專利名稱：利用免疫應(yīng)答系統(tǒng)的藥物傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用低聚糖包裹脂質(zhì)體的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物。更詳細(xì)體，本發(fā)明涉及一種使用低聚糖包裹脂質(zhì)體的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其特征在于于腹腔給藥時(shí)，通過腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的攝取而傳送至靶向部位。
背景技術(shù)：
癌癥術(shù)后的復(fù)發(fā)是阻礙提高癌癥患者生存率的最大障礙，抑制該復(fù)發(fā)成為癌癥臨床上最重要的課題之一。認(rèn)為根治手術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因是手術(shù)時(shí)已經(jīng)擴(kuò)散的游離癌細(xì)胞或肉眼不可見的微小轉(zhuǎn)移引起的，檢查出該微小轉(zhuǎn)移并治療，是與癌癥患者的預(yù)后有直接關(guān)系的重要課題。胃癌中作為根治手術(shù)后的復(fù)發(fā)形式腹膜復(fù)發(fā)占50％以上，是決定患者預(yù)后的最重要的因素。通過目前的Golden standard、腹腔清洗細(xì)胞學(xué)診斷得出的細(xì)胞學(xué)診斷陽性的診斷意味著預(yù)后不良。
但是，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)診斷陰性的癥例中腹腔復(fù)發(fā)也不少等，所以上述方法的檢測靈敏度較低，檢出腹膜微小轉(zhuǎn)移事實(shí)上是不可能的。至今為止，建立了腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞的高靈敏度檢測法，即，使用以癌胚抗原(CEA)作為指標(biāo)的RT-PCR法。自1995年開始經(jīng)過8年使用臨床樣品進(jìn)行解析的結(jié)果，明確腹膜復(fù)發(fā)的高危險(xiǎn)性與生命預(yù)后有直接關(guān)系。現(xiàn)在，作為高度先進(jìn)的醫(yī)療，進(jìn)行腹腔內(nèi)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性評價(jià)，同時(shí)研究開發(fā)用于改善胃癌患者的預(yù)后的治療方法。
另外，抗癌劑給藥時(shí)，使用脂質(zhì)體能更有選擇性地使抗癌劑到達(dá)癌病灶部位，達(dá)到提高治療效果并且抑制在正常組織聚集而降低副作用的目的。脂質(zhì)體血管內(nèi)給藥，具有在血管通透性亢進(jìn)的腫瘤血管中泄漏至癌組織中，并在局部滯留的性質(zhì)。因此，作為藥劑傳遞系統(tǒng)，稱為被動靶向。另外，利用抗體等的特異性結(jié)合能力的藥物傳遞系統(tǒng)稱為主動靶向。以前的方法的目的是將脂質(zhì)體直接傳遞至癌細(xì)胞。該情形的目的是使脂質(zhì)體以不被血中的巨噬細(xì)胞攝取而是隨血液循環(huán)傳送至癌部位。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，腹膜微小轉(zhuǎn)移的有無的檢測正在變?yōu)榭赡?，但確定腹膜微小轉(zhuǎn)移的局部的方法還不存在。臨床上眾所周知，胃癌的主要腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，在稱為乳斑的大網(wǎng)膜以及散布的腸系膜結(jié)外小淋巴結(jié)(節(jié)外性小リンパ節(jié))上產(chǎn)生。本發(fā)明人至今通過組合導(dǎo)入GFP基因的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞以及簡單的GFP檢測系統(tǒng)，建立了非侵襲地可視乳斑上產(chǎn)生的微小轉(zhuǎn)移的微小轉(zhuǎn)移小鼠模型，發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移在大網(wǎng)膜以及腸系膜淋巴結(jié)上產(chǎn)生，進(jìn)一步用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在初期腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的早期給予抗癌劑是有效的。但是，在腹腔較廣的空間內(nèi)給藥不能達(dá)到藥物的有效濃度，或欲維持有效濃度需給予高濃度的藥物，而產(chǎn)生藥物向血中轉(zhuǎn)移等次要的問題，所以并不現(xiàn)實(shí)，現(xiàn)狀是不存在有效的給藥方法。因此，如果可以用藥物傳遞系統(tǒng)將藥物集中在腹膜微小轉(zhuǎn)移相的局部，那么就是有效的給藥方法。即，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可將抗癌劑等給藥物質(zhì)有效地聚集在靶向部位的藥物傳遞組合物。
本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果向腹腔內(nèi)給予用低聚甘露糖包裹的脂質(zhì)體，可非常特異且迅速地被腹腔內(nèi)經(jīng)常存在的巨噬細(xì)胞攝取(圖1)。另外，特異地?cái)z取該低聚甘露糖包裹的脂質(zhì)體的巨噬細(xì)胞可在12小時(shí)至24小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)聚集在產(chǎn)生初期腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移局部的稱為乳斑的大網(wǎng)膜以及在腸系膜淋巴結(jié)之間散布的結(jié)外淋巴結(jié)上(圖2)。還發(fā)現(xiàn)實(shí)際上腹腔內(nèi)攝取了低聚甘露糖包裹的脂質(zhì)體的巨噬細(xì)胞的聚集場所與產(chǎn)生癌細(xì)胞的微小轉(zhuǎn)移的場所相同。本發(fā)明基于這些觀察到的事實(shí)而完成。
即，本發(fā)明提供一種含有低聚糖包裹的脂質(zhì)體及給藥物質(zhì)，用于將給藥物質(zhì)傳送至靶向部位的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物。
低聚糖優(yōu)選低聚甘露糖，更優(yōu)選甘露五糖(mannopentaose)或甘露三糖。
給藥物質(zhì)優(yōu)選藥物、標(biāo)記物或造影劑。
藥物優(yōu)選抗癌劑。
本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，優(yōu)選腹腔給藥，由腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞攝取而傳遞至靶向部位。
靶向部位優(yōu)選腹腔內(nèi)的結(jié)外小淋巴組織或腸系膜淋巴組織。
本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，優(yōu)選與包入磁性化合物的低聚糖包裹脂質(zhì)體一起組合給藥。
本發(fā)明的另一方面，提供一種包括將含有低聚糖包裹的脂質(zhì)體與給藥物質(zhì)的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物給予包括人在內(nèi)的哺乳動物，傳遞給藥物質(zhì)至靶向部位的方法。
本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，優(yōu)選與包入磁性化合物的低聚糖包裹脂質(zhì)體一起組合給予包括人在內(nèi)的哺乳動物之后，可從外部進(jìn)行磁場照射。


圖1表示將用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體與未用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體給予小鼠，1小時(shí)后回收細(xì)胞觀察攝取到腹腔內(nèi)細(xì)胞(F4/80陽性細(xì)胞)中的結(jié)果。
圖2表示用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體向大網(wǎng)膜聚集的經(jīng)時(shí)觀察結(jié)果。
圖3表示包封入了抗癌劑的糖鏈包裹脂質(zhì)體與包封入了磁性微粒的糖鏈包裹脂質(zhì)體吸收到大網(wǎng)膜內(nèi)的最適攝取條件的研究結(jié)果。
圖4表示將抗癌劑(5FU)給藥小鼠與未給藥的小鼠打開腹腔以GFP的熒光為指標(biāo)觀察癌的增殖的結(jié)果。
圖5表示將抗癌劑(5FU)給藥小鼠與未給藥的小鼠打開腹腔以GFP的熒光為指標(biāo)觀察癌的增殖的結(jié)果。
圖6表示將抗癌劑(5FU)給藥小鼠與未給藥的小鼠打開腹腔以GFP的熒光為指標(biāo)觀察癌的增殖的結(jié)果具體實(shí)施方式
以下，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行具體的說明。
本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其特征在于含有給藥物質(zhì)和低聚糖包裹的脂質(zhì)體，用于將給藥物質(zhì)傳遞至靶向部位。更具體的是，本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，在腹腔給藥時(shí)，被腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞攝取而傳送至靶向部位。本發(fā)明的靶向部位，優(yōu)選癌的初期腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶大網(wǎng)膜及腸系膜的結(jié)外小淋巴組織。
作為本發(fā)明中使用的低聚糖包裹的脂質(zhì)體，可使用例如日本專利第2828391號公報(bào)中公開的脂質(zhì)體。構(gòu)成低聚糖的糖成分的種類沒有特別的限制，例如可列舉出D-甘露糖(D-Man)、L-岸藻糖(L-fucose)(L-Fuc)、D-乙酰葡糖胺(D-GlcNAc)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-乙酰半乳糖胺(D-GalNAc)、D-鼠李糖(D-Rha)等。
低聚糖中，各構(gòu)成糖通過α1→2結(jié)合、α1→3結(jié)合、α1→4結(jié)合、α1→6結(jié)合或β1→4結(jié)合等或者這些的組合進(jìn)行結(jié)合。例如，甘露糖可以通過上述結(jié)合構(gòu)成單鏈，也可以通過α1→3結(jié)合和α1→6結(jié)合的組合形成支鏈結(jié)構(gòu)。低聚糖中的單糖數(shù)優(yōu)選2～11個(gè)。作為具體的低聚糖，例如可列舉出甘露二糖(Man2)、甘露三糖(Man3)、甘露四糖(Man4)、甘露五糖(Man5)、甘露六糖(Man6)、甘露七糖(Man7)、各種的混合低聚糖，例如下面表示的M5(式1)以及RN(式2)等。
式1 式2 (式中，α1→2結(jié)合的Man，分別獨(dú)立地可以存在或不存在)。
另外，作為含葡萄糖的低聚糖可列舉具有式3所示結(jié)構(gòu)的低聚糖，作為含N-乙酰葡糖胺的低聚糖可列舉式4所示的低聚糖，作為含巖藻糖的低聚糖可列舉式5所示的低聚糖。
式3 (m+m’+n為1～10)式4 (n為0～4) (p為0或1，n分別獨(dú)立地為0～3。式中右側(cè)的4GlcNAcβ1→4GlcNAc表示的2個(gè)GlcNAc殘基，分別獨(dú)立地可以存在或不存在。另外，(GlcNAcβ1→)n表示的每一個(gè)GlcNAc均可與右側(cè)相鄰的Man上的任何游離羥基以糖苷鍵鍵合。)
(p為0或1，n分別獨(dú)立地為0～3。另外，(GlcNAcβ1→)n表示的GlcNAc的任何一個(gè)均可與右側(cè)相鄰的Man上的任何游離羥基以糖苷鍵鍵合。) R為H、GlcNAc、或(GlcNAcβ1→6)p(GlcNAcβ1→3)pGal(p為0或1。)式5 (k為1～5，p分別獨(dú)立地為0或1。箭頭頂端沒有序號的表示可與任何游離羥基以糖苷鍵鍵合。) (p分別獨(dú)立地為0或1，n分別獨(dú)立地為0～3。箭頭頂端沒有序號的表示可與任何游離羥基以糖苷鍵鍵合。另外，式中右側(cè)的4GlcNAcβ1→4GlcNAc表示的2個(gè)GlcNAc殘基，分別獨(dú)立地可以存在或不存在。) (p分別獨(dú)立地為0或1，n分別獨(dú)立地為0～3。箭頭頂端沒有序號的表示可與任何游離羥基以糖苷鍵鍵合。另外，式中右側(cè)的4GlcNAcβ1→4GlcNAc表示的2個(gè)GlcNAc殘基，分別獨(dú)立地可以存在或不存在。)本發(fā)明中使用的低聚糖優(yōu)選低聚甘露糖，特別優(yōu)選甘露五糖或甘露三糖。
上述低聚糖都具有1個(gè)還原末端醛基。因此，該醛基可以作為將低聚糖導(dǎo)入到脂質(zhì)體表面的一個(gè)手段。即，該醛基與具有氨基的脂質(zhì)之間發(fā)生反應(yīng)形成希夫氏堿，繼而根據(jù)常法將該希夫氏堿還原，優(yōu)選化學(xué)還原，例如用NaBH3CN還原，從而可以使低聚糖與脂質(zhì)結(jié)合(水落次男，糖質(zhì)工學(xué)，224-232頁，產(chǎn)業(yè)調(diào)查會Biotechnology情報(bào)中心，1992)。
上述具有氨基的脂質(zhì)，優(yōu)選具有氨基的磷脂，例如磷脂酰胺，如可使用二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)等。如上所述得到的低聚糖與脂質(zhì)的結(jié)合物在本發(fā)明中有時(shí)稱為人工糖脂質(zhì)。
作為構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，可單獨(dú)使用或組合使用多種用于構(gòu)成脂質(zhì)體的已知的任意常用的脂質(zhì)。例如天然物，如可使用蛋黃、大豆，或其他的從動植物得到的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)經(jīng)修飾的脂質(zhì)，例如通過氫化降低不飽和度的脂質(zhì)，或化學(xué)合成的脂質(zhì)。具體的例如可列舉出甾醇類，如膽固醇(Chol)；磷脂酰乙醇胺類，如二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)；卵磷脂類，如二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)；磷脂酰絲氨酸類，如二棕櫚?；字＝z氨酸(DPPS)、二硬脂?；字＝z氨酸(DSPS)；磷脂酸類，如二棕櫚酰基磷脂酸(DPPA)、二硬脂?；字?DSPA)等。
可使公周知的方法[D.W.Deeamer，P.S.Uster，“Liposome”ed.ByM.J.Ostro，Marcel Dekker Inc.，N.Y.Basel，1983，p27]制備脂質(zhì)體。渦旋法以及超聲法為一般的方法，其他的可采用乙醇注入法、醚法以及反相蒸發(fā)法等，也可將這些方法組合使用。
例如，渦旋法以及超聲法中，將預(yù)定的脂質(zhì)溶于有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、氯仿或這些的混合物例如甲醇和氯仿的混合物中，然后蒸發(fā)除去該有機(jī)溶劑而得到脂質(zhì)薄層。接著，往該脂質(zhì)薄層中加入水性介質(zhì)通過渦旋處理或超聲處理形成脂質(zhì)體。此時(shí)，在上述水性介質(zhì)中混入藥物、標(biāo)記物或造影劑等給藥物質(zhì)，通過例如溶解或混懸，可將該給藥物質(zhì)包入脂質(zhì)體中。
為了往脂質(zhì)體表面導(dǎo)入低聚糖，例如可采用下面2種方法中的任何一種。上述的人工糖脂為水溶性而在有機(jī)溶劑中不能充分溶解時(shí)，例如使用上述的M5與DPPE的結(jié)合物(M5-DPPE)、RN與DPPE的結(jié)合物(RN-DPPE)時(shí)，可制備它們的水性溶液，將該水性溶液與形成的脂質(zhì)體混合，在例如4℃至室溫下保溫24～120小時(shí)，如可孵化72小時(shí)即可。
另一方面，在有機(jī)溶劑中溶解人工糖脂時(shí)，可將該人工糖脂與用于構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)一起在脂質(zhì)體制備過程中如上所述地溶解在有機(jī)溶劑中，然后按照常規(guī)方法形成脂質(zhì)體。相對于脂質(zhì)體的量，低聚糖的量根據(jù)低聚糖的種類，欲包入的抗原的種類，脂質(zhì)體的組合結(jié)構(gòu)等而不同，一般相對于構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)1mg，為5μg～500μg。
本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體，可為多層型(multilamella vesicle)或單層型(unilamella vesicle)?？筛鶕?jù)已知的常規(guī)方法制備這些脂質(zhì)體，并可按照常規(guī)方法將一種類型轉(zhuǎn)換為另一種類型，例如將多層脂質(zhì)體轉(zhuǎn)換為單層脂質(zhì)體。本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體的粒徑?jīng)]有特別的限制，可根據(jù)需要按照常規(guī)方法，例如可通過具有所需孔徑的過濾器過濾來調(diào)整粒徑。
本發(fā)明中使用的給藥物質(zhì)，優(yōu)選藥物、標(biāo)記物、或造影劑。作為藥物，可列舉抗癌劑、癌癥疫苗、抗原肽、免疫活化劑(溶血鏈球菌(Picibanil)等)、細(xì)胞因子、血管新生抑制劑等。
本發(fā)明中可使用的抗癌劑的種類沒有特別的限制，可列舉出烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、鹽酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamicle)、雷莫司汀(ranimustine)、三胺硫磷(thiotepa)、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、卡波醌(carboguone)、鹽酸甲基芐肼(procabazine hydrochloride)等)、抗代謝藥(例如阿糖胞苷(cytarabine)、替加氟(tegafur)、阿糖胞苷酯(cytarabineoctosfate)、依諾他濱(enocitabine)、磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabinephosphate)、左亞葉酸鈣(levofolinate calcium)、鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride)、氨甲蝶呤(folinate calcium)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、卡莫氟(carmofur)、6-氨甲蝶呤核苷(6-mercaptopurine riboside)、羥基脲(hydroxycarbamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、亞葉酸鈣(folinate calcium)、去氧氟尿苷(doxifluridine)等)、分子靶向治療藥物(酪氨酸激酶抑制劑)或生物堿(硫酸長春新堿、硫酸長春地辛、硫酸長春堿等)。
作為標(biāo)記物，可列舉GFP等熒光蛋白質(zhì)、氟·脫氧·葡萄糖等。作為造影劑，可列舉出非離子性水溶性碘造影劑、水溶性碘造影劑、低滲透壓水溶性碘造影劑等。
相對于脂質(zhì)體的量，給藥物質(zhì)的量只要可以得到本發(fā)明的效果，即給藥的脂質(zhì)體組合物被腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞攝取而傳送至靶向部位，則給藥物質(zhì)的量并無特別限制，可根據(jù)給藥物質(zhì)的種類或脂質(zhì)體的組成或構(gòu)造等適宜地設(shè)定。一般地，相對于構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)1mg，給藥物質(zhì)的量為1μg～100μg。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物，根據(jù)需要可含有藥學(xué)上允許的載體。作為載體，可使用滅菌水、緩沖液或食鹽水。另外，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物，根據(jù)需要也可以含有鹽類、糖類、蛋白質(zhì)、淀粉、明膠、植物油以及聚乙二醇等。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的給藥途徑?jīng)]有特別的限制，可優(yōu)選腹腔給藥。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的給藥量，根據(jù)給藥物質(zhì)的種類、給藥途徑、癥狀的嚴(yán)重程度、患者的年齡以及狀態(tài)、副作用的程度等變化，一般為0.1～100mg/kg/日的范圍。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物給藥時(shí)，可與包入了磁性化合物的低聚糖包裹的脂質(zhì)體一起組合給藥。作為本發(fā)明中使用的磁性化合物，優(yōu)選使用在磁場中可發(fā)熱或振動的磁性微粒。此時(shí)，可將含抗癌劑和低聚糖包裹的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體組合物以及含磁性化合物和低聚糖包裹的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體組合物混合而得到的混合物給藥至楊體。此時(shí)，通過外加外部磁場，可將抗癌劑從攝取到大網(wǎng)膜上的吞噬了該脂質(zhì)體組合物的巨噬細(xì)胞中釋放出來，因此可有效地抑制轉(zhuǎn)移到該部位的腫瘤組織。
下面對本發(fā)明的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物的利用方法進(jìn)行說明。
(1)以腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，向腹腔內(nèi)結(jié)外淋巴組織轉(zhuǎn)運(yùn)抗癌劑的藥物傳遞系統(tǒng)將M3脂質(zhì)體(包入FITC-BSA)腹腔給藥，隨時(shí)間經(jīng)過其向大網(wǎng)膜以及腸系膜淋巴組織(乳斑)聚集。腹腔內(nèi)的免疫系統(tǒng)被破壞的小鼠，脂質(zhì)體有一部分傳送至脾臟，在沒有被破壞的情形下，完全沒有發(fā)現(xiàn)脾臟內(nèi)存在的巨噬細(xì)胞進(jìn)行攝取。因此，若往該脂質(zhì)體內(nèi)包入抗癌劑，則抗癌劑可聚集到腹腔內(nèi)淋巴結(jié)上產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移初期病變的部位并發(fā)揮作用。有效的抗癌劑大多具有較強(qiáng)的副作用，為改善這點(diǎn)設(shè)計(jì)了各種藥物傳遞系統(tǒng)?？鼓[瘤效果一般依賴于腫瘤內(nèi)的藥物濃度，因此通過使用M3脂質(zhì)體而可在腫瘤局部聚集的技術(shù)，作為抗癌劑傳遞系統(tǒng)可廣泛地利用。本發(fā)明的系統(tǒng)，以下述3個(gè)基于免疫學(xué)機(jī)理的步驟為基礎(chǔ)。
(i)表面含有甘露糖的M3脂質(zhì)體被遇到的巨噬細(xì)胞特異地、迅速地吞噬，并蓄積到溶酶體中。
(ii)甘露糖受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝取使巨噬細(xì)胞活化，由于該活化，巨噬細(xì)胞為了進(jìn)行抗原呈遞而在局部淋巴結(jié)邊緣竇聚集。
(iii)到達(dá)淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞將溶酶體不能消化的物質(zhì)排列接觸面細(xì)胞之外。
通過使用該方法，可有效地將高濃度的抗癌劑聚集于腫瘤局部，聚集后抗癌劑經(jīng)過較長時(shí)間緩慢地從巨噬細(xì)胞排出，由此可以只將腫瘤局部長時(shí)間暴露在抗癌劑中。進(jìn)一步通過對聚集的巨噬細(xì)胞從體外施加熱等控制的壓力，可積極且主動地排出。
(2)以腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，向腹腔內(nèi)結(jié)外淋巴組織轉(zhuǎn)運(yùn)癌疫苗的傳遞系統(tǒng)低聚糖包裹的脂質(zhì)體的使用，是也可用于癌疫苗的技術(shù)。癌疫苗的效果，認(rèn)為如何有效地向抗原呈遞細(xì)胞輸入癌抗原的抗原情報(bào)，可否更有效地誘導(dǎo)攻擊癌細(xì)胞的免疫活性方面是很重要的。在這方面，如果在低聚甘露糖包裹的脂質(zhì)體中包入癌抗原及免疫激活劑，然后散布在腹腔內(nèi)，則這些藥物由巨噬細(xì)胞傳送，到達(dá)癌的轉(zhuǎn)移灶所在部位的淋巴組織，可在局部使免疫活性亢進(jìn)。之前的癌免疫療法存在問題，由于免疫反應(yīng)的活化不充分使疫苗的效果較弱，這可通過癌病灶局部的抗腫瘤免疫活化而改善。
(3)通過包入了熒光物質(zhì)等的低聚甘露糖包裹脂質(zhì)體檢測初期腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)部位藉由采用了RT-PCR法的高靈敏度檢驗(yàn)法可確認(rèn)腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞的存在，即使在判斷腹膜微小轉(zhuǎn)移可能性較高的情況下，生存率仍為50％左右。這與不能確定腹膜微小轉(zhuǎn)移局部不無關(guān)系。因?yàn)槭聦?shí)上攝取了低聚甘露糖包裹的脂質(zhì)體的巨噬細(xì)胞的聚集場所與產(chǎn)生癌細(xì)胞的微小轉(zhuǎn)移的場所相同，所以通過將包入了熒光蛋白質(zhì)等手術(shù)中容易識別的物質(zhì)的脂質(zhì)體在手術(shù)前24小時(shí)前給藥，可檢出腹膜微小轉(zhuǎn)移的高發(fā)部位，從而可以預(yù)防性地以最小限度的侵襲進(jìn)行切除。
(4)其他的應(yīng)用(A)在對癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療上的應(yīng)用近年正在增加的乳腺癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是對患者預(yù)后有較大影響的一個(gè)方面，原因是即使在廣范圍內(nèi)切除淋巴結(jié)預(yù)后也未得到改善，主要的治療方法正在向縮小手術(shù)與化學(xué)療法的組合轉(zhuǎn)變。乳腺癌中，腋下、鎖骨上窩、胸骨旁淋巴結(jié)為局部淋巴結(jié)，因此時(shí)常發(fā)現(xiàn)來自這些部位的復(fù)發(fā)。通過將包入了抗癌劑的M3脂質(zhì)體，或包入了作為癌免疫療法的癌抗原及免疫激活劑的M3脂質(zhì)體，在手術(shù)后注入至病灶附近，期待通過巨噬細(xì)胞有效地將藥劑送達(dá)至局部淋巴結(jié)，從而期待藥物療法的更好的效果。基于同樣的機(jī)理，也適用于其他的易轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的癌癥即黑素瘤、甲狀腺癌、肺癌的治療。
(B)對血液系統(tǒng)腫瘤的適應(yīng)血液系統(tǒng)腫瘤中，以表現(xiàn)出單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞類的分化的腫瘤為治療適應(yīng)對象。發(fā)果本發(fā)明的M3脂質(zhì)體中包入的抗癌劑具有高的分子靶向性，則盡管有被腫瘤以外的巨噬細(xì)胞攝取的情形，但仍可減輕副作用，可以期待其僅對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥效。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明并不局限于實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1低聚糖包裹的脂質(zhì)體的制備方法以及藥物、標(biāo)記物或造影劑的包入方法根據(jù)以下的方法，使甘露五糖(M5)(化1所示化合物)或甘露三糖(M3)(具有Manα1→6(Manα1→3)Man結(jié)構(gòu)的甘露三糖(Man3))和二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)發(fā)生還原氨化反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，從而合成M5-DPPE以及M3-DPPE。
首先，往甘露五糖(M5)或甘露三糖(M3)2.5mg中加入600μl蒸餾水并攪拌溶解制備低聚糖溶液。然后，在氯仿/甲醇(1∶1，體積比)混合物中以5mg/ml的濃度溶解DPPE制備DPPE溶液。在甲醇中以10mg/ml的濃度溶解NaBH3CN制備NaBH3CN溶液。往上述低聚糖的各溶液600μl中加入上述DPPE溶液9.4ml以及上述NaBH3CN溶液1ml并攪拌混合。將該反應(yīng)混合液于60℃下保溫16小時(shí)，生成人工糖脂。合成的人工糖脂采用HPLC進(jìn)行高純度精制。
如下制備包入用TRITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)(實(shí)施例2)或者用FITC或若丹明標(biāo)記的蛋白質(zhì)(實(shí)施例3)的脂質(zhì)體。
首先，將以1∶1∶0.1的比例混合二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、膽固醇以及人工糖脂(M5-DPPE或M3-DPPE)的氯仿/甲醇溶液或乙醇溶液裝入梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下使其干固，制備脂質(zhì)薄膜。然后，往脂質(zhì)薄膜中加入含有用TRITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)(實(shí)施例2)或者用FITC或若丹明標(biāo)記的蛋白質(zhì)(實(shí)施例3)的PBS溶液(5mg/ml)0.3ml，使用渦旋混合器激烈攪拌，制備M5-DPPE包裹的脂質(zhì)體或M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體。作為用TRITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)或者FITC或若丹明標(biāo)記的蛋白質(zhì)，使用FITC-BSA或者TRITC-BSA。
然后，以PBS數(shù)次清洗脂質(zhì)體，通過離心除去未包入到脂質(zhì)體中的可溶性物質(zhì)。進(jìn)一步使用1μm的濾膜調(diào)整脂質(zhì)體的粒徑。包入蛋白質(zhì)的量通過蛋白質(zhì)定量，脂質(zhì)體中的脂質(zhì)組成比以及藥物采用HPLC定量。
實(shí)施例2被巨噬細(xì)胞攝取的評價(jià)方法及簡單的結(jié)果說明將包入了用TRITC標(biāo)記的BSA的M5-DPPE包裹脂質(zhì)體或M3-DPPE包裹脂質(zhì)體(作為膽固醇為100微克)對小鼠腹腔給藥，在30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘后通過常規(guī)方法回收腹腔內(nèi)細(xì)胞。將回收的細(xì)胞用FITC標(biāo)記的抗CD11c抗體或F4/80染色，然后使用FACS測定攝取到細(xì)胞中的若丹明以及細(xì)胞表面抗原(FITC)的熒光強(qiáng)度。
圖1為用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體以及未用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體給藥1小時(shí)后回收細(xì)胞觀察腹腔內(nèi)細(xì)胞攝取的結(jié)果。給藥M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體時(shí)，巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，即，用F4/80染色的細(xì)胞的78％具有TRITC的強(qiáng)熒光，所以可確定巨噬細(xì)胞攝取了包入用TRITC標(biāo)記蛋白質(zhì)的M3-DPPE包裹脂質(zhì)體。另外，給藥未用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體時(shí)完全不能看見攝取行為。如圖1下部分所示，M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體以顆粒狀被攝取到巨噬細(xì)胞中。
實(shí)施例3巨噬細(xì)胞或者脂質(zhì)體向靶向部位聚集的評價(jià)方法及簡單的說明將包入了用FITC或若丹明標(biāo)記的蛋白質(zhì)的M3-DPPE包裹脂質(zhì)體100微克(按膽固醇換算)用生理鹽水稀釋，將總量0.5毫升接種到裸小鼠腹腔內(nèi)。然后經(jīng)時(shí)地(3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí))處死小鼠，并觀察。打開小鼠腹腔后，用藍(lán)色光(150W鹵素光源，LGPS-2上裝有420-480的帶通濾波器的裝置)照射包含小鼠腹腔內(nèi)的大網(wǎng)膜的上腹部，用裝有黃色濾波器(通過500nm以上波長可見光的長通濾波器)的立體顯微鏡(Olympus GFP Specific Checker，SZ40-GFP)在暗視野下以M3脂質(zhì)體向大網(wǎng)膜上聚集為綠色(FITC)，通過數(shù)碼相機(jī)導(dǎo)入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行評價(jià)。
當(dāng)為若丹明時(shí)，150W鹵素光源，使用帶通濾波器545-580，使用長通濾波器(590nm以上)作為吸收濾波器進(jìn)行觀察。
圖2為經(jīng)時(shí)觀察M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體向大網(wǎng)膜聚集的圖。確認(rèn)3小時(shí)后開始聚集，12小時(shí)后表現(xiàn)出最大聚集，之后至24小時(shí)為止仍有聚集。結(jié)外淋巴組織形成少的γδT細(xì)胞缺失小鼠中幾乎未看到聚集，所以明確M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體聚集在結(jié)外淋巴組織。另一方面，完全沒有發(fā)現(xiàn)未用M3-DPPE包裹的脂質(zhì)體的聚集。
實(shí)施例4包入了抗癌劑的脂質(zhì)體及包入了磁性微粒的脂質(zhì)體對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的抗癌效果的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)(1)通過將包入了抗癌劑的糖鏈包裹脂質(zhì)體及包入了磁性微粒的糖鏈包裹脂質(zhì)體混合給藥使脂質(zhì)體向大網(wǎng)膜上聚集分別制備包入抗癌劑的糖鏈包裹脂質(zhì)體(5FU 120μg/ml，膽固醇2mg/ml)以及包入磁性微粒的糖鏈包裹脂質(zhì)體(磁鐵礦1.5mg/ml，膽固醇2mg/ml)，按以下所示的比例混合，并對小鼠進(jìn)行腹腔給藥。24小時(shí)后，摘取小鼠大網(wǎng)膜，測定其中含有的5FU以及鐵離子(圖3)。
A含240μg膽固醇的M3/5-FU含20μg膽固醇的M3/MLB含320μg膽固醇的M3/5-FU含40μg膽固醇的M3/MLC含480μg膽固醇的M3/5-FU含20μg膽固醇的M3/MLD含480μg膽固醇的M3/5-FU含40μg膽固醇的M3/ML5-FU濃度120μg/ml；M3/ML濃度1.5mg/ml；膽固醇2mg/ml結(jié)果表明，包入抗癌劑的糖鏈包裹脂質(zhì)體以240μg膽固醇，包入磁性微粒的糖鏈包裹脂質(zhì)體以20μg膽固醇的形式混合給藥時(shí)，聚集效率最好。
(2)研究上述條件之后，進(jìn)行抗癌效果的研究首先，將導(dǎo)入了GFP的胃癌細(xì)胞株MKN28投入3×106裸小鼠的腹腔內(nèi)。以24小時(shí)后GFP的熒光作為指標(biāo)確認(rèn)癌細(xì)胞的生存，往確認(rèn)有生存的小鼠腹腔內(nèi)，將包入了抗癌劑的糖鏈包裹脂質(zhì)體以240μg膽固醇，包入了磁性微粒的糖鏈包裹脂質(zhì)體以20μg膽固醇的形式混合給藥。脂質(zhì)體給藥24小時(shí)后，以交變磁照射裝置(第一高頻制造)、高頻感應(yīng)加熱裝置(富士電波工機(jī)株式會社制造，型號F1H-153HH、輸出功率15Kw、400KHz)進(jìn)行交變磁場照射30分鐘。然后經(jīng)1周之后，打開小鼠腹腔以GFP的熒光為指標(biāo)觀察癌的增殖，同時(shí)測定腫瘤的重量。上述方法以及結(jié)果如圖4～圖6所示。相對于對照小鼠的腫瘤重量36.6mg，用抗癌劑(5FU)處理的小鼠腫瘤重量為5.2mg，通過給藥本發(fā)明的脂質(zhì)體可顯著地抑制腫瘤重量。另外，由GFP的熒光觀察也發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗癌劑(5FU)處理的小鼠癌增殖得到抑制。
工業(yè)適用性本發(fā)明可提供一種藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其可使抗癌劑等給藥物質(zhì)高效地聚集到靶向部位并釋放。
權(quán)利要求
1.一種藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其含有給藥物質(zhì)和低聚糖包裹的脂質(zhì)體，用于將給藥物質(zhì)傳送至靶向部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其中低聚糖為低聚甘露糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其中低聚糖為甘露五糖或甘露三糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其中給藥物質(zhì)為藥物、標(biāo)記物或造影劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其中藥物為抗癌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其通過腹腔給藥，由腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞攝取而傳送至靶向部位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其中靶向部位為腹腔內(nèi)的癌初期腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶大網(wǎng)膜或腸系膜的結(jié)外小淋巴結(jié)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物，其與包入了磁性化合物的低聚糖包裹脂質(zhì)體一起組合給藥。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種可以將抗癌劑等給藥物質(zhì)有效地聚集在靶向部位的藥物傳遞組合物。本發(fā)明提供一種含有低聚糖包裹的脂質(zhì)體和給藥物質(zhì)，用于將給藥物質(zhì)傳送至靶向部位的藥物傳遞脂質(zhì)體組合物。
文檔編號A61K47/36GK1953736SQ200580008728
公開日2007年4月25日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日
發(fā)明者小島直也, 清水佳隆, 池原讓, 中西速夫 申請人:學(xué)校法人東海大學(xué), 愛知縣