專利名稱：大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大黃蒽醌類化合物的應(yīng)用，具體地說是大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的一種急性病毒性呼吸道傳染病，以發(fā)病率高、流行廣泛、傳播迅速為主要特點(diǎn)。目前臨床使用的抗流感病毒藥物不少，但多數(shù)毒性較大，易損害宿主細(xì)胞和易導(dǎo)致耐藥毒株出現(xiàn)。當(dāng)前以病毒唑的治療效果最佳，但也有一定的副作用，少數(shù)病人口服或靜注時(shí)有口干，軟便或稀便，白細(xì)胞減少等癥狀，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有致癌作用，故妊娠初期三月內(nèi)禁用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要公開毒副作用低的中藥大黃提取物——大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用。
本發(fā)明是將大黃蒽醌類化合物應(yīng)用于防治流感病毒感染性疾病。
所述的大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性病癥上的應(yīng)用，是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型。
將大黃蒽醌類化合物制成大黃注射液，大黃總蒽醌含量為100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
也可將大黃蒽醌類化合物制成大黃片劑，大黃總蒽醌含量200mg/0.5g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
本發(fā)明用大黃蒽醌類化合物抗流感病毒是用不同濃度的大黃蒽醌類化合物分別作用于MDCK細(xì)胞和接種在MDCK細(xì)胞上的流感病毒，以病毒唑?yàn)閷?duì)照藥，觀察大黃蒽醌類化合物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用和對(duì)流感病毒抑制作用的情況，其對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為226.1μg/ml，對(duì)照為351.3μg/ml，抗流感病毒的半數(shù)有效濃度IC50為122.4μg/ml，對(duì)照為62.7μg/ml。應(yīng)用證實(shí)大黃蒽醌類化合物對(duì)流感病毒有明顯的抑制作用，且存在明顯的量效關(guān)系，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，抑制率升高，經(jīng)直線回歸分析，P＜0.05，大黃蒽醌類化合物濃度在160μg/ml以上時(shí)，對(duì)流感病毒引起的細(xì)胞病變的抑制率可達(dá)50％以上。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的具體步驟是1、所用的藥物為大黃蒽醌類化合物(RAA)，病毒為流感病毒鼠適應(yīng)株，細(xì)胞為MDCK細(xì)胞；2、用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，用胰酶將生長良好的MDCK細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1×105/ml濃度分種子40孔板，每孔0.1ml。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長成單層后備用；3、觀察藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用根據(jù)Mosmnna建立的四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用。
在培養(yǎng)好長成單層的細(xì)胞孔板上，換含不同濃度的含大黃蒽醌類化合物藥液，每種濃度重復(fù)4孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加含5mg/mlMTT的不含血清的MEM培養(yǎng)基50μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇體積比為1∶1)100μl，振蕩5～10分鐘，待結(jié)晶完全溶解，置96孔酶標(biāo)測(cè)定儀上，測(cè)定570nm波長處的光密度OD值，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率，找出藥物對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度范圍。
細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100％藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞粘連、皺縮、脫落并且吸光值明顯下降，吸光度OD值在0.10以下。將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞，結(jié)果見表1表1大黃蒽醌類化合物(RAA)對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用Table 1 The Cytotoxity of RAA to MDCK cells
4、觀察藥物對(duì)流感病毒增殖的抑制作用于已長成單層MDCK細(xì)胞的40孔板上，每孔接種50μl 100TCID50的流感病毒液，于35℃吸附90min，棄病毒上清。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在藥物無毒濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含藥維持液每孔0.2ml，然后將流感病毒培養(yǎng)板置35℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE。隔天換新鮮含藥維持液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽性藥物病毒唑組和中藥樣品組。
CPE記錄方法為一為無CPE，+為25％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；++為50％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；+++為75％細(xì)胞出現(xiàn)CPE++++為100％細(xì)胞出現(xiàn)CPE。約在病毒對(duì)照+++～++++時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100μl，混勻，5～10分鐘后，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm波長處的光密度OD值。并按下述公式計(jì)算藥物對(duì)流感病毒抑制率(Inhibitiverate)。
流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞CPE表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，變園、壁厚、脫落、拆光性增強(qiáng)，在無毒濃度范圍內(nèi)，將藥物以不同的濃度進(jìn)行抑制流感病毒實(shí)驗(yàn)，其病毒抑制率見表2。
表2大黃蒽醌類化合物(RAA)的抗流感病毒作用Table 2 The antiviral activity of RAA to influenza virus
5、結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0的probit回歸法計(jì)算藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為226.1μg/ml和半數(shù)有效濃度IC50為122.4μg/ml及藥物的治療指數(shù)TI為1.9，分析出大黃蒽醌類化合物在MDCK細(xì)胞中對(duì)流感病毒有抑制作用。
大黃蒽醌類化合物是從我國的中藥大黃提取分離得到的，大黃在我國應(yīng)用歷史悠久，自然資源豐富，大黃蒽醌類化合物抗流感病毒作用強(qiáng)，對(duì)人體的毒副作用小，加工提取工藝成熟，可以制成針劑，片劑等多種劑型，應(yīng)用到流感病毒感染性疾病的防治上，應(yīng)用前景非常廣闊。
(四)具體實(shí)施例
實(shí)施例1將大黃蒽醌類化合物制成針劑大黃注射液，大黃總蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
實(shí)施例2將大黃蒽醌類化合物制成大黃片片劑，大黃總蒽醌含量200mg/0.5g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
權(quán)利要求
1.大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物應(yīng)用于防治流感病毒感染性疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成大黃注射液，大黃總蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成大黃片劑，大黃總蒽醌含量200mg/0.5g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
全文摘要
大黃蒽醌類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型應(yīng)用于防治流感病毒引起的感染性疾病。大黃蒽醌類化合物對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC
文檔編號(hào)A61K9/20GK1843341SQ20051002068
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者羅偉生, 徐慶, 張奉學(xué), 蘇小建, 劉衛(wèi)兵, 唐祖年, 梁榮感, 李麗亞, 韋京辰 申請(qǐng)人:桂林醫(yī)學(xué)院