專利名稱：用于治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的草藥組成物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的草藥萃取液。該草藥萃取液作為腫瘤壞死因子(TNFα)拮抗劑。特別是，該草藥是穿心蓮(Andrographis paniculata Nees)。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎病癥包括骨關(guān)節(jié)炎(0A)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)、痛風(fēng)、脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬(AS)及其它關(guān)節(jié)病癥。所有關(guān)節(jié)炎病癥的特征是發(fā)炎和疼痛，且大多數(shù)關(guān)節(jié)炎病癥是進(jìn)行性惡化的。迄今，發(fā)生關(guān)節(jié)炎病癥的病原體因及其作用機(jī)制都是未知的。
前列腺素(prostaglandins)已被認(rèn)定為引起發(fā)炎并進(jìn)而引起疼痛的原因。已發(fā)現(xiàn)環(huán)加氧酶-2(Cox-2)能觸發(fā)前列腺素的釋放，而該Cox-2系環(huán)加氧酶-1(Cox-1)的同型異構(gòu)體且可誘導(dǎo)性地表現(xiàn)為對(duì)各種不同的促炎刺激反應(yīng)。Cox-2抑制劑被視為是治療發(fā)炎和疼痛的有效藥物。六種合成Cox-2抑制劑(如塞來昔布(celecoxib)(Celebrex)和羅非昔布(rofecoxib)(Vioxx))已為市場(chǎng)上可購得用于治療關(guān)節(jié)炎和疼痛的藥品。然而，已經(jīng)證實(shí)所有該塞來昔布(Celebrex)和羅非昔布(Vioxx)及另外兩種Cox-2抑制劑(即lumiracoxib和依妥昔布(etoricoxib)，其皆尚未經(jīng)美國食品暨藥物管理局(FDA)許可)皆顯示出心血管性毒性。迄今，沒有一種藥物能治療關(guān)節(jié)炎和疼痛并同時(shí)顯現(xiàn)低毒性和低副作用。
現(xiàn)今，TNFα被認(rèn)為是一種多功能細(xì)胞因子，其于急性和慢性發(fā)炎、抗腫瘤反應(yīng)及感染上扮演關(guān)鍵性角色。增加TNFα合成與RA、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎及炎性腸疾病的發(fā)展有關(guān)。臨床研究已證實(shí)TNFα于RA的發(fā)病機(jī)制上扮演主要角色。已使用TNFα拮抗劑以治療發(fā)炎疾病；例如，已使用依那西普(etanercept)(Enbrel)以治療RA、JRA、牛皮癬(PS)及AS，且已使用英利昔單抗(infliximab)(Remicade)以治療Crohn氏疾病和RA。另外一種抗TNFα藥物阿達(dá)莫單抗(adalimumab)(Humira，Abbott)亦已上市販?zhǔn)?。此外，現(xiàn)今正開發(fā)D2E7(即一種人類抗TNFα單株抗體，Knoll Pharmaceuticals)以治療Crohn氏疾病和RA。亦正開發(fā)CDP 571(Celltech)以治療Crohn氏疾病及CDP 870(Celltech)以治療RA。
然而，已發(fā)現(xiàn)依那西普和英利昔單抗顯現(xiàn)免疫抑制(immuno suppression)造成肺結(jié)核感染及惡化充血性心力衰竭的潛在危險(xiǎn)，且阿達(dá)莫單抗顯現(xiàn)增加發(fā)展淋巴瘤的可能性。
雖然包括酞胺哌啶酮(Celgene)、p38激酶抑制劑及TACE抑制劑的數(shù)種小分子TNFα合成抑制劑現(xiàn)今正進(jìn)行臨床試驗(yàn)(參閱文獻(xiàn)Nature Reviews，Drug Discovery，September 2003，Vol.2，pages 736-746)，但是這些小分子TNFα合成抑制劑都不是TNFα抑制劑。
中國草藥書籍已記載穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide；即一種自穿心蓮所分離的活性成份)對(duì)抑制細(xì)菌感染及治療呼吸道和肺部發(fā)炎上具有功能。于化學(xué)結(jié)構(gòu)上，穿心蓮內(nèi)酯不同于前述的小分子TNFα合成抑制劑。文獻(xiàn)Phytomedicine，2002Oct.，9(7)598-605已描述對(duì)經(jīng)培養(yǎng)及植物血球凝集素(PHA)刺激的全血細(xì)胞，穿心蓮內(nèi)酯和Kan Jang(即一種西伯利亞人參)能增加TNFα和b2MG的生成。此外，先前技術(shù)文獻(xiàn)完全未揭示穿心蓮內(nèi)酯或穿心蓮本身可用于治療關(guān)節(jié)炎病癥(特別是關(guān)節(jié)炎)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的方法，其包括對(duì)個(gè)體施用穿心蓮萃取液。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該關(guān)節(jié)炎病癥是關(guān)節(jié)炎(特別是RA和OA)及由脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬所引起的神經(jīng)痛，且該皮膚發(fā)炎病癥是牛皮癬、濕疹及皮膚炎。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該給藥方式經(jīng)口服投遞。
本發(fā)明公開了一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的草藥組成物，其包含穿心蓮萃取液和醫(yī)藥上可接受的賦形劑。當(dāng)對(duì)個(gè)體施用時(shí)，該草藥組成物顯示與熟知的Cox-2抑制劑和TNFα抑制劑相比較低的毒性和副作用。
另一方面，本發(fā)明公開了使用穿心蓮萃取液以作為TNFα拮抗劑。


圖1顯示品質(zhì)控制穿心蓮樣品的典型高效液相層析(HPLC；TSK Gel ODS 80TM(TOSOH)反相柱(250×4.6mm)，其填充5mm凝膠顆粒)色層譜，其中所指的波峰是穿心蓮內(nèi)酯(AG)。
圖2顯示制備本發(fā)明的草藥組成物的流程圖。
圖3顯示本發(fā)明的草藥組成物的活體外TNFα抑制活性及其于L929細(xì)胞增生/胞毒性分析上所顯現(xiàn)的細(xì)胞毒性。
圖4顯示經(jīng)連續(xù)7天對(duì)32位患有RA、OA或神經(jīng)痛的病人施用本發(fā)明的草藥組成物后所顯現(xiàn)的征狀緩解的改善。
圖5顯示經(jīng)連續(xù)14天對(duì)32位患有RA、OA或神經(jīng)痛的病人施用本發(fā)明的草藥組成物后所顯現(xiàn)的征狀緩解的改善。
圖6顯示32位分別患有RA、OA或神經(jīng)痛的病人的改善％。
具體實(shí)施例方式
市場(chǎng)上可購得的用于治療關(guān)節(jié)炎病癥和疼痛的藥物包括非類固醇性抗發(fā)炎藥物(NSAIDs)和腎上腺皮質(zhì)類固醇，其中該NSAIDs是最為常用的藥物。然而，治療上使用NSAIDs有限制，因?yàn)镹SAIDs有造成不良的胃腸(GI)損傷的傾向。腎上腺皮質(zhì)類固醇亦會(huì)引起多種副作用且通常為無效。
為治療關(guān)節(jié)炎病癥和疼痛，已開發(fā)新穎的生物藥劑，其顯示于治療上能提供顯著的臨床功效。該生物藥劑阻斷或拮抗特定的細(xì)胞因子的生物作用。該細(xì)胞因子包括白介素族群和腫瘤壞死因子族群。
腫瘤壞死因子α(TNFα)是習(xí)知的促炎細(xì)胞因子，其具有廣泛的生物性功能。已知TNFα影響許多種細(xì)胞的生長、分化、存活及生理功能。TNFα與兩種不同的細(xì)胞表面受體TNFRl(p55)和TNFR2(p75)相互作用，該兩種受體與TNFα結(jié)合皆具有高親和性。TNFα直接地參與神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥性疾病，并在病毒誘導(dǎo)的反應(yīng)或疾病誘導(dǎo)的損傷上扮演主要的角色。TNFα亦于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡上扮演主要的角色。
特定的TNFα抑制劑對(duì)TNFα所中介的病癥能提供治療性介入的可能性。開發(fā)該等TNFα抑制劑系用于治療系統(tǒng)性疾病。例如，Immunex Corporation開發(fā)etanercept(Enbrel)以治療RA；Johnson&Johnson開發(fā)infliximab(Remicade)以治療Crohn氏疾病和RA；正開發(fā)D2E7(即一種人類抗TNFα單株抗體，KnollPharmaceuticals)以治療Crohn氏疾病和RA；且，Celltech亦正開發(fā)CDP 571以治療Crohn氏疾病及CDP 870以治療RA。成功開發(fā)治療用的TNFα拮抗劑對(duì)治療TNFα相關(guān)疾病上有正面結(jié)果。
雖有上述治療上的正面結(jié)果，但是治療上使用生物性TNFα拮抗劑仍有許多限制，諸如(1)增加不欲的易受感染的可能性，特別是對(duì)患有潛伏性結(jié)核病的病人、(2)限制的反應(yīng)速率及(3)高成本。
對(duì)于關(guān)節(jié)炎病癥，改良的治療應(yīng)不需要耗用直接出售的藥物或處方藥物。對(duì)此，中草藥一直是具有潛力的候選藥物。
中草藥已被施用于人體和動(dòng)物以治療各種不同的疾病或病癥。草藥可經(jīng)調(diào)制為各種不同的型式，其包括膠囊、藥片及涂覆藥片；小丸；萃取液和酊劑；粉末；新鮮或干燥的植物和植物部分；茶；果汁；乳霜和乳膏；油；及，其任何組合。草藥可經(jīng)任何慣用的途徑給藥，其包括口服、經(jīng)直腸、非經(jīng)腸、經(jīng)腸、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、經(jīng)喂入管及局部給藥的途徑。
對(duì)治療關(guān)節(jié)炎病癥和疼痛，需要抗發(fā)炎、舒緩疼痛并以草藥為基底的治療方法，該治療方法具有低毒性和低副作用。例如，需要開發(fā)一種非阿斯匹林的治療方法以治療發(fā)熱、疼痛及發(fā)炎性病癥，諸如RA和OA。適宜地，該治療方法可經(jīng)口服投遞。
穿心蓮是一種古老草藥。穿心蓮內(nèi)酯在抗發(fā)熱和抗發(fā)炎上具有溫和的功效且能溫和地增強(qiáng)非特定性免疫功能。
當(dāng)使用本申請(qǐng)人的美國專利USP 6,645,719所揭示的草藥芯片以篩選能與TNFα結(jié)合的草藥活性成份時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在穿心蓮萃取液中存有一種活性成份，其能專一性地與TNFα結(jié)合并能抑制TNFα的活性。進(jìn)一步，經(jīng)由活體外和活體內(nèi)藥理分析，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)穿心蓮萃取液可用于治療關(guān)節(jié)炎病癥和疼痛且與習(xí)知的Cox-2抑制劑和TNFα抑制劑相比較顯現(xiàn)低毒性和低副作用。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)穿心蓮萃取液可用于治療皮膚發(fā)炎病癥，諸如牛皮癬、濕疹及皮膚炎。
本發(fā)明因此公開了一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的草藥組成物，其包含穿心蓮萃取液和醫(yī)藥上可接受的賦形劑。
為調(diào)制該草藥組成物，穿心蓮萃取液可與適當(dāng)?shù)姆勰┗谆旌弦陨筛稍锓勰?，其中該粉末基底選自乳糖、淀粉、淀粉衍生物(諸如多葡聚糖)、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或穿心蓮萃取液可與適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥上可接受的液體載體混合，該液體載體例如鹽水和葡萄糖溶液。
醫(yī)藥上可接受的添加劑(諸如粘合劑、甜味劑、增稠劑、芳香劑、崩解劑、涂覆劑、保存劑、潤滑劑及/或時(shí)間延遲劑)可加入至該草藥組成物中。適宜地，適當(dāng)?shù)奶鹞秳┌ㄕ崽?、果糖、葡萄糖、天冬氨醯苯丙氨酸甲?aspartame)及糖精；適當(dāng)?shù)谋澜鈩┌ㄓ衩椎矸?、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、皂土、藻朊酸及瓊脂；適當(dāng)?shù)姆枷銊┌ū『捎汀字闃?wintergreen)油、櫻桃香料、柑橘香料及覆盆子果香料；適當(dāng)?shù)耐扛矂┌ū┧峒?或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物及/或彼等的酯、蠟、脂肪醇、玉米朊、蟲膠及谷蛋白粘膠(glutan)；適當(dāng)?shù)谋４鎰┌ū郊姿徕c、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯及硫酸氫鈉；適當(dāng)?shù)臐櫥瑒┌ㄓ仓徭V、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉及滑石；且，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間延遲劑包括單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。
本發(fā)明還公開了一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的方法，其包括投遞穿心蓮萃取液至個(gè)體體內(nèi)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，該關(guān)節(jié)炎病癥是關(guān)節(jié)炎(特別是RA和OA)及由脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬所引起的神經(jīng)痛，且該皮膚發(fā)炎病癥是牛皮癬、濕疹及皮膚炎。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該給藥方式包括口服、靜脈內(nèi)、非經(jīng)腸及經(jīng)皮給藥。
對(duì)口服給藥，該草藥組成物可調(diào)制為藥片、顆粒、粉末、小袋(sachet)、膠囊、糖漿、溶液、懸浮液或乳化液。對(duì)靜脈內(nèi)和非經(jīng)腸給藥，該草藥組成物可調(diào)制為醫(yī)藥上可接受的糖漿、溶液、懸浮液或乳化液。對(duì)經(jīng)皮給藥，該草藥組成物可調(diào)制為軟膏、乳霜、洗劑或貼片。
治療上，該草藥組成物的給藥量為300至3200mg/天，適宜地為400至2000mg/天，該給藥量取決于病人的年齡、體重、生理狀態(tài)及病癥的嚴(yán)重程度。每天可施用該草藥組成物1至4次。
下述的實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。然而，應(yīng)了解的是，本發(fā)明并不以下述的實(shí)施例為限。
實(shí)施例實(shí)施例1.草藥品質(zhì)控制的標(biāo)準(zhǔn)化利用高效液相層析(HPLC)以確定每批穿心蓮草藥的品質(zhì)。該HPLC方法和測(cè)試結(jié)果描述如下
(a)制備供HPLC分析使用的草藥萃取液精確地稱重50g草藥，將其置入1000ml樣品瓶中，隨后加入500ml蒸餾水。于室溫和1000rpm下，摻合所生成的混合物5分鐘，隨后于100℃下加熱2小時(shí)。經(jīng)由通過60篩孔微過濾膜以過濾該混合物后，取出該萃取液1ml并以蒸餾水稀釋至總體積50ml。HPLC分析前，通過0.45μM濾膜過濾該1ml萃取液。
(b)HPLC分析利用HPLC實(shí)施分離。將100μl過濾上清液(即草藥萃取液)置入已先前平衡的HPLC系統(tǒng)(Shimadzu)中。在波長230nm下，利用TSK Ge1 80TM反相柱(Tosoh)進(jìn)行分離。該分離所使用的溶劑是雙蒸水和乙腈，其為0至100％梯度的96分鐘溶液，且流速為0.75ml/分。分析條件設(shè)定如下且所得到的HPLC圖譜示于圖1。

對(duì)第20至21分鐘所得到的分級(jí)液進(jìn)行進(jìn)一步純化，并用LC/MS、HPLC及NMR光譜鑒定為穿心蓮內(nèi)酯(AG)。AG是作為草藥材料和大量產(chǎn)物的品質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)。
用下述實(shí)施例3和4所描述的方法，證實(shí)穿心蓮萃取物的抗TNFα活性。經(jīng)活體外L929細(xì)胞分析，評(píng)估IC50值為70μM。對(duì)經(jīng)膠原所誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎的大鼠進(jìn)行研究，經(jīng)連續(xù)7天口服施用該穿心蓮萃取液后，測(cè)得該穿心蓮萃取液的抗發(fā)炎活性減輕該大鼠后腳水腫達(dá)40％。
實(shí)施例2.制備草藥組成物的方法制備本發(fā)明的草藥組成物的方法示于圖2的流程圖中。具體說，將穿心蓮的氣生部分(100kg)于室溫下加入至1500L含有5至15％乙醇的去離子水中，并于100℃下加熱該混合物2小時(shí)。傾析所獲得的萃取液并令其通過120μm尼龍(nylon)篩孔，隨后儲(chǔ)存于32000L不銹鋼容器中。在上述相同條件下，利用額外的1500L去離子水對(duì)不溶的固體殘余物重復(fù)進(jìn)行萃取。將所得的第2次萃取液加入至第1次萃取液中并經(jīng)集中以生成總量約為2950L的萃取液。經(jīng)減壓下濃縮后，該萃取液的總體積減少至50±5L，隨后加入8.5±0.5kg玉米淀粉并進(jìn)行充分?jǐn)嚢?。?25℃和6kg/cm3壓力下，進(jìn)行冷凍干燥36小時(shí)。或可選擇地，將10±2kg玉米淀粉或纖維素或麥芽糖糊精加入至稠和的萃取液中，隨后噴霧干燥該混合物。研磨該干燥粉末，經(jīng)通過60篩孔濾膜過濾后，于20至25℃下儲(chǔ)存于密封的聚乙烯袋中。通常，藉由冷凍干燥或噴霧干燥方法可得到16±2kg或18±2kg的草藥組成物。經(jīng)萃取穿心蓮以得到萃取液并干燥(利用或不利用載體)該萃取液以得到干燥萃取物，可達(dá)成穿心蓮萃取物于醫(yī)藥有效性上的標(biāo)準(zhǔn)化作業(yè)和評(píng)估。結(jié)合適當(dāng)?shù)姆治龇椒?諸如HPLC)，可計(jì)算穿心蓮干燥萃取物的每g指數(shù)或成份(例如AG)，隨后可決定得到預(yù)期功效所需的用量。正常情況下，穿心蓮干燥萃取物中的AG最終含量控制于2.5±0.5％的范圍內(nèi)。
實(shí)施例3.在草藥芯片上進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)草藥中活性成份的高通量方法已描述于USP 6,645,719的說明書中。其方法描述如下(a)利用HPLC對(duì)草藥萃取液進(jìn)行分級(jí)化研磨干燥穿心蓮草藥至微細(xì)粉末，并于25至30℃下利用甲醇、乙醇或蒸餾水進(jìn)行萃取，其比例為50g研磨粉末/500ml HPLC等級(jí)溶劑。利用均質(zhì)器(OMNI)持續(xù)摻合達(dá)5分鐘以進(jìn)行萃取。隨后于8000rpm(Beckman)下離心30分鐘，利用上述相同的方法重復(fù)處理殘余物(即沉降物)2次。收集草藥萃取液的澄清上清液，隨后利用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(Laborota 4000，HEIDOLPH)濃縮至最終體積30ml。利用50％水和50％乙醇的混合物將該濃縮的萃取液體積增加至50ml，隨后利用磁性攪拌棒進(jìn)行混合20分鐘。于8000rpm下，離心該萃取液30分鐘。于12000rpm下，進(jìn)一步離心該澄清上清液10分鐘，隨后利用HPLC(Shimadzu；TSK Gel ODS-80TM管柱(4.6mm×15cm，5μm裝填顆粒，TOSOH)，0至100％乙醇與雙蒸水的梯度溶液，流洗96分鐘，流速0.75ml/分)進(jìn)行解析。在波長205nm下持續(xù)監(jiān)控吸光度。自時(shí)間0至96分鐘，在0.75ml/分鐘/分級(jí)液的條件下，收集HPLC流出液。藉由利用自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)(MultiProbe II，Packard)，將含有穿心蓮成份的分級(jí)液加載3個(gè)含有96個(gè)U形底孔槽的微量滴定板中。含有穿心蓮干燥成份的分級(jí)液的微量滴定板適于儲(chǔ)存或進(jìn)行活性分析。
(b)依微數(shù)組的方式將樣品加載至經(jīng)涂覆的塑料載片上如述于USP 6,645,719說明書中的方法，利用微數(shù)組器(Microarrayer，BioGridII，BioRobotic)將分級(jí)液樣品點(diǎn)配置于經(jīng)涂覆的塑料載片上。首先將該微量滴定板中穿心蓮的干燥成份溶解并分配于30％DMSO/0.1M碳酸鹽緩沖液，pH 9.5中(其中16μl/孔槽)。利用4針(直徑0.4mm)具將樣品自該96孔槽微量滴定板加載至該經(jīng)涂覆的塑料載片的凹槽上。亦將濃度為20μg/ml的生物素肼點(diǎn)配置于該載片上以作為對(duì)照組。經(jīng)該塑料載片的凹槽上的點(diǎn)樣品干燥后，于37℃下將該塑料載片浸沒于1M乙醇胺(pH 8.0)中達(dá)2小時(shí)。
(c)信號(hào)檢測(cè)利用生物素化的腫瘤壞死因子-α(B-TNFα)和經(jīng)Cy5標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白作為探針以進(jìn)行雜交反應(yīng)。利用2塊玻璃蓋片(22mm×22mm)分別蓋住每一個(gè)塑料載片的2個(gè)凹槽，隨后于37℃下加20μl B-TNFα的TBST緩沖液(0.5μg/ml的50mM Tris-HCl，pH 7.3，0.15M NaCl，及0.05％Tween 20)。利用TBST緩沖液沖洗該塑料載片4次，隨后于37℃下干燥，并如上述利用玻璃蓋片蓋住塑料載片的2個(gè)凹槽。令塑料載片于37℃下靜置2小時(shí)，隨后利用TBST緩沖液沖洗4次，并利用雙蒸水輕洗4次。最后，于37℃下干燥該塑料載片，并利用雷射掃瞄器(GenePix 4000，Axon)進(jìn)行掃瞄。顯影上紅色螢光點(diǎn)顯示該等分級(jí)液與B-TNFα結(jié)合。
實(shí)施例4.通過活體外L929細(xì)胞增生/細(xì)胞毒性分析評(píng)估TNFα的拮抗活性活體外L929細(xì)胞增生/細(xì)胞毒性分析在微量滴定板上進(jìn)行。于含有10％牛血清、1％P/S及1％非必需氨基酸的Eagle′s極限必需培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)L929細(xì)胞。利用2ml PBS溶液沖洗匯合的L929細(xì)胞并經(jīng)胰蛋白酶處理，隨后再懸浮于完整培養(yǎng)基中。抽氣吸取200μl細(xì)胞懸浮液以進(jìn)行計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，并于1500rpm下離心其余的懸浮液達(dá)5分鐘。除去上清液并將該完整培養(yǎng)基加入至該稀釋細(xì)胞中以形成最終濃度1.5×105細(xì)胞/ml。將100μl細(xì)胞懸浮液加入至96孔槽平底微量滴定板的每一個(gè)孔槽中，并于37℃和5％CO2大氣下培育24小時(shí)。
將實(shí)施例2的測(cè)試物再懸浮于1xPBS溶液中，并利用0.22μm濾膜進(jìn)行過濾滅菌。不同濃度的化學(xué)品與等體積的可購得的TNFα(0.2ng/ml)一起培育1小時(shí)。在該1小時(shí)先期培育結(jié)束前，自該經(jīng)24小時(shí)培育的96孔板移除培養(yǎng)基，隨后加入50μl含有4μg/ml放線菌素D(Act D)的新鮮培養(yǎng)基。將50μl的該化學(xué)品和TNFα的先期培育混合物轉(zhuǎn)移至含有Act D的培養(yǎng)基的96孔板中以生成最終濃度為2μg/ml Act D和0.1ng/ml TNFα。另外加入2μg/ml Act D和0.1ng/ml TNFα以作為陽性對(duì)照組，及2μg/ml Act D以作為陰性對(duì)照組。經(jīng)溫和搖晃以進(jìn)行混合后，于37℃和5％CO2大氣下培育該96孔板24小時(shí)。
細(xì)胞毒性將TNFα活性分析中所使用的相同樣品加入至含有Act D的培養(yǎng)基的96孔板中，使Act D的最終濃度為2μg/ml。溫和搖晃該96孔板，并于37℃和5％CO2大氣下培育該96孔板24小時(shí)。隨后將50μl XTT(即2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基胺基)羰基]-2H-四唑鎓氫氧化物)加入至每一個(gè)孔槽中，并培育4小時(shí)。利用ELISA讀數(shù)器于O.D.490/630nm下進(jìn)行讀數(shù)測(cè)量。
TNFα抑制作用和細(xì)胞毒性的計(jì)算式如下 測(cè)量該草藥組成物(參閱實(shí)施例2)對(duì)TNFα抑制活性上的功效。作為TNFα拮抗劑，該草藥組成物于濃度500μg/ml下顯示84％抑制活性，且未發(fā)現(xiàn)存有細(xì)胞毒性(參閱圖3)。
實(shí)施例5.在膠原引起關(guān)節(jié)炎的大鼠中進(jìn)行抗發(fā)炎活性測(cè)試(a)準(zhǔn)備動(dòng)物在控制氣候的環(huán)境中，飼養(yǎng)不含有病原體等級(jí)的SD大鼠達(dá)4天。該大鼠為8至12周齡，并進(jìn)行性別和年齡配對(duì)。在至大鼠尾部底端2至3公分處，皮下注射300μg牛天然II型膠原(CII，Chrondrex)的不完全弗氏佐劑(IFA，Sigma)乳化液以免疫大鼠，進(jìn)而引起膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。自起始免疫后7天，利用100μg CII進(jìn)行追加免疫。依據(jù)已建立的測(cè)量大鼠腳體積的方法，每周3次評(píng)估該大鼠的疾病并加以記錄。
(b)利用草藥組成物進(jìn)行治療將患有關(guān)節(jié)炎的大鼠分為6組，飼養(yǎng)在聚苯乙烯材質(zhì)籠中，每籠有4至5只鼠，籠內(nèi)皆有木屑且無限制地供應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物和飲水。每天腹內(nèi)注射1ml含有4.5至9mg所欲標(biāo)的物的草藥組成物(其制備參閱實(shí)施例2)，并利用載體和地塞米松(dexamethasone)作為陰性和陽性對(duì)照組。治療期間系7天。在第0、3、6、10及14天收集大鼠體重?cái)?shù)據(jù)、腳體積數(shù)據(jù)及血液樣品。最終投遞后6天，殺死所有大鼠。取出受影響的后腳以進(jìn)行組織評(píng)估。在該草藥組成物的治療組中，顯現(xiàn)后腳發(fā)炎腫脹體積減少約48％。在治療終止后，發(fā)炎腫脹減少程度系維持50％且持續(xù)至少7天直至本研究終止。
實(shí)施例6.活體外安全性評(píng)估為確認(rèn)可能的不利副作用，進(jìn)行廣泛的活體外研究，該研究涉及67種生理功能相關(guān)的分子標(biāo)的物，其包括G蛋白質(zhì)偶合受體、離子孔道偶合受體、轉(zhuǎn)運(yùn)子、離子孔道及酶。顯著的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)系大于或等于50％抑制作用或刺激作用。初級(jí)分析中所發(fā)現(xiàn)的相互作用可為活體內(nèi)副作用或安全性的指征。
其結(jié)果示于表1。該草藥組成物未顯現(xiàn)符合顯著標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。其顯示該草藥組成物中濃度為25μM的穿心蓮內(nèi)酯未顯現(xiàn)出顯著的副作用。
表1.測(cè)定的顯著的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)大于或等于50％抑制作用或刺激作用。這些分析中未觀察到顯著的變化。




的活性組分或單體化合物。
所述生物傳感器可以是親和型生物傳感器。
所述生物傳感器還可以是親和型特異選擇性生物傳感器IAsysPlus(Affinity-sensor IAsys plus)。
所述吸附柱層析可以是離子交換柱層析或者硅膠柱層析。
所述病原分子可以是致炎病原分子內(nèi)毒素(LPS)或類脂A(Lipid A)。
所述病原分子可以是肽聚糖或細(xì)菌基因組DNA(CpG DNA)。
當(dāng)所述病原分子是致炎病原分子內(nèi)毒素(LPS)或類脂A(Lipid A)時(shí)，所述作為流動(dòng)相的中草藥為具有抗炎作用的中草藥，其抗炎基礎(chǔ)在于本身含有可與病原分子結(jié)合的活性組分，所述活性組分通過靜電勢(shì)作用實(shí)現(xiàn)與所述病原分子發(fā)生特異性結(jié)合作用。
致炎病原分子內(nèi)毒素(LPS)或類脂A(Lipid A)，肽聚糖(PGN)和細(xì)菌基因組DNA(CpG DNA)中的陰離子基團(tuán)與中草藥提取物中的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的陽離子基團(tuán)結(jié)合，由于病原分子生物學(xué)活性的發(fā)揮依賴于其分子結(jié)構(gòu)中的陰離子基團(tuán)與機(jī)體中相應(yīng)的受體結(jié)合，而中草藥提取物中與之結(jié)合的活性物質(zhì)通過陰陽離子的靜電勢(shì)作用結(jié)合后具有中和作用，即改變了病原分子的陰離子特性從而減弱或消除病原分子的生物學(xué)活性。
所述具有抗炎作用的中草藥為赤芍、地丁、阿膠、桅子、枳實(shí)、大黃、射干、西青果、烏梅、白鮮皮、金銀花等84種(下表)所述中草藥中一種或一種以上的組合。
抗炎中草藥名稱及優(yōu)勢(shì)產(chǎn)地

位置、反應(yīng)性、正位反射、自發(fā)性活性、驚跳反應(yīng)及觸摸反應(yīng)。每一種參數(shù)記錄為2分，正常情況下產(chǎn)生總計(jì)為20分×5只鼠＝100分。分?jǐn)?shù)為65分或低于65分表示行為性抑郁。
(e)大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能在置于旋轉(zhuǎn)桿上前1小時(shí)，將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。在套有直徑3.5cm粗糙套管的旋轉(zhuǎn)桿上，選擇在其于115rpm下仍能停留超過1分鐘的大鼠。若50％或大于50％的測(cè)試大鼠能于該旋轉(zhuǎn)桿上停留1分鐘，表示具有運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。
(f)大鼠的運(yùn)動(dòng)刺激性將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。經(jīng)1小時(shí)后，測(cè)量下述10種參數(shù)應(yīng)激性、機(jī)能亢進(jìn)、增加的臉部大小、增加的驚跳反應(yīng)、增加的觸摸敏感性、增加的探索能力、豎毛、Straub尾、震顫及搐搦。每次觀察的最大異常狀態(tài)記錄為2分，產(chǎn)生總計(jì)為2分×10參數(shù)×5只鼠＝100分。分?jǐn)?shù)為20分或大于20分表示運(yùn)動(dòng)刺激性。
(g)大鼠的呼吸速率和深度在置入1L燒杯中進(jìn)行觀察前1小時(shí)，將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。相對(duì)于載體處理組，對(duì)每只動(dòng)物的呼吸改變，速率增加但深度減輕系記錄為“+”，而速率減小但深度增加系記錄為“-”。在50％或大于50％的測(cè)試動(dòng)物具有陽性或陰性反應(yīng)者視為顯著。
(h)大鼠在休息時(shí)或刺激后的平均動(dòng)脈血壓使用重250±20g的多組(每組5只)Wistar衍生的雄鼠。令該等大鼠固定仰臥于水平位置的斜板上，并經(jīng)Propofol麻醉(15mg/5ml/kg，靜脈內(nèi))。將尾動(dòng)脈插入聚乙烯(PE 160)導(dǎo)管中，該聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)由Statham(P23XL)壓力換能器連接NEC/San-Ei放大器及數(shù)據(jù)確認(rèn)和分析系統(tǒng)(Power Lab 4/20)。自麻醉蘇醒后(2至3小時(shí)后)，口服投遞該該草藥組成物或載體。在投藥前(0分鐘)和投藥后60分鐘，記錄平均動(dòng)脈血壓，在90℃下刺激每只動(dòng)物約1秒，并于垂直位置刺激2分鐘。記錄該2分鐘期間的最低平均血壓。相對(duì)于水平位置的平均血壓，刺激反應(yīng)誘導(dǎo)的平均動(dòng)脈血壓減少大于10％系表示顯著活性。在投藥前(0分鐘)和投藥后60分鐘的間，亦評(píng)估平均動(dòng)脈血壓是否減少大于10％。
(i)大鼠的瞳孔放大將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。在投藥前(0分鐘)和投藥后60分鐘，立即地在固定亮光下，用解剖顯微鏡并利用微米眼具以測(cè)量瞳孔直徑。若瞳孔直徑(正常值系等于或小于0.3mm)等于或大于1mm，表示α-腎上腺素受體激動(dòng)活性、神經(jīng)節(jié)阻斷活性或周圍抗膽堿能性活性。
(j)膽固醇、甘油三酯(TG)及HDL的血漿總量將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。經(jīng)24小時(shí)和隔夜禁食(約16小時(shí)，但無限制地供給飲水)后，抽取得到血漿并通過酶法(Automatic analyzer model 7050和Wako cholesterol&HDL and TGdiagnostic kit)測(cè)量脂蛋白(HDL)和TG。相對(duì)于載體處理組，HDL總量改變20％或大于20％或TG總量改變40％或大于40％視為顯著。
(k)鼠肝毒性將該草藥組成物口服投遞至重22±2g的多只預(yù)選的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠體內(nèi)。經(jīng)24小時(shí)和隔夜禁食(約16小時(shí)，但無限制地供給飲水)后，藉由利用最佳的紫外線(UV)方法(Automatic analyzer model 7050和Wako ALT diagnostic kit)測(cè)量每只鼠的丙氨酸轉(zhuǎn)胺酶(ALT)活性。相對(duì)于載體對(duì)照組，ALT活性100％增加或大于100％增加(即相對(duì)于對(duì)照組大于200％)視為顯著。
(1)禁食大鼠的腎功能使用隔夜禁食的多組大鼠(每組5只Wistar衍生的雄鼠或雌鼠，重150±20g)。每只鼠被置入各別籠中，并口服投遞生理食鹽水(15mg/kg)及該草藥組成物或載體。在隨后超過6小時(shí)期間測(cè)量尿液體積，并經(jīng)離心(×400g，10分鐘)尿液后，利用自動(dòng)電解質(zhì)分析儀(Cibacorning，Model 644)分析鈉離子和鉀離子濃度。尿液電解質(zhì)分泌量以μEq/100g體重表示。相對(duì)于對(duì)照組，鈉離子分泌量(Natriuresis)或鉀離子分泌量(Kaliuresis)增加100％或大于100％(即相對(duì)于對(duì)照組大于200％)，或尿液體積增加50％或大于50％(即相對(duì)于對(duì)照組大于150％)視為顯著。相對(duì)于對(duì)照組，鈉離子分泌量、鉀離子分泌量或尿液體積減少50％或多于50％(即相對(duì)于對(duì)照組小于或等于50％)視為顯著。
(m)禁食大鼠的血清葡萄糖在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，隔夜禁食重22±2g的CD-1衍生的雄鼠或雌鼠。對(duì)5只為1組的大鼠，口服投遞該草藥組成物并于90分鐘后抽取血液樣品。相對(duì)于載體處理對(duì)照組，血清葡萄糖改變量達(dá)20％或大于20％視為顯著。
(n)禁食大鼠的胃酸令一組5只Wistar衍生的雄鼠或雌鼠(重150±20g)隔夜禁食。經(jīng)口服投遞該草藥組成物的前2小時(shí)和的后1小時(shí)，測(cè)定胃酸(μEq HCl/ml)，隨后再口服投遞正常鹽水(2ml)。比較治療前和治療后的胃酸量，計(jì)算胃酸增加％。胃酸改變量達(dá)50％或大于50％視為顯著。
(o)禁食大鼠的胃應(yīng)答(irritation)令一組5只Wistar衍生的雄鼠或雌鼠(重150±20g)隔夜禁食?？诜哆f該草藥組成物。4小時(shí)后殺死該等大鼠，并依據(jù)下述的判斷基準(zhǔn)記錄胃應(yīng)答/潰瘍0＝未有損傷、1＝充血、2＝1或2個(gè)輕微損傷、3＝超過2個(gè)輕微損傷或嚴(yán)重?fù)p傷、及4＝極嚴(yán)重?fù)p傷。相對(duì)于對(duì)照組(阿斯匹林，150mg/kg，口服)，測(cè)試藥物所引起的潰瘍達(dá)50％或大于50％視為顯著。
(p)禁食大鼠的胃腸能動(dòng)性在進(jìn)行測(cè)試前16小時(shí)，令重25±2g的多組CD-1衍生的雄鼠或雌鼠隔夜禁食但未限制取用飲水。口服投遞該草藥組成物。投藥后60分鐘，對(duì)該等大鼠口服投遞5％木炭的10％阿糖酸懸浮液(0.3ml/大鼠)，并于15分鐘后殺死大鼠。取出腸部分，并測(cè)量腸長度(cm)和木炭自幽門移動(dòng)的距離(cm)。腸轉(zhuǎn)換(IT)計(jì)算式為IT＝(CP/GL)×100％。相對(duì)于載體處理對(duì)照組，IT增加或減少達(dá)30％或超過30％視為顯著。
表2所示的結(jié)果顯示，依據(jù)上述鼠的分析所建立的標(biāo)準(zhǔn)，口服投遞該草藥組成物(666mg/kg)并未造成任何顯著的改變。
表2

<p>實(shí)施例6 鹽酸乙胺丁醇胃溶顆粒的制備和體外釋藥特性1、鹽酸乙胺丁醇胃溶顆粒的制備鹽酸乙胺丁醇顆粒的處方組成鹽酸乙胺丁醇275g，淀粉40g，糊精10g，5％淀粉漿適量。
制粒按上述處方取稱各原、輔料，過100目篩后混勻，用5％淀粉漿制粒，置烘箱中60℃干燥，過篩，整粒，備用。
胃溶包衣溶液的配制取胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑9g，加50％乙醇液100ml溶解均勻即得。
胃溶顆粒的制備將制備好的顆粒置包衣鍋內(nèi)，滾動(dòng)包衣鍋，邊噴胃溶衣液，邊吹熱風(fēng)，包至顆粒增重至4％左右，取出置烘箱60℃干燥1小時(shí)取即得。
2、鹽酸乙胺丁醇胃溶顆粒的體外釋藥特性(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)定胃溶鹽酸乙胺丁醇顆粒在水中的溶出曲線。
(2)實(shí)驗(yàn)依據(jù)中國藥典2005年版二部附錄“溶出度測(cè)定法”項(xiàng)下第一法的方法。取本品(相當(dāng)于鹽酸乙胺丁醇92mg)，以水900ml為溶劑，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分，依法操作。分別于5、10、20、30、45、60分鐘時(shí)，取溶液5ml，同時(shí)補(bǔ)充同體積的溶劑，濾過，取續(xù)濾液1ml，加溴甲酚綠溶液(取溴甲酚綠0.2g，加水30ml與0.1mol/L氫氧化鈉溶液6.5ml使溶解，加磷酸二氫鈉19.0g與磷酸氫二鈉2.5g，加水稀釋至500ml，搖勻，加0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4.6±0.1)10ml，搖勻，精密加氯仿20ml，振搖提取后，靜置使分層，分取氯仿液，照分光光度法在360～700nm波長間掃描其最大吸收波長并于最大吸收波長處測(cè)其吸收度。另精密量取鹽酸乙胺丁醇對(duì)照品溶液(每1ml中含鹽酸乙胺丁醇對(duì)照品100ug)1ml，按上述方法自“溴甲酚綠溶液”起，同法測(cè)定吸收度，計(jì)算出溶出量。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表數(shù)據(jù)所示

<p>下述的評(píng)估(1)和(2)并未分析牛皮癬病人的改善情況。
(1)7天連續(xù)投藥后對(duì)所有病人的系統(tǒng)性征候舒緩評(píng)估(圖4)32位病人中2位病人(6％)顯示100％改善；32位病人中2位病人(6％)顯示70％改善；32位病人中4位病人(13％)顯示50％改善；32位病人中6位病人(19％)顯示25％改善；及32位病人中18位病人(56％)并未顯示改善。
(2)14天連續(xù)投藥后對(duì)所有病人的系統(tǒng)性征候舒緩評(píng)估(圖5)，其中32位病人中僅有15位病人接受此治療，其評(píng)估結(jié)果如下15位病人中2位病人(13％)顯示100％改善；15位病人中2位病人(13％)顯示70％改善；15位病人中4位病人(27％)顯示50％改善；15位病人中3位病人(20％)顯示25％改善；及15位病人中4位病人(27％)并未顯示改善。
該等結(jié)果示于表3。
表3


于治療期間，所有該32位病人未曾有重要的抱怨。在2位RA病人、5位OA病人及25位神經(jīng)痛病人中，不同病人組的病人征候舒緩改善超過25％的結(jié)果示于圖6。
經(jīng)連續(xù)7天投藥后，2位RA病人皆顯示改善(100％)、5位OA病人中的1位顯示改善(20％)及25位神經(jīng)痛病人中的11位顯示改善(44％)。
經(jīng)連續(xù)14天投藥后，在15位病人中，4位OA病人中的2位顯示改善(50％)及11位神經(jīng)痛病人中的9位顯示改善(82％)。
2位中度至重度牛皮癬的病人亦顯示相似的結(jié)果。經(jīng)連續(xù)14天投藥后，該2位病人顯現(xiàn)50至70％的改善。
權(quán)利要求
1.一種穿心蓮(Andrographis paniculata Nees)萃取液在制造用于治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1的用途，其中該藥物經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、非經(jīng)腸或穿皮途徑投遞。
3.如權(quán)利要求1的用途，其中該穿心蓮萃取液與TNFα結(jié)合并抑制TNFα的活性。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中該關(guān)節(jié)炎病癥是關(guān)節(jié)炎或由脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬所引起的神經(jīng)痛。
5.如權(quán)利要求4的用途，其中該關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
6.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中該皮膚發(fā)炎病癥是牛皮癬、濕疹及皮膚炎。
7.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中該穿心蓮萃取液含有1至3重量％的穿心蓮內(nèi)酯的乙醇在水中的萃取液。
8.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中該穿心蓮萃取液調(diào)制為粉末、膠囊、藥片、液體、糖漿、溶液、懸浮液、乳化液、軟膏、乳霜、洗劑或貼片。
9.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中該穿心蓮萃取液的投遞量是300至3200mg/天，適宜地400至2000mg/天。
10.一種用于治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的草藥組成物，其包含穿心蓮萃取液和醫(yī)藥上可接受的賦形劑。
11.如權(quán)利要求10所述的草藥組成物，其中該穿心蓮萃取液與TNFα結(jié)合并抑制TNFα的活性。
12.如權(quán)利要求10或11所述的草藥組成物，其中該關(guān)節(jié)炎病癥是關(guān)節(jié)炎或由脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬所引起的神經(jīng)痛。
13.如權(quán)利要求12所述的草藥組成物，其中該關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
14.如權(quán)利要求10至11所述的草藥組成物，其中該皮膚發(fā)炎病癥是牛皮癬、濕疹及皮膚炎。
15.如權(quán)利要求10或11所述的草藥組成物，其中該穿心蓮萃取液含有1至3重量％的穿心蓮內(nèi)酯的乙醇于水中的萃取液。
16.如權(quán)利要求10或11所述的草藥組成物，其調(diào)制為粉末、膠囊、藥片、液體或糖漿。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療關(guān)節(jié)炎病癥、皮膚發(fā)炎病癥及疼痛的方法，其包括投遞穿心蓮(Andrographis paniculata Nees)萃取液至個(gè)體體內(nèi)。本發(fā)明亦提供一種用于治療前揭癥狀的草藥組成物，其包含穿心蓮萃取液。
文檔編號(hào)A61P25/04GK1864704SQ20051010894
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者徐立偉, 張素真, 莊國昇, 林軒儀, 陳志雄 申請(qǐng)人:先進(jìn)基因股份有限公司