專利名稱：制劑形式的制作方法
技術領域：
本發(fā)明關于一種制藥學或營養(yǎng)學上的制劑形式，一種此種制劑形式的制造方法及利用此種制劑形式的治療方法。提供有人用及獸用的制劑形式。
孢粉質是各種植物、苔類、菌類及藻類的孢子外膜。通過用溶劑、堿及酸的連續(xù)處理來移除可能附著于孢子外膜上或孢子外膜所含的脂質、碳水化合物、蛋白質及核酸，可將孢粉質從孢子上分離出來。亦用到了酶的方法。孢粉質在化學上及物理上呈穩(wěn)定狀態(tài)，且其被描述為類似于類胡蘿卜素并具有疏水性。其他由葡聚糖、甘露聚糖及甲殼素形成的孢子外膜可具有相似的化學及物理穩(wěn)定性。然而一些孢子的內(nèi)膜部分由纖維素構成；該內(nèi)膜很大程度上會被此等化學處理分解(F.Zetzsche與K.Huggler Annalen，1928，461，89)。
DE-A-19902724揭示了一種制劑形式，其中微囊體由填充了活性物質的孢粉質孢蒴制成。此等制劑形式具有一缺點，就是該種或該等活性物質的釋放視乎孢蒴的完整性而定。與該揭示不同，本發(fā)明利用酒精的存在及其彈性本質來輔助孢粉質囊的填充，特別是用來提高處理速度，并利用特定的孢子外膜尺寸來確定輸送目標。
US-A-5013552揭示了把由花粉粒子中得來已滿載的纖維素外殼用于輸送系統(tǒng)。此種外殼與內(nèi)膜類似，即其會被用來獲得孢粉質的提取過程所破壞。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，一種制藥學或營養(yǎng)學上的制劑形式包含有效劑量的活性物質，該活性物質與一承載物化學結合，該承載物由植物、苔類、菌類、藻類或其零碎部分的孢子外膜中選出，可選擇性地進一步帶有賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，一種制藥學或營養(yǎng)學上的制劑形式包含有效劑量的活性物質，該活性物質在物理上被結合于一承載物中，該承載物由植物、苔類、菌類、藻類或其零碎部分的孢子外膜中選出，可選擇進一步帶有賦形劑。
當該活性物質在物理上被結合時，其可被吸附于承載物上。
作為另一選擇且經(jīng)常更為可取的是保留該活性物質于與中空孢子外膜例如孢子花粉素的孢子花粉素壁連為一整體的腔體中，或保留于中心腔體內(nèi)。這三方面均使該制劑形式可以通過將其吸收進入血流，隨后將外膜分解以釋放活性物質的方法進行施藥。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，一種制藥學或營養(yǎng)學的制劑形式的制作方法包含以下步驟以一滲透輔助液體接觸一孢子外膜以一活性物質接觸該孢子外膜并讓該物質能夠滲入孢粉質壁腔體內(nèi)及/或以一活性物質接觸孢子外膜并讓該物質滲入孢子外膜內(nèi)部，且隨后移除該滲透輔助液體并讓該孢子外膜干燥以將該物質保留在外膜內(nèi)。
一種優(yōu)選的滲透輔助液體可為由一族群中選出的一溶劑或增溶介質，該族群包括C1至C4酒精，更優(yōu)選為乙醇及水性C1至C4酒精，優(yōu)選為水性乙醇。
孢粉質的孢子外膜可被浸于一種溶有活性物質的溶液中。另可選擇在與活性物質接觸前將外膜浸于溶劑或其他滲透輔助液體中。
孢粉質的孢子外膜可被(i)在大氣壓力下或在真空中壓成片劑，然后將其與活性物質(或僅為帶有或不帶有滲透輔助液體的液態(tài)活性物質)溶液接觸；(ii)置于有活性物質存在的真空中，其中該活性物質帶有或不帶有滲透輔助液體。這些過程可在室溫或高至攝氏250度的溫度下進行操作。該活性物質可以包含一種藥物、一種藥物混合物、一種營養(yǎng)物質、一種營養(yǎng)物質混合物或一種藥物與營養(yǎng)物質的混合物。營養(yǎng)物質的例子包括礦物質及香精油。可以提供降低膽固醇制劑形式。維生素、礦物質、食物調(diào)味料及其他營養(yǎng)補充性活性物質可以利用根據(jù)本發(fā)明的制劑形式進行施用。
可將根據(jù)本發(fā)明此方面的制劑形式結合于食品中，例如像谷物條那樣的降低膽固醇食品。亦提供有獸用營養(yǎng)產(chǎn)品。
可以大量承載活性物質，例如達到孢子外膜重量的幾倍。此種可以容納相當大量的其他物質的能力促進了添加營養(yǎng)補充物質或其他成分或添加劑例如香料、防腐劑、抗氧化劑或礦物質在其他產(chǎn)品例如食物及飲料。孢粉質外膜可以在產(chǎn)品被服用之前為活性物質提供防潮、防酸、抗堿氧化或抗光解的保護。有些物質，例如硫酸銅，不易于釋放進入水性溶液中，而另一些(那些僅在物理上包括的)則釋放緩慢。掃描電子顯微鏡(SEM)X光下顯示整個孢粉質外殼的硫酸銅被均勻地吸收。當活性成分被輸送經(jīng)過腸道時可被緩慢釋放。如不希望有上述情況則可在孢粉質外膜上增加另一外膜以延遲釋放。孢子外膜可以被衍化以降低其半滲透性，例如用一低粘度樹脂，如阿拉伯樹膠。如果不希望被吸收進入血流中，可使用較大粒子的孢粉質(大于100微米)。
在優(yōu)選的制劑形式中，孢子外膜包含孢粉質、葡聚糖、甘露聚糖或甲殼素。這些孢子外膜具有在化學上及物理上呈穩(wěn)定狀態(tài)，使用及施用方便且準備簡單，價格低廉的優(yōu)點。其通常不含有可濾出雜質并可被設計成提供高活性物質承載能力的功能，且其具有無蛋白質的優(yōu)點，可防止過敏或其他由蛋白質或變性蛋白質引起的生理影響。后者可能會存在于一不夠嚴格的提取過程中，例如US-A-5013552中所描述的那樣。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，該承載物基本上由孢子外膜組成，該孢子外膜包含孢粉質、甲殼素、葡聚糖或甘露聚糖，且基本上不含蛋白質。
優(yōu)選為蛋白質含量不超過0.5％，最好是不超過0.1％。
優(yōu)選的外膜的蛋白質含量低至足以在6％w/v的水性氫氧化鉀中回流2小時后再沒有觀察到進一步的蛋白質流失。
根據(jù)本發(fā)明的制劑形式，其具有在酸或堿性介質中呈穩(wěn)定狀態(tài)，但在某種環(huán)境下尤其是在血液中會快速地生物分解的優(yōu)點。此分解產(chǎn)物可為無毒且無炎癥反應。在胃腸道中的停留時間短。分解可在血流中迅速發(fā)生，且在胃腸道中的程度可能較小，其使得藥物或活性物質的施用有效且迅速，例如在幾分鐘如20分鐘的時間內(nèi)。
該制劑形式可包含一生物軛合，即通過化學結合以合成方法獲得的一大分子復合物，例如將藥物分子共價鍵接至一包含孢粉質或其他孢子外膜的承載物或培養(yǎng)基上。盡管共價鍵接用于同樣的應用較為可取，但也可以使用離子鍵接、氫鍵鍵接、范德華力或在孢子外膜內(nèi)封囊的方法，尤其在可不需要藥物或其他活性物質與承載物強力鍵接時可應用例如吸入處方劑中?；钚晕镔|或藥物可與孢粉質直接反應或在物理上與其附著以產(chǎn)生一生物軛合。然而，在本發(fā)明的實施例中孢粉質或其他孢子外膜被功能化，從而藥物可以通過具有適當穩(wěn)定性的共價鍵接或其他化學鍵接而附著。例如，在通過口部輸送的情況下可選擇在酸性溶液中呈穩(wěn)定狀態(tài)的鍵接，從而活性物質及承載物可以通過胃部進入腸道?；蚩蛇x擇利用孢子外膜所提供的保護使囊封的藥物呈穩(wěn)定狀態(tài)。通過一額外的外膜例如使用阿拉伯樹膠或淀粉可以達到對物理附著或化學附著的活性物質的額外保護。亦可以使用傳統(tǒng)的薄膜，例如羥丙基纖維素或其他改良的纖維素。
根據(jù)這些資料的制劑形式在施藥方面有特定應用，即其在液體中或尤其在酸性介質例如β-內(nèi)酰胺(β-lactams)、頭孢菌素(cephalosporins)或雙脫氧腺甘酸(dideoxyadenosine)中呈不穩(wěn)定狀態(tài)?？蓽p少釋放進入血液前的分解。亦可促進將不可溶的或幾乎不可溶的藥物例如環(huán)孢霉素(cyclosporins)、紫杉醇(taxanes)或其他大環(huán)內(nèi)酯物(macrolides)施加入血流中，例如環(huán)孢素(ciclosporin)、甲苯咪唑(mebendazole)、制霉菌素(nystatin)、異丙酚(propofol)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、miconazole anthracyclinones或丙氟哌酸(ciprofloxacin)。
若承載物由孢粉質或其他孢子外膜組成的或包含孢粉質或其他孢子外膜的，由于其在口服之后能夠快速吸混進入血液及有快速代謝(20分鐘至2小時)的能力，相較于市面有售的用于傳輸藥物或其他活性物質的聚合物而言具有顯著優(yōu)勢。另外其易于被衍化以附著多種具有不同的溶解性及穩(wěn)定性的藥物。此種承載物可以根據(jù)其生物性起源在保持化學上及形態(tài)上一致，能夠保護酸性不穩(wěn)定分子且無毒。再者，當口服孢粉質或其他孢子外膜或將其吸入肺中時也沒有過敏反應，部分原因是與此等反應相關的蛋白質及碳水化合物已由植物孢子原料中移除。孢粉質或孢子外膜在血液中迅速分解使活性成分迅速釋放。此種外膜在施藥及吸收過程中可保持其大小及形態(tài)。特定物種而來的孢子外膜的大小及形態(tài)的統(tǒng)一使制劑形式可以根據(jù)藥物的承載量及輸送的模式而被優(yōu)化。較大的粒子可包含較高比例的活性物質，例如藥物或功能性食物成分。我們已發(fā)現(xiàn)25微米的粒子可以在中心腔體內(nèi)容納多于同等重量的活性物質。以前已經(jīng)提出過，此種大粒子不能通過腸壁吸混進入血流(ML Wierner，F(xiàn)dChem.Toxic.，1988，26(10)867-880)。
有很多涉及生物軛合這個課題的論文、評論及書籍生物軛合(兩著名引用包括Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson，1996，AcademicPress Inc及Bioconjugation in Pharmaceutical Chemistry，Il Farmaco，1999，54，497-526)。很多偶聯(lián)劑已被揭示。碳化二亞胺如DCC(二環(huán)己基碳二亞胺dicyclohexylcarbodiimide)或EDC{1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride}非常有效。與伯胺或與羧酸酯基團(carboxylate groups)結合的一些藥物及探針可以直接與非衍化孢粉質結合。
根據(jù)本發(fā)明的制劑形式可以單獨施用，特別是用于吸入施藥，但通常選擇至少一種與施藥途徑相關的適當藥學賦形劑、稀釋劑或載體。
該制劑形式可被制造為適于口部、含服或舌下以片劑、膠囊，包括軟凝膠膠囊、胚珠、酏劑溶液或懸液的形式給藥。該制劑形式可被制造為適用于立即、延遲、經(jīng)改良或在控制下釋放輸送。在壓縮處方劑中的孢子外膜的作用有時較為有利，因為其具有彈性，可在制成片劑或在需要縮小片劑尺寸時保持完整。
該制劑形式還可被制造為適用于快速消散或快速溶解給藥。
可以使用壓縮片劑或其他壓縮制劑形式?？梢詰盟约胺撬酝鈱印Ｌ幏絼┗蚩蛇x擇使用一分解質或發(fā)泡劑結合以便于在液體中消散。
根據(jù)本發(fā)明的片劑可包括賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二堿式磷酸鈣、氨基乙酸及淀粉，優(yōu)選為谷類、馬鈴薯或木薯淀粉，分解質，例如羧甲淀粉鈉(sodium starch glycollate)、交聯(lián)羧甲纖維素鈉(croscarmelose sodium)及制粒黏結劑，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrollidone)、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose)、羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose)、甲基纖維素、蔗糖及凝膠。亦可使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂及助流劑，例如滑石或硅膠。
根據(jù)本發(fā)明的制劑形式可以用作凝膠膠囊的填充物。優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、混晶糖、淀粉、纖維素及聚乙二醇?；蚩蛇x擇使用冷凍干燥制劑形式，例如在GB1548022中所揭示的及各種與RP Scherer公司的ZydisTM劑相關的專利。
根據(jù)本發(fā)明的制劑形式可以包括水性懸液或干性粒子或作為懸液用于補充的其他成分。
改良的釋放或脈動釋放制劑形式可以包括釋放頻率改良劑包括羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、醋酸纖維素、聚環(huán)氧乙烷、黃原酸膠(xanthan gum)、卡波姆(Carbomer)、油、蠟及甲基丙烯酸鹽(methacrylate)共聚物。
也可使用經(jīng)皮膚給藥方式，尤其使用小的孢粉質零碎部分。
在特別優(yōu)選的實施例中本發(fā)明的制劑形式被制造為適用于肺部給藥。孢粉質或其他孢子外膜可從一苔類、真菌或植物物種中選出以提供選定尺寸的粒子來使制劑形式可以滲透到所需給藥位置，例如下肺部。特別優(yōu)選一大小約為1-100微米的粒子，最好是約為1-30微米，更優(yōu)選為約1-10微米，尤其是1-5微米。
根據(jù)本發(fā)明此方面的制劑形式具有粒子大小統(tǒng)一的優(yōu)點。此外，用酸、堿或有機溶液對孢子進行提取之后粒子的大小和形狀大致不變。被提取的孢子外膜可保持與其所來自的孢子在大小及形狀上保持相似。相對之下，微粉化藥物，例如傳統(tǒng)上用于哮喘治療的那種，其具有許多種粒子大小，包括一部分的幼細粒子，也有較大的凝塊。每一種來自一特定物種的孢子，其尺寸上的區(qū)分都很小且具有一致的形狀，并可被選出以提供一適合于在一選定部位或以一選定模式進行給藥的制劑形式。根據(jù)本發(fā)明的有用孢子可根據(jù)以下出版物所揭示那樣從裸子植物、被子植物、種子蕨類、菌類及藻類中獲取，其結合于本說明書作為參考G.Shaw，Sporopollenin in Phytochemical Phylogeny，J.B.Harborne(Ed)，Academic press，London and New York，第3章，(1997)，31-5。
P.D.Moore，J.A.Webb與M.E.Collinson，Pollen analysis，第二版，Blackwell Scientific Publications，(1999)。
J.Brooks，Some Chemical and Geochemical Studies onSporopollenin inSporopollenin，J.Brooks，M.Muir，P.Van Gijzel與G.Shaw，(Eds)Academic press，London and New York，(1971)，305-348。
典型物種的孢子大小如下孢子大小示例枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.2微米勿忘我屬植物(勿忘草)(Myosotis(Forgetmenot))2.4-5微米黑曲霉(Aspergillus niger) 4微米青霉菌(Penicillium)3-5微米小雞油菌(Cantharellus minor) 4-6微米靈芝(Ganomerma)5-6.5微米田頭菇(Agrocybe) 10-14微米異株蕁麻(Urtica dioica)10-12微米黑蒽花霉(Periconia)16-18微米附球菌(Epicoccum) 20微米伸筋草(Lycopodium clavatum)25微米冷杉(Abies)125微米矮南瓜(Cucurbitapapo) 200微米南瓜(Cuburbita)250微米引致例如農(nóng)夫肺等疾病的孢子之所以能夠引致疾病是因為其積存于肺部的一特定位置。通過從孢子移除含有蛋白質及其他相關物質以制成孢子外膜，剩下的無害形體可以將有益介質傳輸至肺部中這些相同的位置。
根據(jù)本發(fā)明的一制劑形式可以通過肺部吸入或鼻腔吸入的方式給藥，并可以通過使用一干粉末吸入劑或一定量吸入氣霧劑噴霧或由一加壓容器、泵、噴霧或霧化器利用適當?shù)耐七M劑，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227)方便地傳輸。
根據(jù)傳統(tǒng)做法，定量吸入氣霧劑成分可以結合一表面活性劑或共溶劑。
根據(jù)本發(fā)明的制劑形式可以以栓劑或陰道栓劑的形式給藥。制劑形式，尤其是結合孢粉質或孢子的零碎部分的，可以外敷以凝膠、水分凝膠液、溶液、乳劑、軟膏或粉劑的形式施用。該處方劑亦可在皮膚上或經(jīng)皮膚給藥，例如通過使用皮膚貼。
本發(fā)明的制劑形式可提供給人用或獸用。
本發(fā)明通過舉例的方法進一步描述，但其不意味任何限制。
孢粉質或其他孢子外膜可以通過使用一有機溶液與強酸與強堿的組合物對孢子進行嚴格處理而分離出來。
例1從伸筋草(Lycopodium clavatum)中分離孢粉質使伸筋草(250克，F(xiàn)luka有售)懸浮于丙酮(700毫升)中并在回流下攪拌4小時。濾出固態(tài)殘余物，用干凈的丙酮沖洗，裝回反應瓶中并再次使其懸浮于氫氧化鉀溶液(850毫升，于水的濃度為6％w/v)中。然后將該混合物在回流下攪拌6小時。濾出殘余物，用熱水充分沖洗，裝回反應瓶中，然后重復氫氧化處理。過濾后將固態(tài)物質用熱水、熱乙醇及水再次沖洗。將殘余物在乙醇(750毫升)回流下攪拌2小時，過濾，然后先后用干凈的乙醇及二氯甲烷沖洗。再使所得固體懸浮于干凈的二氯甲烷(750毫升)中，在回流下攪拌2小時，濾出再風干24小時。
然后使濾出的粒子懸浮于正磷酸(85％，800毫升)中，在溫和的回流下攪拌5天并過濾。用足量熱水沖洗殘余物再吸干。再重復正磷酸處理及干燥。然后用熱水、乙醇及二氯甲烷沖洗粒子。最后將該固體在乙醇(800毫升)回流下攪拌2小時，過濾并用二氯甲烷沖洗，然后風干并真空干燥以生產(chǎn)孢粉質(50克)。
例2甲狀腺素的物理附著及生物性評估孢粉質(0.5克)壓縮于10公噸下2分鐘。將所得片劑加入一溶液中，該溶液為包含300微克甲狀腺素的0.3毫升DMSO(二甲基亞砜)及1.5毫升乙醇。該片劑不到一分鐘就吸收了溶液，然后將該樣本置于有五氧化二磷的真空下在攝氏5度下干燥至恒重。將物理附著甲狀腺素的孢粉質給自愿者口服。不到15分鐘病人血液中甲狀腺素水平上升了1奈米摩/公升(nano mole/litre)。在此上升的同時，可觀察到明顯數(shù)量的孢粉質粒子或部分分解的粒子，如例18中所觀察到的。因此，假設自愿者體內(nèi)有5公升血液，如口服15分鐘后發(fā)現(xiàn)4微克甲狀腺素則相當于藥物傳輸量的0.66％。其與傳輸?shù)逆叻圪|粒子的量(0.6％)保持一致。此甲狀腺素水平的迅速上升應于1至2個小時之后才發(fā)生，因為其首先會被位于消化道較下位置的空腸(jeujenum)所吸收。
例3人重組細胞生長激素的物理吸收孢粉質(0.5克)于10公噸下壓縮2分鐘形成片劑(16毫米乘3毫米)。將該片劑加入一將人體重組生長激素固體處方劑[5.5毫克，其包括該激素(1毫克)及一甘露醇、氨基乙酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉及/或磷酸的混合物]溶于一混合物的溶液中，該混合物包括一稀釋液(0.5毫升；包括甘油、間甲酚水(m-cresol water)及氫氧化鈉及/或鹽酸)及乙醇(2.0毫升)。該孢粉質片劑迅速地(15秒)增至其原有體積的幾乎4倍，同時吸收所有的溶液。將所得粉末在攝氐5度及真空下干燥48小時，在此段時間內(nèi)達到恒重。
例4可溶解胰島素處方劑的物理吸收將一可溶解胰島素(包括0.18克胰島素、rDNA(核糖體DNA)、氯化鋅、甘油、間甲酚、氫氧化鈉、鹽酸及水的一2立方厘米的處方劑)及乙醇(1毫升)的溶液加入孢粉質(1克)中，該1克的孢粉質已事先于10公噸下被壓縮2分鐘形成片劑。在孢粉質片劑增長至其原有體積的幾乎4倍的同時，該溶液在20秒內(nèi)被吸收。將該所得粉末在攝氏5度及真空下干燥48小時，在這段時間內(nèi)達到恒重。
例5向日葵油的物理吸收通過在一16毫米模具中以10公噸壓力壓縮2分鐘制備孢粉質(0.5克)片劑。將該等片劑在室溫下加入一向日葵油(1毫升)和一輔助吸收液體的混合物中(表1)。將所得粉末在一干燥器中在有P2O5(五氧化二磷)及攝氐50度下烘干至恒重。
當不用溶劑時該片劑將實質上保持無變化超過3小時。
表1
在攝氏40度下重復乙醇與向日葵油的物理附著，其縮短了完全吸收該樣本所用的時間；12秒鐘后即完成吸收。用于完全吸收的時間非常依賴所使用的輔助吸收液體及溫度。
例6氨基乙酸的物理吸收將一孢粉質片劑(0.5克)加入用乙醇(0.5毫升)稀釋的1M氨基乙酸溶液(0.5毫升)中。溶液被迅速吸收，再將所得粉末在有五氧化二磷的真空下干燥至恒重。孢粉質的承載量被發(fā)現(xiàn)為1.9毫摩/克。重復此實驗，但不必壓縮孢粉質。孢粉質的承載量被發(fā)現(xiàn)為0.38毫摩/克。這顯示出當孢粉質被壓縮時，其對氨基乙酸的吸收明顯增加。
孢粉質被發(fā)現(xiàn)將其在水中激烈攪拌30分鐘后可保留15％的水溶性氨基乙酸。同樣的樣本在外層覆上淀粉后被發(fā)現(xiàn)在激烈攪拌30分鐘后可保留35％的氨基乙酸。
例7硫酸銅的物理吸收將一孢粉質片劑(0.5克)加入用乙醇(0.5毫升)稀釋的1M硫酸銅溶液(0.5毫升)中。該溶液被迅速吸收，然后將所得粉末在有五氧化二磷的真空下干燥至恒重。孢粉質的承載量被發(fā)現(xiàn)為2.5毫摩/克。在掃描電子顯微鏡(SEM)X光下顯示整個孢粉質外殼的硫酸銅被均勻地吸收。
孢粉質在水中攪拌30分鐘后被發(fā)現(xiàn)保留了75％的硫酸銅。
例8LR White Resin的物理吸收將一孢粉質片劑(0.1克)加入50％LR White Resin的乙醇溶液(2毫升其中含80％多羥基取代雙酚A二甲基丙烯酸酯樹脂(polyhydroxysubstituted bisphenol A dimethacrylate resin)，19.6％C12甲基丙烯酸酯(C12 methacrylate ester)，0.9％二甲基對甲苯胺(dimethyl paratoluidine))中。將該混合物溫和地攪動2小時。將所得粒子通過離心法分離并進一步用LR White Resin(2毫升)再處理12小時。然后將該混合物置于一膠囊中在攝氏60度下加熱8小時。所得聚合物填滿孢粉質粒子及其壁內(nèi)腔體，如掃描電子顯微鏡下所示(

圖15)。
例9孢粉質的衍化(圖1)由伸筋草中分離出來的孢粉質可在一大約5毫摩/克的水平通過直接溴化而鹵化(F.Zetsche與K.Huggler，Liebigs Ann.Chem.，1928，461，89)。其可通過與二氯甲基醚及四氯化錫產(chǎn)生作用而被氯甲基化，以得到承載量約為1毫摩/克的氯(G.Mackenzie與G.Shaw，Int.J.PeptideProtein Res.，1980，15，298-300)。使用傳統(tǒng)的Merrifield方法用氯甲基團來合成一單一的三縮氨酸。或可選擇用1，3-二氨基丙烷使孢粉質氨化，以使其得到承載量為1.6毫摩/克的堿(R Adamson，S.Gregson與G.Shaw，Int.J.Peptide Protein Res.，1983，22，560-564)。該1，3-二氨基丙烷孢粉質可以與氯乙酸酐或者與氯乙酰氯產(chǎn)生反應，隨后用4-羥基苯甲醇鏈接劑鈉鹽進行處理。隨后可用苯甲基終止隔離劑以傳統(tǒng)的方法來合成一四縮氨酸。孢粉質的二氨基乙烷衍化物可產(chǎn)生離子交換樹脂類物料，而此物料與溴乙酸乙酯/堿水解作用(承載量為1.4毫摩/克)反應可得到酸。通過孢粉質與氯磺酸(承載量為1.6毫摩/克)的反應可得到一酸性產(chǎn)物(G.Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan，E.Phelivan，Reactive Polymers，1988，9，211-217)。
孢粉質相較于許多市面有售的聚合物而言具有在物理上及化學上堅固但同時相對地易于衍化的優(yōu)點。市面有售的聚合物中最常用作生物軛合的結合基團為BNH2、-OH、SH及CO2H。孢粉質具有易于將此種結合基團引導至其表面的優(yōu)點，以直接或通過一隔離劑或鏈接劑基團與一藥物產(chǎn)生一共價鍵接，其在結合團與藥物之間形成一短鏈。我們已改進文獻中所揭示的孢粉質上的鏈接劑及結合基團，并已在前面的部分中總結過。在將此等衍化的孢粉質作為藥物輸送物質的應用中，下面所描述的新的鏈接劑/結合基團相對于文獻中所記載的那些來說具有附著方便，承載量提高，附著穩(wěn)定且將毒性副產(chǎn)物減到最小的優(yōu)點。必須注意的是同一來源的孢粉質粒子在其形態(tài)及化學上近乎一致。此一致性是在治藥領域中所使用的人造聚合物未必有的。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供有一伯胺功能化的孢粉質。
用于藥物輸送的幾種市面有售的聚合物，例如多聚(L-賴氨酸)及多聚(L-天門冬氨酸)，其具有一用于藥物附著的伯胺基團，由于其有效的親核性使其可成為用于多種藥物媒介應用的一特別多用途的鏈接劑/結合功能基團。一般，用碳化二亞胺試劑將胺基團與含羧基藥物結合。伯胺亦可與二琥珀酰亞胺基碳酸酯(disuccinimidyl carbonate)及三乙胺(triethylamine)反應以產(chǎn)生異脲(Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson，1996，Academic Press Inc及Bioconjugation in pharmaceutical chemistry，IlFarmaco，1999，54，497-526及其中參考)，其可附著輸送胺的藥物，例如胰島素。
本發(fā)明一優(yōu)選的方面提供了一新穎的方法來用一伯胺功能基團以最低的化學作用來衍化孢粉質，并避免無毒隔離劑基團的使用，例如以前所使用的二胺。此方法包括用氨水(0.880)在室溫下處理孢粉質以產(chǎn)生孢粉質的胺化形，隨后用LiAlH4(氫化鋁鋰)還原以產(chǎn)生聚合物的伯胺基(-NH2)形?？傻玫酱蠹s1毫摩/克的承載量。
例10伯胺功能化的孢粉質的制備(圖2)將孢粉質(2克)在0.880氨水中于室溫下攪拌4天。通過過濾收集孢粉質，然后用水(10×100立方厘米)、EtOH(乙醇)(2×30立方厘米)及DCM(二氯甲烷)(2×30立方厘米)沖洗。然后將孢粉質在真空中干燥至恒重。在二氧六環(huán)(dioxane)(100立方厘米)中的N2(氮氣)下攪拌LiAlH4(氫化鋁鋰)(3.6克)。加入胺化的孢粉質(2克)并于N2(氮氣)中回流4天。冷卻該混合物。小心地加入乙酸乙酯(100立方厘米)并冷卻。用玻璃棒將不可溶的大塊攪碎。緩慢地加入水(100立方厘米)然后加入2M硫酸(200立方厘米)。然后用水(2×250立方厘米)、EtOH(2×250立方厘米)、DCM(2×250立方厘米)沖洗伯胺化孢粉質，然后在真空中干燥至恒重(1.8克)。
根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供有一聚氨基功能化的孢子外膜。亦提供有一包含化學上結合有效劑量活性物質的聚氨基功能化孢粉質的制劑形式。
一些聚氨基化合物，例如自然存在于體內(nèi)的精胺及亞精胺。它們無毒，并因此可以作為隔離劑基團應用。在一優(yōu)選實施例中，可以在一惰性溶劑中通過加熱或回流使一聚氨基化合物與孢粉質反應以形成共價鍵。
相對于二胺及伯胺來說，使用聚胺具有一優(yōu)點，即其具有用于藥物附著的額外的親核氨基團，以提供此等衍化具有提高的藥物裝載能力的衍化孢粉質及類似的孢子外膜。亦可用相似的方法使用芳族聚胺，例如1，3，5-鄰苯二胺及相關的雜環(huán)，例如三聚氰胺。分別使用光氣或硫光氣連同帶有氫氧基的藥物，例如核苷(例如司他夫定(D4T)、阿昔洛韋(acyclovir)及齊他夫定(AZT))，可容易地將芳族胺類分別活化成異氰酸酯或異硫氰酸酯氫氧基團。例11揭示了使此等結合或隔離劑基團附著的方法。
例11聚胺功能化的孢粉質的制備(圖3)亞精胺(0.7毫摩)、1，3，5-鄰苯二胺(0.7毫摩)及三聚氰胺，分別與孢粉質(0.1克)在各種溶劑例如甲苯(10毫升)、二甲基亞砜(DMSOdimethyl sulphoxide)及二甲基甲酰胺(DMF dimethyl formamide)中回流24小時以使其在經(jīng)過濾，然后用甲苯(2×10立方厘米)、2M HCl(鹽酸)(2×10立方厘米)、水(3×10立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)及DCM(2×10立方厘米)沖洗，并在真空中干燥至恒重后的承載量分別為1.6、0.95及0.54毫摩/克。
根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供有一羧酸功能化的孢子外膜。亦提供有包含化學上結合有效劑量活性物質的羧酸功能化孢子外膜的制劑形式。
一常用于形成藥物-聚合物結合物的方法，包括通過N-羥基丁二酰亞胺酯利用N-羥基丁二酰亞胺及一碳化二亞胺活化一羧酸鹽功能。此等活化酯可以有效地與帶有伯胺的藥物例如縮氨酸，及含氫氧基的藥物例如核苷氫氧基團結合。數(shù)種市面有售的碳化二亞胺可溶于水性或有機溶劑。附著于孢粉質的羧酸鏈接劑已被揭示(G.Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan，E.Phelivan，Reactive Polymers，1988，9，211-217)。此作用包括了1，3-二氨基丙烷衍化孢粉質與溴乙酸乙酯產(chǎn)生反應后皂化。例如通過使前面提到的聚氨基衍化孢粉質與例如琥珀酸酐或溴乙酸乙酯反應，隨后再進行皂化，可以提高承載量。另一可以引導羧酸功能的方法為一氨基酸或例如Gly(甘氨酸)-Phe(苯丙氨酸)-Ala(丙氨酸)-Leu(亮氨酸)或Gly(甘氨酸)-Phe(苯丙氨酸)-Leu(亮氨酸)-Gly(甘氨酸)的短縮氨酸鏈的附著。一附著在孢子外膜上作為鏈接劑的氨基酸較引人注目，因為其通過在一適當溶劑中將一無保護的氨基酸或或氨基酸的乙酯或其他烷基酯與孢子外膜進行加熱或回流即可輕易得到。此等鏈接劑的進一步優(yōu)點為其無毒性。例12揭示了一非衍化氨基酸附著至孢粉質的方法。
例12制備氨基酸功能化孢粉質作為附著羧酸功能的一種方法(圖4)一種氨基乙酸(0.1克)與孢粉質(0.1克)的混合物在DMSO中回流24小時。通過過濾收集孢粉質，并用甲苯(2×10立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)、2M HCl(2×10立方厘米)、水(3×10立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)及DCM(2×10立方厘米)沖洗以使其承載量為3.6毫摩/克。
例13顯示出一用于將氨基酸酯附著至孢粉質并隨后提供羧基功能的方法。
例13制備氨基酸酯功能化孢粉質作為附著一羧酸功能的一種方法(圖5)將甘氨酸乙酯鹽酸鹽(0.1克)在甲苯(20立方厘米)及三乙胺(2毫升)中攪拌。加入孢粉質(0.1克)并將該混合物回流24小時并攪拌。通過過濾收集冷卻的衍化孢子，用甲苯(2×10立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)、2M HCl(2×10立方厘米)、水(3×10立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)及DCM(2×10立方厘米)沖洗。然后將孢粉質在真空中干燥，其所顯示的承載量為1.7毫摩/克。通過在2M NaOH(20毫升)回流2小時，可使相應羧酸的鈉鹽進行乙酯功能的水解作用。與2M HCl(40毫升)在室溫下中和，隨后用水沖洗并在真空下干燥，即得所需要的酸(承載量為2.8毫摩/克)。
以上過程亦可用于承載量范圍為1.0至2.5毫摩/克的例如β-丙胺酸、L-賴胺酸、α-L-丙胺酸、天門冬氨酸、谷氨酸及氨基丙二酸的乙酯氫氯化物。附著氨基丙二酸、天門冬氨酸或谷氨酸的優(yōu)點為其具有兩個羧酸鹽功能基團，具有額外的承載藥物的能力。
根據(jù)本發(fā)明的第七個方面提供有一多羥基功能化的孢子外膜。亦提供有一種包括化學上結合有效劑量活性物質的多羥基功能化孢子外膜的制劑形式。
大部分由碳水化合物中獲得的多羥基鏈接劑，由于具有多個根據(jù)糖的屬性附著至孢子外膜的氫氧基團，其具有易于附著，無毒，承載量高的優(yōu)點。孢子外膜上具有大量氫氧基團，具有可以附著多種藥物的優(yōu)點。多羥基衍化孢子外膜的穩(wěn)定性及化學上與形態(tài)學上的一致性，相對于多醣類藥物媒介例如淀粉、纖維素及非孢子衍化甲殼素來說具有優(yōu)點。后述的聚合物未被發(fā)現(xiàn)具有與孢粉質或與其相等的孢子外膜同樣的化學上及/或形態(tài)上的一致性，或同樣的酸堿抵抗力及吸水性。
此等結合物材料上的氫氧基團可被轉化為很多適于合成藥物-聚合物結合物的活性物種。例如氫氧基團可以用琥珀酰亞氨基碳酸鹽及二氮雜茂基碳酸鹽及對硝基苯基甲酸鹽(p-nitrophenylformates)活化成甲磺酸鹽及甲苯磺酸鹽。所有這些都易于與含有伯胺的藥物，例如縮氨酸產(chǎn)生反應。氫氧基團亦可被氧化成醛或酮。
包含伯胺的藥物可以通過還原氨化附著。聚合物上的氫氧基團亦可用CNBr(溴化氰)活化以形成氰酸酯，其可以與包含胺的藥物產(chǎn)生反應。因此一種從碳水化合物衍生的一藥物-聚合物結合物可以與一孢子外膜結合以產(chǎn)生一帶有大量反應性的氫氧基團的結合物且其在化學上及形態(tài)上具有一致性。例14顯示出一種可將一多羥基鏈接劑附著于孢粉質的方法。
例14多羥基功能化孢粉質的制備(圖6)在DMSO(10立方厘米)中將山梨醇胺(Sorbitolamine)(0.13克，0.69毫摩)攪拌。加入孢粉質(0.1克，0.23毫摩)，將該混合物回流24小時。通過過濾收集冷卻的孢子，并用DMSO(2×10立方厘米)、水(100立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)及DCM(2×10立方厘米)沖洗。將孢粉質在真空下干燥至恒重，使其承載量為1.7毫摩/克。
例15三(羥甲基)甲胺(tris(hydroxymethy1)methylamine)-孢粉質的制備(圖7)一與例14相似的程序使用三(羥甲基)甲胺(tris(hydroxymethyl)methylamine)可達到0.83毫摩/克的承載量。
例16熒光素及甲狀腺素共價鍵附著孢粉質的制備熒光素(0.5克)與甲狀腺素(0.5克)分別與孢粉質(0.1克)在DMSO(20毫升)中回流。通過過濾收集冷卻的孢粉質并用水(100立方厘米)、EtOH(2×10立方厘米)及DCM(2×10立方厘米)沖洗。將孢粉質在真空中干燥至恒重以使其承載量分別為1.0及0.37毫摩/克。
如果藥物或其他活性物質足夠穩(wěn)定以抵擋回流步驟，則這種附著方式非常有效。此直接附著方法相對在化學上不如孢粉質穩(wěn)定的許多市面有售的聚合物來說具有顯著優(yōu)點。
較不穩(wěn)定的藥物，例如胰島素可以通過例如一琥珀酰氨基隔離劑及使用DCC及HOBt(1-羥基苯并三唑)作為偶聯(lián)劑附著于氨基孢粉質。在此種結合中的孢粉質相較于市面有售的聚合物而言具有化學一致性的優(yōu)點，從而使結合至每組孢粉質的藥物的預期承載量非常一致。一藥物，例如胰島素的附著方法包括以下步驟例17結合胰島素的孢粉質的制備將溶解于干二甲基甲酰胺(DMF，15毫升)中的琥珀酰酐(0.57克，5.7毫摩)加入于干DMF(30毫升)的氨基孢粉質(1克)懸液中。將該反應混合物在氮氣中在室溫下攪拌一整夜。通過過濾分離其產(chǎn)物，用丙酮沖洗并在有P2O5存在的真空下干燥48小時。再將干DMF中的DCC(3.80克，18.4毫摩)及HOBt(2.27克，1.84毫摩)連續(xù)加入干DMF(20毫升)中的琥珀酰氨基孢粉質懸液中。將該混合物在氮氣中在室溫下攪拌3小時然后將冷凍干燥的胰島素(0.2克)加入干DMF(20毫升)中作為一溶液。將該混合物在室溫下攪拌48小時。通過在攝氏0度加入水(10毫升)停止該反應。將該混合物在室溫下溫和地攪拌2小時，過濾并用丙酮及醚沖洗以產(chǎn)生承載量為0.03毫摩/克的胰島素-琥珀酰氨基孢粉質(insulin-succinylamido sporopollenin)。
以上示例展示出怎樣將蛋白質和酶附著至孢粉質及相似孢子外膜。寡核苷酸，例如反義寡核苷酸可以通過相似的化學反應來附著以使此藥物可以口服。以前此等化合物經(jīng)常作為PEG(聚乙二醇)-3’-寡核苷酸或PEG-5’-寡核苷酸結合物被注射輸送?？梢酝ㄟ^利用前面提到的羥化結合孢粉質，進行那些與用來合成PEG-3’-寡核苷酸或PEG-5’-寡核苷酸結合物的合成偶聯(lián)反應相似的步驟。
應用幾乎不具有水溶性的藥物，例如紫杉醇及環(huán)孢霉素的孢粉質-藥物類型結合物具有特殊的益處。此等藥物可以在很多情況下附著于孢粉質，例如，在高效溶劑，例如DMSO中或在緩沖水性溶劑中使用偶聯(lián)劑。當口服孢粉質-藥物型結合物到達血流時藥物可以高度消散方式釋放，因此可以更好地被血清溶劑化。因此孢粉質及相似孢子外膜亦可作為使用聚乙二醇(PEGs)以外的一種選擇，其常被用來衍化在水性系統(tǒng)中幾乎不溶的藥物。相對于使用時需要注射的PEG-藥物結合物，此種結合物具有一優(yōu)點即其可口服。
例18生物評估給兩臨床試驗者服用孢粉質(1克；25微米；來源于伸筋草)，每隔30分鐘抽取血液樣本。
血液樣本(20)用離心機以3000轉/分的速度分離八分鐘。然后移離血清，并將殘余物質用水沖洗幾次(共10毫升)，并轉移至較大的試管。然后將樣本充分混合再用離心機分離一次。移除上層清液，將小粒及殘余液體(0.5毫升)再次懸置于0.5毫升甘油中。取每分約0.1毫升的等分并用光學顯微鏡檢查。檢查蓋片下面整個部分。用以下方法計算孢粉質粒子數(shù)量。通過計算完整的粒子及攢在一團的零碎部分的數(shù)量來計算粒子的總數(shù)。這些零碎部分被當作來源于同一孢粉質粒子，但其可能包含幾個粒子的成分。
顯微鏡測試結果如下來自第一人體試驗者的樣本(進食后)1)施用孢粉質前未發(fā)現(xiàn)粒子。
2a)施用30分鐘后80個粒子，其中有12個為完整的，其余為10-20個零碎部分形成的蔟。
2b)施用30分鐘后發(fā)現(xiàn)45個粒子，其中7個是完整的，其余的為零碎部分。
3a)施用60分鐘后發(fā)現(xiàn)2個完整粒子及27組小的零碎部分。
3b)施用60分鐘后發(fā)現(xiàn)20組小的零碎部分，無完整粒子。
4)施用90分鐘后觀察到1個完整粒子及12組非常小的零碎部分。
5)施用120分鐘后觀察到少量小的零碎部分。
來自第二人體試驗者的樣本(進食前)1)施用孢粉質前未發(fā)現(xiàn)粒子。
2a)施用后30分鐘發(fā)現(xiàn)3個完整粒子及48個非常小的零碎部分。
2b)施用30分鐘后發(fā)現(xiàn)4個完整粒子及35個零碎部分。
3a)施用60分鐘后觀察到1個完整粒子及17個極小的零碎部分。
3b)施用60分鐘后可見2個粒子及15個零碎部分。
4)施用90分鐘后未發(fā)現(xiàn)粒子或零碎部分。
由1克孢粉質進入血流中的最小比例估計為0.60％。
估計有療效的所需藥物-孢粉質結合物的劑量為假設平均承載量為1毫摩/克，則由1克孢粉質進入血流中的藥物總量將為0.006毫摩。
對于1克物理地或共價地附著有胰島素(M.W.6000)的0.03毫摩/克的孢粉質而言，可以使11毫克(0.018毫米)30國際單位(IU)的胰島素進入血流中。正常人每天產(chǎn)生24u胰島素，而普通糖尿病患者每天需要60u，假設皮下注射劑與口服效果相同，則最大量的2克孢粉質可以相當于1天的胰島素供應。
對于1克附有甲狀腺素(M.Wt.776.9)承載量為0.37毫摩/克的孢粉質而言，其可提供1.7毫克的甲狀腺素，[約為17劑(平均劑量為100微克)]。物理附著于承載量為600微克/克的孢粉質的甲狀腺素可預期地輸送3.6微克進入血流。此值通過對自愿者血液中發(fā)現(xiàn)的甲狀腺素進行分析獲得證明，其中口服15分鐘后的甲狀腺素量為4微克/5公升血液(即傳輸了0.66％，與傳輸孢粉質粒子的量一致)。
孢粉質或其他相似的孢子外膜可被多重衍化。通過此方式孢粉質可被用于在一劑量中傳輸多于一種的藥物。另外，一藥物與一活性介質亦可被一起結合于同一孢粉質粒子中。此外，此種多重功能性可被用于引導功能基團，例如一脂肪酸鏈，以形成一種脂質結合物，或一聚乙二醇(PEG)以形成一PEG-脂質結合物，一旦附著的粒子到達血流中，可以通過內(nèi)體空間阻隔及能使藥物較慢地釋放來保護附著的藥物。例如，孢粉質的殘余雙鍵及羧酸基團可被分別衍化。因此該雙鍵首先與溴產(chǎn)生反應形成溴基孢粉質，使其與迭氮化鈉反應形成一新穎的迭氮基孢粉質，用氫化鋁鋰將其還原以形成一伯胺基孢粉質。使伯胺在緩沖溶液中及以EDC作為偶聯(lián)劑與一藥物，例如抗濾過性病原體藥物AZT單磷酸鹽反應以產(chǎn)生AZT單磷酸孢粉質。隨后將剩余在孢粉質上的羧酸基團與十六烷基氨用DDC濃縮。十六烷基半族則當附著藥物在胃部的短暫時間內(nèi)為其提供額外的保護。此類型的附著方法的一示例如下(圖8)。
根據(jù)本發(fā)明的第八個方面，提供有一鹵基功能化孢子外膜。亦提供有一包括化學上結合有效劑量活性物質的鹵基功能化孢子外膜的制劑形式。
例19通過溴化、迭氮化及還原對伯胺的引導將孢粉質(1克)在有30％溴的乙酸(10立方厘米)中攪拌24小時。通過過濾重新獲得孢粉質，并用甲醇(10×5立方厘米)及醚(5立方厘米)沖洗，并在真空下干燥以產(chǎn)生溴基孢粉質(A，圖8)。加入一溶于DMSO(30立方厘米)中的迭氮化鈉(1.25克，19.2毫摩)溶液并將該混合物以攝氏60度加熱48小時。通過過濾、沖洗、干燥(1.8毫摩/克的N3)并與一含有氫化鋁鋰(0.2克)的THF(15立方厘米)混合物回流1小時，以收集形成的迭氮基孢粉質(B，圖8)。將該混合物冷卻至室溫，沖洗并干燥以獲取胺基孢粉質(C，圖8)(1.4毫摩/克的NH2)。
例20AZT單磷酸鹽的附著將AZT單磷酸鹽(2.1毫摩)加入一在0.1M MES(脂肪酸甲酯磺酸鹽)，pH值為4.7-6.0的緩沖溶液(15立方厘米)中的胺基孢粉質(0.3克；1.4毫摩/克的NH2)攪拌懸液。加入EDC(2.1毫摩)，并將混合物在室溫下攪拌18小時。濾出粒子，用水沖洗并在真空下干燥以得出AZT單磷酸鹽酰胺化孢粉質(D，圖8)(1毫摩/克)。
例21十六烷基胺的附著將一AZT單磷酸鹽孢粉質(0.3克；1毫摩/克)及DCC(2.1毫摩)的混合物在DMSO(10立方厘米)中攪拌18小時。通過過濾并在真空下干燥移除所得的十六烷基氨基(1毫摩/克)/AZT單磷酸鹽酰氨化(1毫摩/克)孢粉質(E，圖8)。
承載量約為1毫摩/克的孢粉質具有殘留氫氧基團，如Fmoc(芴甲氧羰?；?分析中所得(圖9中路線A)。這些功能基團可用于直接或通過隔離劑基團附著藥物。
例22氫氧基團的烷化將一含有孢粉質(1克；1毫摩/克)及氯乙酸(6毫摩)的6M NaOH(50立方厘米)懸液攪拌18小時，沖洗及干燥后獲取承載量為0.8毫摩/克的孢粉質-乙酸(圖9中路線B)。
例23氫氧基團的?；痠)使用酐及酸性氯化物殘留的氫氧基團易于通過試劑例如乙酰氯或乙酸酐被乙?；?，3，4，及通過苯酰氯被苯酰化，以在標準狀態(tài)下以獲得酰化的孢粉質(圖9中路線C)。將苯酰氯(5毫摩)加入一攪和的并含有孢粉質(0.1克；1毫摩/克OH)的DCM(10立方厘米)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)及于冰浴中冷卻的嘧啶(3毫摩)的懸液中。將苯?；逆叻圪|(0.6毫摩/克苯?；?過濾，沖洗，干燥。
ii)使用一N-保護(N-protected)氨基酸及偶聯(lián)劑用N-保護(N-protected)氨基酸例如Fmoc氨基乙酸(圖8中路線D)及偶聯(lián)劑例如DMAP催化的DCC以直接?；瘹溲趸鶊F尚未被公開。因此此方法的一個示例如下將含有DCC(0.5毫摩)及Fmoc氨基乙酸(1毫摩)的DCM(20立方厘米)及DMF(1立方厘米)溶液攪拌20分鐘。然后將DCM蒸發(fā)除去，將剩余物溶于DMF(10立方厘米)所形成的溶液加入一于DMF(10立方厘米)中含有孢粉質(0.1毫摩/克)的懸液中。加入一于DMF(2立方厘米)含有DMAP(0.1毫摩)的溶液，然后將所得混合物攪拌24小時。濾出Fmoc氨基乙酸孢粉質，用DMF、DCM及MeOH(甲醇)沖洗并干燥(0.41毫摩/克Fmoc氨基乙酸)。
可以使用一相似的附著方法來附著縮氨酸及蛋白質藥物。
(iii)氫氧基團的氨基甲酸化剩余的氫氧基團可以與異氰酸鹽發(fā)生反應(圖9中路線E)。此方法可用于形成異相雙功能鏈接劑，以使用p-馬來酰亞胺異氰酸鹽(p-maleimidophenyl isocyanate)來結合氫氧基團。用異氰酸苯酯衍化孢粉質的步驟如下將孢粉質(1克；1毫摩/克)與異氰酸苯酯的懸液攪拌并以攝氏80度加熱18小時，以獲取孢粉質氨基甲酸鹽(0.9毫摩/克)，將其濾出，用DMSO及甲醇沖洗并干燥。
(iv)氫氧基團的鹵化孢粉質剩余的氫氧基團用SOCl2、POCl3或PCl5可以輕易地被鹵化(圖9中路線F)。孢粉質的此鹵化形式可用于通過一鏈接劑并隨后用一藥物進一步衍化聚合物。氫氧基團的鹵化闡述如下將無水碳酸鉀(6.37毫摩)及孢粉質(1克；1毫摩/克OH)于攝氏0度加入一于DCM中含有PCl5的溶液中。將該混合物攪拌15分鐘，然后濾出孢粉質，用DCM及乙醇沖洗并干燥(1毫摩/克C1)。
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4.P.Fawcett，D.Gree，R.Holleyhead及G.Shaw，Grana，1970，10，246。
5.M.E.Annunziato，U.S.Patel，M.Ranade及P.S.PalumboBiocon jugate Chem.，1993，4，212。
一些生物軛合使用硫醇結合基團(Biocojugate Techniques，Greg THermanson，1996，Academic Press Inc及Bioconjugation inpharmaceutical chemistry，Il Farmaco 1999，54，497-526)。孢粉質易于被衍化，以通過例如，先對孢粉質雙鍵進行溴化，隨后用硫脲(圖10)或者用NaSH處理方法引導硫醇基團。
根據(jù)本發(fā)明的第九個方面，提供有一硫醇功能化的孢子外膜。亦提供有一包含化學上結合有效劑量活性物質的硫醇功能化孢子外膜的制劑形式。
例24硫醇基團至孢粉質的附著(圖10)將一于DMSO(10立方厘米)中含有溴基孢粉質(1克，4.5毫摩/克；如前面所描述的方法通過孢粉質與乙酸中的溴反應獲得)與硫脲(60毫摩)的懸液回流24小時。通過過濾收集所得物，并用DMSO、水、2M HCl、水、EtOH及DCM沖洗。將該等粒子在25％KOH中在回流并攪拌6小時。冷卻后將此粒子過濾并用水、2M HCl、水及甲醇沖洗并干燥以獲得硫醇化的孢粉質(5.2毫摩/克)。
例25p-硝基苯酰氧碳酰(p-nitrobenzoyloxycarbonyl)基團至孢粉質的附著(圖11)用p-硝基苯酰氧碳酰基氯化物(p-nitrobenzoyloxycarbonyl chloride)對硫醇基團的?；?圖11)硫醇化孢粉質(5.2毫摩/克)在N2下用含有p-硝基苯酰氧碳?；然?p-nitrobenzoyloxycarbonyl chloride)(30毫摩)及三乙胺(30毫摩)的DCM(25立方厘米)在回流下攪拌。將粒子濾出，用DCM及甲醇沖洗并干燥以獲取p-硝基苯酰氧碳?；?p-nitrobenzoylthiooxycarbonylated)孢粉質(2.45毫摩/克)。
有許多用于使碳-碳附著于孢粉質的方法。此相當復雜但在物理上及化學上呈穩(wěn)定狀態(tài)的聚合物質的結構尚未完全獲知；因此很難知道將來在其表面會發(fā)現(xiàn)有什幺反應產(chǎn)生。然而，碳-碳鍵結構的一簡單示例包括二乙基丙二酸酯與溴基孢粉質在乙氧甲鈉溶液中的反應，以在與KOH溶液水解及與一無機酸中和后在孢粉質上產(chǎn)生一二酸功能(結構C，圖12)并由此增加CO2H基團的承載量。此方法的一示例如下根據(jù)本發(fā)明的第十個方面提供有一通過碳-碳鍵功能化的孢子外膜。亦提供有一包含一孢子外膜、一碳-碳鍵，與有效劑量活性物質結合的其他功能基團的制劑形式。
例26功能基團碳-碳鍵至孢粉質的附著將二乙基丙二酸酯(25毫摩)在攝氏50度下緩慢加入一甲氧基鈉(30立方厘米；25毫摩鈉)溶液中。將所得溶液緩慢加入一于乙醇(50立方厘米)中含有溴基孢粉質(1克；5毫摩/克溴)的攪和懸液中。加入后(15分鐘)將該混合物回流18小時。濾出二乙基丙二?；叻圪|(A，圖12)并用乙醇沖洗。將氫氧化鉀(15毫摩)溶于水(2立方厘米)中再加至乙醇(10立方厘米)中。將該溶液加至一于乙醇(40立方厘米)中含有二乙基孢粉質二乙基丙二酸酯(A，圖12)的攪和懸液中并回流18小時。濾出粒子并用水及乙醇沖洗再干燥以獲取鉀鹽(B，圖12)。將置于冰水中的B的懸液用稀釋硫酸酸化，以于用水及乙醇沖洗并干燥后獲取孢粉質丙二酸(C，圖12)(1毫摩/克)。
金屬被附著于附著至孢粉質的隔離劑基團以產(chǎn)生一過濾物質且無關于藥物傳輸{G.Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan，E.Phelivan，Reactive Polymers，9，(1988)，211-217}。然而至今尚未揭示具有金屬絡合物的藥物。接下來的例子揭示一種方法，其中孢粉質作為鉑的配位基(D，圖12)。其與為人所知的抗腫瘤藥物例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(CBDCA)及JM-40類似(圖13)。圖12中簡單顯示出合成新型衍化物(D，圖12)的方法，其細節(jié)如下例27順鉑(cisplatin)至孢粉質的附著將一包含cis-[PtCl2(NH3)2](順-二氨二氯鉑)(1.33毫摩)的DMF(20立方厘米)溶液加入至一于DMF(20立方厘米)中含有孢粉質丙二酸(C，圖12)的攪和懸液中。然后加入0.1M水性KOH(27立方厘米)并將所得混合物在攝氏60度下攪拌48小時。濾出鉑孢子(Sporoplatin)(D，圖12并在圖13中以此名稱顯示)并用水、乙醇及醚(0.9毫摩/克)沖洗。
一些金(I)硫醇鹽(gold(I)thiolate)絡合物顯示對類風濕性關節(jié)炎具有有效活性。Allochrysine及較近期的口服的瑞得(Ridaura)(R.Bau，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，9380)。瑞得(Ridaura)為一硫糖/磷化氫與金的絡合物，且如多數(shù)的糖分會在消化系統(tǒng)內(nèi)被分解。相關的孢粉質/磷化氫與金的絡合物在腸部應更穩(wěn)定且更易于將金(I)硫醇鹽(gold(I)thiolate)輸送進入血流中以治療類風濕性關節(jié)炎。也可以使用鉑、釕、釓及锝絡合物。
例28孢粉質的金(I)硫醇鹽(gold(I)thiolate)絡合物(圖14)將包含碳酸鉀(1毫摩)的乙醇-水(1∶4；50立方厘米)加入至一硫醇化孢粉質懸液(1克；1毫摩/克)中，在室溫下攪拌5小時并冷卻至攝氏0度。于攝氏0度慢慢加入一包含(三乙膦)氯化金(I)(1.1毫摩)的乙醇-水?？蓪⒃撊芤禾嵘潦覝?，并再進一步攪拌12小時。將該(三乙膦)(孢粉質-S)金(I)衍化物(0.8毫摩/克)用水、乙醇及醚沖洗并干燥。
權利要求
1.一種制藥學或營養(yǎng)學上的制劑形式，其包含有效劑量的活性物質，在化學上或物理上結合于或封裝于一承載物中，該承載物由一植物、苔類、菌類或藻類或其零碎部分的孢子外膜中選出，可選擇性地進一步帶有賦形劑。
2.如權利要求1所述的制劑形式，其中該承載物包含孢粉質、甲殼素或葡聚糖。
3.如權利要求1所述的制劑形式，其中該外膜包含來源于植物、苔類、菌類或藻類孢子的孢粉質、甲殼素、葡聚糖或甘露聚糖。
4.如前述任何一項權利要求所述的制劑形式，其適于口服、含服、舌下或經(jīng)皮膚給藥。
5.如權利要求4所述的制劑形式，由片劑、膠囊、胚珠、酏劑、溶液及懸劑中選出。
6.如權利要求1至3中任何一項所述的制劑形式，其用于肺部給藥。
7.如權利要求6所述的制劑形式，其中承載物的粒子大小處于1至100微米的范圍內(nèi)。
8.如權利要求7所述的制劑形式，其中承載物的粒子大小處于1至10微米的范圍內(nèi)。
9.如權利要求8所述的制劑形式，其中承載物的粒子大小處于1至5微米的范圍內(nèi)。
10.如前述任何一項權利要求所述的制劑形式，其中活性物質包含縮氨酸或遺傳物質。
11.如前述任何一項權利要求所述的制劑形式，其中孢粉質或其他孢子外膜或孢子被功能化。
12.如前述任何一項權利要求所述的制劑形式，其中活性物質為對堿不穩(wěn)定或對酸不穩(wěn)定。
13.如權利要求1至11中任何一項所述的制劑形式，其中活性物質在水中具有低溶解性。
14.如權利要求13所述的制劑形式，其中活性物質為金屬或金屬衍化物。
15.一種用于肺部給藥并包含有效劑量活性物質的制劑形式，其中活性物質被包含于一密封體內(nèi)，其由一株植物、苔類、菌類或藻類的完整孢子外膜中選出，或包含于該密封體壁內(nèi)的腔體中，并可選擇性地進一步帶有賦形劑。
16.如權利要求15所述的制劑形式，其中該密封體包含孢粉質、甲殼素或葡聚糖。
17.一種用于肺部給藥并包含有效劑量活性物質的制劑形式，其中該活性物質被吸收于載體的表面，其由一株植物、苔類、菌類或藻類的完整孢子外膜中選出，可選擇性地進一步帶有賦形劑。
18.如權利要求16及17所述的制劑形式，其中完整的孢子外膜具有一范圍處于約1至10微米的平均直徑。
19.如權利要求16及17所述的制劑形式，其中完整的孢子外膜具有一范圍處于約1至5微米的平均直徑。
20.一種伯胺功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
21.一種硫醇功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
22.一種形成伯胺功能化的孢粉質或其他孢子外膜的方法，包括用氨水對孢粉質或其他外膜進行處理并用例如氫化鋁鋰進行還原的步驟。
23.一種聚氨基功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
24.一種形成聚氨基功能化的孢粉質或其他孢子外膜的方法，包括將孢粉質或其他孢子外膜與聚氨基化合物加熱的步驟。
25.一種羧酸功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
26.一種氨基酸功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
27.一種制造氨基酸功能化的孢粉質或其他孢子外膜的方法，包括將其氨基酸酯與孢粉質或其他孢子外膜加熱的步驟。
28.一種聚氫氧基功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
29.一種鹵基功能化的孢粉質或其他孢子外膜。
30.一種功能化的孢粉質或其他孢子外膜，其中在外膜與活性成分之間有一碳-碳鍵。
31.一種包含有共價鍵接至胰島素的孢粉質或其他孢子外膜的制劑形式，可選擇性地進一步帶有一種或多種賦形劑。
32.一種營養(yǎng)學或調(diào)味料制劑形式，其包含一種在物理上包含于孢子外膜內(nèi)的營養(yǎng)學或功能化物質。
33.一種營養(yǎng)學或調(diào)味料制劑形式，其包含一種在物理上或化學上附著于孢子外膜的營養(yǎng)學或功能化物質。
34.一種營養(yǎng)學或調(diào)味料制劑形式，其包含一種包含在孢子外膜中的營養(yǎng)學的或功能化物質。
35.一種以壓力或真空的組合在有包含C1至C4酒精的輔助滲透液體存在下填充孢子外膜的方法。
36.一種以壓力或真空的組合在有水性乙醇存在下填充孢子外膜的方法。
37.如權利要求32至34中任何一項所述的營養(yǎng)學或調(diào)味料制劑形式，其中孢子外膜外層進一步覆有一可食用物質以輔助保留活性成分。
38.如權利要求1至9中任何一項所述的制劑形式，其中孢子外膜外層進一步覆有一種物質以輔助保留活性成分。
39.如權利要求1至18中任何一項中所述的制劑形式，用其制備治療疾病的藥物。
40.一種利用一不可溶的介質經(jīng)口部輸送一活性成分進入血流中的方法，其中活性成分不到20分鐘即進入血流中且隨后介質在3小時內(nèi)分解。
全文摘要
一種制藥學或營養(yǎng)學上的制劑形式，其包括有效劑量的活性物質，其在化學上或物理上結合于一承載物，該承載物包含孢粉質或其他相似的植物或菌類的孢子外膜，可選擇性地進一步帶有賦形劑。
文檔編號A61K9/20GK1842325SQ200480024330
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月28日 優(yōu)先權日2003年6月27日
發(fā)明者史提芬·羅倫斯·阿特肯, 史提芬·湯瑪斯·貝克特, 格拉姆·麥根斯 申請人:赫爾大學