(bào)道B-Raf在胚胎血管發(fā)育中起重要作用，因?yàn)镾-i^F敲除小鼠呈現(xiàn)明顯的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，導(dǎo)致出血和胚胎死亡(WojnowskiLetal.NatGenet;16:293-7(1997))。然而，我們觀察到在預(yù)先存在的腫瘤血管中在使用BAY43-9006抑制V599EB-Raf之后沒有明顯的內(nèi)皮細(xì)胞死亡。更確切地，對vs"EB-Raf的抑制通過腫瘤細(xì)胞分泌VEGF減少而介導(dǎo)抑制血管發(fā)生(KranenburgOetal.BiochimBiophysActa.1654:23-37(2004)，JainRK.SeminOncol.29:3-9(2002))。這個(gè)觀察結(jié)果得到了公開的證據(jù)支持，所述證據(jù)中降低的VEGF分泌導(dǎo)致降低的血管發(fā)生，從而抑制癌細(xì)胞的致腫瘤發(fā)育潛力(HeidenreichRetal.IntJCancer.111:348-57(2004)，InaiTetal.AmJPatrol.165:35-52(2004))。因此，由突變體V599EB-Raf信號(hào)傳導(dǎo)降低介導(dǎo)的VEGF分泌的降低導(dǎo)致血管發(fā)生的抑制，使得先前存在的黑素瘤腫瘤生長停止。我們的研究還示出BAY43-9006在體外和體內(nèi)均抑制V599EB-Raf的活性，導(dǎo)致下游靶位Mek和Erk的磷酸化降低，由此減慢黑素瘤腫瘤發(fā)育。我們觀察到用BAY43-9006對動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理以與siRNA介導(dǎo)的抑制作用相似的方式降低了黑素瘤腫瘤發(fā)育。然而，BAY43-9006處理僅僅通過破壞腫瘤血管的發(fā)育而延遲已建立的腫瘤的發(fā)展。在處理后腫瘤未完全消退，而是腫瘤大小變得相對穩(wěn)定。這個(gè)觀察結(jié)果與得自臨床實(shí)驗(yàn)的初步數(shù)據(jù)一致，臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示出BAY43-9006單一治療對于治療晚期黑素瘤患者相對無效(TuvesonDAetal.CancerCell.4:95-8(2003)，AhmadTetal.ProcAmSocClinOncol.23:708(2004))。然而，與傳統(tǒng)的化療(paclitaxel和carboplatinum)組合，在患者中產(chǎn)生50X的應(yīng)答率(TuvesonDAetal.CancerCell.4:95-8(2003)，F(xiàn)lahertyKetal.ProcAmSocClinOncol.23:708(2004))。因此，盡管BAY43-9006減慢腫瘤發(fā)育，很可能所述藥物需要與其它協(xié)同治療劑組合以使得已建立的預(yù)先存在的腫瘤衰退(TuvesonDAetal.CancerCell.4:95-8(2003)，BollagGetal.CurrOpinInvestigDrugs.4:1436-41(2003)，LyonsJFetal.EndocrRelatCancer.8:219-25(2001))?？赡艿氖撬幬锝o予途徑也可以改變BAY43-9006在黑素瘤患者中的效力。雖然臨床實(shí)驗(yàn)包括口服給予所述藥物，但我們的研究是通過每2—3天經(jīng)腹膜內(nèi)注射給予藥物。通過增加藥物的局部生物利用率的替代的給藥途徑可能更有效(SparreboomAetal.ProcNatlAcadSciUSA.94:2031-5(1997)，BardelmeijerHAetal.CancerResearch.62:6158-64(2002)，HaleJTetal.BioclPharm.64:1493-502(2002)，KimuraYetal.CancerChemotherPharm.49:322-8(2002))。因此，治療性耙向V599EB-Rafr活性與化療劑組合可以提供一種縮小含有這種突變蛋白的確定的黑素瘤腫瘤的有效方案?？傊?，我們鑒別了突變體v，B-Raf促進(jìn)黑素瘤腫瘤發(fā)育的機(jī)制，并示出了這種突變是如何使得黑素瘤細(xì)胞具有在腫瘤環(huán)境中選擇性生長和血管發(fā)生的優(yōu)勢。實(shí)施例24:Akt3結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)，結(jié)果和討論Akt同種型之間的結(jié)構(gòu)域交換鑒別了導(dǎo)致在黑素瘤中優(yōu)先激活A(yù)kt3而非Aktl或Akt2的Akt3區(qū)域。激活是作為在Akt3上第308位蘇氨酸或者第472位絲氨酸的磷酸化水平而測定的；或者通過Akt3的免疫沉淀隨后進(jìn)行體外激酶分析而測定，其中Crosstide被Akt3磷酸化以評估活性。Akt3的結(jié)構(gòu)域用Akt2或者Aktl的結(jié)構(gòu)域交換，含有嵌合基因的構(gòu)建體被核核轉(zhuǎn)染進(jìn)黑素瘤細(xì)胞系WM35或者UACC903中。豆蔻?；腁kt3和Akt2作為陽性對照，失效的Akt3(T305A/S472A)禾BAkt2(T309A/S474A)作為陰性對照。野生型Akt3的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致活性增加，野生型Akt2不導(dǎo)致活性增加，這表明在黑素瘤細(xì)胞中Akt3激活的特異性。其中來自Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域(氨基酸1一110)與Akt2的催化-調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域連接的構(gòu)建體不導(dǎo)致激活。相反，其中來自Akt2的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域(氨基酸1—110)與來自Akt3的催化-調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(氨基酸111—497)連接的構(gòu)建體是激活的。這說明導(dǎo)致黑素瘤中Akt3優(yōu)先激活的關(guān)鍵區(qū)域是氨基酸111一497。這是治療劑可以靶向的區(qū)域從而特異性防止Akt3在黑素瘤中激活。本發(fā)明結(jié)合上述特異性實(shí)施方案已經(jīng)加以描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見對其的許多替代、修改和變化方案。所有這種替代、修改和變化均在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。本文引用的所有文獻(xiàn)(例如出版物和專利申請)均以全文并入作參考。參考文獻(xiàn)AhmadT，MaraisR,PyleL，al.e.BAY43-9006inpatientswithadvancedmelanoma:TheRoyalMarsdenexperience.ProcAmSocClinOnco12004;23:708.AlessiDR,AndjelkovicM,CaudwellB，CronP,Mo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物質(zhì)是作為Akt3假底物的肽。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域或者調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的假底物。8.權(quán)利要求3的方法，其中所述物質(zhì)是作為Akt3競爭性抑制劑的肽。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述肽作為Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述肽作為Akt3的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括給予選自垸化劑、抗代謝物、抗生素、天然產(chǎn)物或植物衍生的產(chǎn)物、激素和類固醇及鉑制劑藥物的化療劑。13.權(quán)利要求的12的方法，其中所述化療劑是達(dá)卡巴嗪。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括給予放射治療。15.—種治療哺乳動(dòng)物中黑素瘤腫瘤的方法，包括給予黑素瘤腫瘤有效量的物質(zhì)以誘導(dǎo)凋亡，及給予黑素瘤腫瘤有效量的物質(zhì)以降低血管發(fā)生和細(xì)胞增殖。16.權(quán)利要求15的方法，其中誘導(dǎo)凋亡的所述物質(zhì)是降低Akt3活性的物質(zhì)。17.權(quán)利要求15的方法，其中降低血管發(fā)生和細(xì)胞增殖的所述物質(zhì)是降低V599EB-Raf活性從而治療黑素瘤腫瘤的物質(zhì)。18.權(quán)利要求16的方法，其中降低Akt3活性的所述物質(zhì)選自siRNA分子、反義分子、拮抗劑、核酶、抑制劑、肽和小分子。19.權(quán)利要求18的方法，其中降低Akt3活性的所述物質(zhì)是siRNA分子，其包含具有選自如下序列的多核苷酸5，GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'、5，CUAUCUACAUUCCGGAAAG3,、5，GAAUUUACAGCUCAGACUA3，、5，CAGCUCAGACUAUUACAAU3，、5'CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3'、5'CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG3'、5'GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3'、5'UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3'、5'AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3'、5'AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3'及其互補(bǔ)序列。20.權(quán)利要求16的方法，其中降低Akt3活性的物質(zhì)使用如下方式導(dǎo)入所述黑素瘤腫瘤中脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸鈣納米顆粒、磷酸轉(zhuǎn)納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、聚(D-精氨酸)、納米樹狀物、病毒、磷酸鈣核苷酸介導(dǎo)的核苷酸輸送、電穿孔和顯微注射。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述物質(zhì)是作為Akt3假底物的肽。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域或者調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的假底物。23.權(quán)利要求18的方法，其中所述物質(zhì)是作為Akt3的競爭性抑制劑的肽。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述肽作為Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。26.權(quán)利要求23的方法，其中所述肽作為Akt3的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。27.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法迸一步包括給予選自烷化劑、抗代謝物、抗生素、天然產(chǎn)物或者衍生自植物的產(chǎn)物、激素和類固醇、及鉑制劑藥物的化療劑。28.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括給予放射治療。29.權(quán)利要求17的方法，其中降低V599EB-Raf活性的物質(zhì)選自siRNA分子、反義分子、拮抗劑、核酶、抑制劑、肽、及小分子。30.權(quán)利要求17的方法，其中降低V599EB-Raf活性的物質(zhì)通過使用如下方式導(dǎo)入所述黑素瘤腫瘤中脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸鈣納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、聚(D-精氨酸)、納米樹狀物、病毒、磷酸鈣核苷酸介導(dǎo)的核苷酸輸送、電穿孔和顯微注射。31.權(quán)利要求29的方法，其中降低V599EB-Raf活性的siRNA分子包含具有序列5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'的多核苷酸。32.權(quán)利要求29的方法，其中降低B-Raf活性的siRNA分子包含具有序列5'GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3'的多核苷酸。33.權(quán)利要求29的方法，其中降低V599EB-Raf活性的物質(zhì)是B-Raf抑制劑。34.權(quán)利要求33的方法，其中B-Raf抑制劑是BAY43-9006。35.權(quán)利要求15的方法，其中所述治療包括同時(shí)或者相繼給予有效量的降低Akt3活性的物質(zhì)及降低V599EB-Raf活性的物質(zhì)。36.—種治療黑素瘤腫瘤的藥物組合物，其包含降低Akt3活性的物質(zhì)和載體。37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述載體選自脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、含有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體、蛋白脂質(zhì)體、納米顆粒、磷硅酸鈣納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、納米結(jié)晶顆粒、半導(dǎo)體納米顆粒、聚(D-精氨酸)、納米樹狀物、病毒和磷酸鈣核苷酸介導(dǎo)的核苷酸輸送。38.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述物質(zhì)選自siRNA分子、反義分子、掊抗劑、核酶、抑制劑、肽、及小分子。39.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'或其互補(bǔ)序列。40.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含5'CUAUCUACAUUCCGGAAAG3'或其互補(bǔ)序列。41.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'GAAUUUACAGCUCAGACUA3'或其互補(bǔ)序列。'42.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'CAGCUCAGACUAUUACAAU3'或其互補(bǔ)序列。43.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3'或其互補(bǔ)序列。44.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG3'或其互補(bǔ)序列。45.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3'或其互補(bǔ)序列。46.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3'或其互補(bǔ)序列。47.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3'或其互補(bǔ)序列。48.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3'或其互補(bǔ)序列。49.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3'或其互補(bǔ)序列。50.51.52.53.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述物質(zhì)是作為Akt3的假底物的肽。54.權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域或者調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的假底物。55.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述物質(zhì)是作為Akt3的競爭性抑制劑的肽。56.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述肽作為Akt3的催化結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。57.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述肽作為Akt3的普列克底物蛋白同源性結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。58.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述肽作為Akt3的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的競爭性抑制劑。59.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含降低B-Raf活性的物質(zhì)。60.權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述物質(zhì)選自siRNA分子、反義分子、拮抗劑、核酶、抑制劑、肽和小分子。61.權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3'或其互補(bǔ)序列。62.權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述小干擾RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5'GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3'或其互補(bǔ)序列。全文摘要本發(fā)明提供了未普遍用于治療黑素瘤的組合靶向治療與選擇的化療一種合理方法。本發(fā)明基于本發(fā)明人揭示了在黑素瘤中Akt3調(diào)節(jié)凋亡及^V599EB-Raf調(diào)節(jié)生長和血管發(fā)生。本發(fā)明人首先認(rèn)識(shí)到治療黑素瘤的有效組合的靶向治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過降低Akt3活性而誘導(dǎo)黑素瘤腫瘤細(xì)胞中凋亡的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)黑素瘤腫瘤細(xì)胞中凋亡的方法，包括將黑素瘤腫瘤細(xì)胞與降低Akt3活性的物質(zhì)接觸。因此，所述方法可以恢復(fù)對黑素瘤腫瘤細(xì)胞的正常凋亡敏感，從而可以給予低濃度的化療劑從而對患者的毒性降低。本發(fā)明人揭示了一種治療哺乳動(dòng)物黑素瘤的方法，包括給予黑素瘤有效量的物質(zhì)以誘導(dǎo)凋亡；給予黑素瘤有效量的物質(zhì)以降低血管發(fā)生和細(xì)胞增殖。本發(fā)明還揭示了一種治療哺乳動(dòng)物黑素瘤的方法，包括給予哺乳動(dòng)物黑素瘤有效量的降低Akt3活性的物質(zhì)；給予哺乳動(dòng)物黑素瘤有效量的降低^V599EB-Raf活性的物質(zhì)，從而治療黑素瘤。另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物以治療黑素瘤，所述藥物組合物包含降低Akt3活性的物質(zhì)和載體。文檔編號(hào)A61K31/00GK101389345SQ200580008819公開日2009年3月18日申請日期2005年3月18日優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日發(fā)明者加文·P.·羅伯遜,拉克什曼·桑迪拉塞加雷恩,阿拉蒂·夏爾馬,馬克·凱斯特申請人:賓州研究基金會(huì)