專利名稱：草烏葉提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種草烏葉提取物，屬于中藥制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
草烏葉是毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥葉。夏季葉茂盛花未開時(shí)采收，除去雜質(zhì)，及時(shí)干燥?！吨袊幍洹?005版中，規(guī)定有小毒。為蒙古族習(xí)用藥材。因其溶出速度快，容易加工，在臨床主要入丸散。草烏葉中總堿含量較高，雙酯性生物堿含量較低，在止痛效果上接近草烏的水平，但毒性較小，而且其有較好的清熱解毒的作用，從來源上都為北烏頭。因此，需要解決同時(shí)協(xié)調(diào)草烏葉的毒性和療效問題，又方便臨床使用的制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種草烏葉提取物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供含有該草烏葉提取物的藥物組合物及其制備方法。
本發(fā)明提供了一種草烏葉提取物，它是由草烏Radix Aconiti Kusnezoffii的葉為原料制備而成的提取物，其中，每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計(jì)在0.125mg～0.25mg；含總生物堿，照滴定法測定，以烏頭堿C34H47NO11計(jì)在0.6～0.9mg。
以烏頭堿為指標(biāo)成分，測定本發(fā)明提取物中雙酯性生物堿及總生堿的含量，因?yàn)樯飰A類成分既是本發(fā)明提取物的活性成分，也是毒性成分，因此，對生物堿類成分的質(zhì)量控制非常重要，直接影響了藥物的有效、安全。只有在上述質(zhì)量控制的范圍內(nèi)的藥物才能滿足安全、有效，才能便于臨床使用。
進(jìn)一步地，它是由草烏葉為原料，加水或有機(jī)溶劑提取而得。
其中，本發(fā)明提取物是由如下方法制備稱取草烏葉，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分鐘，煎煮1.5～2.5小時(shí)，第2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小時(shí)，濾過，合并濾液濃縮，干燥即得。
進(jìn)一步地，它是由如下方法制備稱取草烏葉，加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2次，每次2小時(shí)，濾過，濾液，濃縮，干燥即得。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是含有草烏葉提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，所述的藥劑是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑、合劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法，它包括如下步驟a、稱取草烏葉，第一次加9～11倍量水，浸泡30分鐘，煎煮1.5～2.5小時(shí)，第2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小時(shí)，濾過，合并濾液濃縮，干燥；b、將a步驟的干燥物加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，步驟a中煎煮2次，每次加10倍量水，每次2小時(shí)，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
其中，所述濃縮是將濾液減壓濃縮至相對密度1.02～1.05，60℃；所述干燥方法為一步制粒法，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
本發(fā)明藥物解決了患者使用不便和安全性的問題，通過對本發(fā)明藥物進(jìn)行質(zhì)量控制，解決了草烏在臨床上使用的安全性問題，擴(kuò)大了藥源；且本發(fā)明藥物制備方法操作簡單，節(jié)約了炮制成本、治療成本，有非常好的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
原料購自成都荷花池市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定教研室鑒定為北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥葉，當(dāng)年采收。
實(shí)施例1草烏葉水提取物的制備取草烏葉藥材12.50kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.15Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實(shí)施例2草烏葉水提取物的制備取草烏葉藥材11.50kg，以水浸泡40min，加至11倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后2.5h，第2次加9倍量水，煎煮2.5小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得1.98Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實(shí)施例3本發(fā)明藥物顆粒劑的制備取草烏葉藥材10.50kg，以水浸泡20min，加至9倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后1.5h，第2次加7倍量水，煎煮1.5小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得1.75Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃，制備的提取物制顆粒、整粒，制成顆粒劑。
實(shí)施例4本發(fā)明藥物片劑的制備取草烏葉藥材12.30kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.12Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃，制備的提取物制顆粒、整粒，壓片，制成片劑。
實(shí)施例5本發(fā)明藥物膠囊劑的制備取草烏葉藥材13.5kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.25Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。制備的提取物制顆粒、裝膠囊，得膠囊劑。
實(shí)施例6質(zhì)量控制方法限量檢查照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄VA)測定。
分別精密稱取實(shí)施例1制備的草烏葉顆粒10g，加氨試液2ml，用乙醚50ml連續(xù)振搖1小時(shí)，冷浸過夜，再用乙醚50ml分3次洗滌，濾過，合并濾液和洗液，低溫蒸干，加乙醚5ml溶解，揮干，加乙醇2.5ml溶解，置25ml容量瓶中，精密加入堿性鹽酸羥胺試液1.5ml，于60~65℃中水浴10分鐘，取出，放冷，加入13ml高氯酸鐵試液，搖勻，放置5分鐘，精密加入高氯酸試液8ml，搖勻，用高氯酸鐵試液定容至刻度。以空白做參比，在520nm下測定其吸光度(標(biāo)準(zhǔn)曲線按《中國藥典》2000年制川烏項(xiàng)下操作)顆粒劑每袋4g草烏葉顆粒劑，相當(dāng)于草烏葉藥材5g，含雙酯性生物堿以烏頭堿(C34H47NO11)計(jì)在0.5～1.0mg間。
含量測定照滴定法測定。
分別精密稱取草烏葉顆粒20g，加氨試液4ml，加氨試液4ml，用乙醚氯仿(31)混合液50ml超聲提取45分鐘，再用混合液50ml分3次洗滌，濾過，合并濾液和洗液，低溫蒸干，濾過，濾液，低溫蒸干，殘?jiān)踊旌弦?ml使溶解并蒸干，再加乙醇5ml使溶解，精密加入硫酸滴定液(0.01mol/L)15ml、水15ml與甲基紅指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)滴定至黃色。每1ml硫酸滴定液(0.01mol)相當(dāng)于12.9mg的烏頭堿(C34H47NO11)。
顆粒劑每袋4g，相當(dāng)于草烏葉藥材5g，含總生物堿以烏頭堿(C34H47NO11)計(jì)在2.4～3.6mg間。
以下通過藥效試驗(yàn)的方法對本發(fā)明的有益效果做進(jìn)一步詳述。
試驗(yàn)例1本發(fā)明草烏葉提取物提取工藝不同參數(shù)的篩選試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物原料購自成都荷花池市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定教研室鑒定為北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥葉，當(dāng)年采收。以加水浸泡30min后，加至10倍量水煎煮，煎煮時(shí)間分別取煮沸后15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，煎煮完畢均減壓濃縮為每ml含原生藥1g。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表，草烏葉煎煮15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的給藥劑量分別取臨床劑量(1.2g/60kg.d-1)的24倍、3倍、48倍、12倍、1倍、36倍和6倍。臨用時(shí)用蒸餾水分別配制成4.8％、0.6％、9.6％、2.4％、0.2％、7.2％、1.2％的草烏葉藥液備用。
萘普生陽性藥物，成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H51020774。生產(chǎn)批號040707。規(guī)格0.1g×100片/瓶。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成2％的藥液備用。
1.2動(dòng)物SD大鼠，雌雄不拘，體重180-220g。由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號04-11。檢疫后備用。
2、實(shí)驗(yàn)方法取SD大鼠90只，以WMZ-03型電子溫度計(jì)測定大鼠肛溫作為基礎(chǔ)體溫，測量時(shí)將大鼠仰位固定于鼠板上，待其穩(wěn)定后，在肛溫計(jì)頂端涂少許液體石蠟，輕緩送入肛門2cm，放置30秒待電子肛溫計(jì)指針穩(wěn)定后讀數(shù)。按基礎(chǔ)體溫高低隨機(jī)分為模型對照組(N＝10)、陽性對照組(N＝10)、草烏葉15min組(N＝10)、30min組(N＝10)、1h組(N＝10)、2h組(N＝10)、3h組(N＝10)、4h組(N＝10)、6h組(N＝10)，按組分別灌胃蒸餾水、2％萘普生藥液、4.8％、0.6％、9.6％、2.4％、0.2％、7.2％、1.2％的草烏葉藥液。給藥1小時(shí)后，于大鼠背部皮下注射0.25％2，4-二硝基苯酚溶液10ml/kg(精密稱取2，4-二硝基苯酚150mg，置于80ml生理鹽水中，滴加5mol/L的NaOH溶液，不斷攪拌，待藥液澄明變?yōu)榱咙S色，再加入生理鹽水至100ml)，分別測定造模后30min、60min、90min、120min、150min、180min的肛溫，以給藥前后溫度之差進(jìn)行組間比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，回歸分析采用均勻設(shè)計(jì)1.0專用軟件處理。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組2，4-二硝基苯酚造模后，30min體溫即顯著升高，120min組達(dá)高峰，持續(xù)3小時(shí)。草烏葉除1小時(shí)組外，其余各給藥組體溫均明顯降低，尤以6h組顯著，各時(shí)間段與模型組比較均有顯著或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，草烏葉除30min發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件為6h，21.12倍外，60min、90min、120min、150min、180min發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件均為6h，48倍。結(jié)果詳見表1及回歸分析。
表1 草烏葉對2，4-二硝基苯酚致熱大鼠體溫的影響


注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析0.5hY＝1.99-0.547X1+0.0356X2+0.0933X22-2.66×10-5X23R＝0.9948 a＝0.05最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝21.12倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝2.571hY＝1.78+1.41X1-0.0264X2-0.808X12+0.0945X13+0.00502X12X2R＝1.0000 a＝0.01最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝8.991.5hY＝2.71-0.0407X1X2+0.00954X12X2R＝0.9823 a＝0.05
最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝7.462hY＝4.57-1.36X1-0.0519X2+0.232X12+3.69×10-4X1X22R＝0.9961 a＝0.05最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝7.382.5hY＝2.47+1.45X1-0.0527X2-0.824X12+0.0972X13+0.00401 X12X2R＝0.9982 a＝0.15最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝6.863hY＝2.65-0.189X1+0.134X2-0.0107X22+0.00204X12X2+1.5×10-4X23R＝0.9991 a＝0.15最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果Y＝3.37上述藥效試驗(yàn)證明，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h均能發(fā)揮藥效作用，6h較優(yōu)；15min、30min、4h、6h條件下制備的本發(fā)明藥物是最佳藥物。
試驗(yàn)例2本發(fā)明草烏葉提取物提取工藝不同參數(shù)的安全性試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1.藥物草烏葉各時(shí)間點(diǎn)水煎液，受試藥物，按實(shí)施例1-3所述的方法制備，分別含生藥量為15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h均為3.33g/ml；由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，試驗(yàn)批號050625，用各水煎液灌胃小鼠。
1.2.動(dòng)物SPF小鼠，雌雄各半，體重18-21g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號川實(shí)動(dòng)管質(zhì)04-11，檢疫后備用。
2.實(shí)驗(yàn)方法預(yù)試取SPF小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12hr，通過試驗(yàn)測得15min、30min、1h的全死、全活量，做LD50；2h、3h、4h及6h以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量灌胃，24h連續(xù)給藥3次。連續(xù)觀察3d，記錄動(dòng)物有無毒性反應(yīng)以及實(shí)驗(yàn)前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
取SPF小鼠150只，雌雄各半，禁食不禁水12hr， 按體重隨機(jī)分為15組，每組10只。在15min、30min、1h的全死全活量之間再設(shè)定3個(gè)劑量組，分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液；連續(xù)觀察7天，記錄動(dòng)物死亡只數(shù)，求其LD50。
取SPF小鼠100只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按體重隨機(jī)分為5組，每組20只。即空白對照組(N＝20)、2h組(N＝20)、3h組(N＝20)、4h組(N＝20)及6h組(N＝20)。以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液，24h連續(xù)給藥3次；連續(xù)觀察7天，記錄動(dòng)物有無毒性反應(yīng)以及實(shí)驗(yàn)前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
以上結(jié)果均用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1草烏葉15min時(shí)間點(diǎn)藥液結(jié)果SPF小鼠灌胃草烏葉15min時(shí)間點(diǎn)藥液后，均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、神情淡漠、等不同程度的中毒反應(yīng)，死亡多發(fā)生在給藥后24小時(shí)內(nèi)死亡。動(dòng)物死亡情況詳見表3。
Y＝-4.532+0.0473X r＝0.344LD50＝95.84g/kg。
表3 15min草烏葉灌胃給藥對動(dòng)物死亡的影響

3.2草烏葉30min時(shí)間點(diǎn)藥液結(jié)果SPF小鼠灌胃草烏葉30min時(shí)間點(diǎn)藥液后，均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、神情淡漠等不同程度的中毒反應(yīng)，死亡多發(fā)生在給藥后24小時(shí)內(nèi)死亡。動(dòng)物死亡情況詳見表4。
Y＝-9.659+0.099X r＝0.740LD50＝97.09g/kg。
表4 30min草烏葉灌胃給藥對動(dòng)物死亡的影響

3.2草烏葉1h時(shí)間點(diǎn)藥液結(jié)果SPF小鼠灌胃草烏葉1h時(shí)間點(diǎn)藥液后，均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、神情淡漠等不同程度的中毒反應(yīng)，死亡多發(fā)生在給藥后24小時(shí)內(nèi)死亡。動(dòng)物死亡情況詳見表5。
Y＝-14.797+0.1209X r＝0.657
LD50＝122.35g/kg。
表5 30min草烏葉灌胃給藥對動(dòng)物死亡的影響

3.3草烏葉2h、3h、4h及6h時(shí)間點(diǎn)藥液結(jié)果SPF小鼠灌胃草烏葉2h、3h、4h及6h時(shí)間點(diǎn)藥液后，發(fā)育健康，肌肉豐滿，被毛濃密而有光澤、緊貼其身，眼睛明亮而靈活、無異常的分泌物，肛周潔凈，攝食正常，四肢健壯，自發(fā)活動(dòng)正常，體重逐漸增加。7d內(nèi)未內(nèi)動(dòng)物死亡及毒副反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)肉眼尸解未見明顯病理改變。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論SPF小鼠灌胃草烏葉各時(shí)間點(diǎn)水煎液結(jié)果草烏葉15分鐘LD50為95.84g原生藥/kg(約相當(dāng)于人用量的4792倍)；30分鐘LD50為97.09g原生藥/kg(約相當(dāng)于人用量的4855倍)；1h LD50為122.35g原生藥/kg(約相當(dāng)于人用量的6118倍)、2h、3h、4h及6h MTD為399.6g原生藥/kg(約相當(dāng)于人用量的19980倍)。
草烏葉煎煮15min、30min、1h無明顯毒性，煎煮時(shí)間2h以上基本無毒性。
上述實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明草烏提取物煎煮時(shí)間2h以上安全。
上述藥效學(xué)試驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所述的方法制備的產(chǎn)品，在質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，達(dá)到了安全、有效，為臨床提供了一種新的選擇。
權(quán)利要求
1.一種草烏葉提取物，其特征在于它是由草烏Radix Aconiti Kusnezoffii的葉為原料，加水或有機(jī)溶劑提取制備而成的提取物，其中，每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計(jì)在0.125mg～0.25mg；含總生物堿，照滴定法測定，以烏頭堿C34H47NO11計(jì)在0.6～.9mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草烏葉提取物，其特征在于它是由如下方法制備稱取草烏葉，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分鐘，煎煮1.5～2.5小時(shí)，第2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小時(shí)，濾過，合并濾液濃縮，干燥即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的草烏葉提取物，其特征在于它是由如下方法制備稱取草烏葉，加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2次，每次2小時(shí)，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
4.一種藥物組合物，它是含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的草烏葉提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑、合劑。
6.一種制備權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、稱取草烏葉，第一次加9～11倍量水，浸泡30分鐘，煎煮1.5～2.5小時(shí)，第2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小時(shí)，濾過，合并濾液濃縮，干燥；b、將a步驟的干燥物加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于步驟a中煎煮2次，每次加10倍量水，每次2小時(shí)，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述濃縮是將濾液減壓濃縮至相對密度1.02～1.05，60℃；所述干燥方法為一步制粒法，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種草烏葉提取物，它是由草烏Radix Aconiti Kusnezoffii的葉為原料制備而成的提取物，其中，每克提取物中含雙酯性生物堿照異肟羥酸鐵法以烏頭堿C
文檔編號A61P43/00GK1935200SQ20051002170
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者彭成, 郭力 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)