專利名稱：荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及荔枝核黃酮類、多酚類化合物的應(yīng)用，具體地說是荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的一種急性病毒性呼吸道傳染病，以發(fā)病率高、流行廣泛、傳播迅速為主要特點(diǎn)。目前臨床使用的抗流感病毒藥物不少，但多數(shù)毒性較大，易損害宿主細(xì)胞和易導(dǎo)致耐藥毒株出現(xiàn)。當(dāng)前以病毒唑的治療效果最佳，但也有一定的副作用，少數(shù)病人口服或靜注時(shí)有口干，軟便或稀便，白細(xì)胞減少等癥狀，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有致癌作用，故妊娠初期三月內(nèi)禁用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要公開毒副作用低的荔枝核提取物——荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用。
本發(fā)明是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物應(yīng)用于防治流感病毒感染性疾病。
所述的荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型應(yīng)用于防治流感病毒感染性疾病。
將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成荔枝核注射液，荔枝核黃酮類多酚類總含量為100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
也可將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成荔枝核片片劑，荔枝核黃酮類多酚類總含量100mg/0.3g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
本發(fā)明用荔枝核黃酮類、多酚類化合物抗流感病毒是用不同濃度的荔枝核黃酮類、多酚類化合物分別作用于MDCK細(xì)胞和接種在MDCK細(xì)胞上的流感病毒，以病毒唑?yàn)閷φ账?，觀察荔枝核黃酮類、多酚類化合物對MDCK細(xì)胞的毒性作用和對流感病毒抑制作用的情況，其藥物抗MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為347.3μg/ml，對照為351.3μg/ml，抗流感病毒的半數(shù)有效濃度IC50為63.2μg/ml，對照為62.7μg/ml，治療指數(shù)為5.5，對照為5.6。應(yīng)用結(jié)果證實(shí)荔枝核黃酮類、多酚類化合物對流感病毒有明顯的抑制作用，且存在明顯的量效關(guān)系，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，抑制率升高，經(jīng)直線回歸分析，P＜0.05，與病毒唑無明顯差異，荔枝核黃酮類、多酚類化合物濃度在160μg/ml以上時(shí)，對流感病毒引起的細(xì)胞病變的抑制率可達(dá)50％以上。
發(fā)明應(yīng)用的具體步驟是1、所用的藥物為荔枝核黃酮類(Flavonoids)、多酚類化合物(Polyphenol)，病毒為流感病毒鼠適應(yīng)株，細(xì)胞為MDCK細(xì)胞；2、用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，用胰酶將生長良好的MDCK細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1×105/ml濃度分種于40孔板，每孔0.1ml。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長成單層后備用；3、觀察藥物對MDCK細(xì)胞的毒性作用根據(jù)Mosmnna建立的四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測藥物對MDCK細(xì)胞的毒性作用。
在培養(yǎng)好長成單層的細(xì)胞孔板上，換含不同濃度的含大黃蒽醌類化合物藥液，每種濃度重復(fù)4孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加含5mg/mlMTT的不含血清的MEM培養(yǎng)基50μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇體積比為1∶1)100μl，振蕩5～10分鐘，待結(jié)晶完全溶解，置96孔酶標(biāo)測定儀上，測定570nm波長處的光密度OD值，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率，找出藥物對細(xì)胞的最大無毒濃度范圍。
細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100％藥物對MDCK細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞粘連、皺縮、脫落并且吸光值明顯下降，吸光度OD值在0.10以下。將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞，結(jié)果見表1表1荔枝核黃酮類(Flavonoids)多酚類(Polyphenol)化合物對MDCK細(xì)胞的毒性作用
4、觀察藥物對流感病毒增殖的抑制作用于已長成單層MDCK細(xì)胞的40孔板上，每孔接種50μl 100TCID50的流感病毒液，于35℃吸附90min，棄病毒上清。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在藥物無毒濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含藥維持液每孔0.2ml，然后將流感病毒培養(yǎng)板置35℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE。隔天換新鮮含藥維持液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組、陽性藥物病毒唑組和中藥樣品組。
CPE記錄方法為一為無CPE，+為25％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；++為50％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；+++為75％細(xì)胞出現(xiàn)CPE++++為100％細(xì)胞出現(xiàn)CPE。約在病毒對照+++～++++時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100μl，混勻，5～10分鐘后，用酶標(biāo)儀測570nm波長處的光密度OD值。并按下述公式計(jì)算藥物對流感病毒抑制率(Inhibitiverate)。
流感病毒對MDCK細(xì)胞CPE表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，變園、壁厚、脫落、拆光性增強(qiáng)，在無毒濃度范圍內(nèi)，將藥物以不同的濃度進(jìn)行抑制流感病毒實(shí)驗(yàn)，其病毒抑制率見表2。
表2荔枝核黃類(Flavonoids)多酚類(Polyphenol)化合物的抗流感病毒作用
5、結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0的probit回歸法計(jì)算藥物對MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為347.3μg/ml，對照為351.3μg/ml，抗流感病毒的半數(shù)有效濃度IC50為63.2μg/ml，對照為62.7μg/ml，藥物的治療指數(shù)TI為5.5，對照為5.6，證明荔枝核黃酮類、多酚類化合物在MDCK細(xì)胞中對流感病毒有抑制作用。
荔枝核黃酮類、多酚類化合物是從荔枝核中提取分離得到的，荔枝核本屬廢棄物，為廢物再利用，來源廣，加工提取工藝成熟，荔枝核黃酮類、多酚類抗流感病毒作用強(qiáng)，與病毒唑無明顯差異，而對人體的毒副作用小，可以制成針劑，片劑等多種劑型，應(yīng)用到流感病感染性疾病的防治上，應(yīng)用前景非常廣闊。
(四)具體實(shí)施例實(shí)施例1將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成針劑荔枝核注射液，荔枝核黃酮類多酚類總含量100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
實(shí)施例2將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成荔枝核片片劑，荔枝核黃酮類多酚類總含量100mg/0.3g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
權(quán)利要求
1.荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物應(yīng)用于防治流感病毒感染性疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成荔枝核注射液，荔枝核黃酮類多酚類總含量為100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，其特征是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成荔枝核片片劑，荔枝核黃酮類多酚類總含量100mg/0.3g/片，臨床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
全文摘要
荔枝核黃酮類多酚類化合物在防治流感病毒感染性疾病上的應(yīng)用，是將荔枝核黃酮類、多酚類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型，荔枝核黃酮類多酚類化合物對MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC
文檔編號(hào)A61K36/185GK1843348SQ20051002068
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者徐慶, 羅偉生, 張奉學(xué), 蘇小建, 龔受基, 梁榮感, 李麗亞, 韋京辰 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院