專利名稱：姜黃素固體分散體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物領(lǐng)域，具體的說涉及姜黃素固體分散體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代藥理研究表明姜黃中主要有效成分為姜黃素(curcumin，Cur)，具有抗炎、降血脂、抗癌、抗氧化等多方面藥理作用。雖然姜黃素具有廣泛的藥理學(xué)作用，但極難溶于水，同時(shí)生物利用度極低，大大局限了其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究及臨床開發(fā)。給大鼠口服1g·kg-1姜黃素，約75％自糞便排出，而尿中只有痕量的姜黃素，測定血中姜黃素含量和膽汁排泄結(jié)果表明腸吸收不好；動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)給予姜黃素的方式采用腹腔注射，需0.5％二甲基亞砜溶解溶解，而且溶液不穩(wěn)定，表明由于姜黃素的水溶性差及其口服吸收差、生物利用度低，限制其合理應(yīng)用在人體患者。有報(bào)道將姜黃素與大分子物質(zhì)形成復(fù)合物以提高其水溶性，如明膠、多糖和蛋白、以及羥丙基-β-環(huán)糊精等。但復(fù)合物制備過程緩慢，并且姜黃素在堿性溶液中容易降解，在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，25μmol·L-1的姜黃素很快降解，其426nm的吸收值5min后降低到約50％，10min后只剩10％，最后溶液是無色的。故本發(fā)明利用聚乙烯吡咯烷酮，采用固體分散技術(shù)分散姜黃素，以提高其溶解度880倍(比使用羥丙基-β-環(huán)糊精提高150倍要高)，同時(shí)可提高體外溶出速度及生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述姜黃素的水溶性低、吸收差問題，提供一種水溶性好，生物利用度高的姜黃素固體分散體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述姜黃素固體分散體的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述姜黃素固體分散體在制備用于治療胃潰瘍、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎的藥物或保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用固體分散技術(shù)，利用聚乙烯吡咯烷酮(PVP-k30)作為載體，制備姜黃素固體分散體。本發(fā)明的姜黃素固體分散體，包括姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮，質(zhì)量比為1∶4～1∶15，將姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮按比例溶于有機(jī)溶劑，于減壓蒸餾55～95℃下除去大部分有機(jī)溶劑至成糊狀，迅速倒如入不銹鋼盤中在60～90℃下真空烘箱烘干，用粉碎機(jī)粉碎得到姜黃素固體分散體。
上述有機(jī)溶劑為無水乙醇、丙醇、異丙醇或乙酸乙酯。
Cur-PVPk30的固體分散體是這樣形成的在飽和Cur-PVPk30的溶劑系統(tǒng)中，蒸發(fā)溶劑，Cur濃度逐漸達(dá)到溶解度，并進(jìn)而越過溶解度成為過飽和溶液，過飽和程度會(huì)逐漸增強(qiáng)。在這一過程中，一定濃度的PVPk30有效抑制姜黃素晶核的形成和晶體的長大。揮干溶劑后就得到了Cur-PVPk30所形成的固體分散物。
差示掃描量熱分析結(jié)果提示，固體分散物中姜黃素不是以結(jié)晶方式存在，而是以分子狀態(tài)分散在PVP-k30載體中；X-射線粉末衍射分析進(jìn)一步說明在固體分散物中，Cur晶體消失，而以無定型或者分子形式分散于無定型的PVP-k30中，從而達(dá)到高度分散狀態(tài)，這種分散與PVP-k30的量有關(guān)。姜黃素固體分散體中姜黃素與PVP-k30的質(zhì)量比一般為(1∶4)～(1∶15)，常用比例為(1∶6)～(1∶12)，最常用劑量為(1∶7)～(1∶10)。
固體分散法改善姜黃素的溶出機(jī)制(1)姜黃素在固體分散體中以無定型形式存在，大大增加了其溶解時(shí)的表面積；(2)Cur分子中的酚羥基與PVPk30分子中的羰基形成氫鍵，一方面使相對較小的姜黃素分子以無定型狀態(tài)進(jìn)入PVP大分子，另一方面，氫鍵的形成并沒有改變PVP易溶于水的性質(zhì)，所以使得難溶的姜黃素分子通過氫鍵分散于PVP大分子中使其變得容易溶解。對于一定分子量的PVP每個(gè)PVP分子能結(jié)合的藥物分子數(shù)量是一定的，難溶的姜黃素往往具有一定的晶體狀態(tài)，PVP的用量不足以結(jié)合一定量的姜黃素而使姜黃素仍以結(jié)晶狀態(tài)為主，溶解度變化不大。所以PVP必須達(dá)到一定含量才能使藥物表現(xiàn)為無定型分散體系，其溶解度才能明顯增加，才能達(dá)到快速溶解的目的。(3)固體分散體中的姜黃素處于高能態(tài)，即為過飽和溶液，極易重新聚集成大顆粒，而PVPk30的圍繞有效的防止這種積聚。
姜黃素固體分散體可與普通常規(guī)的藥劑填充劑配合，經(jīng)常規(guī)方法而制得；可根據(jù)需要制成適當(dāng)?shù)膭┬?，如針劑、輸液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑或栓劑等。通常以口服方式使用，當(dāng)然也可以采用其它給藥方式；其每天使用劑量一般為約0.001～200000毫克，成年人常用量為每天0.002～80000毫克，最常用劑量為0.01～30000毫克。每天一次或分?jǐn)?shù)次使用。本發(fā)明制備的姜黃素固體分散體在制備用于治療胃潰瘍、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎的藥物或保健品中有著重要的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以PVP-k30為載體，采用溶劑法制備姜黃素固體分散體顯著提高了姜黃素的溶出速率以及溶解度、生物利用度。當(dāng)姜黃素與PVP-k30質(zhì)量比為1∶10時(shí)，其溶出度高達(dá)90％，溶解度是姜黃素原藥的882倍。所制備的姜黃素固體分散體在制備用于治療胃潰瘍、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎的藥物或保健品中有著重要的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明的姜黃素固體分散體制備方法簡單，成本低。


圖1為姜黃素粉末、PM及SD的差示掃描量熱圖譜；圖2為姜黃素粉末及其PM的X射線粉末衍射圖譜；圖3為姜黃素粉末以及SD的X射線粉末衍射圖譜；圖4為姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5為姜黃素及其PM體外溶出度曲線圖；圖6為姜黃素及其SD體外溶出度曲線圖；圖7為大鼠血漿中姜黃素的HPLC色譜圖；圖8為姜黃素血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖9為姜黃素固體分散體大鼠體內(nèi)藥時(shí)曲線。
其中，在圖1中，A姜黃素；B聚乙烯吡咯烷酮k30；C姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30固體分散體(1∶2)；D姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶4)；E姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶6)；F姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶8)；G姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶10)；H姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶8)；I姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶10)。
在圖2中，A聚乙烯吡咯烷酮k30；B姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶2)；C姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶4)；D姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶6)；E姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶8)；F姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30PM(1∶10)；G姜黃素。
在圖3中，A聚乙烯吡咯烷酮k30；B姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶2)；C姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶4)；D姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶6)；E姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶8)；F姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30SD(1∶10)；G姜黃素。
在圖5中， 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶10)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶8)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶6)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶4)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 PM(1∶2)； 姜黃素。
在圖6中， 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶10)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶8)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶6)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶4)； 姜黃素-聚乙烯吡咯烷酮-k30 SD(1∶10)； 姜黃素。
在圖7中，A空白血漿；B含姜黃素及內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)血清；C給藥后的樣品血清；1雌二醇樣品鋒；2姜黃素樣品峰。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1固體分散體的制備及其溶解度、溶出度的測定。
1.1藥品、試劑和儀器 姜黃素(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；聚乙烯吡咯烷酮k30(Polyvinylpyrrolidone k30，海南南杭藥業(yè)有限公司)；無水乙醇(天津市百世化工有限公司)；以上試劑均為分析純。RCZ-8A智能藥物溶出儀(天津大學(xué)精密儀器廠)；UV-2102 PC型紫外分光光度計(jì)(UNICO儀器有限公司)；DSC-204型差示掃描量熱儀(德國Netzsch公司)；D/Max-IIIA型X-射線粉末(多晶)衍射儀(日本理學(xué)電機(jī))。
1.2物理混合物和固體分散體的制備 物理混合物(physical mixture，PM)姜黃素和PVP-k30分別過80目篩，然后精密稱定，配成1∶2(w/w)、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的混合物，充分混勻即得物理混合物。固體分散體(solid dispersion，SD)選用無水乙醇作溶劑，用溶劑法制備。將一定比例的姜黃素和PVP-k30溶于適量乙醇，于65℃下除去大部分的乙醇至成糊狀，迅速倒如入不銹鋼盤中在80℃下真空烘箱烘干，用粉碎機(jī)粉碎。制成質(zhì)量比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的姜黃素固體分散體。
差示掃描量熱實(shí)驗(yàn)(DSC) 工作條件空鋁鉗鍋為參比物，另一鋁鍋中放入約5mg樣，掃描速度10℃·min-1，掃范圍0～240℃，繪制姜黃素原料粉末、PM及SD的DSC曲線圖。
X-射線粉末衍射實(shí)驗(yàn) 工作條件銅靶；高壓強(qiáng)度40KV；管流20mA；發(fā)散、散射和接受狹縫分別1°，1°，0.3mm；測速4°/min；掃描范圍3°～60°(2θ)。繪制姜黃素原料粉末、PM及SD的X-射線粉末衍射曲線圖。
1.3溶出度以及溶解度的測定分析方法的建立 檢測波長的確定分別稱取姜黃素和PVP-k30適量，用含2％濃HCl(w/w)、10％乙醇(V/V)的蒸餾水(以溶液A表示)配制成適宜濃度的溶液，并以該溶液為空白對照，于200～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明姜黃素在428nm處有最大吸收峰而PVP-k30在此處對姜黃素的測定無干擾。因此，選定428nm作為測定波長。標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取姜黃素適量，用A溶液配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于428nm處測定吸收度，以濃度(C)對吸收度(A)進(jìn)行線性回歸。
PM和SD溶出度的測定 取姜黃素368.4mg、含有姜黃素368.4mg的PM和SD樣品進(jìn)行溶出度試驗(yàn)。每組樣品平行測定5份，按中國藥典2000版第二法進(jìn)行。溶出介質(zhì)為1000mL的A溶液，溫度37±0.5℃，轉(zhuǎn)速100±1r/min。分別在5、10、15、30、45、60、90min取樣5mL并補(bǔ)入相同體積的溶液A，樣品經(jīng)0.8μm微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液稀釋后于428nm處測定吸收度，計(jì)算姜黃素的溶出度。溶出曲線見圖。精密度試驗(yàn)在溶出度測定試驗(yàn)完成后，重復(fù)測定同一份90min釋放液的吸收度5次，結(jié)果吸收度的RSD＝0.383％。穩(wěn)定性試驗(yàn)在溶出度測定試驗(yàn)完成后，以90min釋放液的吸收度為起點(diǎn)，每隔1h測定1次，其吸收度RSD＝1.286％(n＝3)。
PM和SD的溶解度測定 分別將過量的Cur、PM和SD加至盛有適量溶液A的具塞錐形瓶中，于25℃、100r/min振搖。同溫靜置，間隔一定的時(shí)間取樣，測定姜黃素的濃度。
結(jié)果固體分散體的制備成功制備了PVP-Cur比例為10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1的固體分散體。PVPk30為無定形物，熔點(diǎn)高(200℃以上分解)，可用溶劑法制成固體分散體，干燥品較易粉碎。
差示掃描量熱分析DSC曲線見圖1，PVP-k30與姜黃素分別在74.6、187℃有吸收峰，制成的固體分散體其吸熱峰均較純輔料和Cur結(jié)晶的吸熱峰前移，表明載體與Cur形成了低共熔物。Cur和PVP-k30的物理混合物(1∶8、1∶10)的Cur吸熱峰部分消失，但是不完全。Cur和PVP-k30固體分散物的DSC曲線上Cur的吸熱峰明顯前移(1∶2、1∶4)或完全消失(1∶6、1∶8、1∶10)。
X-射線粉末衍射分析如圖2、3所示。Cur在3°～60°間有強(qiáng)衍射峰。PVP-k30屬于無定型物，不具有晶體衍射峰。Cur和PVP-k30的物理混合物(1∶10)的X射線衍射圖中仍出現(xiàn)晶體衍射峰，但是該衍射峰已經(jīng)被PVP-k30的衍射寬帶所掩蓋和重疊，可能與樣品中Cur所占比例較小有關(guān)。X射線衍射圖中顯示Cur-PVPk30比例為1∶6時(shí)Cur的結(jié)晶衍射峰即已不明顯，且隨著PVPK30比例的加大，圖譜越來越接近PVP-k30衍射圖譜，Cur的衍射峰消失得更加明顯。
固體分散體系對體外溶出的影響如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C＝0.2974A+0.0011，r＝0.999，線性范圍0.025～0.1667×10-4mol/L。
體外溶出度結(jié)果如圖5、6所示，各種比例的固體分散體的溶出度均高于原料，Cur與PVP-k30比例為1∶8、1∶10的SD在5min的溶出度即超過80％；比例為1∶6的SD在90min內(nèi)的溶出度未到50％，而比例為1∶4以下的SD，在90min的溶出度未過10％。各比例Cur與PVP-k30的PM在90min的溶出度均未到5％?？梢姡腆w分散體系大大增加了藥物的體外釋放速率，并且隨著SD中載體比例的增加，增溶作用更明顯。
固體分散體系對溶解度的影響如表1所示，由于PVP-k30是水溶性高分子，與水完全互溶，姜黃素SD以及PM的溶解度實(shí)際上是姜黃素的溶解度。本文以姜黃素SD、PM不再溶解時(shí)測得的濃度為其溶解度。在過量Cur、SD、PM中加入適量的溶液A并充分振搖30min后，測得在相同的取樣時(shí)間下，姜黃素溶解度隨SD、PM中PVPk30比例的增大而增大，與姜黃素原料相比其溶解度顯著增加(P＜0.001)。相同處方配比下，PM溶解度小于SD溶解度；Cur溶解度穩(wěn)定在0.006至0.007mg·mL-1，SD(1∶10)中姜黃素溶解度在0.5h時(shí)高達(dá)6.088mg·mL-1，與同一時(shí)間下姜黃素溶解度相比，提高了880倍以上。
表1姜黃素PM體外溶出度實(shí)驗(yàn)(x±SD，n＝5)時(shí)間溶出百分率(％)(min) CurPM(1∶2) PM(1∶4) PM(1∶6)PM(1∶8) PM(1∶10)5 0.55±0.10.55±0.15 0.67±0.17 0.77±0.16 1.65±0.19 2.85±0.2010 0.58±0.12 0.58±0.12 0.88±0.20 1.06±0.25 1.95±0.15 3.04±0.1115 0.73±0.17 0.91±0.30 1.09±0.22 1.39±0.26 2.63±0.20 3.17±0.1330 0.97±0.27 1.59±0.29 1.74±0.26 2.65±0.18 3.29±0.15 3.79±0.1545 1.62±0.26 2.25±0.32 2.13±0.28 2.77±0.35 3.76±0.17 3.90±0.1260 2.16±0.27 2.36±0.29 2.22±0.21 2.94±0.19 3.79±0.16 3.93±0.1590 2.36±0.34 2.39±0.33 2.39±0.23 3.03±0.22 3.88±0.19 4.15±0.16表2姜黃素及其SD體外溶出度數(shù)據(jù)(x±SD，n＝5)時(shí)間 溶出百分率(％)(min) CurSD(1∶2) SD(1∶4) SD(1∶6) SD(1∶8) SD(1∶10)5 0.55±0.150.32±0.17 1.04±0.20 17.35±2.67 75.70±3.57 81.32±2.46100.58±0.121.43±0.19 4.59±0.33 20.39±2.36 80.52±3.11 81.50±2.95150.73±0.17 3.49±0.245.23±0.30 22.62±2.10 85.43±2.45 84.00±3.18300.97±0.27 3.74±0.296.36±0.28 39.21±3.30 85.96±3.02 86.05±2.97451.62±0.26 3.85±0.236.62±0.25 41.00±3.04 86.94±2.23 87.03±2.16602.16±0.27 3.90±0.227.55±0.27 42.25±1.97 87.30±2.70 87.57±2.16902.36±0.34 3.99±0.167.55±0.21 41.98±2.25 87.84±2.23 88.19±2.36差示掃描量熱分析結(jié)果提示，固體分散物中姜黃素不是以結(jié)晶方式存在，而是以分子狀態(tài)分散在PVP-k30載體中；X-射線粉末衍射分析進(jìn)一步說明在固體分散物中，Cur晶體消失，而以無定型或者分子形式分散于無定型的PVP-k30中，從而達(dá)到高度分散狀態(tài)，這種分散與PVP-k30的量有關(guān)。
從研究結(jié)果及固體分散體的制備情況看，我們認(rèn)為Cur-PVPk30的固體分散體是這樣形成的在飽和Cur-PVPk30的溶劑系統(tǒng)中，蒸發(fā)溶劑，Cur濃度逐漸達(dá)到溶解度，并進(jìn)而越過溶解度成為過飽和溶液，過飽和程度會(huì)逐漸增強(qiáng)。在這一過程中，一定濃度的PVPk30有效抑制姜黃素晶核的形成和晶體的長大。揮干溶劑后就得到了Cur-PVPk30所形成的固體分散物。
通過比較研究，確定姜黃素固體分散體、物理混合物的溶出速率以及溶解度與藥物原粉間差異均有顯著性。姜黃素固體分散體及其物理混合物的體外釋藥速率以及溶解度較原料藥均有明顯增加，但二者增溶機(jī)理不同。物理混合物加快藥物溶出，是由于水溶性載體增加了藥物的濕潤性之故；而固體分散法能顯著改善其溶出的機(jī)制包括(1)姜黃素在固體分散體中以無定型形式存在，大大增加了其溶解時(shí)的表面積；(2)Cur分子中的酚羥基與PVPk30分子中的羰基形成氫鍵，一方面使相對較小的姜黃素分子以無定型狀態(tài)進(jìn)入PVP大分子，另一方面，氫鍵的形成并沒有改變PVP易溶于水的性質(zhì)，所以使得難溶的姜黃素分子通過氫鍵分散于PVP大分子中使其變得容易溶解。對于一定分子量的PVP每個(gè)PVP分子能結(jié)合的藥物分子數(shù)量是一定的，難溶的姜黃素往往具有一定的晶體狀態(tài)，PVP的用量不足以結(jié)合一定量的姜黃素而使姜黃素仍以結(jié)晶狀態(tài)為主，溶解度變化不大。所以PVP必須達(dá)到一定含量才能使藥物表現(xiàn)為無定型分散體系，其溶解度才能明顯增加，才能達(dá)到快速溶解的目的。(3)固體分散體中的姜黃素處于高能態(tài)，即為過飽和溶液，極易重新聚集成大顆粒，而PVPk30的圍繞有效的防止這種積聚。
由表1可見，姜黃素PM以及SD溶液中姜黃素溶解度隨著放置時(shí)間的延長而下降，24h后溶解度基本不變。這是由于姜黃素本身為水不溶性物質(zhì)，其SD、PM加入到A液中所形成的是不穩(wěn)定的過飽和溶液，隨著姜黃素的不斷沉淀，其濃度下降直至達(dá)到溶解平衡。
結(jié)論以PVP-k30為載體，采用溶劑法制備Cur固體分散體顯著提高了Cur的溶出速率以及溶解度，當(dāng)Cur與PVP-k30質(zhì)量比為1∶10時(shí)，其溶出度高達(dá)90％；溶解度是姜黃素原藥的882倍。
實(shí)施例2姜黃素固體分散體大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究2.1藥品、試劑和儀器Wistar純系大鼠(SPF級)，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2002-009，粵監(jiān)證字2004A068，姜黃素，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；姜黃素固體分散體以及物理混合物(Cur與PVP-k30質(zhì)量比為1∶8)，本實(shí)驗(yàn)室制備；乙酸乙酯，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；雌二醇，分析純，海南南杭藥業(yè)有限公司；乙腈，HPLC級，德國Merk公司；甲醇，HPLC級，美國Fisher公司；冰醋酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；純水；氮?dú)?，高純氮，廣州氣體有限公司。
2.2姜黃素血藥濃度的測定2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用甲醇配制100μg/mL的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)貯備液；內(nèi)標(biāo)雌二醇配成45μg/mL的甲醇溶液。以上溶液均儲(chǔ)藏在棕色瓶內(nèi)、4℃冷藏備用。
2.2.2測試條件(色譜條件)選擇固定相為Kromasil C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙腈∶冰醋酸(23∶36∶41∶5，V/V)，雙波長檢測(姜黃素和內(nèi)標(biāo)的檢測波長分別為428nm、280nm)，流速為1.0mL/min，柱溫35℃。
2.2.3血漿樣品預(yù)處理精密吸取0.2mL血漿樣品于具塞的5mL玻璃離心管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液(雌二醇45μg/mL)，渦旋震蕩30s，然后加入1.5mL乙酸乙酯溶液2000r/min渦旋振蕩萃取90s，3000rmp離心10min。取上清于另一玻璃離心管中；沉淀物用上述步驟再行萃取，合并上清夜，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)眉状?00μL溶解，離心取20μL上清液作HPLC進(jìn)樣分析。
2.2.4線性范圍在5mL玻璃離心管中加入大鼠空白血漿1mL，再加入已稀釋的姜黃素貯備液使姜黃素終濃度分別為30、50、200、400、600、800ng/mL，取出上述樣品0.2mL于另一離心管并加入10μL內(nèi)標(biāo)貯備液(雌二醇45μg/mL)，按“2.2.3”樣品處理方法進(jìn)行操作、測定，每個(gè)濃度測試5次，以姜黃素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)姜黃素血漿濃度(X)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
2.2.5方法鑒定2.2.5.1方法專屬性通過比較空白大鼠血漿、含姜黃素和內(nèi)標(biāo)的空白血漿以及姜黃素給藥后所取血漿樣品(含內(nèi)標(biāo))色譜圖的比較來研究測試方法的專屬性。
2.2.5.2方法(加樣)回收率按照制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法制成低、中、高(150、300、600ng/mL)三個(gè)濃度的姜黃素血漿樣品，取出上述樣品0.2mL按樣品處理方法進(jìn)行操作、測定，每個(gè)樣品重復(fù)檢測5次，檢出量與加入量的比值為方法回收率。
2.2.5.3提取回收率按照制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法制成低、中、高(150、300、600ng/mL)三個(gè)濃度的姜黃素血漿樣品，取出上述樣品0.2mL按樣品處理方法進(jìn)行操作、測定；另配制相同終濃度的姜黃素甲醇溶液0.2mL，直接測定，每個(gè)樣品重復(fù)檢測5次。記萃取樣與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為A1，標(biāo)準(zhǔn)樣與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為A2，A1比A2即為提取回收率。
2.2.5.4精密度按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成低、中、高(150、300、600ng/mL)三個(gè)濃度的姜黃素血漿樣品，按“2.2.3”樣品處理方法進(jìn)行操作、測定。
日內(nèi)精密度一天內(nèi)重復(fù)測定5次。
日間精密度每天測定一次，連續(xù)測定5天。
2.2.5.5靈敏度取信噪比為3(即姜黃素峰高與噪音之比)，測得最低檢測限以及最低檢測濃度。
2.3藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的給藥方法設(shè)計(jì)及血樣采集選取健康、雄性Wistar大鼠，體重為300±10g，隨機(jī)分成9組，每組3只。禁食12h，按含姜黃素100、200、400mg/kg(無特別說明，以下劑量均表示姜黃素實(shí)際含量)的給藥劑量對大鼠用CMC-Na混懸的姜黃素，物理混合物以及固體分散體分別進(jìn)行灌胃，給藥后于0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10h自大鼠眼眶后靜脈叢取血0.5mL，收集于加有肝素鈉的離心管內(nèi)，3000r/min離心10min，分離得血漿，取血漿0.2mL，按“2.2.3”樣品處理方法進(jìn)行操作，測定。以給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，以姜黃素的血藥濃度為縱坐標(biāo)制備藥-時(shí)曲線。
2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1方法特異性在上述流動(dòng)相及色譜條件下，姜黃素以及內(nèi)標(biāo)與血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，無雜質(zhì)峰干擾。雌二醇以及姜黃素的保留時(shí)間分別為3.70min、4.70min。
2.4.2方法(加樣)回收率如表3所示，高、中、低三個(gè)濃度的加樣回收率在97％至103％之間，RSD在6.08以內(nèi)，效果良好，符合生物樣品分析的要求。
表3姜黃素方法(加樣)回收率姜黃素加入量 檢出量 回收率平均回收率 RSD(ng/mL) (ng/mL)(％) (％) (％)150.57 100.38156.99 104.66150 159.42 106.28102.59±2.70 2.63154.11 102.74148.36 98.91300.81 100.27339.53 113.18300 304.57 101.52101.63±6.18 6.08294.39 98.13285.10 95.03568.31 94.72580.70 96.78600 626.94 104.49 97.17±3.97 4.09556.80 92.80582.47 97.082.4.3絕對回收率如表4所示，高、中、低三個(gè)濃度的提取回收率分別為77.38％、80.13％、84.89％，RSD分別是8.0％、9.95％、9.65％，都小于10％，效果良好，符合生物樣品分析的要求。
表4姜黃素血漿中的絕對回收率萃取樣與內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn)樣與內(nèi)姜黃素加入絕對回收率平均回收率RSD標(biāo)峰面積比 標(biāo)峰面積比量(ng/mL) (％) (％) (％)(A1) (A2)0.6960.772 90.160.5760.742 77.63150 0.6840.772 88.6084.89±8.199.650.5860.617 94.980.4830.661 73.071.2421.641 75.691.4921.579 94.49300 1.2541.74 72.07 80.13±7.979.951.3331.762 75.651.6 1.934 82.732.4813.164 78.412.5713.197 80.42600 3.06 3.586 85.33 77.38±6.198.02.4623.233 76.151.9962.953 66.582.4.4精密度、靈敏度日內(nèi)日間的精密度如表5所示，日內(nèi)日間的RSD值都小于6.63％，效果教好，符合生物樣品分析要求。最低檢測限0.8ng，最低檢測濃度20ng/mL。
表5姜黃素血藥濃度日內(nèi)、日間差異(n＝5)姜黃素加入量 日內(nèi)差異 日間差異(ng/mL)測出量 RSD(％) 測出量 RSD(％)150151.81±7.014.62 155.44±10.30 6.63300306.03±14.68 4.80 309.83±18.56 5.99600602.65±19.30 3.20 615.97±27.80 4.512.4.5線性關(guān)系如表6所示，在30～800ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝221.26X±25.116(r＝0.9989)，回歸曲線如圖8所示。
表6姜黃素血漿線性精密度濃度(ng/mL) 檢測次數(shù)(n) x±SD RSD(％)30 50.08±0.01316.350 50.1106±0.008 7.23200 50.699±0.079 11.3400 51.695±0.151 8.91600 52.677±0.146 5.45800 53.458±0.110 3.18采用建立的分析方法用來檢測大鼠血漿中姜黃素的濃度，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，當(dāng)給口服給予CMC-Na姜黃素混懸液以及姜黃素物理混合物后，0-4h內(nèi)大鼠血漿中姜黃素的量小于最低檢測限(20ng/mL)；給予姜黃素固體分散體后，0-10h可檢測到血漿中姜黃素的存在，藥時(shí)曲線經(jīng)3P97程序擬合，結(jié)果符合二室模型，三個(gè)給藥劑量(100、200、400mg/kg)的藥時(shí)曲線如圖9所示，參數(shù)分別如表7、8、9所示。姜黃素血藥達(dá)峰時(shí)間均在45min左右，血藥峰值分別為74.558、110.174、193.665ng/mL。生物利用度分別為514.646、609.111、1028.627ng/mL·h。
表7姜黃素固體分散體大鼠給藥后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(100mg/kg，n＝3)(100mg/kg，n＝3)參數(shù)/單位 數(shù)值(x±SD)Tmax/h 0.718±0.069Cmax/ng/mL 74.588±2.287A/ng/mL 33.704±44.240B/ng/mL 56.782±46.571α/l/h 1.362±1.481β/l/h 0.152±0.045V/F(c)/L/kg 1.165±0.044T1/2α/h0.862±2.390T1/2β/h4.837±1.396K21/l/h 1.315±1.513K10/l/h 0.173±0.045K12/l/h 0.026±0.045AUC/ng/mL·h514.646±101.163CLs/L(kg·h)0.200±0.044表8姜黃素固體分散體大鼠給藥后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(200mg/kg，n＝3)參數(shù)/單位 數(shù)值(x±SD)Tmax/ h 0.803±0.093Cmax/ng/mL 110.174±7.474A/ng/mL 220.224±48.725B/ng/mL 76.072±16.885α/l/h1.093±0.162β/l/h0140±0.026V/F(c)/L/kg 1.098±0.102T1/2α/h 0.643±0.088T1/2β/h 5.067±0.986K21/l/h 0.509±0.105K10/l/h 0.300±0.017K12/l/h 0.424±0.104AUC/ng/mL·h 609.111±26.713CLs/L/(kg·h) 0.329±0.014
表9姜黃素固體分散體大鼠給藥后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(400mg/kg，n＝3)參數(shù)/單位 數(shù)值(x±SD)Tmax/h 0.678±0.217Cmax/ng/mL 193.665±10.400A/ng/mL 985.771±124.109B/ng/mL 84.890±28.815α/l/h1.554±0.746β/l/h0.104±0.041V/F(c)/L/kg 1.023±0.038T1/2α/h 0.498±0.187T1/2β/h 7.658±3.767K21/l/h 0.428±0.280K10/l/h 0.386±0.061K12/l/h 0.861±0.449AUC/ng/mL·h 1028.627±161.403CLs/L/(kg·h) 0.395±0.057灌胃給予姜黃素CMC-Na混懸液，姜黃素PVP-k30物理混合物后0.25-4小時(shí)都無法在血漿中測到姜黃素原形藥物，或者說其血藥濃度低于最低檢測限(20ng/mL)，可能是由于CMC-Na混懸液，姜黃素PVP-k30物理混合物在大鼠體內(nèi)吸收差，大部分以原藥形式排出體外。并有報(bào)道給大鼠口服1g/kg姜黃素，約75％自糞便排出；這些都說明姜黃素吸收差限制了其生物利用度。而給予姜黃素固體分散體后，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，其生物利用度相對提高，經(jīng)檢驗(yàn)屬二室模型。低、中、高濃度的姜黃素血藥達(dá)峰時(shí)間均在45min左右，血藥峰值分別為74.558、110.174、193.665ng/mL，生物利用度分別為514.646、609.111、1028.627ng/mL·h。表明固體分散體提高了姜黃素的口服吸收以及生物利用度。藥物的口服生物利用度是由多種原因決定的，其中之一就是藥物在胃腸的分解，而藥物的胃腸分解又是由其溶出度以及溶解度決定的。姜黃素PVP-k30固體分散體正是通過提高姜黃素的溶出度以及溶解度而達(dá)到提高生物利用度的目的。
3姜黃素固體分散體對實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的藥效學(xué)研究3.1藥品與試劑姜黃素，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；姜黃素固體分散體(Cur與PVP-k30質(zhì)量比為1∶8)，若無特別說明，以下所用給藥劑量都為實(shí)際姜黃素含量，制備方法與實(shí)施例1相同；鹽酸雷尼替丁，中諾藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H19994029，生產(chǎn)批號(hào)04075001；利血平注射液，廣東邦民制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H44021982生產(chǎn)批號(hào)040620；醋酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；甲醛，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，分析純，汕頭市光華化學(xué)廠；草酸，分析純，興塔化工廠；酚酞，廣州化學(xué)試劑廠；內(nèi)皮素免疫分析藥盒，北京市福瑞生物工程公司，生產(chǎn)批號(hào)20050401；一氧化氮檢測試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)20050325，南京建成生物工程研究所；胃蛋白酶檢測試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)20050325，南京建成生物工程研究所。
Sprague-Dawley(SD)大鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2004A021。
NIH純系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2004A018。
3.2.1姜黃素固體分散體對乙酸燒灼誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型作用選擇健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重200±10g，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水24h，其中50只30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉(剩余10只作正常對照組，雌雄各半)，無菌條件于劍突下2cm處打開腹腔，將內(nèi)徑5mm、長30mm的玻璃管垂直放于胃體部漿膜面上，向管內(nèi)加入乙酸0.02mL，1min后用棉簽蘸出乙酸，用無菌生理鹽水沖洗兩次，逢合切口。隨機(jī)分成5組，每組10只(雌雄各半)，即模型組，姜黃素低、中、高劑量組，雷尼替丁組，模型組每天灌胃給予PVP-k30輔料720mg/kg，姜黃素低、中、高劑量組每天分別灌胃給予含姜黃素10、30、90mg/kg的固體分散體(若無特別說明，以下所用劑量都為實(shí)際姜黃素含量)，雷尼替丁組每天灌胃給予雷尼替丁27mg/kg，正常對照組每天給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥14d，第15d禁食不禁水24h后，眼眶靜脈叢取血3mL，其中2mL注入含10％EDTA-Na230μL和抑肽酶的試管中，混勻，4℃，3000rmp離心10min，分離血漿，-20℃保存待測；余下1mL注入玻璃管中，室溫靜置一段時(shí)間后分離血清，-20℃保存待測。血清NO和血漿ET測定按說明書操作。
脫頸椎處死大鼠，打開腹腔結(jié)扎幽門賁門取胃，向胃中注入4％甲醛溶液5mL，固定30min后沿胃大彎剪開，將胃外翻，洗去食物殘?jiān)?。潰瘍成圓形或橢圓形，測量潰瘍處的最長徑和最短徑，以他們的均值作為潰瘍指數(shù)[79]。在各組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，按公式5-1計(jì)算潰瘍抑制率。
3.2.2姜黃素固體分散體對大鼠幽門結(jié)扎胃潰瘍模型的作用選擇健康SD大鼠50只，雌雄各半，體重200±10g，隨機(jī)分成5組，每組10只(雌雄各半)，即模型組，姜黃素低、中、高劑量組，雷尼替丁組，模型組每天灌胃給予PVP-k30輔料720mg/kg，姜黃素低、中、高劑量組每天分別灌胃給予含姜黃素10、30、90mg/kg的固體分散體，雷尼替丁組每天灌胃給予雷尼替丁27mg/kg。實(shí)驗(yàn)前3d開始給藥，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水36h，30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉下無菌操作，施幽門結(jié)扎術(shù)，術(shù)后禁食禁水，16h后解剖，收集胃液，離心測量胃液含量；胃經(jīng)4％甲醛溶液固定30min后，觀察潰瘍情況并記錄潰瘍指數(shù)，潰瘍指數(shù)評分按Adami等方法略加修改，分為六級[80-81]。0級無病變；I級出血，糜爛或發(fā)生糜爛點(diǎn)(≤1mm)；II級1～5個(gè)小潰瘍(＞1mm，≤3mm)；III級6個(gè)以上小潰瘍或1個(gè)大潰瘍(＞3mm)；IV級11個(gè)以上小潰瘍或2個(gè)大潰瘍(＞3mm)；V級2個(gè)以上大潰瘍。在各組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，潰瘍抑制率按公式5-2計(jì)算。
測量胃液量的胃液經(jīng)離心，取1mL稀釋至10mL，用0.01mol/L NaOH液滴定其酸度；胃蛋白酶活性的測定按說明書操作。
3.2.3姜黃素固體分散體對利血平誘導(dǎo)小鼠胃潰瘍模型的作用選擇健康NIH小鼠，雌雄各半，體重20±1g，隨機(jī)分成5組，每組10只(雌雄各半)，即模型組，姜黃素低、中、高劑量組，雷尼替丁組，模型組每天灌胃給予PVP-k30輔料720mg/kg，姜黃素低、中、高劑量組每天分別灌胃給予含姜黃素10、30、90mg/kg的固體分散體，雷尼替丁組每天灌胃給予雷尼替丁27mg/kg。實(shí)驗(yàn)前3d開始給藥，第4d給藥后開始禁食24h，第5d給藥后1h，皮下注射利血平10mg/kg；6小時(shí)后脫頸椎處死，取胃、4％甲醛固定，計(jì)數(shù)腺胃部出現(xiàn)的潰瘍點(diǎn)數(shù)作為潰瘍指數(shù)。潰瘍抑制率按公式5-2計(jì)算。胃粘膜損傷評定方法無損傷粘膜0分，點(diǎn)狀損傷≥1mm，1點(diǎn)為0.2分，2點(diǎn)為0.4分；條狀損傷1條為1分，2條為2分，依次類推。
3.3.1姜黃素固體分散體對乙酸燒灼性胃潰瘍的保護(hù)作用
3.3.1.1姜黃素固體分散體對潰瘍指數(shù)的影響結(jié)果如表10所示，與模型組相比，姜黃素中、高劑量組以及雷尼替丁組潰瘍指數(shù)均降低(p＜0.01)，姜黃素低劑量給藥組對胃潰瘍指數(shù)雖有降低趨勢，但p＞0.05。結(jié)果表明，姜黃素固體分散體中、高劑量對該模型胃潰瘍具有顯著的抑制作用。
表10姜黃素SD對乙酸燒灼性胃潰瘍的作用(x±SD，n＝10)組別劑量(mg/kg) 潰瘍指數(shù) 愈合率(％)模型組(給予輔料)720 5.87±0.48姜黃素低劑量組 10 5.35±0.778.86姜黃素中劑量組 30 4.59±0.96**21.81姜黃素高劑量組 90 3.33±0.93**43.27雷尼替丁組 27 2.40±0.23**59.07與模型組比較，**p＜0.013.3.1.2姜黃素固體分散體對血清NO與血漿ET含量的影響結(jié)果如表11所示，模型組大鼠血清NO水平明顯下降，血漿ET水平明顯升高，與模型組比較，姜黃素高劑量給藥組以及雷尼替丁組的血清NO水平顯著升高(p＜0.01)，血漿ET顯著降低(p＜0.05)。
表11姜黃素SD對各組血清NO和血漿ET含量的影響(x±SD，n＝10)組別 劑量(mg/kg) 血清NO(μmol/mL) 血漿ET(pg/mL)正常對照組 -54.75±15.54 63.05±23.80模型組(給予輔料) 720 23.63±5.73 163.65±63.84姜黃素低劑量組 10 26.63±7.17 157.57±57.28姜黃素中劑量組 30 29.75±5.90*135.12±36.62姜黃素高劑量組 90 39.63±12.73**104.22±63.84*雷尼替丁組 27 49.13±16.57**97.97±27.93*與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01
3.3.2姜黃素固體分散體對幽門結(jié)扎胃潰瘍的保護(hù)作用3.3.2.1姜黃素固體分散體對潰瘍指數(shù)的影響結(jié)果如表12所示，與模型組相比，姜黃素高劑量給藥組以及雷尼替丁組的潰瘍指數(shù)均降低(p＜0.01)，姜黃素中劑量給藥組對胃潰瘍指數(shù)也有降低作用(p＜0.05)，但姜黃素低劑量給藥組對胃潰瘍指數(shù)無顯著變化。結(jié)果表明，姜黃素固體分散體對該模型胃潰瘍具有顯著的抑制作用。
表12姜黃素SD體對幽門結(jié)扎胃潰瘍的作用(x±SD，n＝10)組別 劑量(mg/kg)潰瘍指數(shù) 愈合率(％)模型組(給予輔料) 7204.25±0.71 -姜黃素低劑量組10 4.13±0.64 2.82姜黃素中劑量組30 3.75±0.46 11.76姜黃素高劑量組90 2.38±0.74**44.00雷尼替丁組27 1.63±0.52**61.65與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.013.3.2.2姜黃素固體分散體對胃液含量，胃液酸度以及胃蛋白酶活性的影響結(jié)果如表13所示，與模型組相比，姜黃素中、高劑量給藥組以及雷尼替丁組對胃液含量、胃酸分泌及胃蛋白酶活性均具有顯著的抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)；并且姜黃素低劑量給藥組對胃蛋白酶活性也有顯著的抑制作用(p＜0.05)。
表13姜黃素SD對各組胃液含量，胃液酸度以及胃蛋白酶活性的影響(x±SD，n＝10)劑量胃液量 胃液酸度胃蛋白酶活性組別(mg/kg) (mL) (mmol/L)(U/mL)模型組(給予輔料) 720 14.61±1.8087.70±9.84 408.63±41.75**姜黃素低劑量組10 13.70±1.2682.19±9.48 372.13±38.12姜黃素中劑量組30 12.68±1.46*77.62±8.34*358.13±37.44*姜黃素高劑量組90 9.99±0.79**65.77±8.19**292.13±41.93**雷尼替丁組27 7.63±1.29**55.66±10.46**254.88±42.37**與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.013.3.3.1姜黃素固體分散體對潰瘍指數(shù)的影響結(jié)果如表14所示，與模型組相比，姜黃素中、高劑量給藥組以及雷尼替丁組的潰瘍指數(shù)均降低(p＜0.01)，結(jié)果表明，姜黃素固體分散體對該模型胃潰瘍具有顯著的抑制作用。
表14姜黃素SD對利血平誘導(dǎo)的胃潰瘍的作用(x±SD，n＝10)組別 劑量(mg/kg) 潰瘍指數(shù)愈合率(％)模型組(給予輔料) 720 5.13±0.59 -姜黃素低劑量組 104.68±0.50 8.77姜黃素中劑量組 303.88±0.40**24.37姜黃素高劑量組 903.03±0.64**40.94雷尼替丁組 272.23±0.52**56.53與模型對照組比較，**p＜0.014.姜黃素固體分散體的鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎作用實(shí)驗(yàn)藥品、試劑、動(dòng)物Sprague-Dawley，SD大鼠，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2004A021。NIH純系小鼠，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2004A018。昆明小鼠，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2004A019。
陽性對照藥地塞米松片，廣東華南制藥廠，國藥準(zhǔn)字H44024469，批號(hào)040301。陽性對照藥京都念慈庵蜜煉川貝枇杷膏，京都念慈庵總廠有限公司，醫(yī)藥產(chǎn)品注冊號(hào)ZC2002010(ZC2002009，ZC2002008)，批號(hào)Y140495(G240317，G341119)。姜黃素，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；姜黃素固體分散體(Cur與PVP-k30質(zhì)量比為1∶8)，若無特別說明，以下所用姜黃素固體分散體給藥劑量都為實(shí)際姜黃素含量，制備方法與實(shí)施例1相同。
4.1.1小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)選取健康NIH小鼠70只，體重18-22g，雄性，隨機(jī)分為7組，分別為空白對照組、地塞米松組、念慈庵組、姜黃素固體分散體四個(gè)給藥劑量組(0.043、0.130、0.39和1.170g·Kg-1)，每組10只小鼠。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7d。于末次給藥后30min，將每只小鼠置于250ml的廣口瓶中，廣口瓶中預(yù)先加入吸有75μl氨水的棉球，觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期(由放入瓶中至產(chǎn)生咳嗽所需的時(shí)間)和2min內(nèi)小鼠咳嗽的次數(shù)(典型咳嗽是小鼠腹肌收縮，同時(shí)張大嘴，有咳聲)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。
3.1.2小鼠氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)3.1.2.1酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用分析天平準(zhǔn)確稱取酚紅，加5％NaHCO3，配制成濃度為100μg·ml-1的儲(chǔ)備液，然后順次稀釋成濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、5和10μg·ml-1的酚紅溶液，以5％NaHCO3溶液作為空白對照，用546nm波長下測OD值，以酚紅的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.1.2.2檢測方法選取健康雄性昆明種小鼠105只，體重18～22g，隨機(jī)分為7組，分別為空白對照組、地塞米松組、念慈庵組、姜黃素固體分散體給藥劑量組(43、130、390、1170mg·Kg-1)每組15只小鼠。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7d。末次給藥30min后，腹腔注射5％酚紅溶液，0.1ml/10g。注射30min后將小鼠處死，背位固定，分離氣管，取一段氣管(長1cm)放入裝有1ml生理鹽水的試管中，振蕩30min，將沖洗液吸入試管內(nèi)，加1mol·L-1NaOH，0.1ml，使其呈堿性，將酚紅標(biāo)準(zhǔn)管在546nm處比色，通過酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出酚紅濃度(由于部分酚紅可由呼吸道粘液腺分泌到氣管腺內(nèi))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。
3.1.3小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)選取健康雄性昆明種小鼠105只，體重18～22g，隨機(jī)分為7組，分別為空白對照組、地塞米松組、念慈庵組、姜黃素固體分散體給藥劑量組(43、130、390、1170mg·Kg-1)，每組15只小鼠。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7d。于末次給藥30min后在小鼠右耳的前后兩面涂布致炎劑二甲苯(濃度為100％)0.05ml/只，左耳不做任何處理，致使小鼠右耳發(fā)炎。30min后處死小鼠，剪下雙耳用8mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，稱重，每鼠右耳片重量減去左耳片重量即為腫脹度，計(jì)算耳腫脹度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。
耳腫脹度＝右耳片重量-左耳片重量腫脹抑制率＝(對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)÷對照組平均腫脹度×100％
3.1.4大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)選取體重健康的雄性SD大鼠70只，體重180-200g，隨機(jī)分成7組，分別為空白對照組、地塞米松組、念慈庵組、姜黃素固體分散體給藥劑量組(30、90、270和810mg·Kg-1)，每組10只大鼠。每天灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7d。末次給藥0.5h后測定大鼠右足體積一次。測量足體積采用毛細(xì)管放大測量法取三通開關(guān)一只，一端與20ml玻璃注射器相連，另一端與5ml刻度移液管相接，中間連一導(dǎo)尿管，內(nèi)盛滿了滴加酚紅的水溶液。通過三通開關(guān)使液體凹面與注射器上標(biāo)記的刻度線相平，液體充滿導(dǎo)尿管并超過移液管的最低刻度線，讀得此時(shí)移液管上的刻度，用記號(hào)筆在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)周圍做上標(biāo)記線，試驗(yàn)者將大鼠后肢拉直，放入玻璃注射器，使大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)記線與注射器上標(biāo)記的刻度相平，通過調(diào)節(jié)三通開關(guān)使注射器與移液管相通，液體由注射器流入移液管，移液管內(nèi)液面升高。用眼注視注射器內(nèi)液面，控制三通開關(guān)，當(dāng)注射器內(nèi)液面與標(biāo)記的刻度線相平時(shí)立即旋轉(zhuǎn)三通開關(guān)，使注射器與移液管內(nèi)液體不再流動(dòng)。讀得此時(shí)移液管上的刻度，記錄，兩次刻度之差即為測量時(shí)大鼠的足體積。除正常組外，每組均注射角叉菜致炎。給藥后，試驗(yàn)者將大鼠后肢拉直，把實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配的1％角叉菜膠(準(zhǔn)確稱取1.0g溶于100ml生理鹽水)用26號(hào)針頭注射器先自足趾中部皮下向上然后調(diào)轉(zhuǎn)針頭向下注射0.05ml。分別于注射角叉菜后0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h測定大鼠踝關(guān)節(jié)容積的變化(即足腫脹度)，觀察到達(dá)高峰時(shí)間和消退時(shí)間，計(jì)算足腫脹度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。
腫脹度(ml)＝致炎后右足的體積-實(shí)驗(yàn)前右足的體積3.1.5大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)選取體重健康的雄性SD大鼠70只，體重180-200g，隨機(jī)分成7組，分別為空白對照組、地塞米松組、念慈庵組、姜黃素固體分散體給藥劑量組(30、90、270和810mg·Kg-1)，每組10只大鼠。大鼠在乙醚淺麻醉下腹部去毛并用75％酒精和碘酒消毒。在腹部正中做一個(gè)切口，將兩個(gè)滅菌棉球(每個(gè)棉球重20mg，高壓滅菌，各加入氨芐青霉素每個(gè)1mg/0.1ml，50℃烘箱烤干)分別植入大鼠兩側(cè)腋窩皮下(或兩側(cè)腹股溝皮下)，將切口縫合后用75％酒精和碘酒消毒。于手術(shù)后當(dāng)天開始灌胃給藥，每天一次，連續(xù)14d。15d頸椎脫臼處死，剝離并取出棉球肉芽組織，然后在60℃烘箱內(nèi)烘12h后稱干重，相比各組肉芽腫脹重量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。
4.1姜黃素固體分散體的平喘、祛痰和抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)姜黃素固體分散體43、130、390、1170mg·Kg-1劑量組與空白對照組相比，能顯著延長小鼠的咳嗽潛伏期，使咳嗽次數(shù)明顯減少，與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，而地塞米松對咳嗽潛伏的延長作用與空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，但有延長的趨勢，能夠顯著性的減少小鼠的咳嗽次數(shù)(P＜0.05)。姜黃素固體分散體43、130、390、1170mg·Kg-1劑量組與地塞米松組以及念慈庵組相比，止咳效果無顯著性差異(P＞0.05)，各個(gè)劑量之間的鎮(zhèn)咳作用差異不大(見表15)。
表15姜黃素固體分散體對氨水致咳小鼠的影響(x±s，n＝10)組別 劑量咳嗽潛伏期 咳嗽次數(shù)(mg·Kg-1) (s)(n)空白對照組 -- 26.8±7.9 32.2±21.0地塞米松組 1.5531.2±20.3 14.±10.2*念慈庵組 580038.8±16.5*13.6±7.3*姜黃素固體分 38.4±10.5*△■14.5±5.2*△■43散體組130 38.3±11.5*△■12.4±7.6*△■390 39.7±14.3*△■13.6±6.7*△■117037.2±14.3*△■15.6±5.3*△■與空白對照組相比，*P＜0.05；與地塞米松組相比，△P＞0.05；與念慈庵組相比，■P＞0.05。
4.1.2小鼠氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.1306x-0.0061，(r＝0.9995)。與空白對照組比，姜黃素固體分散體130、390、1170g·Kg-1組和地塞米松組、念慈庵組均能夠顯著性地增加小鼠氣管酚紅的排泄量(P＜0.05)，與念慈庵組、地塞米松組相比，姜黃素固體分散體130、390、1170mg·Kg-1組對小鼠氣管酚紅排泄量無顯著性差異(P＞0.05)，其中姜黃素固體分散體1170mg·Kg-1組效果最佳(見表16)。
表16姜黃素固體分散體對酚紅排泄量的影響(x±s，n＝15)組別 劑量 酚紅濃度(mg·Kg-1)(ug·ml-1)空白對照組 - 0.21±0.10地塞米松組 1.55 0.33±0.11念慈庵組 5800 0.26±0.06*姜黃素固體分散體組 43 0.28±0.12△■1300.29±0.07*△■3900.33±0.09**△■1170 0.38±0.13**△■與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與地塞米松組相比，△P＞0.05；與念慈庵組相比，■P＞0.05。
4.1.3小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)姜黃素固體分散體390、1170mg·Kg-1給藥劑量和陽性對照藥均能顯著性減輕二甲苯引起的小鼠耳腫脹程度(P＜0.05)，其中地塞米松組和1170mg·Kg-1姜黃素固體分散體組效果最好(P＜0.01)；與地塞米松組相比，1170mg·Kg-1姜黃素固體分散體組無顯著性差異(P＜0.05)；與念慈庵組相比，42、130、390mg·Kg-1姜黃素固體分散體組無顯著性差異(P＞0.05)，而1170mg·Kg-1姜黃素固體分散體組與念慈庵組相比具有顯著性差異(P＜0.05)(見表17)。
表17黃素固體分散體對小鼠耳腫脹的影響(x±s，n＝15)組別劑量 腫脹度(mg·Kg-1) (mg)空白對照組 - 19.7±4.0地塞米松組 1.55 10.9±4.2***念慈庵組5800 15.7±4.3*姜黃素固體分散體組 4317.9±4.5▲■130 16.6±4.3▲■390 15.6±5.4*▲■1170 11.7±5.6***△□與空白對照組相比，*P＜0.05，***P＜0.001；與地塞米松組相比，▲P＜0.05；與念慈庵組相比，□P＜0.05，■P＞0.05。
4.1.4大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)注射角叉菜膠后，大鼠足趾在20min后開始腫脹，在4h后腫脹程度最明顯。30、90、270、810mg·Kg-1姜黃素固體分散體和陽性對照藥在不同時(shí)間顯著性的抑制角叉菜膠引起大鼠足腫脹的程度(P＜0.05)，其中地塞米松的抗炎效果最好(P＜0.01)。姜黃素固體分散體8.1g·Kg-1與念慈庵組相比，無顯著性差異(P＞0.05)(見表18。
表18姜黃素固體分散體對大鼠足腫脹的影響(x±s，n＝10)

與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與地塞米松組相比△P＞0.05；與念慈庵組相比■P＞0.05。
4.1.5大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)植入棉球后，大鼠傷口愈合良好。連續(xù)給藥14d后，空白對照組大鼠腋下肉芽腫非常明顯，給予30、90、270、810mg·Kg-1姜黃素固體分散體能夠明顯抑制棉球肉芽腫的增生(P＜0.01)，而且抑制效果與陽性藥念慈庵、地塞米松組相比無顯著性差異(P＞0.05)。說明姜黃素固體分散體各劑量組均能有效的抑制肉芽腫的形成，具有抗慢性炎癥的作用(見表19)。
表19姜黃素固體分散體對大鼠棉球肉芽腫的影響(x±s)劑量 動(dòng)物數(shù)肉芽腫重量組別(mg·Kg-1)(n) (mg)空白對照組-10105.3±39.2地塞米松組1.05 1043.3±5.2**念慈庵組 5400 1048.2±5.3**姜黃素固體分散體1051.0±6.0**△■組3090 1050.2±6.3**△■210 1046.9±3.6**△■810 1045.4±6.3**△■與空白對照組相比，**P＜0.01；與地塞米松組相比，△P＞0.05；與念慈庵組相比，■P＞0.05。
權(quán)利要求
1.一種姜黃素固體分散體的制備方法，其特征在于將姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮按質(zhì)量比1∶4～1∶15溶于有機(jī)溶劑，于55～95℃下減壓蒸餾除去大部分有機(jī)溶劑至成糊狀，然后在60～90℃下真空烘箱烘干，粉碎，得到姜黃素固體分散體。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為1∶6～1∶12。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為1∶7～1∶10。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為無水乙醇、丙醇、異丙醇或乙酸乙酯。
5.一種姜黃素固體分散體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的制備方法制備而成。
6.權(quán)利要求5所述的姜黃素固體分散體在制備用于治療胃潰瘍、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎的藥物或保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了姜黃素固體分散體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明將姜黃素和聚乙烯吡咯烷酮按質(zhì)量比1∶4～1∶15溶于有機(jī)溶劑(如無水乙醇、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯等)，于減壓蒸餾55－ 95℃下除去大部分乙醇至成糊狀，迅速倒入不銹鋼盤中，在60－90℃下真空烘箱烘干，用粉碎機(jī)粉碎，得到姜黃素固體分散體。本發(fā)明的姜黃素固體分散體水溶性好，生物利用度高，在制備用于治療胃潰瘍、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎的藥物或保健品中有著重要的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/122GK1709228SQ200510035060
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者許東暉 申請人:中山大學(xué)