專利名稱：生物活性硅酸三鈣自固化材料、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性硅酸三鈣自固化材料、制備和用途，更具體地說涉及人體硬組織缺損填充修復(fù)材料，即作為人體骨和牙缺損填充修復(fù)的生物活性材料，在骨科、牙科和微創(chuàng)治療中的應(yīng)用。屬于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在人體骨組織和牙缺損修復(fù)治療中，可以在缺損部位進(jìn)行磷酸鈣骨水泥填充修復(fù)治療。目前，人們還借助微創(chuàng)治療手段，將填充材料設(shè)計(jì)成可注射并能在體內(nèi)自固化的糊狀物進(jìn)行注射治療，既避免了傳統(tǒng)手術(shù)的繁雜過程，減輕了病人的痛苦，又大大降低了治療費(fèi)用。
自從20世紀(jì)80年代Chow等人提出了磷酸鈣骨水泥(CPC)的概念以來(Chow等，J Dent Res 1984；63200)，不少學(xué)者相繼開發(fā)出一系列不同磷酸鈣鹽組合的CPC骨水泥填充材料，這類材料具有良好的生物相容性和自固化特性，并且能夠傳導(dǎo)成骨性細(xì)胞遷移和骨組織內(nèi)生長，但是從本質(zhì)上講，這種修復(fù)過程僅僅是骨組織沿著具有良好生物相容性的材料表面和微孔內(nèi)爬行替代(如骨傳導(dǎo))(J Biomed Mater ResAppl Biomater 1998；43451-461)，材料本身不具有生物活性，不能對(duì)成骨性干細(xì)胞產(chǎn)生活性刺激并促進(jìn)骨組織修復(fù)(Hench等，Life Chem Rep 1996；13187-241)。其次，這類材料固化速度太快，在微創(chuàng)治療中容易產(chǎn)生“濾壓”現(xiàn)象，不易注射。
近30年來，大量研究結(jié)果顯示，一些含鈣-硅的生物活性材料，如45S5生物活性玻璃和A-W玻璃陶瓷，在模擬體液和人體內(nèi)均能誘導(dǎo)類骨碳酸羥基磷灰石(CHA)沉積，并且體內(nèi)試驗(yàn)也已經(jīng)證明這類生物活性材料具有優(yōu)良的與骨組織鍵合的能力(Hench等，J Biomed Mater Res Symp1971；36117-141；Kokubo等，Biomaterials 1991；12155-163)。不僅如此，人們還發(fā)現(xiàn)硅在幼鼠的新骨鈣化區(qū)域發(fā)生富集，并且協(xié)同鈣促進(jìn)骨組織的早期鈣化(Carlisle EM，Science 1970；167279-280)；相反，如果缺乏適量硅元素，老鼠顱骨將發(fā)生畸變(Schwarz等，Nature 1972；239333-334)。最近幾年來，不少學(xué)者報(bào)道，不少含鈣-硅組分的生物活性材料釋放的鈣、硅離子能與成骨細(xì)胞作用，激活細(xì)胞基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化(Xynos等，BiomedBiophys Res Commun 2000；276461-465；Xynos等，J Biomed Mater Res2001；55151-157；Phan等，J Biomed Mater Res 2003；67A1001-1008；Gough等，Biomaterials 2004；252039-2046)。由此可見，誘導(dǎo)類骨CHA生成和促進(jìn)人體骨細(xì)胞增殖、分化是某些含鈣-硅組分生物活性材料的共同特征，這為開發(fā)新的具有生物活性自固化材料提供了科學(xué)依據(jù)。
此外，牙髓壞死及根尖周病是常見的牙科疾病，這種疾病的治療必須先清除根管內(nèi)壞死物質(zhì)，再填充根管。傳統(tǒng)上采用Ca(OH)2作封閉填充劑，容易對(duì)髓腔軟組織和血管產(chǎn)生不良影響；如果利用具有生物活性和藥物緩釋功能的自固化材料，通過負(fù)載藥物消炎滅菌和材料自身誘導(dǎo)產(chǎn)生的磷灰石與牙髓形成牢固鍵合，將可以促進(jìn)病變愈合、縮短療程并防止復(fù)發(fā)。
硅酸三鈣(Ca3SiO5)是波特蘭水泥中的主要成分之一，加入適量的調(diào)和液制備的糊狀物具有任意塑形、自行固化等特點(diǎn)。當(dāng)硅酸三鈣粉體與水接觸，微粒表層溶解并伴隨離子遷移，具有納米孔結(jié)構(gòu)的鈣硅酸鹽水合物凝膠沉積在粉體微粒表面，同時(shí)氫氧化鈣晶粒在水合物凝膠毛細(xì)孔區(qū)成核并長大；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，鈣硅酸鹽水合物凝膠聚合硬化，形成具有一定微孔和強(qiáng)度的塊體材料(Barnes著，Structure and performance of cements.LondonApplied Science Publishers.1983)。與生物活性玻璃和陶瓷類似，硅酸三鈣也具有優(yōu)良的生物活性(Zhao等，Mater Lett 2004；582350-2353)。硅酸三鈣粉體與模擬體液接觸，材料表面首先溶解，Ca2+和SiO44-進(jìn)入溶液；溶液中SiO44-穩(wěn)定性下降并發(fā)生聚合反應(yīng)，富集在材料表面，在材料表面形成富硅的Si-O網(wǎng)絡(luò)凝膠層；隨著上述反應(yīng)的進(jìn)行和Ca2+持續(xù)溶解，材料表面附近溶液中的Ca2+、OH-濃度提高，隨后通過靜電吸引Ca2+、PO43-、HPO42-與富硅活性表面作用并吸附在表面，沉積形成鈣磷酸鹽，它們?cè)倥c溶液中的HPO42-、CO32-、OH-相互作用，鈣磷酸鹽轉(zhuǎn)化形成碳酸羥基磷灰石晶核，這種晶核不斷長大，形成納米級(jí)的類骨磷灰石層。硅酸三鈣粉體表面誘導(dǎo)沉積的碳酸羥基磷灰石具有人體骨中納米級(jí)針狀磷灰石晶體相同的結(jié)構(gòu)，從而保證了與人體骨組織中的膠原鍵合和外延生長。此外，最新的研究顯示，硅酸三鈣不僅具有優(yōu)良的生物活性，還具有適度的硅離子釋放和降解性能，是一種新型的具有良好應(yīng)用前景的人體骨/牙缺損填充修復(fù)生物活性材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物活性硅酸三鈣自固化材料、制備方法和用途。它是利用硅酸三鈣具有誘導(dǎo)類骨磷灰石沉積和自固化特性，制備出一種新型的鈣-硅基生物活性人體骨和牙缺損填充修復(fù)材料；通過改變調(diào)和液與硅酸三鈣粉體的比例，可以制備出適合于骨科、口腔科以及微創(chuàng)治療中應(yīng)用的自固化材料。
基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種以硅酸三鈣為活性誘導(dǎo)物質(zhì)，以水或各種溶液為調(diào)和液制備的原位固化生物活性材料，并且本發(fā)明還提供了原位固化生物活性硅酸三鈣材料的制備技術(shù)以及在骨/牙缺損填充、藥物緩釋和微創(chuàng)治療的用途。
本發(fā)明的硅酸三鈣自固化材料既有優(yōu)良的生物活性和生物相容性，又能根據(jù)需要方便地制備成面團(tuán)狀或者可注射的水泥材料，滿足臨床進(jìn)行骨、牙缺損修復(fù)手術(shù)的多種治療需要。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述本發(fā)明所說的人體骨缺損修復(fù)材料主要由硅酸三鈣和調(diào)和液調(diào)漿制備成的糊狀物，優(yōu)選的液固比例為調(diào)和液∶硅酸三鈣＝(0.8-1.2)∶1，質(zhì)量比。
本發(fā)明所用的硅酸三鈣粉體顆粒定義為粒徑小于30μm的小顆粒材料，更優(yōu)選的粒徑0.5-10μm的微顆粒材料。本發(fā)明所用的微米顆粒直徑有利于糊狀物的水化反應(yīng)和凝結(jié)速度。
所述的硅酸三鈣原位固化材料粉體制備是以分析純硝酸鈣及正硅酸乙酯為原料，采用溶膠—凝膠法制備硅酸三鈣粉體。首先，去離子水中加入一定量硝酸，然后再加入0.5-0.8摩爾正硅酸乙酯，攪拌。再加入1.5-2.4摩爾硝酸鈣，攪拌1-2小時(shí)，密封，55-65℃下沉化20-24小時(shí)，直至凝膠出現(xiàn)；然后，在120℃干燥，球磨。再在1400-1450℃下煅燒8-10小時(shí)得到硅酸三鈣粉體。用XRD鑒定合成粉體為硅酸三鈣，用SEM觀察粉體粒度在5～30μm之間，采用乙二醇-乙醇法測定粉體中游離CaO含量在0.1％以下。
本發(fā)明所用的調(diào)和液是去離子水、無機(jī)鹽(碳酸鹽、氯化鈣、磷酸鹽等)溶液、有機(jī)物溶液(明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸等)及模擬體液中的一種。以上述硅酸三鈣粉體和調(diào)和液，按調(diào)和液/硅酸三鈣分別為(0.8-1.2)∶1的不同液/固比例(l/p)混合后，調(diào)和0.5-1分鐘，得到可作為修復(fù)人體骨缺損填充修復(fù)的相應(yīng)骨水泥糊狀物樣品。將各樣品裝入15mL容量的帶有噴嘴內(nèi)徑(D)為2.0mm針頭的注射器，對(duì)其注射性進(jìn)行試驗(yàn)；按ISO9597-1989E推薦標(biāo)準(zhǔn)，采用Vicat針對(duì)上述骨水泥糊狀物的初凝時(shí)間(I)和終凝時(shí)間(F)進(jìn)行測試。對(duì)不同骨水泥粉體和調(diào)和液以不同比例混合得到的糊狀物樣品的注射性和凝結(jié)時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果，如表1所示。
表1硅酸三鈣糊狀物l/p比與可注射性和凝結(jié)時(shí)間的關(guān)系

表1的結(jié)果表明，本發(fā)明前述的硅酸三鈣糊狀物的可注射性和凝固時(shí)間分別隨l/p的變化而改變。采用2.0mm直徑噴嘴，液固比為(1.0-1.2)∶1時(shí)，可以注射。提高l/p能夠增強(qiáng)糊狀物的流動(dòng)性，初凝時(shí)間為90-130分鐘。本發(fā)明按l/p為1.0-1.2制備的糊狀物材料可以注射并兼顧力學(xué)強(qiáng)度，適于微創(chuàng)手術(shù)；按l/p為0.8制備的面團(tuán)狀材料具有快速凝固的特點(diǎn)，能解決大體積骨缺損填充修復(fù)的問題。
對(duì)硅酸三鈣固化材料采用體外模擬體液(SBF)浸泡實(shí)驗(yàn)(Kokubo等，J Biomed Mater Res 1990；24721-734)進(jìn)行生物活性測試，并對(duì)浸泡后樣品表面進(jìn)行X射線衍射(XRD)表征。如圖2所示，本發(fā)明的硅酸三鈣固化材料表面能誘導(dǎo)類骨磷灰石生成，表明本發(fā)明的硅酸三鈣固化材料具有優(yōu)良的生物活性。XRD圖譜還顯示材料表面含有碳酸鈣，這是硅酸三鈣自固化材料水化產(chǎn)物之一——?dú)溲趸}在模擬生理環(huán)境中與碳酸根反應(yīng)轉(zhuǎn)化成為碳酸鈣，碳酸鈣有利于骨細(xì)胞活性和礦化。
對(duì)硅酸三鈣固化材料進(jìn)行細(xì)胞毒性和細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)。取養(yǎng)護(hù)7天后的水泥樣品粉碎、滅菌。按ISO10993-5標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行材料浸提和L929成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。分別培養(yǎng)1-7天后取出，采用溴化鉀基噻唑基四唑(MTT)溶液測定細(xì)胞活性。如圖4所示，成纖維細(xì)胞的增殖均明顯高于對(duì)照組，表明硅酸三鈣固化物浸提液中的鈣、硅離子能提高成纖維細(xì)胞的相對(duì)生長率，顯著促進(jìn)了細(xì)胞有絲分裂，說明這種材料釋出的鈣、硅離子能促進(jìn)細(xì)胞增殖。取初生小牛大腿骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)第2-3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)。用掃描電鏡觀察MSCs在材料表面上的貼附情況，如圖4所示。MSCs在24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞的質(zhì)膜外突起發(fā)生伸展牢固黏附在材料表面，顯示MSCs能夠在本發(fā)明的硅酸三鈣固化材料表面貼壁鋪展，材料具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性。
據(jù)此，本發(fā)明的可注射原位固化材料是一種新型的人體骨缺損修復(fù)材料，該材料具有優(yōu)良的生物學(xué)性能，在人體模擬體液中能沉積類骨碳酸羥基磷灰石并且逐步降解，析出的鈣、硅離子對(duì)細(xì)胞增殖具有良好的促進(jìn)作用。
本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是硅酸三鈣固材料對(duì)負(fù)載藥物具有緩釋特征。向本發(fā)明推薦的調(diào)和液中加入硫酸慶大霉素，對(duì)制備的硅酸三鈣固化材料進(jìn)行體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明該材料能夠?qū)崿F(xiàn)緩慢釋放附載藥物，不存在爆發(fā)式釋放和藥物濃度快速下降等現(xiàn)象。
硅酸三鈣自固化材料具有良好的注射性；具有微孔管道和力學(xué)強(qiáng)度；具有優(yōu)良的生物活性、適度的降解性；具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性，無細(xì)胞毒性，主動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化；能作為藥物載體的藥物復(fù)合物。硅酸三鈣自固化材料可用于骨/牙缺損填充、藥物緩釋和微創(chuàng)治療。
按照上述內(nèi)容，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，根據(jù)本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和技術(shù)手段，向硅酸三鈣粉體顆粒原料和調(diào)和液中添加其他生物相容性和治療性藥物組分，都屬于本發(fā)明內(nèi)容包括的多種形式的修改、替換和變更，均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1硅酸三鈣粉體(a)及其骨水泥材料養(yǎng)護(hù)7天(b)后的XRD圖譜。
圖2養(yǎng)護(hù)7天后硅酸三鈣固化材料在SBF中浸泡7天時(shí)XRD圖譜；l/p＝1.0。
圖3硅酸三鈣固化材料浸提液成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后與對(duì)照組的相對(duì)生長率比較(*＝p＜0.05)。
圖4MSCs在硅酸三鈣固化材料表面培養(yǎng)24小時(shí)后的SEM照片。
圖5慶大霉素從硅酸三鈣固化材料中的釋放曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)例并不限制本發(fā)明的范圍，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)和制備的材料均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例11)硅酸三鈣原位固化材料粉體制備以分析純硝酸鈣及正硅酸乙酯為原料，采用溶膠—凝膠法制備硅酸三鈣粉體。首先，200毫升去離子水中加入一定量硝酸，然后再加入0.5摩爾正硅酸乙酯，攪拌。再加入1.5摩爾硝酸鈣，攪拌1小時(shí)，密封，60℃下沉化24小時(shí)，直至凝膠出現(xiàn)；然后，在120℃干燥，球磨。再在1450℃下煅燒8小時(shí)得到硅酸三鈣粉體。用XRD鑒定合成粉體為硅酸三鈣，用SEM觀察粉體粒度在5～30μm之間，采用乙二醇-乙醇法測定粉體中游離CaO含量在0.1％以下。
2)調(diào)和液配制稱取1.0g分析純碳酸氫鈉溶解于99.0mL去離子水中得到1.0％的碳酸氫鈉溶液，消毒，密閉在消毒瓶中，備用。
3)硅酸三鈣骨缺損填充材料的制備將硅酸三鈣粉料和調(diào)和液按液固質(zhì)量比為0.8∶1的比例充分調(diào)和0.5-1分鐘，即得到硅酸三鈣骨缺損填充材料。
實(shí)施例21)硅酸三鈣粉體制備同實(shí)施例1；僅沉化溫度改為60℃，時(shí)間為20小時(shí)，最后煅燒溫度1400℃，時(shí)間為10小時(shí)，CaO含量低于0.1％，硅酸三改粒徑0.5-30μm。
2)調(diào)和液配制
稱取1.0g分析純明膠溶解于99.0mL去離子水中得到1.0％的明膠溶液，消毒，密閉在消毒瓶中，備用。
3)硅酸三鈣自固化材料的制備將上述合成的硅酸三鈣固化材料粉料和調(diào)和液按液固質(zhì)量比為0.8∶1的比例充分調(diào)和0.5-1分鐘，即得到可用于微創(chuàng)治療的硅酸三鈣自固化材料。
實(shí)施例3向去離子水中加入粉劑硫酸慶大霉素，配制成濃度為3.0mg·mL-1慶大霉素水溶液。以此慶大霉素水溶液為調(diào)和液，將硅酸三鈣粉料和調(diào)和液按液固質(zhì)量比為1.0的比例充分調(diào)和0.5-1分鐘，然后在37℃、100％濕度條件下養(yǎng)護(hù)1天，即得到硅酸三鈣藥物緩釋載體材料。將本例所得到的可注射硅酸三鈣藥物緩釋載體材料(10×4mm)進(jìn)行體外藥物釋放，釋放環(huán)境為20mL去離子水及20mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS；pH7.4)。定期吸取5mL釋放溶液介質(zhì)并補(bǔ)充等量新鮮介質(zhì)，采用紫外-可見吸光光度法測定吸取液中慶大霉素的濃度。以慶大霉素累積釋放量對(duì)釋放時(shí)間作圖，如圖5所示。
權(quán)利要求
1.一種生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于它是由一種調(diào)和液和硅酸三鈣組成的糊狀物，調(diào)和液和硅酸三鈣的質(zhì)量比為0.8-1.2∶1，所選的調(diào)和液為去離子水、模擬體液、無機(jī)鹽溶液或有機(jī)物溶液中任意一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于硅酸三鈣調(diào)和液和硅酸三鈣質(zhì)量比為1.0-1.2∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于硅酸三鈣的粒徑小于30μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于硅酸三鈣的粒徑為0.5-10μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于用作調(diào)和液的無機(jī)鹽為碳酸鹽、氯化鈣或磷酸鹽中任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述生物活性硅酸三鈣自固化材料，其特征在于用作調(diào)和液的有機(jī)物溶液為明膠、殼聚糖或透明質(zhì)酸溶液中任意一種。
7.制備如權(quán)利要求1所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料的方法，其特征在于具體工藝步驟是1)硅酸三鈣粉體的制備以分析純硝酸鈣及正硅酸乙酯為原料，采用溶膠-凝膠法制備硅酸三鈣粉體。首先，去離子水中加入一定量硝酸，然后再加入0.5-0.8摩爾正硅酸乙酯，攪拌。再加入1.5-2.4摩爾硝酸鈣，攪拌1-2小時(shí)，密封，沉化，直至凝膠出現(xiàn)；然后干燥，球磨。再在1400-1450℃高溫下煅燒得到硅酸三鈣粉體；并使CaO含量在0.1％以下；2)硅酸三鈣自固化材料制備將上述合成的硅酸三鈣粉體和調(diào)和液按液固質(zhì)量比為0.8-1.2∶1的比例充分調(diào)和0.5-1分鐘，即得到供修復(fù)人體組織缺損的硅酸三鈣自固化材料。
8.按權(quán)利要求7所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料的制備方法，其特征在于攪拌后密封沉化的溫度為55-65℃，時(shí)間20-24小時(shí)。
9.按權(quán)利要求7所述的生物活性硅酸三鈣自固化材料的制備方法，其特征在于高溫煅燒時(shí)間為8-10小時(shí)。
10.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的硅酸三鈣作為自固化材料的應(yīng)用，其特征在于作為骨/牙缺損填充料、硫酸慶大霉素藥物緩釋的載體和微創(chuàng)治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體骨缺損填充原位自固化生物活性材料、制備方法及用途。其特征在于它是以具有生物活性的硅酸三鈣粉體和調(diào)和液為原料研制的一種新型骨/牙缺損修復(fù)材料。兩者質(zhì)量比為(0.8～1.2)∶1，所述的調(diào)和液為去離子水、模擬體液、無機(jī)鹽溶液或有機(jī)鹽中任意一種。與現(xiàn)有材料相比，本發(fā)明的材料具有“生物活性優(yōu)良，任意塑形，自行固化，無細(xì)胞毒性，逐步降解和負(fù)載藥物緩慢釋放”的特性，可以達(dá)到誘導(dǎo)類骨磷灰石生成、促進(jìn)人體骨細(xì)胞增殖分化效果；其生物活性比磷酸鈣類骨水泥優(yōu)良，制備方法簡單。用于骨/牙缺損填充、藥物緩釋的載體以及微創(chuàng)治療。
文檔編號(hào)A61L27/02GK1706504SQ20051002582
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者常江, 趙文淵 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所