專利名稱：用于“cest”應(yīng)用的磁共振位移試劑和包含可交換質(zhì)子的底物的加合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于磁共振成像(MRI)技術(shù)的順磁性加合物，其利用飽和轉(zhuǎn)移以形成影像對(duì)比。
背景技術(shù)：
通過對(duì)組織中自由質(zhì)子的照射在MRI圖像中產(chǎn)生對(duì)比已公開于US5,050,609。含有至少一個(gè)可與水交換的自由質(zhì)子的外源性造影劑(最初稱為CEDST試劑，現(xiàn)在稱為CEST試劑)的應(yīng)用已公開于WO 00/66180。上述文獻(xiàn)沒有明確提及將順磁性復(fù)合物作為CEST試劑的可能性。優(yōu)選的化合物為反磁性分子例如糖、氨基酸、雜環(huán)化合物、核苷、咪唑及其衍生物、胍等。
同一文獻(xiàn)還要求保護(hù)通過使用含有兩組磁不等價(jià)自由質(zhì)子的造影劑進(jìn)行體內(nèi)和體外測(cè)定pH、溫度、代謝物濃度的方法。對(duì)兩池(pool)的選擇性照射以及應(yīng)用比例計(jì)量法(ratiometric)使得可以不依賴于造影劑的濃度而對(duì)轉(zhuǎn)移效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。飽和轉(zhuǎn)移是指CEST試劑的自由質(zhì)子不與自由水(bulk water)結(jié)合，這意味著兩組自由質(zhì)子的共振頻率之間的分離一定大于其交換率。而且，轉(zhuǎn)移的程度直接與試劑質(zhì)子的交換率成比例，這意味著增加兩個(gè)交換信號(hào)共振頻率的分離可增加飽和轉(zhuǎn)移的效率。因此WO 02/43775公開了CEST順磁性造影劑的用途，其要求保護(hù)具有自由質(zhì)子的順磁性復(fù)合物的用途，其飽和轉(zhuǎn)移(優(yōu)于US 5050609中例舉的反磁性化合物)對(duì)于對(duì)診斷有益的參數(shù)例如pH、溫度、代謝物濃度等敏感。
然而，上述文件或文獻(xiàn)均未涉及由含有可與自由水交換的質(zhì)子的底物(包括與US 5050609所示例的相似類型)和能夠增加加合物與自由水的共振頻率之間的分離的順磁性復(fù)合物形成的非共價(jià)加合物作為CEST試劑系統(tǒng)的應(yīng)用可能性。在該方法中，將根據(jù)其位移試劑(SR)特性與含有可交換質(zhì)子的化合物特性之間的關(guān)系來選擇順磁試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及順磁性CEST試劑的制備和用途，其中，在所述試劑中，必須被照射以觀察飽和轉(zhuǎn)移的自由質(zhì)子的化學(xué)位移已作為底物與含有選自鐵(II)(高自旋結(jié)構(gòu))、鐵(III)、鈷(II)、銠(II)、銅(II)、鎳(II)、鈰(III)、鐠(III)、釹(III)、鏑(III)、鉺(III)、鋱(III)、鈥(III)、銩(III)、鐿(III)、銪(III)的金屬的順磁性螯合物的相互作用的結(jié)果被適當(dāng)?shù)摹耙苿?dòng)”。自由質(zhì)子可屬于反磁性或順磁性底物，條件是，在后一種情況中，其化學(xué)位移受順磁性物質(zhì)的非共價(jià)相互作用的影響。
因此，本發(fā)明第一方面涉及由反磁性底物組成的順磁性CEST試劑，所述底物包含通過靜電作用或共價(jià)鍵合與順磁性螯合物(SR單元)相結(jié)合的自由質(zhì)子(SH單元)，所述順磁性螯合物與底物的相互作用是可逆的。
本發(fā)明還涉及包含混有適當(dāng)賦形劑的上述CEST試劑的診斷組合物。
US 5050609和WO 00/66180中所描述的所有分子均可用作含有自由質(zhì)子的分子，優(yōu)選線型和大環(huán)聚胺例如Cyclen(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷)、聚氨基酸如聚精氨酸、蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白、多糖、聚環(huán)糊精、合成聚合物(聚酰氨基胺(polyamidoamine)、過酰胺化聚氨基酸(peramidated polyaminoacid)和含有酰胺基團(tuán)的枝狀聚合物)。特別優(yōu)選Cyclen、聚精氨酸和白蛋白。
可交換質(zhì)子也可以屬于水分子，其在與SH底物相互作用后并且基于加合物[(SR)(SH)]的性質(zhì)，會(huì)從自由水信號(hào)中“轉(zhuǎn)移”并且處于適合交換的條件下。該類SH底物包括多糖體系，特別是可形成能夠捕獲水和SR單元的分子的大分子聚集物的體系。這一概念的進(jìn)一步延伸包括其中SR和水分子被捕獲到同一區(qū)室內(nèi)并且同時(shí)水分子(其化學(xué)位移受SR單元影響)處于適于與自由水交換的條件下的任意體系?？杀挥糜讷@得該區(qū)室化作用的體系的非詳盡性列表包括脂質(zhì)體、納米和微米囊體系、蛋白質(zhì)腔和細(xì)胞。
本發(fā)明的加合物可通過簡(jiǎn)單的混合適宜摩爾比的含有自由質(zhì)子的分子和順磁性螯合物而制備，所述摩爾比取決于底物和SR單元的親和力
親和力可以通過締合的熱力學(xué)常數(shù)(KA)值表示，該值必須大于10。加合物可通過層析法和/或冷凍干燥、沉淀、蒸發(fā)等類似方法分離和純化。
依照本發(fā)明的第一種實(shí)施方式，SR單元具有能夠識(shí)別含有自由質(zhì)子的底物分子部分的化學(xué)特性，以顯著影響其化學(xué)位移。例如，[LnDOTP]4-(Ln為鑭系元素)和優(yōu)選底物Cyclen、聚精氨酸和HSA形成的加合物，通過靜電結(jié)合產(chǎn)生相互作用。
關(guān)于底物與SR單元間的靜電相互作用的其他實(shí)例是[LnDOTP]4-在其中可影響反磁性分子的自由質(zhì)子的化學(xué)位移值的那些，例如Co(III)-sarcophagine、Co(III)-(乙二胺)3和胍基丁胺。
底物-SR單元的識(shí)別也可通過疏水性相互作用(如在聚環(huán)糊精的情況下)或混合的相互作用(如在蛋白質(zhì)的情況下)發(fā)生。
或者，SR單元可被捕獲到高生物相容性的聚合物體系中，例如水凝膠或交聯(lián)蛋白質(zhì)，其在這些系統(tǒng)中能夠表現(xiàn)出對(duì)于存在于該體系中的慢交換水分子的作用。
其他有益的系統(tǒng)為那些由于區(qū)室化效應(yīng)而在其中發(fā)生可交換質(zhì)子池之間的分化的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，SR單元和SH底物能夠在適合的生物相容性系統(tǒng)中被區(qū)室化，例如脂質(zhì)體、納米微粒、微乳和蛋白質(zhì)腔(例如脫鐵鐵蛋白)，其中水(不同于SR單元和底物)能夠在區(qū)室內(nèi)外自由交換。這樣，SR單元的作用可通過能夠影響區(qū)室中底物的自由質(zhì)子共振頻率的磁化率的簡(jiǎn)單改變來實(shí)現(xiàn)而不需要它們之間的相互作用，其優(yōu)點(diǎn)在于使底物自由質(zhì)子的照射頻率幾乎不變。
如果SH-SR試劑在其中區(qū)室內(nèi)外的水交換速率非常慢并且含單元區(qū)室中的水量足以用于MR顯像觀察的體系中區(qū)室化，那么由于局部SR濃度的增加以及含自由質(zhì)子的底物的增加，可使飽和轉(zhuǎn)移效應(yīng)顯著增加。
或者，可以對(duì)位移試劑進(jìn)行選擇從而僅影響自由水信號(hào)的共振。該效應(yīng)必然增大水和底物共振頻率的分離，從而允許底物自由質(zhì)子的照射。Otting等人報(bào)道了一個(gè)與CEST無關(guān)的該類型的例子(J.Am.Chem.Soc.，1991，113，4363)，他們使用Co(II)來“移動(dòng)”自由水信號(hào)，從而使得可以對(duì)捕獲于蛋白質(zhì)BPTI位點(diǎn)(位移試劑不能進(jìn)入該位點(diǎn))內(nèi)的水分子進(jìn)行觀察。
SR單元和SH單元還可以通過共價(jià)鍵結(jié)合，以保證兩個(gè)單元在體內(nèi)具有同樣的生物分布。在該情況下，通過自我識(shí)別/自我聚集機(jī)制，SR單元對(duì)于SH單元質(zhì)子的作用并不表現(xiàn)為分子內(nèi)的，而是分子間的。
一個(gè)優(yōu)選的該類化合物如下 其中，分子間的自我識(shí)別發(fā)生在一個(gè)分子的負(fù)電性SR單元和另一個(gè)分子的正電性聚精氨酸鏈之間。該化合物中，側(cè)鏈上精氨酸殘基數(shù)量的選擇部分是基于已知結(jié)構(gòu)模塊(Arg)8(使人聯(lián)想起HIV-1病毒的48-60肽片段)可被細(xì)胞識(shí)別和內(nèi)在化這一事實(shí)(Suzuki等，J.Biol.Chem.，2002，277，2437)。
該化合物可通過以下合成路線制備
對(duì)于診斷應(yīng)用，可將本發(fā)明的試劑制成適于胃腸道外給藥的組合物。
本發(fā)明的診斷組合物可用于通過CEST方法測(cè)定診斷有益的化學(xué)-物理參數(shù)，如在人或動(dòng)物組織或體內(nèi)的溫度、pH、代謝物濃度、O2和CO2分壓以及酶活性。對(duì)此目的，優(yōu)選的診斷組合物應(yīng)當(dāng)含有兩個(gè)磁性不同的自由質(zhì)子組，它們的轉(zhuǎn)移效應(yīng)對(duì)于所關(guān)心的化學(xué)-物理參數(shù)優(yōu)選是不同的。這樣，通過使用比例計(jì)量法(已描述于WO 00/66180)，可獨(dú)立于診斷組合物的局部濃度來測(cè)定診斷參數(shù)。
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式涉及使該用系統(tǒng)以獲得內(nèi)皮通透性的信息。對(duì)此目的，常規(guī)的診斷試劑(即作用于水質(zhì)子T1或T2的試劑)(Min-Ying S.等，Magn.Res.Med.1998，39，259-269)通常結(jié)合DCE-MRI(DCE＝動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng))技術(shù)一起使用。該方法包括給予不同大小的診斷劑(直接給予，或在與大分子如HAS相互作用之后)以評(píng)估毛細(xì)血管的通透性。毛細(xì)血管通透性的定量評(píng)估通過需要連續(xù)使用不同診斷劑的動(dòng)力學(xué)研究來實(shí)現(xiàn)。然而，使用CEST方法，可以評(píng)估每一SR單元(或每一SH單元)的外滲，因?yàn)榭梢酝ㄟ^對(duì)診斷系統(tǒng)信號(hào)的選擇性照射來“刺激”造影劑。在此基礎(chǔ)上，可以使用能夠區(qū)別性地移動(dòng)底物SH的自由質(zhì)子信號(hào)的不同大小的SR單元(例如，通過改變順磁性金屬)。對(duì)透過內(nèi)皮的物質(zhì)的鑒定使得可以在單次給予診斷劑后進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。
可選擇地，通過使用同樣的SR單元并調(diào)整反應(yīng)底物的大小和類型以改變其自由質(zhì)子的共振頻率可達(dá)到同樣的目的。通過使用具有不同大小的區(qū)室化系統(tǒng)可得到相似的結(jié)果，其中，透過內(nèi)皮的診斷劑可以很容易地通過適當(dāng)?shù)嘏渲扑x系統(tǒng)(脂質(zhì)體、納米球等)中所包含的溶液來鑒定。
組合物優(yōu)選含有摩爾濃度為約0.001至1.0M的與適當(dāng)輔料相混合的本發(fā)明的加合物。
本發(fā)明的組合物可通過血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或心室內(nèi)途徑)或通過胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、淋巴內(nèi)、腔內(nèi)、口服或腸道途徑給藥。
優(yōu)選的形式為即可使用的無菌水溶液或懸浮液，或用于在臨使用前用無菌溶液重構(gòu)的凍干物的形式。根據(jù)具體診斷要求，劑量可以在0.01至0.5mmol/kg體重之間。
以下實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明。
實(shí)施例1pH 6.5，312K，7.05T，照射時(shí)間10s條件下，0.1mM聚精氨酸(DP 227)溶液的CEST光譜。
該光譜(

圖1)顯示了自由水NMR信號(hào)的強(qiáng)度隨照射頻率的變化，以關(guān)于水的ppm表達(dá)。
可在偏離水2ppm和4ppm附近觀察到兩個(gè)CEST峰值，顯示分別由胍質(zhì)子和聚合物的酰胺主鏈的照射所引起的飽和轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例2pH 7.2，312K，7.05T，照射時(shí)間10s條件下，0.1mM聚精氨酸(DP 227)溶液的CEST光譜。
該光譜(圖2)顯示了由pH增加引起的聚合物質(zhì)子交換速率的增加導(dǎo)致了聚合物質(zhì)子與自由水信號(hào)的結(jié)合。
實(shí)施例3pH 6.5，312K，7.05T，照射時(shí)間4s，0.5mM聚精氨酸(P 227)溶液在2.5mM[YbDOTP]4-在下的CEST光譜。
該光譜(圖3)顯示了SR單元對(duì)底物共振頻率的影響。
實(shí)施例4pH 7.2，312K，7.05T，照射時(shí)間4s，0.5mM聚精氨酸(DP 227)溶液在2.5mM[YbDOTP]4-在下的CEST光譜。
該光譜(圖4)表明，通過增加溶液的pH值，SR單元效應(yīng)允許通過偏離自由水5-10ppm區(qū)間的照射測(cè)量胍質(zhì)子的飽和轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例5pH 6.5，312K，7.05T，照射時(shí)間4s，0.25mM聚精氨酸(DP 227)溶液在3.5mM[DyDOTP]4-在下的CEST光譜。
該光譜(圖5)顯示，Dy(III)離子對(duì)胍自由質(zhì)子共振的影響與使用Yb(III)離子相比具有相反的數(shù)學(xué)信號(hào)。
實(shí)施例6pH 7.2，312K，7.05T，照射時(shí)間4s，0.1mM聚精氨酸(DP 227)溶液在1.2mM和2.4mM[TmDOTP]4-在下的CEST光譜。
該光譜(圖6)顯示該復(fù)合物對(duì)胍自由質(zhì)子共振頻率的顯著影響，照射可在30-40ppm區(qū)間進(jìn)行(SR為2.4mM)。
實(shí)施例7pH 7.2，312K，7.05T，偏離水照射頻率8400Hz，照射時(shí)間4s，6.25μM聚精氨酸(DP 227)溶液的飽和轉(zhuǎn)移(ST％)隨[TmDOTP]4-濃度的變化。
該圖表明該體系具有很強(qiáng)的靈敏度，可用于在SR單元濃度約為40μM時(shí)測(cè)量5％的ST效應(yīng)。
實(shí)施例8312K，7.05T，偏離水照射頻率6000Hz，照射時(shí)間4s，0.11mM聚精氨酸(DP270)和2mM[TmDOTP]4-的溶液的飽和轉(zhuǎn)移(ST％)隨pH的變化。
該效應(yīng)在酸性pH下顯著下降，主要是由于胍質(zhì)子交換速率下降。
實(shí)施例9人血清白蛋白(HSA)和[TmDOTP]4-間的相互作用(312K，pH 7.4)。
圖9顯示通過1.3ppm至10ppm區(qū)間照射NMR光譜頻率進(jìn)行測(cè)量的，單獨(dú)的1mM HSA溶液(□)和加入總量3mM的[TmDOTP]4-之后(■)的飽和轉(zhuǎn)移。觀察到最大轉(zhuǎn)移的頻率，可歸于Arg蛋白殘基胍質(zhì)子的照射，位移大約為2ppm。
實(shí)施例10[TmDOTP]4-和Co(en)33+間的相互作用。
圖10說明了298K，pH 5.7，7.05T，偏離水照射頻率21,000Hz，照射時(shí)間4s，CEST效應(yīng)(ST％)隨1∶1[TmDOTP]4-和Co(en)33+溶液濃度的變化。該實(shí)驗(yàn)條件下，SR單元濃度為0.1mM時(shí)可獲得5％CEST效應(yīng)。在生理溫度和pH下，由于伯胺質(zhì)子的高交換速率導(dǎo)致最大效應(yīng)只有9％。
實(shí)施例11[TmDOTP]4-和Cyclen間的相互作用。
圖11顯示了312K，pH 6，7.05T，偏離水照射頻率21,000Hz，照射時(shí)間4s，CEST效應(yīng)(ST％)隨Cyclen和[TmDOTP]4-的濃度比的變化，其中[TmDOTP]4-的濃度為4mM。在底物/SR單元濃度比約為3-4∶1時(shí)可觀察到最大效應(yīng)。底物濃度較低時(shí)，由于只有少量的質(zhì)子被照射而使效應(yīng)大幅下降，而濃度較高時(shí)，由于Cyclen游離部分的增加導(dǎo)致了自由質(zhì)子信號(hào)向反磁性區(qū)域發(fā)生位移，使效應(yīng)大幅下降。
實(shí)施例12[TmDOTP]4-和Cyclen間的相互作用。
圖12說明了312K，pH 6，7.05T，偏離水照射頻率21,000Hz，照射時(shí)間4s，保持[Cyclen]/[TmDOTP]4-濃度比為3∶1，CEST效應(yīng)(ST％)隨[TmDOTP]4-濃度的變化。
該圖顯示了本系統(tǒng)具有很強(qiáng)的靈敏度，可用于在SR單元濃度約為60μM時(shí)測(cè)量5％ST效應(yīng)。
實(shí)施例13[TmDOTP]4-和Cyclen間的相互作用。
圖13說明了312K，7.05T，偏離水照射頻率21,000Hz，照射時(shí)間4s，3∶1的Cyclen(12mM)和[TmDOTP]4-(4mM)溶液的CEST效應(yīng)(ST％)隨pH的變化。
轉(zhuǎn)移效應(yīng)反映胺質(zhì)子交換速率與pH的相關(guān)性；換言之，當(dāng)交換速率太慢(pH＜5)或當(dāng)其太快、接近結(jié)合條件時(shí)(pH＞7)，相關(guān)性下降。
實(shí)施例14圖14中的直方圖比較了312K，pH 7.4，7.05T，照射時(shí)間4s條件下，一系列的底物與SR單元[TmDOTP]4-相互作用的ST％值。所有例子中的[TmDOTP]4-濃度為4mM，而底物濃度依據(jù)先前評(píng)估的最佳濃度比變化。Triaza＝1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷10∶1；Hexaaza＝1，4，7，10，13，16-六氮雜環(huán)十八烷2∶1；Cyclen 3∶1；Cyclam 2∶1和聚精氨酸0.055∶1。
權(quán)利要求
1.一種順磁性CEST試劑，其含有一個(gè)底物(SH)，該底物含有可與順磁性螯合物(SR)結(jié)合的自由質(zhì)子，該順磁性螯合物含有選自鐵(II)(高自旋結(jié)構(gòu))、鐵(III)、鈷(II)、銠(II)、銅(II)、鎳(II)、鈰(III)、鐠(III)、釹(III)、鏑(III)、鉺(III)、鋱(III)、鈥(III)、銩(III)、鐿(III)和銪(III)的金屬。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中SH底物為反磁性的，選自線型和環(huán)狀聚胺、聚氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、聚酰氨基胺、過酰胺化聚氨基酸、含有酰胺基團(tuán)的枝狀聚合物、聚環(huán)糊精、多糖和藻酸鹽。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其中底物選自聚精氨酸、白蛋白和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷。
4.按照權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的試劑，其中順磁性螯合物為[LnDOTP]4-。
5.按照權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的試劑，其在選自脂質(zhì)體、納米微粒、微乳劑和蛋白質(zhì)腔的生物相容性系統(tǒng)中被區(qū)室化。
6.按照權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的試劑，其中底物和螯合物之間的鍵為靜電類型，SR-底物結(jié)合的表觀熱力學(xué)常數(shù)(KA)大于10。
7.按照權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的試劑，其中SH通過共價(jià)鍵與SR結(jié)合。
8.具有以下結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求7所述的試劑
9.一種診斷組合物，含有如權(quán)利要求1-8所述的與適當(dāng)載體相混合的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CEST順磁性試劑，其含有一個(gè)底物(SH)，該底物含有可與順磁性螯合物(SR)結(jié)合的自由質(zhì)子，該順磁性螯合物含有選自鐵(II)(高自旋結(jié)構(gòu))、鐵(III)、鈷(II)、銠(II)、銅(II)、鎳(II)、鈰(III)、鐠(III)、釹(III)、鏑(III)、鉺(III)、鋱(III)、鈥(III)、銩(III)、鐿(III)和銪(III)的金屬。
文檔編號(hào)A61K49/08GK1809386SQ200480009565
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者S·艾梅, E·泰雷諾, D·德利卡斯泰利, G·B·焦文扎納 申請(qǐng)人:布雷克成像有限公司