專利名稱：附子提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種附子提取物，屬于中藥制劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
生附子是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根，其加工品有黑順片，淡附片、白附片等共作附子用?！秱摗肥亲钤鐟?yīng)用附子，且相當(dāng)成熟記載，在20首方中運用附子如芍藥甘草附子湯、附子瀉心湯、附子湯、四逆湯等。在這些方中，有些附子為生用，有些為炮制后用。在四逆類方中如干姜附子湯、茯苓四逆湯、四逆湯、通脈四逆湯、白通湯、白通加豬膽汁湯、四逆加人參湯、通脈四逆加豬膽汁湯等8首方中附子均為生用以回陽救逆。在附子的主產(chǎn)地許多中醫(yī)臨床仍在使用生附子配伍使用。
其加工品有黑順片，白附片等在臨床應(yīng)用較多，加工炮制過程中，生品中所含毒性很強的雙酯類生物堿(烏頭堿等)，易水解生成毒性較小的單酯類生物堿，繼續(xù)水解，則生成毒性更小的不帶酯鍵的生物堿，而起到減毒的作用。文獻(xiàn)表明主要通過加熱和水漂的過程，是雙酯類生物堿的含量下降，達(dá)到減毒的目的，但時在炮制過程中不可避免降低總生物堿的含量，日本有學(xué)者懷疑炮制有過度的可能，缺乏足夠的藥效學(xué)和毒理學(xué)證據(jù)；目前在炮制品中間，炮制方法不同，含量也不同，藥典未做明確的區(qū)分，僅對起毒性作用的酯性堿作了限量檢查。
在臨床上，湯劑仍是目前附子應(yīng)用最廣的劑型，文獻(xiàn)統(tǒng)計表明，湯劑引發(fā)的毒性比例可達(dá)11.27％，主要原因在于患者使用時，藥典規(guī)定要先煎使用，至于要先煎多久，加水量、煎煮次數(shù)、火力等很難在實際中得到控制。因此，要解決好附子的毒性和療效問題，又要方便臨床使用，通過附子及其炮制品種黑順片，白附片進(jìn)行了藥效試驗和毒性試驗，在含量測定的基礎(chǔ)上，對三個品種的水提取制備時間點進(jìn)行深度了研究，確定了最佳時間點，通過制劑工藝的形式確定下來，并建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種附子提取物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供含有該附子提取物的藥物組合物及其制備方法。
本發(fā)明提供了一種附子提取物，它是由附子Radix Aconiti Lateralis Preparata或其炮制品為原料制備而成的水或乙醇提取物，其中，提取物中含有雙酯性生物堿照異肟羥酸鐵法以烏頭堿C34H47NO11計在0.04mg～0.75mg，含總生物堿照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.50～3.6mg。
其中，所述的附子或其炮制品為生附子、黑附片、白附片，它是由附子RadixAconiti Lateralis Preparata及其炮制品為原料制備而成的提取物，其中，生附子中每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.07mg～0.75mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在1.0～3.6mg；黑順片中每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.04mg～0.25mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.50～1.80mg；白附片中每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.05mg～0.3mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.65～1.75mg。
以烏頭堿為指標(biāo)成分，測定本發(fā)明提取物中雙酯性生物堿及總生堿的含量，因為生物堿類成分既是本發(fā)明提取物的活性成分，也是毒性成分，因此，對生物堿類成分的質(zhì)量控制非常重要，直接影響了藥物的有效、安全。只有在上述質(zhì)量控制的范圍內(nèi)的藥物才能滿足安全、有效，才能便于臨床使用。
它是由附子Radix Aconiti Lateralis Preparata及其炮制品為原料，加水或有機溶劑提取而得。
本發(fā)明附子提取物是由如下方法制備 取生附子藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮5.5～6.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得； 或，取黑順片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮4.5～5.5小時，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得； 或，取白附片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮3.5～4.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得。
進(jìn)一步地，它是由如下方法制備 取生附子藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮6小時；第二次加10倍量水，煎煮4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得； 取黑順片藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮5小時；第二次加8倍量水，煎煮3小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得； 取白附片藥材飲片，加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2次，每次4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是由所述的附子提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，所述的藥劑是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑、合劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法，它包括如下步驟 a、取生附子藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮5.5～6.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得； 或，取黑順片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮4.5～5.5小時，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得； 或，取白附片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮3.5～4.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得； b、將a步驟的干燥物加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，步驟a具體如下 取生附子藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮6小時；第二次加10倍量水，煎煮4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得； 取黑順片藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮5小時；第二次加8倍量水，煎煮3小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得； 取白附片藥材飲片，加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2次，每次4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
其中，所述濃縮是將濾液減壓濃縮至相對密度1.02~1.05，60℃；所述干燥方法為一步制粒法，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
本發(fā)明藥物解決了患者使用不便和安全性的問題，在質(zhì)量上對不同炮制品進(jìn)行了比較明確的區(qū)分，解決了生附子在臨床上使用的安全性問題，擴大了藥源，節(jié)約了炮制成本，且本發(fā)明采用不同的提取條件下制備的產(chǎn)品功效不同，適應(yīng)癥廣泛，為臨床提供了一種新的選擇。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

具體實施例方式 實施例1生附子水提取物的制備 取生附子藥材13.50kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后6h，第2次加10倍量水，煎煮4小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.51Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例2附子水提取物的制備 取生附子藥材12.50kg，以水浸泡30min，加至9倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后5.5h，第2次加9倍量水，煎煮3.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.25Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例3本發(fā)明藥物顆粒劑的制備 取生附子藥材11.50kg，以水浸泡30min，加至11倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后6.5h，第2次加11倍量水，煎煮4.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.08Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃，提取物加淀粉制粒，整粒，即得顆粒劑。
實施例4黑順片提取物的制備 取黑順片藥材12.35kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后5h，第2次加8倍量水，煎煮3小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.03Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例5黑順片提取物的制備 取黑順片藥材11.50kg，以水浸泡30min，加至9倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后4.5h，第2次加7倍量水，煎煮2.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.03Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例6本發(fā)明藥物片劑的制備 取黑順片藥材12.35kg，以水浸泡30min，加至11倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后5.5h，第2次加9倍量水，煎煮3.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.03Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃，制備的提取物加入輔料，制顆粒、壓片，即得。
實施例7白附片提取物的制備 取白附片藥材12.35kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后4h，第2次加10倍量水，煎煮4小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.03Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例8白附片提取的制備 取白附片藥材11kg，以水浸泡30min，加至11倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后4.5h，第2次加11倍量水，煎煮4.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
實施例9本發(fā)明藥物膠囊劑的制備 取白附片藥材12.35kg，以水浸泡30min，加至9倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后3.5h，第2次加9倍量水，煎煮3.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1.02~1.05(60℃)，干燥即得2.03Kg提取物，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃，制備的提取物加入淀粉制顆粒、裝膠囊，制成膠囊劑。
實施例10本發(fā)明藥物提取物的質(zhì)量控制方法 性狀本品為棕黃色至棕色顆粒，氣微，味微苦澀。
鑒別取本品2g，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加氨試液5ml，加入乙醚3ml，超聲提取10分鐘，振搖20分鐘，濾過，濾液置分液漏斗中，加0.25mol/L硫酸溶液，振搖提取，分取酸液，照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄VA)測定。在231nm與274nm波長處有最大吸收。
檢查應(yīng)符合顆粒劑項下有關(guān)的各項規(guī)定(《中國藥典》2000年版一部附錄IC)。
限量檢查照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄VA)測定。
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取烏頭堿對照品20mg加適量無水乙醇溶解，移入10ml量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得。精密量取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)液0、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50ml，置25ml容量瓶中，加乙醇至2.5ml，精密加入堿性鹽酸羥胺試液1.5ml，于60~65℃中水浴10分鐘，取出，放冷，加入13ml高氯酸鐵試液，搖勻，放置5分鐘，精密加入高氯酸試液8ml，搖勻，用高氯酸鐵試液定容至刻度。以空白作參比，在520nm下測定其吸光度，以生物堿量與吸收度值作圖并經(jīng)直線回歸處理，得線性方程式。
2、供試品溶液的制備 分別精密稱取2個最小包裝內(nèi)容物，加氨試液5ml，用乙醚50ml連續(xù)振搖1小時，冷浸過夜，再用乙醚50ml分3次洗滌，濾過，合并濾液和洗液，低溫蒸干，加乙醚5ml溶解，揮干，加乙醇2.5ml溶解，置25ml容量瓶中，自“精密加入堿性鹽酸羥胺”起至“在520nm下測定其吸光度”計算求得總生物堿含量 本品每袋2g，含生附子以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得高于1.5mg。
本品每袋4g，含黑順片以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得高于1.0mg。
本品每袋4g，含白附片以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得高于1.5mg。
含量測定照分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄VA)測定。
1、標(biāo)推曲線的繪制 精密稱取烏頭堿對照品10mg加適量氯仿溶解，移入100ml量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，即得。精密量取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)液0、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50ml，分別置于分液漏斗中，并精密加入氛仿至20.0ml。以第一份為空白對照，然后各加入10mlpH6.1±0.1溴甲酚綠染料，充分振搖，靜置1小時，氯仿液過濾至25ml容量瓶中并用氯仿稀釋至刻度。于410nm波長處，分別測定空白、供試液的吸收度。以生物堿量與吸收度值作圖并經(jīng)直線回歸處理，得線性方程式。
2、供試品溶液的制備 分別精密稱取單個最小包裝內(nèi)容物，按鑒別法備用，用乙醚-氯仿(3∶1)混合液代替氯仿，置蒸發(fā)皿中，水浴低溫蒸干加乙醚-氯仿(3∶1)混合液5ml蒸干，加氯仿使溶解，定容于1ml，每次測定分別取0.1ml的溶液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加氯仿至20ml，即得。自“加入10mlpH6.1±0.1溴甲酚綠染料”起至“410nm波長處”依法測定，計算求得總生物堿含量 本品每袋2g，含生附子以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得少于3.6mg。
本品每袋4g，含黑順片以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得少于3.5mg 本品每袋4g，含白附片以烏頭堿(C34H47NO11)計，不得少于3.0mg。
以下通過藥效試驗的方法對本發(fā)明的有益效果做進(jìn)一步詳述。
試驗例1本發(fā)明附子提取物提取工藝不同參數(shù)的篩選試驗 (一)篩選試驗 1、實驗材料 1.1藥物 附子(生附子、白附片、黑附片)受試藥物，購自四川江油，經(jīng)本校生藥鑒定教研室鑒定為烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根，當(dāng)年采收。以3倍量水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮時間分別取煮沸后15min、30min、60min、120min、3h、4h、6h等7個時間點，煎煮完畢減壓濃縮為每ml含原生藥3g。根據(jù)均勻設(shè)計表，附子(生附子、白附片、黑附片)煎煮15min、30min、60min、120min、3h、4h、6h的7個時間點依次取臨床劑量(15g/60kg.d-1)的24倍、2倍、48倍、12倍、1倍、36倍和6倍，臨用時用蒸餾水分別配制成60％、7.5％、120％、30％、2.5％、90％、15％的藥液備用。
參附注射液雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z51020664，生產(chǎn)批號040513。規(guī)格10ml/支。
醋酸地塞米松陽性藥物，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H33020822。生產(chǎn)批號040209。規(guī)格0.75mg/片。實驗時用蒸餾水配制成0.03％的藥液備用。
鹽酸曲馬多片陽性藥物，石家莊制藥集團有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H10960106。生產(chǎn)批號031003。規(guī)格50mg/片。實驗時用蒸餾水配制成1％的藥液備用。
通便靈膠囊陽性藥物，四川奇力制藥有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z51020262。生產(chǎn)批號040201。規(guī)格12?！?板/盒。實驗時用蒸餾水配制成5％的藥液備用。
金匱腎氣丸陽性藥物，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z11020417。生產(chǎn)批號040811。規(guī)格360粒/瓶。實驗時用蒸餾水配制成33.33％的金匱腎氣丸藥液備用。
羥基脲膠囊造模藥物，山西安特生物制藥股份有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H14023012。生產(chǎn)批號20030702。規(guī)格0.25×12?！?板/盒。實驗時用蒸餾水配制成3.75％的羥基脲藥液備用。
氫化可的松注射液造模藥物，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H12020887。生產(chǎn)批號040310。規(guī)格100mg/20ml/支。
鹽酸普魯帕酮造模藥物，廣州明興制藥有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H4402049。生產(chǎn)批號MC3201。規(guī)格35mg/10ml/支。
1.2動物 昆明種小鼠，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號04-11。SD大鼠，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號04-11。檢疫后備用。
1.3儀器 BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司研制。RB-200型智能熱板儀，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。
2、實驗方法 2.1溫陽試驗 2.1.1心陽虛試驗 張子彬，Tsung O.Cheng，張玉傳.充血性心力衰竭學(xué).北京科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2002，204 2.1.2腎陽虛試驗 2.1.2.1生附子腎陽虛試驗 廖進(jìn)民，吳鐵.羥基脲致“陽虛”大鼠代謝變化的實驗研究.廣東解剖學(xué)報，1994；16(1)24-28 2.1.2.2白附片腎陽虛試驗 2.1.2.2.1游泳試驗 孔成文，雷春利，呂文偉，等.黃芪皂甙對實驗性心力衰竭的作用[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994，20(2)125 2.1.2.2.2爬桿試驗 孔成文，雷春利，呂文偉，等.黃芪皂甙對實驗性心力衰竭的作用[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994，20(2)125 2.1.2.3黑附片腎陽虛試驗 2.1.2.3.1游泳試驗 取體重20-24g的昆明種小鼠(雌雄各半)120只，隨機分為空白對照組(n＝10)、模型對照組(n＝14)、陽性對照組(n＝12)、黑附片15min組(n＝12)、30min組(n＝12)、1h組(n＝12)、2h組(n＝12)、3h組(n＝12)、4h組(n＝12)、6h組(n＝12)。給藥方法及數(shù)據(jù)處理同2.1.2.2.1。
2.1.2.3.2爬桿試驗 取體重20-24g的昆明種小鼠(雌雄各半)120只，隨機分為空白對照組(n＝10)、模型對照組(n＝14)、陽性藥物組(n＝12)、黑附片15min組(n＝12)、30min組(n＝12)、1h組(n＝12)、2h組(n＝12)、3h組(n＝12)、4h組(n＝12)、6h組(n＝12)。給藥方法及數(shù)據(jù)處理同2.1.2.2.2。
2.1.3陽虛便秘試驗 2.1.3.1生附子陽虛便秘試驗 取體重20-24g昆明種小鼠(雌雄各半)158只，隨機分為空白組(n＝10)、模型組(n＝20)、陽性藥物組(n＝16)、生附子15min組(n＝16)、30min組(n＝16)、1h組(n＝16)、2h組(n＝16)、3h組(n＝16)、4h組(n＝16)、6h組(n＝16)。除空白對照組外，各組均灌胃山西白醋(山西省美和居老陳醋有限公司生產(chǎn)，酸度3.5g/100ml)，首劑量15ml/kg，第2日起10ml/kg.d-1，連續(xù)9日。第7日，灌胃白醋的同時給予10％的0℃活性炭冰水25ml/kg.d-1，連續(xù)3日。各實驗組造模同時按組分別灌胃蒸餾水、5％通便靈膠囊藥液、60％、7.5％、120％、30％、2.5％、90％、15％的生附子藥液10ml/kg.d-1，連續(xù)9日。第8日，動物禁食不禁水24h。于末次給藥1h后，將小鼠分別放入代謝籠內(nèi)，記錄各組動物3h內(nèi)排便粒數(shù)及首粒排便時間(潛伏期)。觀察完畢后，各組小鼠灌胃營養(yǎng)糊(紅墨水125ml、羧甲基纖維素鈉5g、淀粉5g、奶粉10g、白糖5g)15ml/kg，15分鐘后處死，測量小腸全長及營養(yǎng)糊推進(jìn)長度，計算腸推進(jìn)率(營養(yǎng)糊推進(jìn)長度/小腸全長×100％)。實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，回歸分析采用均勻設(shè)計1.0專用軟件處理。
2.1.3.2白附片陽虛便秘試驗 取20-24g昆明種小鼠(雌雄各半)130只，隨機分為空白對照組(n＝13)、模型對照組(n＝13)、陽性組(n＝13)、白附片15min組(n＝13)、30min組(n＝13)、60min組(n＝13)、1h組(n＝13)、2h組(n＝13)、3h組(n＝13)、4h組(n＝13)、6h組(n＝13)。給藥方法及數(shù)據(jù)處理同2.1.3.1。
2.1.3.3黑附片陽虛便秘試驗 實驗方法及數(shù)據(jù)處理同2.1.3.1。
2.2抗炎試驗 2.2.1二甲苯耳廓腫脹試驗 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)(第2版).北京人民衛(wèi)生出版社，1991，719 2.2.2蛋清足跖腫脹試驗 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)(第3版).北京人民衛(wèi)生出版社，2002，911 2.2.3巴豆油肉芽腫試驗 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)(第3版).北京人民衛(wèi)生出版社，2002，918 2.3鎮(zhèn)痛試驗 2.3.1扭體試驗 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)(第3版).北京人民衛(wèi)生出版社，2002，882 2.3.2熱板試驗 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)(第3版).北京人民衛(wèi)生出版社，2002，885 3、實驗結(jié)果 3.1溫陽試驗 3.1.1心陽虛試驗 3.1.1.1對心率的影響 模型組大鼠給予普魯帕酮10.5mg/kg造模后，心率立即顯著減慢，數(shù)秒內(nèi)降至最低，其后緩慢上升，持續(xù)數(shù)十分鐘，與空白組比較有極顯著性差異。白附片除3h組外，其余各時間劑量組心率在不同時間均有明顯加快，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，2.5min、5min、10min、15min最優(yōu)條件分別為0.25小時25.06倍、1.929小時25.82倍、1.561小時29.39倍、6小時25倍，20min、25min、30min和60min則分別為6小時25.35倍、0.25小時37.38倍、6小時48倍和6小時48倍。
結(jié)果詳見表1和回歸分析。
表1對急性心衰陽虛大鼠心率(％)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 2.5min最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝25.06倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.41 5min最優(yōu)條件X1＝1.929h，X2＝25.82倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.82 10min最優(yōu)條件X1＝1.561h，X2＝29.39倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.50 15min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝26倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.49 20min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝25.35倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝8.17 25min最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝37.38倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.36 30min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝7.24 60min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝27.6 3.1.1.2對左室內(nèi)壓最大上升速率的影響 模型組大鼠給予普魯帕酮10.5mg/kg造模后，左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)立即顯著下降，數(shù)秒內(nèi)降至最低，其后緩慢上升，持續(xù)數(shù)十分鐘，與空白組比較有極顯著性差異。白附片各時間劑量組+dp/dtmax均有上升，其中15min組、1h組、2h組和4h組顯著上升，與模型組比較有顯著性差異或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，5min、10min、15min最優(yōu)條件分別為0.25小時28.17倍、4.551小時20.65倍、2.654小時48倍，20min、25min、30min和60min則分別為6小時34.75倍、6小時48倍、6小時45.09倍和6小時48倍。結(jié)果詳見表2和回歸分析。
表2對急性心衰陽虛大鼠+dp/dtmax(％)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 5min最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝28.17倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.47 10min最優(yōu)條件X1＝4.551h，X2＝20.65倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.71 15min最優(yōu)條件X1＝2.654h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.91 20min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝34.75倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.80 25min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝12.4 30min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝45.09倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.92 60min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝13.2 3.1.1.3對左室內(nèi)壓最大下降速率的影響 模型組大鼠給予普魯帕酮10.5mg/kg造模后，左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)立即顯著升高，數(shù)秒內(nèi)升至最高，其后緩慢下降，持續(xù)數(shù)十分鐘，與空白組比較有極顯著性差異。白附片各時間劑量組-dp/dtmax均有下降，其中15min組、2h組和4h組顯著下降，-dp/dtmax百分率顯著上升，與模型組比較有顯著性差異。經(jīng)回歸分析，5min、10min、15min最優(yōu)條件分別為0.25小時29.58倍、0.25小時27.41倍、1.964小時30.7倍，20min、25min、30min和60min則分別為6小時34.28倍、6小時48倍、4.827小時1倍和6小時48倍。結(jié)果詳見表3和回歸分析。
表3對急性心衰陽虛大鼠-dp/dtmax(％)的影響
注與空白組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 5min最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝29.58倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.58 10min最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝27.41倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.58 15min最優(yōu)條件X1＝1.964h，X2＝30.7倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.67 20min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝34.28倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.94 25min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝16.6 30min最優(yōu)條件X1＝4.827h，X2＝1倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.39 60min最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.6 3.1.2腎陽虛試驗 3.1.2.1生附子腎陽虛試驗 3.1.2.1.1對腎陽虛大鼠一般狀態(tài)的影響 模型組動物給予造模藥375mg/kg.d-117天后一般狀態(tài)較差，體重顯著減輕，被毛蓬松，嗜臥少動，小便增多，畏寒喜暖，攝食量減少。生附子15min組、1h組和6h組一般狀況較好，體重有明顯增加的趨勢，尤以6h組為甚，連續(xù)17天造模，未見有動物死亡。結(jié)果詳見表4。
表4對腎陽虛大鼠體重的影響
注與空白組比較，△P＜0.05，△△△P＜0.001。
3.1.2.1.2對腎陽虛大鼠體溫的影響 3.1.2.1.2.1腎陽虛大鼠造模16天體溫變化 模型組大鼠造模第10天體溫即顯著降低，與空白組比較有顯著性差異。給予生附子藥液后，溫度顯著升高，尤以1h組和6h組為甚，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異?；貧w分析表明，以6小時48倍升溫作用顯著。結(jié)果詳見表5及回歸分析。
表5對腎陽虛大鼠體溫的影響
注與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
回歸分析 第5天最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.83 第10天最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝1倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝6.53 第13天最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝7.19 第16天最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝10.49倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.37 3.1.2.1.2.2對腎陽虛大鼠12時辰體溫的影響 模型組大鼠造模16天后體溫普遍降低，給予生附子藥液后體溫明顯升高，6小時組在9時-21時體溫顯著升高，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。結(jié)果詳見表6。
表6對腎陽虛大鼠12時辰體溫的影響
注與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3.1.2.1.3對腎陽虛大鼠游泳時間的影響 模型組大鼠游泳時間顯著縮短，與空白組比較有極顯著性差異。生附子15min組、1h組和6h組游泳時間顯著延長，與模型組比較，有極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最佳時間劑量為6小時48倍。結(jié)果詳見表7和回歸分析。
表7對陽虛大鼠游泳時間的影響
注與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝18.8 3.1.2.1.4對腎陽虛大鼠臟器系數(shù)的影響 模型組大鼠造模17天后胸腺顯著萎縮，脾臟明顯減小。1h組、2h組、3h組、4h組和6h組胸腺明顯增大，1h組和4h組脾臟明顯增重，與模型組比較，有顯著性或極顯著性差異。結(jié)果詳見表8及回歸分析。
表8對腎陽虛大鼠臟器系數(shù)(％)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 胸腺最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝6.81 脾臟最優(yōu)條件X1＝5.23h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.82 3.1.2.2白附片腎陽虛試驗 3.1.2.2.1游泳試驗 3.1.2.2.1.1一般狀態(tài) 模型組動物連續(xù)給予造模藥40mg/kg.d-110天后一般狀態(tài)較差，體重不增，被毛蓬松，嗜臥少動，小便明顯增多，畏寒喜暖，攝食量明顯減少。白附片15min組、6h組一般狀況較好，體重逐漸增加。末次體重，白附片6h組與模型組比較有顯著性差異?；貧w分析結(jié)果表明，白附片增加體重的最佳煎煮時間和給藥劑量分別為6小時，19.89倍。結(jié)果詳見表9及回歸分析。
表9對腎陽虛小鼠體重的影響
注與空白組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05。
回歸分析 體重最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝19.89倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.18 3.1.2.2.1.2對游泳時間的影響 空白組低溫游泳時間平均達(dá)223.73秒，模型組小鼠游泳時間顯著縮短，平均游泳時間僅為102.86秒，與空白組比較有極顯著性差異。白附片除3h組外，其余各給藥組游泳時間均明顯延長，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異?；貧w分析表明，白附片延長腎陽虛小鼠游泳時間的最佳時間劑量為6h23.18倍。結(jié)果詳見表10及回歸分析。
表10對腎陽虛小鼠游泳時間的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 游泳時間最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝23.18倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝7.01 3.1.2.2.2爬桿試驗 空白組小鼠爬桿動作敏捷，平均爬桿時間達(dá)845.18秒；模型組動物爬桿反應(yīng)遲鈍，平均爬桿時間僅268.64秒，與空白組比較有極顯著性差異。白附片各給藥組爬桿時間均延長，其中以15min組、1h組和6h組最為明顯，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，白附片延長腎陽虛小鼠爬桿時間的最佳時間劑量分別為6h14.54倍。結(jié)果詳見表11及回歸分析。
表11對腎陽虛小鼠爬桿時間的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 爬桿時間最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝14.54倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.45 3.1.2.3黑附片腎陽虛試驗 3.1.2.3.1游泳試驗 3.1.2.3.1.1一般狀態(tài) 模型組動物連續(xù)給予造模藥40mg/kg.d-110天后，一般狀態(tài)較差，體重不增，被毛蓬松，嗜臥少動，小便明顯增多，畏寒喜暖，攝食量明顯減少。黑附片15min組、30min組、4h組和6h組一般狀況較好，體重逐漸增加。末次體重，黑附片30min組和4h組與模型組比較有顯著性差異。回歸分析結(jié)果表明，黑附片增加體重的最佳煎煮時間和給藥劑量分別為6小時，48倍。結(jié)果詳見表12及回歸分析。
表12對腎陽虛小鼠體重的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
回歸分析 體重(末次)最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.76 3.1.2.3.1.2對游泳時間的影響 空白組低溫游泳時間平均達(dá)232.5秒，模型組小鼠游泳時間顯著縮短，平均僅129.67秒，與空白組比較有極顯著性差異。黑附片1h組、4h組和6h組游泳時間顯著延長，與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。其余各給藥組游泳時間有明顯延長的趨勢?；貧w分析表明，黑附片延長腎陽虛小鼠游泳時間的最佳時間劑量為6h，37.57倍。結(jié)果詳見表13及回歸分析。
表13對腎陽虛小鼠游泳時間的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
回歸分析 游泳時間最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝37.57倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.23 3.1.2.3.2爬桿試驗 空白組小鼠爬桿動作敏捷，平均爬桿時間為547.6秒；模型組動物爬桿反應(yīng)遲鈍，平均爬桿時間僅142秒，與空白組比較有極顯著性差異。黑附片各給藥組爬桿時間均延長，其中以15min組和1h組最為明顯，與模型組比較有顯著性差異。經(jīng)回歸分析，黑附片延長腎陽虛小鼠爬桿時間的最佳時間劑量分別為6h23.94倍。結(jié)果詳見表14及回歸分析。
表14對腎陽虛小鼠爬桿時間的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05。
回歸分析 爬桿時間最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝23.94倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.59 3.1.3陽虛便秘試驗 3.1.3.1一般狀況 模型組動物個別于造模第2天就出現(xiàn)腹脹狀態(tài)，普遍于造模3-4天時出現(xiàn)倦怠蜷縮，活動減少，皮毛蓬松，后期動物死亡率較高，皆因腹脹大至死，動物瘦弱，觸之覺皮毛松弛，無肉。陽性藥物組、生附子、白附片、黑附片的1h組和6h組動物一般狀態(tài)較好，活動較頻繁，皮毛略蓬松，但觸之有肉感。與模型組比較有顯著性差異。各組體重比較，無顯著性差異。
3.1.3.2排便潛伏期和排便粒數(shù) 模型組小鼠造模9天后排便潛伏期顯著延長，3小時排便粒數(shù)顯著減少，與空白組比較，有極顯著性差異。生附子排便潛伏期除15min組和4h組外，均顯著縮短，3小時排便粒數(shù)1h組和6h組顯著增加；白附片排便潛伏期60min組、3h組、4h組和6h組均顯著縮短，3小時排便粒數(shù)30min組和6h組顯著增加；黑附片排便潛伏期30min組和4h、6h組均顯著縮短，3小時排便粒數(shù)1h組和6h組顯著增加。與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子排便潛伏期和排便粒數(shù)最優(yōu)條件分別為6小時19.71倍和6小時48倍；白附片排便潛伏期和排便粒數(shù)最優(yōu)條件均為6小時48倍；黑附子排便潛伏期和排便粒數(shù)最優(yōu)條件均為6小時48倍。結(jié)果詳見表15、16、17和回歸分析。
表15生附子對陽虛便秘小鼠排便潛伏期和顆粒數(shù)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
回歸分析 潛伏期最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝19.71倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.34 排便次數(shù)最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.62 表16白附片對陽虛便秘小鼠排便潛伏期和排便粒數(shù)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 排便潛伏期 最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.03 排便顆粒數(shù) 最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.53 表17黑附片對陽虛便秘小鼠排便潛伏期和排便粒數(shù)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
回歸分析 潛伏期最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝8.20 排便次數(shù)最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.42 3.1.3.3對胃腸推進(jìn)的影響 模型組小鼠胃腸推進(jìn)率顯著降低，與空白組比較有極顯著性差異。生附子除15min組外其余各組胃腸推進(jìn)率顯著增加白附片1h組和6h組胃腸推進(jìn)率顯著延長；黑附片除30min組和1h組外，其余各組胃腸推進(jìn)率顯著增加。與模型組比較有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件為6小時48倍；白附片為6小時1倍；黑附片發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件為6小時48倍。結(jié)果詳見表18、19、20和回歸分析。
表18生附子對陽虛便秘小鼠胃腸推進(jìn)的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 胃腸推進(jìn)最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.62 表19白附片對陽虛便秘小鼠胃腸推進(jìn)率的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 回歸方程最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝1倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.38 表20黑附片對陽虛便秘小鼠胃腸推進(jìn)率的影響
注與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回歸分析 胃腸推進(jìn)最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝10.1 3.2抗炎試驗 3.2.1二甲苯抗炎試驗 模型組小鼠造模后1.5h耳廓腫脹明顯。生附子組除2h、3h、4h外，其余各組耳廓腫脹均明顯縮小，與模型組比較，均有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件為0.25h，48倍。結(jié)果詳見表21及回歸分析。
表21對二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹的影響
注與模型組比較，*P＜0.05，**＜P0.01，***P＜0.001。
回歸分析 最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.2 3.2.2對蛋清足跖腫脹的影響 模型組大鼠右足跖注射雞蛋清后很快腫脹，注射后1h腫脹達(dá)高峰，注射后6h仍腫脹明顯。生附子組除3小時1倍劑量無效外，其余均有明顯抑制大鼠足跖腫脹的作用。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最優(yōu)條件30min、1h、2h、6h時為6h，48倍；3h、4h時為0.25h，31.64倍和31.93倍。結(jié)果詳見表22和回歸分析。
表22對雞蛋清致炎大鼠足跖腫脹的影響
注與模型組比較，*P＜0.05，**＜P0.01，***P＜0.001。
回歸分析 0.5h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.17 1h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝15.2 2h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝9.57 3h最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝31.64倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝5.47 4h最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝31.93倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.91 6h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝18.4 3.2.3對巴豆油肉芽腫的影響 模型組大鼠造模后1周體重未增加，反有減輕趨勢，滲出液量較多，肉芽增生顯著。生附子15min組、1h組、2h組和4h組給藥1周后體重顯著增加，15min組、30min組和6小時組滲出液量顯著減少，肉芽增生除2小時組外其余各組亦顯著減輕，與模型組比較，有顯著性或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最優(yōu)時間劑量為，體重2.274h、38.22倍；滲出液0.25h、1倍；肉芽腫0.25h、48倍。結(jié)果詳見表23和回歸分析。
表23對巴豆油致炎大鼠的影響
注與模型組比較，*P＜0.05，**＜P0.01，***＜P0.001。
回歸分析 體重最優(yōu)條件X1＝2.274h，X2＝38.22倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.37 滲出液最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝1倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝6.3 肉芽重最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝7.07 3.3鎮(zhèn)痛試驗 3.3.1扭體試驗 模型組小鼠注射0.6％醋酸后疼痛明顯，表現(xiàn)為扭體次數(shù)頻繁。生附子除4h組外，其余各時間劑量組扭體次數(shù)顯著減少，與模型組比較，有顯性著或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子發(fā)揮藥效的最佳時間劑量為0.25小時27.88倍。結(jié)果詳見表24和回歸分析。
表24對醋酸致痛小鼠的影響
注與模型組比較，*P＜0.05，**＜P0.01，***P＜0.001。
回歸分析 最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝27.88倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝7.28 3.3.2熱板試驗 生附子除30分鐘組外，其余各組痛閾值與模型組比較均有顯著或極顯著性差異。經(jīng)回歸分析，生附子60分鐘時間點發(fā)揮藥效的最佳時間劑量為0.25小時40.86倍。結(jié)果詳見表25和回歸分析。
表25對熱板致痛小鼠痛閾值(秒)的影響
注與模型組比較，*P＜0.05，**＜P0.01。
回歸分析 0.5h最優(yōu)條件X1＝3.286h，X2＝27.86倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝4.42 1h最優(yōu)條件X1＝0.25h，X2＝40.86倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝3.38 1.5h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝1倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝2.2 2h最優(yōu)條件X1＝6h，X2＝48倍 預(yù)期試驗結(jié)果Y＝18.4 上述藥效試驗證明，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮附子15min、2h、5h、6h溫心陽，4h、6h溫腎陽，6h溫脾陽效果較好；以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮附子15min、5h、6h抗炎作用較好；以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮附子15min、3h、6h鎮(zhèn)痛效果較好。
試驗例2本發(fā)明附子(生附子、白附片、黑附片)提取物提取工藝不同參數(shù)的安全性試驗 1.生附片動物急性毒性試驗資料及文獻(xiàn)資料 1.1.實驗材料 1.1.1.藥物 生附片各時間點水煎液，受試藥物，分別含生藥量為15min、30min、1h、2h均為3.3g/ml，3h為2g/ml，4h為1.33g/ml，6h為1.05g/ml，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，試驗批號050622，用各水煎液灌胃小鼠。
1.1.2.動物 SPF小鼠，雌雄各半，體重18-22g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，合格證號川實動管質(zhì)04-11，檢疫后備用。
1.2.實驗方法 預(yù)試取SPF小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12hr，通過試驗測得15min、30min的全死、全活量，做LD50；1h、2h、3h、4h及6h以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量灌胃，24h連續(xù)給藥3次。連續(xù)觀察3d，記錄動物有無毒性反應(yīng)以及實驗前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
取SPF小鼠100只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按體重隨機分為10組，每組10只。在15min、30min的全死全活量之間再設(shè)定3個劑量組，分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液；連續(xù)觀察7天，記錄動物死亡只數(shù)，求其LD50。
取SPF小鼠120只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按體重隨機分為6組，每組20只。即空白對照組(N＝20)、1h組(N＝20)、2h組(N＝20)、3h組(N＝20)、4h組(N＝20)及6h組(N＝20)。以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液，24h連續(xù)給藥3次；連續(xù)觀察7天，記錄動物有無毒性反應(yīng)以及實驗前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
以上結(jié)果均用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理。
1.3.實驗結(jié)果 1.3.1生附片15min時間點藥液結(jié)果 SPF小鼠灌胃生附片15min時間點藥液后，均出現(xiàn)行動遲緩、神情淡漠、嘔吐涎沫、扭體等不同程度的中毒反應(yīng)，死亡多發(fā)生在給藥后24小時內(nèi)死亡。動物死亡情況詳見表1。
Y＝-10.016+0.5095X r＝0.968 LD50＝19.657g/kg。
表26 15min生附片灌胃給藥對動物死亡的影響 1.3.2生附片30min時間點藥液結(jié)果 SPF小鼠灌胃生附片30min時間點藥液后，均出現(xiàn)行動遲緩、神情淡漠等不同程度的中毒反應(yīng)，死亡多發(fā)生在給藥后24小時內(nèi)死亡。動物死亡情況詳見表2。
Y＝-3.476+0.1153X r＝0.561 LD50＝30.151g/kg。
表27 30min生附片灌胃給藥對動物死亡的影響 1.3.3生附片1h、2h、3h、4h及6h時間點藥液結(jié)果 SPF小鼠灌胃生附片其他各時間點藥液后，發(fā)育健康，肌肉豐滿，被毛濃密而有光澤、緊貼其身，眼睛明亮而靈活、無異常的分泌物，肛周潔凈，攝食正常，四肢健壯，自發(fā)活動正常，體重逐漸增加。7d內(nèi)未內(nèi)動物死亡及毒副反應(yīng)。實驗結(jié)束時肉眼尸解未見明顯病理改變。
2.白附片動物急性毒性試驗資料 2.1.實驗材料 2.1.1.藥物 白附片各時間點水煎液，受試藥物，分別含生藥量為15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h為3.33g/ml，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，試驗批號050625，用各水煎液灌胃小鼠。
2.1.2.動物 SPF小鼠，雌雄各半，體重18-22g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，合格證號川實動管質(zhì)04-11，檢疫后備用。
2.2.實驗方法 預(yù)試取SPF小鼠若干只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，將15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各時間點水煎液以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量灌胃，24h連續(xù)給藥3次。連續(xù)觀察3d，動物均無死亡和明顯的毒性反應(yīng)，以此不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
取SPF小鼠160只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按體重隨機分為8組，每組20只。即空白對照組(N＝20)、15min組(N＝20)、30min組(N＝20)、1h組(N＝20)、2h組(N＝20)、3h組(N＝20)、4h組(N＝20)及6h組(N＝20)。以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液，24h連續(xù)給藥3次；連續(xù)觀察7天，記錄動物有無毒性反應(yīng)以及實驗前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
以上結(jié)果均用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理。
2.3.實驗結(jié)果 SPF小鼠灌胃白附片5min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各時間點水煎液后，發(fā)育健康，肌肉豐滿，被毛濃密而有光澤、緊貼其身，眼睛明亮而靈活、無異常的分泌物，肛周潔凈，攝食正常，四肢健壯，自發(fā)活動正常，體重逐漸增加。7d內(nèi)未內(nèi)動物死亡及毒副反應(yīng)。實驗結(jié)束時肉眼尸解未見明顯病理改變。
3.黑附片動物急性毒性試驗資料 3.1.實驗材料 3.1.1.藥物 黑附片各時間點水煎液，受試藥物，分別含生藥量為15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h為3.33g/ml，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，試驗批號0500701，用各水煎液灌胃小鼠。
3.1.2.動物 SPF小鼠，雌雄各半，體重18-22g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供，合格證號川實動管質(zhì)04-11，檢疫后備用。
3.2.實驗方法 預(yù)試取SPF小鼠若干只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，將15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各時間點水煎液以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量灌胃，24h連續(xù)給藥3次。連續(xù)觀察3d，動物均無死亡和明顯的毒性反應(yīng)，以此不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
取SPF小鼠160只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按體重隨機分為8組，每組20只。即空白對照組(N＝20)、15min組(N＝20)、30min組(N＝20)、1h組(N＝20)、2h組(N＝20)、3h組(N＝20)、4h組(N＝20)及6h組(N＝20)。以小鼠耐受的最大容積0.4ml/10g.B.W的劑量分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液，24h連續(xù)給藥3次；連續(xù)觀察7天，記錄動物有無毒性反應(yīng)以及實驗前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大耐受量(MTD)。
以上結(jié)果均用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理。
3.3.實驗結(jié)果 SPF小鼠灌胃黑附片5min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各時間點水煎液后，發(fā)育健康，肌肉豐滿，被毛濃密而有光澤、緊貼其身，眼睛明亮而靈活、無異常的分泌物，肛周潔凈，攝食正常，四肢健壯，自發(fā)活動正常，體重逐漸增加。7d內(nèi)未內(nèi)動物死亡及毒副反應(yīng)。實驗結(jié)束時肉眼尸解未見明顯病理改變。
4.實驗結(jié)論 SPF小鼠灌胃生附片15min、30min時間點藥液的LD50分別為19.657g原生藥/kg(約相當(dāng)于人用量的79倍)和30.151g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的121倍)。1h、2h MTD均為399.6g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的1600倍)、3h MTD為240g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的961倍)、4h MTD為160g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的640倍)、及6h MTD(最大給藥量)為126.32g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的505倍)；所有動物均未出現(xiàn)死亡或異常中毒反應(yīng)。提示生附片煎煮15min、30min仍然具有一定的毒性，煎煮時間達(dá)到1h以上基本沒有明顯毒性。
SPF小鼠灌胃白附片15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h MTD均為399.6g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的1598倍)；所有動物均未出現(xiàn)死亡或異常中毒反應(yīng)。提示白附片水煎液沒有明顯毒性。
SPF小鼠灌胃黑附片15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h MTD均為399.6g原生藥/kg(相當(dāng)于人用量的1598倍)；所有動物均未出現(xiàn)死亡或明顯中毒反應(yīng)。提示黑附片水煎液沒有明顯毒性。
上述實驗說明本發(fā)明附子(生附子、白附片、黑附片)提取物煎煮時間1h以上安全。
上述藥效、安全試驗證明，采用本發(fā)明所述的方法制備的產(chǎn)品，在質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，藥效明確，且針對不同的適應(yīng)癥，達(dá)到了安全、有效，為臨床提供了一種新的選擇。
權(quán)利要求
1、一種附子提取物，其特征在于它是由附子Radix Aconiti Lateralis Preparata或其炮制品為原料制備而成的水或乙醇提取物，其中，提取物中含有雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.04mg～0.75mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.50～3.6mg。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的附子提取物，其特征在于所述的附子或其炮制品為生附子、黑附片、白附片，其中，生附子每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.07mg～0.75mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在1.0～3.6mg；黑順片每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.04mg～0.25mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.50～1.80mg；白附片每克提取物中含雙酯性生物堿，照異肟羥酸鐵法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.05mg～0.3mg，含總生物堿，照溴甲酚綠法測定，以烏頭堿C34H47NO11計在0.65～1.75mg。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的附子提取物，其特征在于
所述的生附子提取物是由下述方法制備；取生附子藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮5.5～6.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得；
所述的黑附片提取物是由下述方法制備取黑順片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮4.5～5.5小時，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得；
所述的白附片提取物是由下述方法制備取白附片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮3.5～4.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得。
4、一種藥物組合物，它是由權(quán)利要求1～3任一項所述的附子提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑、合劑。
6、一種制備權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物的方法，它包括如下步驟
a、取生附子藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮5.5～6.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得；
或，取黑順片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮4.5～5.5小時，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得；
或，取白附片藥材飲片，第一次加9～11倍量水，浸泡20～40分鐘，煎煮3.5～4.5小時，第2次加9～11倍量水，煎煮3.5～4.5小時，濾過，濃縮，干燥，即得；
b、將a步驟的干燥物加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于步驟a具體如下
取生附子藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮6小時；第二次加10倍量水，煎煮4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得；
取黑順片藥材飲片，第一次加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮5小時；第二次加8倍量水，煎煮3小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得；
取白附片藥材飲片，加10倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2次，每次4小時，濾過，濾液濃縮，干燥即得。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述濃縮是將濾液減壓濃縮至相對密度1.02～1.05，60℃；所述干燥方法為一步制粒法，進(jìn)風(fēng)溫度為90～100℃，出風(fēng)溫度為60～65℃。
全文摘要
一種附子提取物，它是由附子Radix AconitiLateralis Preparata及其炮制品為原料制備而成的提取物。本發(fā)明提供了該附子提取物的質(zhì)量控制指標(biāo)。本發(fā)明還提供了該附子提取物的制備方法和含有附子提取物的藥物組合物。本發(fā)明藥物解決了患者使用不便和安全性的問題，在質(zhì)量上對不同炮制品進(jìn)行了比較，明確了藥效，解決了生附子在臨床上使用的安全性問題，擴大了藥源，節(jié)約了炮制成本，為臨床提供了一種新的選擇。
文檔編號A61K9/48GK1935201SQ20051002170
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者彭成, 郭力 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)