專利名稱：修復(fù)神經(jīng)損傷及促進(jìn)神經(jīng)功能復(fù)元之組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修復(fù)神經(jīng)損傷及促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之組合物及方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)損傷通常是由外傷或缺血所造成，且十分難以修復(fù)?；加猩窠?jīng)損傷之脊椎動(dòng)物可能遭受運(yùn)動(dòng)缺陷、癱瘓、甚或死亡。
現(xiàn)已發(fā)展出許多修復(fù)神經(jīng)損傷之策略，其中之一是使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。衍生自神經(jīng)膠細(xì)胞株之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族之一員，其被認(rèn)為是最有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，還有周邊感覺及交感神經(jīng)元之存活及軸突枝生。參見Science，2601130-1132(1993)；Science，2661062-1064(1994)；Nature，373289-290(1995)；Nature，373335-339(1995)；Nature，373341-344(1995)；及Nature，373344-346(1995)。
中腦動(dòng)脈(MCA)閉塞不僅會(huì)造成大范圍的梗塞，更會(huì)造成運(yùn)動(dòng)功能損傷。MCA區(qū)域內(nèi)，如尾狀核被殼(caudate putamen)及紋狀體(striatum)之神經(jīng)傷害將造成運(yùn)動(dòng)缺陷。參見Stroke，282060-2066(1997)。在局灶性腦缺血的早期，顯示GDNF基因表現(xiàn)被暫時(shí)性誘發(fā)于同側(cè)皮層及尾狀核。參見Brain Res.，776230-234。此外，已有調(diào)查在永久性MCA閉塞之大鼠中，GDNF對(duì)于梗塞大小、腦水腫、DNA片段化及半胱胺酸蛋白酶(caspase)免疫反應(yīng)的改變之影響。參見Stroke，291417-1422(1998)。亦有報(bào)告指出在急性FCI傷害后之再灌注大鼠大腦中，將GDNF局部施用于缺血大腦之表面可顯著降低梗塞大小及腦水腫。參見Neurosci.Lett.，23137-40(1997)。
然而，局部施用GDNF對(duì)梗塞大小的降低顯示為時(shí)間-依賴性之模式，且治療時(shí)間窗較其它化學(xué)化合物如MK-801(一種N-甲基-D-天門冬胺酸酯(NMDA)受體拮抗劑)及α-苯基-第三丁基硝酮(PBN)(一種自由基清除劑)為短。參見Brain Res.，903253-256(2001)。
直接施用GDNF對(duì)某些神經(jīng)損傷無(wú)效，特別是慢性神經(jīng)損傷。例如，已知GDNF對(duì)慢性FCI傷害無(wú)效。參見Hum.Gene Ther.，131047-1059(2002)。
據(jù)報(bào)GDNF可在一段長(zhǎng)期作用時(shí)期內(nèi)以生理相關(guān)量緩慢釋放。參見Exp.Brain Res.，104199-206(1995)；及Cell Transplant.，753-61(1998)。然而，緩慢釋放GDNF并無(wú)法成功治療慢性神經(jīng)損傷或促進(jìn)神經(jīng)功能復(fù)元。
對(duì)于有效修復(fù)神經(jīng)損傷及進(jìn)一步促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之手段仍有所需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之目的為提供一種有效修復(fù)神經(jīng)損傷及進(jìn)一步促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之方法。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明之目的可通過(guò)一種纖維蛋白膠組合物而達(dá)到，該組合物包含有效量之神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶(aprotinin)及二價(jià)鈣離子；其中該神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑選自由類固醇、細(xì)胞素、化激素、蛋白酶、胞外基質(zhì)分子、導(dǎo)引分子、抗血管生成因子、神經(jīng)保護(hù)劑、Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體所組成之群。
據(jù)此，就第一方面而言，本發(fā)明提供一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷之纖維蛋白膠組合物，其包含有效量之神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶及二價(jià)鈣離子；其中該神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑選自由類固醇、細(xì)胞素、化激素、蛋白酶、胞外基質(zhì)分子、導(dǎo)引分子、抗血管生成因子、神經(jīng)保護(hù)劑、Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體所組成之群。
就另一方面而言，本發(fā)明是提供一種用于促進(jìn)神經(jīng)功能復(fù)元之纖維蛋白膠組合物，其包含有效量之神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶及二價(jià)鈣離子；其中該神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑選自由類固醇、細(xì)胞素、化激素、蛋白酶、胞外基質(zhì)分子、導(dǎo)引分子、抗血管生成因子、神經(jīng)保護(hù)劑、Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體所組成之群。
就另外一方面而言，本發(fā)明提供一種修復(fù)神經(jīng)損傷之方法，其包括將本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物局部施用于受損之神經(jīng)。
此外，本發(fā)明亦提供一種促進(jìn)神經(jīng)功能復(fù)元之方法，其包括將本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物局部施用于受損之神經(jīng)。


圖1為通過(guò)活性TTC染色評(píng)估經(jīng)一小時(shí)MCA閉塞及四星期再灌注后之梗塞體積。GDNF-纖維蛋白膠組之梗塞體積與對(duì)照組及僅有GDNF組相比有顯著的降低。各實(shí)驗(yàn)組由六只大鼠組成。結(jié)果以平均值±SEM表示。*，當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)P＜0.05。#，當(dāng)與僅有GDNF組比較時(shí)P＜0.05。
圖2為GDNF于轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)之效果。花費(fèi)于轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)之時(shí)間(以秒表示)。經(jīng)偽裝手術(shù)而未缺血之動(dòng)物相對(duì)于其它組在轉(zhuǎn)動(dòng)棒上顯著維持較久。在局灶性腦缺血后第一、第二、第三及第四周末，GDNF-纖維蛋白膠組之大鼠維持在轉(zhuǎn)動(dòng)棒上的時(shí)間與對(duì)照組及僅有GDNF組相比有顯著增加。各實(shí)驗(yàn)組由六只大鼠組成。結(jié)果以平均值±SEM表示。*，當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)P＜0.05。#，當(dāng)與僅有GDNF組比較時(shí)P＜0.05。
圖3為FCI傷害后第一、第二、第三及第四周末GDNF對(duì)大鼠(A)右前腳及(B)左前腳抓握力之效果。各實(shí)驗(yàn)組由六只大鼠組成。結(jié)果以平均值+SEM表示。*，當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)P＜0.05。#，當(dāng)與僅有GDNF組比較時(shí)P＜0.05。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之纖維蛋白膠組合物，其包含有效量之神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶及二價(jià)鈣離子；其中該神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑是選自由類固醇、細(xì)胞素、化激素、蛋白酶、胞外基質(zhì)分子、導(dǎo)引分子、抗血管生成因子、神經(jīng)保護(hù)劑、Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體所組成之群。本發(fā)明還涉及一種修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之方法，其包括將本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物局部施用于受損之神經(jīng)。
本發(fā)明組合物中使用之神經(jīng)生長(zhǎng)因子選自但不限于衍生自神經(jīng)膠細(xì)胞株之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、衍生自血小板之生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、衍生自大腦之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、NT3、NT4及NT5。較佳者，該生長(zhǎng)因子為纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括酸性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)及堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。最佳者，該生長(zhǎng)因子為衍生自神經(jīng)膠細(xì)胞株之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
本文使用之“纖維蛋白膠”一詞是指由纖維蛋白原及其它試劑形成的一種生物兼容性及生物可分解產(chǎn)物。
本文使用之“有效量”一詞是指本發(fā)明纖維蛋白膠組合物中活性成分之量，當(dāng)投予罹患神經(jīng)損傷之對(duì)象時(shí)可達(dá)到所需之效果，亦即修復(fù)該對(duì)象之神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元。該有效量可由所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地決定。
依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明纖維蛋白膠組合物中神經(jīng)生長(zhǎng)因子之濃度較佳為介于該組合物之約1至1000μg/ml范圍內(nèi)，更佳為50μg/ml。
依據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑選自由下列所組成之群類固醇，如甲基潑尼松；細(xì)胞素；化激素；蛋白酶，如金屬蛋白酶；胞外基質(zhì)分子，如層黏蛋白(laminin)或肌腱蛋白(tenascin)；導(dǎo)引分子，即吸引或排斥細(xì)胞遷移之分子，如netrin、semaphorin、神經(jīng)細(xì)胞附著分子、鈣黏蛋白(cadherin)、硫氧化還原蛋白(thioredoxin)過(guò)氧化酵素或Eph配位體；抗血管生成因子，如血管抑制素(angiostatin)、內(nèi)皮抑制素(endostatin)、TNP-470或kringle 5；神經(jīng)保護(hù)劑，如NMDA、非NMDA拮抗劑、鈣通道阻斷劑、一氧化氮合成酵素(NOS)、NOS抑制劑、過(guò)氧化亞硝酸鹽清除劑或鈉通道阻斷劑；以及Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體。
依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明纖維蛋白膠組合物中纖維蛋白原之濃度較佳為介于約10至1000mg/ml范圍內(nèi)，更佳為約100mg/ml。
依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明纖維蛋白膠組合物中抑肽酶之濃度較佳為介于該組合物之約10至500KIU/ml范圍內(nèi)，更佳為200KIU/ml。
依據(jù)本發(fā)明，二價(jià)鈣離子可衍生自任何鈣離子源，例如由氯化鈣或碳酸鈣提供。本發(fā)明纖維蛋白膠組合物中二價(jià)鈣離子之濃度較佳為介于約1至100mM范圍內(nèi)，更佳為8mM。
本發(fā)明之纖維蛋白膠可方便地通過(guò)混合各成份而制備。例如，將神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑及纖維蛋白原與抑肽酶溶液混合，然后進(jìn)一步將所得混合物與鈣離子源混合。所得組合物在使用前可予以貯存?；蛘?，該組合物亦可在使用前才制備。較佳者，纖維蛋白膠是在施用前才制備。
本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物適用于修復(fù)所有種類的神經(jīng)損傷及促進(jìn)所以神經(jīng)系統(tǒng)中受損神經(jīng)之功能復(fù)元，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周邊神經(jīng)系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)及副交感神經(jīng)系統(tǒng)。較佳者，該神經(jīng)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)之神經(jīng)。在本發(fā)明之一實(shí)施方式中，該神經(jīng)損傷是由局灶性腦缺血(FCI)所造成者。在另一實(shí)施方式中，該神經(jīng)損傷是由慢性局灶性腦缺血所造成者。
本文使用之“修復(fù)神經(jīng)損傷”一詞是指罹患神經(jīng)損傷個(gè)體之病理學(xué)狀況方面獲得改善，而“神經(jīng)功能復(fù)元”一詞是指受損神經(jīng)之生理功能獲得重建。例如，就FCI所造成之神經(jīng)損傷而言，總梗塞體積及運(yùn)動(dòng)缺陷的降低就是受損神經(jīng)獲得修復(fù)及其功能獲得重建的信號(hào)。在本發(fā)明之一動(dòng)物模型中，運(yùn)動(dòng)缺陷的降低包括平衡、協(xié)調(diào)及抓握強(qiáng)度的改善。
本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物可局部施用于受損之神經(jīng)。該局部施用可于外科手術(shù)中實(shí)施。
本發(fā)明之方法可發(fā)揮修復(fù)慢性神經(jīng)損傷及促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元所需的長(zhǎng)期效果。此外，僅需將本發(fā)明組合物局部施用于受損神經(jīng)一次即可充分達(dá)到所需效果。
在不愿受限于理論的前提下，相信本發(fā)明纖維蛋白膠在修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)神經(jīng)功能復(fù)元上的效果并非歸因于神經(jīng)生長(zhǎng)因子的緩慢釋放，而是其它未知機(jī)制。
有鑒于其對(duì)受損神經(jīng)的效果，本發(fā)明之組合物及/或方法可有效治療神經(jīng)損傷相關(guān)疾病，包括但不限于缺血性腦疾病。較佳者，該缺血性腦疾病包括中風(fēng)、血栓及MCA之栓塞。
如以下實(shí)例所示，將本發(fā)明纖維蛋白膠組合物局部施用至MCA閉塞大鼠之缺血大腦，于慢性FCI傷害后第四周可顯著降低梗塞體積，且亦顯著改善運(yùn)動(dòng)功能，反觀對(duì)照組，在慢性局灶性腦缺血后并未對(duì)大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)的效果。該數(shù)據(jù)表示本發(fā)明纖維蛋白膠組合物對(duì)治療MCA閉塞之腦缺血及促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能復(fù)元十分有效。
給予下列實(shí)例之目的僅為舉例說(shuō)明，并無(wú)意限制本發(fā)明之范疇。
實(shí)例1修復(fù)神經(jīng)損傷及促進(jìn)功能復(fù)元之方法動(dòng)物本實(shí)例符合美國(guó)國(guó)家健康局所公布之“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照顧及使用指南”(NIH出版編號(hào)85-23，1996年修訂)。本研究使用重300至350克之雄性Long-Evans大鼠(國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖及研究中心)。這些動(dòng)物飼養(yǎng)于一間溫度(24±1℃)及濕度(55±5％)受到控制的房間內(nèi)，光暗周期為1212小時(shí)。它們可自由獲取食物及飲水。
外科手術(shù)程序本技術(shù)是將黃等人之方法(Huang SS，Tsai SK，Chih CL，Chiang LY，Hsieh HM，Teng CM，Tsai MC；六磺基丁基化C60對(duì)罹患局灶性腦缺血之大鼠之神經(jīng)保護(hù)效果。Free Radic.Biol.Med.2001；30643-649)加以修改而成。簡(jiǎn)言之，在準(zhǔn)備手術(shù)時(shí)令各雄性Long-Evans大鼠吸入一氧化氮/氧/氟烷(69％∶30％∶1％)混合物而予以麻醉。手術(shù)期間體溫以加熱墊維持在37±0.5℃，該加熱墊是以一肛溫探測(cè)器作伺服控制。于尾部腹面動(dòng)脈作插管，持續(xù)以StathamTMP23 XL換能器監(jiān)控心跳及平均動(dòng)脈血壓(MABP)并顯示于Gould RS-3400生理紀(jì)錄器(Gould，Cleveland，OH，USA)上。使用血液氣體分析儀(GEM-5300 I.L.CO，USA)作血液采樣以測(cè)試血中之pH、PO2及PCO2。于單側(cè)MCA閉塞之前、期間及其后進(jìn)行測(cè)量。
于右腦皮層之MCA區(qū)域內(nèi)制造局灶性缺血梗塞。以中線前頸部切開暴露出兩條一般頸動(dòng)脈。將該動(dòng)物側(cè)向放置，于右眼角及前耳廓之中間點(diǎn)作皮膚切開。將顳肌肉縮回，并于顴骨及鱗狀骨交會(huì)點(diǎn)使用經(jīng)生理鹽水溶夜冷卻之鉆子(DremelTMMultipro+5395，Dremel com，USA)作一小的(直徑3mm)顱骨切除。使用解剖顯微鏡(OPMI-1，ZISS，Germany)，以尖細(xì)鑷子打開硬膜，以10-0單絲尼龍結(jié)捆綁右MCA。然后以微動(dòng)脈夾使兩條一般頸動(dòng)脈閉塞一小時(shí)。移除夾子后，可目視到動(dòng)脈中恢復(fù)血流。
實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)FCI傷害后，大鼠以隨機(jī)順序分配至四個(gè)處理組之一(各n＝6)(a)局部施用GDNF(RBI，Natick，MA，USA)-纖維蛋白膠組將GDNF(1μg)與纖維蛋白原加抑肽酶溶液混合；(b)僅局部施用GDNF組將GDNF溶解于HBSS溶液；(c)對(duì)照組添加HBSS溶液做成纖維蛋白膠；(d)偽裝組動(dòng)物經(jīng)過(guò)與前述相同之外科手術(shù)程序，但無(wú)MCA捆綁。
纖維蛋白膠(Beriplast PTM，Germany)用作CNS組織黏合劑，習(xí)慣上在使用前將纖維蛋白原(100mg/ml)與抑肽酶溶液(200KIU/ml)混合而制備。此溶液進(jìn)一步在手術(shù)區(qū)域與氯化鈣(8mM)混合以形成固定膠。局部施用至梗塞腦組織之最終體積為20μl。
滲透性施用GDNF之組別將1μgGDNF(RBI，Natick，MA，USA)溶解于HBSS溶液。(n＝6)。將大鼠植入導(dǎo)管供灌注藥物。將大鼠予以麻醉，于大鼠右腦植入口徑21之不銹鋼套管。套管以快速定型牙醫(yī)用壓克力(Lang Dental，Wheeling，IL，USA)定位，并以一鋁質(zhì)保護(hù)蓋及鋼釘固定于頭骨。如所述般(僅稍作修改)將微型泵作s.c.植入。簡(jiǎn)言之，于大鼠耳后作一小切口，以止血鉗將皮下空間擴(kuò)大。將HBSS溶液或GDNF(1μg于HBSS溶液中)以0.2-mm無(wú)菌注射過(guò)濾器(Sterile Acrodisc)過(guò)濾，然后填充于一滲透性微型泵(AlzetTM2004，Alza，Palo Alto，CA，USA)中。將該微型泵植入，并經(jīng)由6-cm長(zhǎng)之PE-60聚乙烯管直接連接至前述套管。灌注速率為每小時(shí)0.25μl，持續(xù)28天。背部切口以氰基丙烯酸酯膠閉合，并于聚乙烯管上鋪以牙醫(yī)用壓克力。
梗塞體積分析經(jīng)局灶性腦缺血一小時(shí)及再灌注四星期后，將大鼠麻醉并以快速斬首方式殺死。移除大腦，目視檢測(cè)MCA之解剖結(jié)構(gòu)及出血或感染跡象，將之浸泡于冷生理鹽水溶液內(nèi)十分鐘，并使用腦基質(zhì)切片機(jī)(JACOBOWITZTMSystems，Zivic-Miller Laboratories INC，Allison Park，USA)切成標(biāo)準(zhǔn)頭顱切片(各2 mm厚)。將切片置于活體染料2，3，5-三苯基四氮鎓氯化物(TTC，2％；Sigma，USA)中，于37℃下黑暗中經(jīng)30分鐘，接著置于1 0％福爾馬林中，于室溫下過(guò)夜。經(jīng)由TTC染色，右腦半球及左腦半球以及梗塞組織的輪廓清晰可見(Chen ST Hsu CY，HoganEL，Maricq H，Balentine JD；局灶性缺血性中風(fēng)于大鼠之模型可復(fù)制之廣泛性皮層梗塞。Stroke.1986；17738-743)。使用一圖像分析器(彩色圖像掃描儀，EPSONTMGT-9000)將該等輪廓描繪于各切片之后表面上，該圖像分析器連結(jié)至一于個(gè)人計(jì)算機(jī)(AMDTMK6-23D400)上執(zhí)行之圖像分析系統(tǒng)(AIS軟件，Imaging research INC，Canada)。梗塞面積的測(cè)量是將對(duì)側(cè)之面積減去無(wú)損害側(cè)腦半球之面積。梗塞體積的計(jì)算是將每片切片梗塞面積之總和乘以切片厚度。外科醫(yī)師及圖像分析器操作員均不知道各動(dòng)物所接受的處理。
于GDNF-纖維蛋白膠組、僅有GDNF組及對(duì)照組之右MCA閉塞區(qū)域均得到了可復(fù)制之腦梗塞。在FCI傷害后第四周末，與對(duì)照組(124.0±20.0mm3)相比較，GDNF-纖維蛋白膠組之梗塞體積有顯著降低(69.1±12.4mm3，P＜0.05)，但僅有GDNF組則無(wú)(108.0±12.1mm3)(圖1)。
該結(jié)果指出，在FCI傷害后于梗塞之腦組織局部施用混合于纖維蛋白膠中之GDNF可顯著降低44.3％及36％之總梗塞體積(分別與對(duì)照組及僅有GDNF組之總梗塞體積相比較)。
行為試驗(yàn)行為測(cè)量是于局灶性FCI傷害后第一、第二、第三及第四周末時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)及抓握力試驗(yàn)。
轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)使用加速轉(zhuǎn)動(dòng)棒評(píng)估大鼠經(jīng)缺血性傷害后之運(yùn)動(dòng)缺陷(Hamm RJ，Pike BR，O’Dell DM，Lyeth BG，Jenkins LW；轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)評(píng)估其在評(píng)估外傷性腦傷害后之運(yùn)動(dòng)缺陷方面的效果。J.Neurotrauma.1994；11187-196)。將大鼠置于加速中之轉(zhuǎn)動(dòng)棒之輪輻處，并測(cè)量該動(dòng)物維持于轉(zhuǎn)動(dòng)棒上的時(shí)間。速度是在五分鐘時(shí)間內(nèi)由4rev/min緩慢增加至40rev/min。各動(dòng)物跌下輪輻之時(shí)間是以秒為單位紀(jì)錄。各動(dòng)物均接受三次連續(xù)試驗(yàn)。
各組之轉(zhuǎn)動(dòng)棒試驗(yàn)結(jié)果示于圖2。在術(shù)前準(zhǔn)備前，四組之動(dòng)物待在轉(zhuǎn)動(dòng)棒上的時(shí)間并無(wú)顯著差異。FCI傷害后第一周末時(shí)，大鼠待在轉(zhuǎn)動(dòng)棒上的平均期間在對(duì)照組、僅有GDNF組及GDNF-纖維蛋白膠組分別為基值的55.0％、50.3％及92.2％(P＜0.05vs.對(duì)照組及僅有GDNF組)，但FCI傷害后第四周末時(shí)則為基值的75.3％、67.3％及106.6％(P＜0.05vs.對(duì)照組及僅有GDNF組)。該結(jié)果顯示經(jīng)FCI傷害后，對(duì)照組及僅有GDNF組之大鼠待在轉(zhuǎn)動(dòng)棒上的時(shí)間顯著短于GDNF-纖維蛋白膠組之動(dòng)物。此結(jié)果指出于大腦受傷區(qū)域覆蓋含GDNF之纖維蛋白膠可改善FCI傷害后大鼠之平衡感及協(xié)調(diào)性。
抓握力試驗(yàn)本抓握力試驗(yàn)是將Bertelli等人之方法(Bertelli JA，Mira JC；抓握力試驗(yàn)一種用于客觀量化評(píng)估大鼠周邊神經(jīng)再生之簡(jiǎn)易行為方法。J.Neurosci.Methods.1995；59151-155)修改而成。為評(píng)估抓握強(qiáng)度，將一條金屬絲棒連接至一個(gè)普通電子秤。兩只前腳均予測(cè)試，暫時(shí)用膠帶將不測(cè)試之前腳捆住，而欲測(cè)試之前腳則保持自由。由尾部抓起老鼠，令其以漸增之堅(jiān)牢度抓握該棒直到松手，評(píng)分其抓握力。
四組之抓握力試驗(yàn)效果示于圖3。在四組中，大鼠左前腳之平均抓握力在右MCA閉塞前并無(wú)顯著差異，而大鼠右前腳之平均抓握力在右MCA閉塞前及閉塞后第一、第二、第三及第四周末時(shí)均無(wú)顯著差異。
FCI傷害后第一周末時(shí)，抓握力之平均值在對(duì)照組、僅有GDNF組及GDNF-纖維蛋白膠組分別為基值的78.7％、71.7％及101.2％(P＜0.05vs.對(duì)照組及僅有GDNF組)，但FCI傷害后第四周末時(shí)則為基值的89.6％、97.6％及120.7％(P＜0.05vs.對(duì)照組)。
此結(jié)果顯示局部施用GDNF-纖維蛋白膠與大鼠經(jīng)FCI傷害后抓握強(qiáng)度之改善有關(guān)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)以平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)差(S.E.M.)表示。大鼠梗塞體積及行為缺陷分?jǐn)?shù)差異之統(tǒng)計(jì)分析是以非配對(duì)之雙尾t試驗(yàn)，及合并數(shù)據(jù)之變量雙向分析(ANOVA)進(jìn)行，俾評(píng)估對(duì)照組及處理組間之差異。P＜0.05之?dāng)?shù)值可視為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性。
雖然本發(fā)明之各種實(shí)施方式已經(jīng)例示及說(shuō)明，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行各種修改及改良。本發(fā)明并不限于所例示的特定形式，所有未偏離本發(fā)明思想及范圍之修改均應(yīng)包含于權(quán)利要求所定義的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之纖維蛋白膠組合物，其特征是包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶(aprotinin)及二價(jià)鈣離子；其中該神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑選自由類固醇、細(xì)胞素、化激素、蛋白酶、胞外基質(zhì)分子、導(dǎo)引分子、抗血管生成因子、神經(jīng)保護(hù)劑、Nogo基因多肽及專一性結(jié)合至該多肽之抗體所組成之群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該神經(jīng)損傷是由局灶性腦缺血所造成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述之組合物，其特征是該局灶性腦缺血是慢性局灶性腦缺血。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)之神經(jīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該神經(jīng)生長(zhǎng)因子選自由下列所組成之群衍生自神經(jīng)膠細(xì)胞株之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、衍生自血小板之生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、衍生自大腦之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、NT3、NT4及NT5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述之組合物，其特征是該神經(jīng)生長(zhǎng)因子為衍生自神經(jīng)膠細(xì)胞株之神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該類固醇為甲基潑尼松。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該蛋白酶為金屬蛋白酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該胞外基質(zhì)分子為層黏蛋白或肌腱蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該導(dǎo)引分子是選自由下列所組成之群netrin、semaphorin、神經(jīng)細(xì)胞附著分子、鈣黏蛋白、硫氧化還原蛋白、過(guò)氧化酵素及Eph配位體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該抗血管生成因子選自由下列所組成之群血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、TNP-470及kringle 5。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該神經(jīng)保護(hù)劑選自由下列所組成之群NMDA、非NMDA拮抗劑、鈣通道阻斷劑、一氧化氮合成酵素、一氧化氮合成酵素抑制劑、過(guò)氧化亞硝酸鹽清除劑及鈉通道阻斷劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是該二價(jià)鈣離子是衍生自氯化鈣或碳酸鈣。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述之組合物，其特征是用于治療缺血性腦疾病。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述之組合物，其特征是該缺血性腦疾病包括中風(fēng)、血栓及中腦動(dòng)脈栓塞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之纖維蛋白膠組合物，其包含有效量之神經(jīng)生長(zhǎng)因子及/或神經(jīng)修復(fù)促進(jìn)劑、纖維蛋白原、抑肽酶(aprotinin)及二價(jià)鈣離子。本發(fā)明還涉及一種修復(fù)神經(jīng)損傷及/或促進(jìn)受損神經(jīng)功能復(fù)元之方法，其包括將本發(fā)明之纖維蛋白膠組合物局部施用于受損之神經(jīng)。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1768858SQ200510109130
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者鄭宏志, 黃相碩, 蔡勝國(guó) 申請(qǐng)人:鄭宏志