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突變神經(jīng)胚素的聚合物偶聯(lián)物的制作方法

文檔序號:1090977閱讀:789來源:國知局
專利名稱:突變神經(jīng)胚素的聚合物偶聯(lián)物的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學、分子生物學、神經(jīng)生物學、神經(jīng)病學及疼痛治療(pain management)領域。

背景技術
神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然存在的蛋白質(zhì),其調(diào)節(jié)發(fā)育過程中的神經(jīng)元存活,并調(diào)節(jié)成熟神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性及結構完整性。神經(jīng)營養(yǎng)因子可從神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中分離出來。最近20年里已發(fā)現(xiàn)許多,神經(jīng)營養(yǎng)因子根據(jù)它們的結構和功能這些神經(jīng)營養(yǎng)因子可歸類為超家族、家族、亞家族和個別種類。
神經(jīng)營養(yǎng)因子超家族包括成纖維細胞生長因子(FGF)超家族、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白超家族及轉化生長因子β(TGF-β)超家族。神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)相關的配體是TGF-β超家族內(nèi)的一種蛋白家族。GDNF相關的配體包括GDNF、persephin(PSP)、neurturin(NTN)及神經(jīng)胚素(Neublastin)(NBN;已知為artemin或enovin)。GDNF相關的配體家族成員以其七個保守的半胱氨酸殘基為一種特征。這些殘基形成分子內(nèi)和分子間的二硫鍵,并產(chǎn)生二聚化多肽配體的三級及四級結構。這個家族的成員也共享通過多成分受體復合體來誘導信號的能力,所述多成分受體復合體由GFRα家族的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨著的共同受體、GDNF相關的配體亞家族的成員及RET酪氨酸激酶受體組成。
活化的RET引發(fā)可至少部分引起GDNF相關配體的下游效應的信號轉導級聯(lián)。因此,RET的活化可代表通過GFRα受體途徑影響下游細胞過程而起作用的療法的一個可取的方面。
神經(jīng)胚素歸類在GDNF家族內(nèi),因為它與其它含有七個半胱氨酸基序的GDNF配體(如,在EP02/02691PCT公報US02/02319以及US02/06388描述的)共享同源區(qū),并且因為它具有結合、活化作為GFRα復合體一部分的RET受體的能力。具體來說,神經(jīng)胚素對與GFRα3-RET受體復合體的結合具有高選擇性。在那方面,神經(jīng)胚素與GDNF相關的配體家族的其他成員相比在其氨基酸序列內(nèi)含有獨特亞區(qū)。
目前的數(shù)據(jù)提示神經(jīng)胚素在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)可具有保護性和再生性的作用,因此它可用作針對神經(jīng)變性疾病的治療劑。例如,資料提示神經(jīng)胚素對所培養(yǎng)的來源于背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元以及培養(yǎng)的黑質(zhì)(substantia nigra)多巴胺能神經(jīng)元可具有促進存活的效應(Baloh等,Neuron 211291-1302(1998))。所以看來神經(jīng)胚素可促進包括感覺神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元群體的存活。由于神經(jīng)元的退化和功能異常與疾病的狀態(tài)有關,因此這點是重要的。例如,感覺神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元的病理學分別是外周神經(jīng)病變和帕金森病的致病基礎。
因而,給予神經(jīng)胚素可用于例如治療與神經(jīng)元的退化和功能異常相關的疾病。但是,神經(jīng)胚素很快被機體清除,這可能影響神經(jīng)胚素在治療應用中所需的劑量范式(closing paradigm)。因而需要具有增強的生物利用率的經(jīng)修飾的神經(jīng)胚素多肽。因此,本發(fā)明的一個目的是識別顯示增強的生物利用率的神經(jīng)胚素的修飾形式。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了聚合物偶聯(lián)的、突變的神經(jīng)胚素二聚體。每一種二聚體含有包含第一氨基末端氨基酸的第一多肽和包含第二氨基末端氨基酸的第二多肽。每一種多肽各自含有(a)以與SEQ ID NO1的氨基酸8-113具有至少70%、80%、90%或95%的序列同一性為特征的氨基酸序列;(b)在位置16、43、47、80、81、109及111(按SEQ ID NO1編號)中的每個位置的半胱氨酸殘基;(c)如下氨基酸殘基16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C;以及(d)LGLG重復、FRFC基序、QPCCRP基序以及SATACGC基序。這種二聚體包括至少一種氨基酸取代(相對于SEQ ID NO1),其可提供與聚合物偶聯(lián)的內(nèi)部聚合物偶聯(lián)位點。
本發(fā)明也提供聚合物偶聯(lián)的、突變的神經(jīng)胚素二聚體,其含有第一多肽和第二多肽,其中每種多肽含有具有1-6個氨基酸取代的、SEQ ID NO6的氨基酸90-140,如95-120或100-110,每個取代提供了與聚合物偶聯(lián)的聚合物偶聯(lián)位點。本發(fā)明多肽的具體例子包括NBN113(SEQ ID NO2)、NBN140(SEQ ID NO6)、NBN116(SEQ ID NO7)、NBN112(SEQ ID NO8)、NBN111(SEQ ID NO9)、NBN110(SEQ ID NO10)、NBN109(SEQ ID NO11)、NBN108(SEQ ID NO12)、NBN107(SEQ ID NO13)、NBN106(SEQ IDNO14)、NBN105(SEQ ID NO15)、NBN104(SEQ ID NO16)、NBN103(SEQID NO17)、NBN102(SEQ ID NO18)、NBN101(SEQ ID NO19)、NBN100(SEQID NO20)及NBN99(SEQ ID NO21)。
優(yōu)選地,二聚體中兩個氨基末端氨基酸的至少一個偶聯(lián)于聚合物。優(yōu)選的氨基酸取代包括賴氨酸殘基取代精氨酸殘基(Raa#K;aa#是基于SEQID NO1的氨基酸編號),及賴氨酸殘基(Naa#K)或天冬氨酸殘基(Naa#D)取代天冬酰胺殘基。這種取代的具體例子是R14K、R39K、R68K、N95D及N95K(基于SEQ ID NO1編號)。特別優(yōu)選的取代是N95K。
優(yōu)選地,二聚體上的聚合物的總復合分子量(total combined molecularweight)是20,000-40,000Da。優(yōu)選地,每種聚合物的平均分子量是2,000-100,000Da;更優(yōu)選5,000-50,000Da;及最優(yōu)選大約10,000到20,000Da。所述聚合物可為線性的或分支的。優(yōu)選地,聚合物是一種聚亞烷基二醇組分,如,聚乙二醇(PEG)組分。在一些實施方案中,至少一種多肽是糖基化的。
在本發(fā)明的一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的二聚體含有第一多肽和第二多肽,其中(a)每一種多肽各自包含SEQ ID NO1的100到110位氨基酸,(b)每一種多肽包含位于SEQ ID NO1中的氨基酸95的天冬酰胺-到-賴氨酸的取代,(c)以及該二聚體包含3或4個PEG組分,其中每個PEG組分的分子量大約10,000Da,并且每種PEG組分在氨基末端或95位賴氨酸處偶聯(lián)。優(yōu)選的實施方案是含有一對命名為3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K單體的同源二聚體。
本發(fā)明包括包含依照本發(fā)明的二聚體的藥物組合物。在一些實施方案中,該組合物包含兩種或更多種不同的依據(jù)本發(fā)明的二聚體。
本發(fā)明包括核酸,如,一種編碼用于摻入本發(fā)明二聚體的多肽的DNA表達載體。本發(fā)明也包括由該核酸轉化的宿主細胞。
本發(fā)明包括一種治療哺乳動物神經(jīng)性疼痛的方法。該方法包括給予哺乳動物治療有效量的本發(fā)明的二聚體。在一些實施方案中,該治療有效量為從0.1μg/kg到1000μg/kg,從1μg/kg到100μg/kg,或從1μg/kg到30μg/kg。該二聚體的給藥可通過各種途徑,如,經(jīng)肌肉內(nèi),皮下或靜脈內(nèi)。依據(jù)發(fā)明的一些方法,該二聚體每周被給予三次。本發(fā)明也提供在哺乳動物中活化RET受體的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的所述二聚體。
根據(jù)以下的詳細說明及權利要求,本發(fā)明的其他特點及優(yōu)點將顯而易見。
附圖簡述

圖1是一個散點圖,概括了與野生型NBN113相比較,3,(4)×10KPEG化的NBN106-N95K的KIRA ELISA分析數(shù)據(jù)。
圖2是一個散點圖,概括了與野生型NBN113比較,3×10K PEG化的NBN106-N95K及4×10K PEG化的NBN106-N95K的KIRA ELISA分析的數(shù)據(jù)。
圖3是一個斷續(xù)的線圖,說明在脊神經(jīng)結扎的大鼠中,用10μg/kg 3×10K PEG化的NBN106-N95K及4×10K PEG化的NBN106-N95K的混合物(即″3(,4)×10kDa PEG NBN106-N95K)″)可幾乎完全逆轉已充分確定的觸覺異常性疼痛(allodynia)。
圖4是一個斷續(xù)的線圖,說明在脊神經(jīng)結扎的大鼠體內(nèi),用10μg/kg 3(,4)×10kDa PEG化的NBN106-N95K可幾乎完全逆轉已充分確定的熱痛覺過敏(thermal hyperalgesia)。
發(fā)明詳述 除非另作說明,神經(jīng)胚素氨基酸位置編號的任何引用將參照SEQ IDNO1說明的編號。
除非另行定義,本文所用所有技術術語和科學術語與本發(fā)明所屬領域技術人員通常理解的意思相同。盡管與在此描述的相近的或等同的方法及材料可用于實施或測試本發(fā)明,合適的方法及材料描述如下。所有公開出版物、專利申請、專利及在此提及的其他參考文獻通過引用全部合并在本文中。如有沖突,以本說明書包括定義為準。此外,材料、方法及實施例僅用于說明而非旨在限制。
本文所用“野生型神經(jīng)胚素多肽”意思是天然存在的神經(jīng)胚素多肽序列。野生型神經(jīng)胚素多肽可通過神經(jīng)胚素的來源進一步定義,例如,人、小鼠或大鼠的神經(jīng)胚素(見如SEQ ID NO2、3或4)。共有神經(jīng)胚素多肽序列提供為SEQ ID NO1。
本文所用“突變型神經(jīng)胚素多肽”意思是一種多肽,其含有相對于野生型神經(jīng)胚素多肽的至少規(guī)定的最低水平的序列同一性,其含有相對于野生型神經(jīng)胚素多肽的至少一種氨基酸取代、插入或融合,并且顯示神經(jīng)胚素活性。(如,國際專利申請?zhí)朠CT/US02/02319(WO 02/060929)所述)。
本文所用“內(nèi)部聚合物偶聯(lián)位點”意思是在突變型神經(jīng)胚素多肽中的非末端氨基酸殘基,該殘基提供適于偶聯(lián)聚合物的側鏈。
本文所用“修飾的神經(jīng)胚素多肽”意思是含有至少一種附著的聚合物的多肽。
本文所用“融合”意思是兩種或更多種多肽的共線性(co-linear)、共價連接,所述連接通過所述多肽各自的肽主鏈、通過同一讀碼框內(nèi)編碼那些蛋白的多聚核苷酸分子的基因表達而形成。
本文所用“同一性”是指兩種多肽、分子間或兩種核酸間的序列相似性。當兩種被比較的序列的位置為同一堿基或氨基酸單體亞單位所占時(例如,兩種DNA分子的每一種中的位置為腺嘌呤所占,或兩種多肽的每一種中的位置為賴氨酸所占),每個分子便在那個位置是同源的。兩種序列間的“百分比同一性”是一個函數(shù),用兩種序列共有的匹配位置數(shù)除以被比較的位置數(shù)再乘100。例如,如果兩種序列中10個位置有6個匹配,那么這兩種序列有60%同一性。例如,DNA序列CTGACT及CAGGTT共享50%同一性(共6個位置中有3個匹配)。一般的,當兩種序列經(jīng)比對產(chǎn)生最大同源性時作比較。這種對比可用例如Needleman等J.Mol Biol.48443-453(1970)用計算機程序諸如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地實現(xiàn)的方法來提供?!跋嗨频摹毙蛄惺窃诒葘r那些共享同樣且相似的氨基酸殘基的序列,其中相似的殘基是被比對參照序列中的相應氨基酸殘基的保守取代殘基或“容許的點突變(allowed point mutations)”。在這一點上,參照序列的殘基的“保守取代”是由物理上或功能上近似于相應參照殘基的殘基進行取代,如,這種殘基具有相似的大小、形狀、電荷、化學性質(zhì),包括形成共價鍵或氫鍵的能力等等。因此,“保守取代突變的”序列是一種不同于參照序列或野生型序列的序列,其不同之處在于其存在一種或更多種保守取代或容許的點突變。兩種序列間的“百分比陽性”是一個函數(shù),用含有兩種序列共有的匹配殘基或保守取代的位置數(shù)除以被比較的位置數(shù)再乘100。例如,如果兩種序列10個位置中有6個匹配且10個位置中有2個含有保守取代,那么這兩種序列有80%陽性同源性。
突變的神經(jīng)胚素多肽 本發(fā)明的突變的神經(jīng)胚素多肽與野生型神經(jīng)胚素多肽相比,其保留神經(jīng)營養(yǎng)活性并且具有提高的生物利用率。例如,在野生型神經(jīng)胚素活化RET的測定中本發(fā)明的突變的神經(jīng)胚素可活化RET基因產(chǎn)物。一般地,突變的神經(jīng)胚素多肽將保留以下特點中至少一種但可另外包含至少一種修飾,以使得產(chǎn)生出內(nèi)部聚合物偶聯(lián)位點 (i)當依照SEQ ID NO1-4編號時,在16,、43、47、80、81、109及111位的七個保守的半胱氨酸殘基; (ii)每一位置都依據(jù)SEQ ID NO1-4編號時,如下氨基酸殘基 16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C; (iii)LGLG重復、FRFC基序、QPCCRP基序及SATACGC基序。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種截短的突變型的神經(jīng)胚素多肽,其中截短的神經(jīng)胚素多肽的氨基末端缺少一種或多種成熟的神經(jīng)胚素多肽的氨基末端氨基酸,但其被突變成具有內(nèi)部聚合物附著物。優(yōu)選地,截短的突變型神經(jīng)胚素多肽在二聚化時可活化RET多肽。在一些實施方案中,突變型神經(jīng)胚素多肽誘導RET多肽的二聚化。這種誘導可能需要額外的多肽或輔因子,這對于本領域技術人員是顯而易見的。
人及鼠神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列在PCT公開WO00/01815中已公開。本發(fā)明的野生型神經(jīng)胚素多肽的實施例在表1A中給出。神經(jīng)胚素的共有序列(相對于人、小鼠及大鼠的同一性)在表1B中列出。

在一些實施方案中,表1A粗體顯示的精氨酸(Arg或R)或天冬酰胺(Asn或N)殘基中至少一種由一種不同的氨基酸殘基取代。在一個優(yōu)選的實施方案中,突變的神經(jīng)胚素多肽具有賴氨酸(Lys或K)殘基,其取代了95位氨基酸的天冬酰胺,由表1A星號標出,稱為NBN-N95K。一般地,N95K取代導致改良的可溶性。這利于以高濃度配制。

本發(fā)明包括與聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽,其包含例如與SEQID NO1(也見表1所示)的氨基酸8-113具有至少70%同一性的氨基酸序列;在一種實施方案中,14位、39位、68位中一種或更多個位置的精氨酸或95位天冬酰胺除精氨酸或天冬酰胺以外的氨基酸所取代。在一種實施方案中,野生型氨基酸由賴氨酸或半胱氨酸取代。
突變型神經(jīng)胚素多肽中被取代的殘基可被選擇以便于聚合物如聚亞烷基二醇聚合物在被取代氨基酸處的偶聯(lián)。修飾的有利位點是神經(jīng)胚素多肽中溶劑易接近的區(qū)域。這些位點可基于相關神經(jīng)營養(yǎng)因子如GDNF的晶體結構的檢測而選擇,其晶體結構見Eigenbrot等,Nat.Struct.Biol.4435-38,1997所述。這些位點也可基于神經(jīng)胚素的晶體結構而選擇,其結晶化及結構測定描述如下。同樣,這些位點也可基于為persephin/神經(jīng)胚素嵌合蛋白提供的結構-功能的信息而選擇。這些嵌合體見Baloh等,J.Biol.Chem.2753412-20,2000所述。通過這種方法學鑒別出的溶劑易接近的或表面暴露的神經(jīng)胚素氨基酸的實例在表2中列出。
表2列出了預期為表面暴露的人神經(jīng)胚素中的殘基及數(shù)目。第一列指的是通過檢測由鏈A及鏈B形成的大鼠GDNF二聚體(PDB碼1AGQ)的結構并測定殘基是否在該結構的表面而確定的表面暴露的殘基。這種結構再與GDNF及神經(jīng)胚素的序列對比(Baloh等,Neuron 211291-1302,1998)相比較以確定神經(jīng)胚素中適宜的殘基。第二和第三列分別指的是通過檢測由鏈A及鏈B形成的人神經(jīng)胚素二聚體的結構而確定的表面暴露的殘基。表2的編號方案如表1所示。

n指這些殘基不存在于GDNF或神經(jīng)胚素的結構中。這或是因為構建體設計、可變區(qū)或是因為神經(jīng)胚素中相對于GDNF(殘基68-71)的插入物。
-指這些殘基是隱蔽的且不在表面,或是參與形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。由于這種蛋白是半胱氨酸節(jié)(knot),絕大部分殘基在表面。
+指該殘基在GDNF結構中或神經(jīng)胚素結構中是表面暴露的,盡管含有66-75殘基的環(huán)只在一種GDNF單體(推定為柔性的)中可見。此環(huán)相對于GDNF在神經(jīng)胚素中也含有4殘基插入物。
在一些實施方案中,神經(jīng)胚素多肽保留GDNF亞家族及TGF β超家族的特征性七個保守的Cys殘基。
人的全長前原NBN多肽的序列(SEQ ID NO5)如表3所示。鑒定了神經(jīng)胚素多肽的三種成熟型。這些類型包括 (i)在本文命名為NBN140的140AA多肽,其具有的氨基酸序列為SEQID NO6; (ii)在本文命名為NBN116的116AA多肽,其具有的氨基酸序列為SEQID NO7; (i)在本文命名為NBN113的113AA多肽,其具有的氨基酸序列為SEQID NO2。
表3說明本發(fā)明公開的前原神經(jīng)胚素多肽序列間的關系。行1提供了多肽SEQ ID NO5,行2提供了多肽SEQ ID NO6,行3提供了多肽SEQ IDNO7以及行4提供了多肽SEQ ID NO2.。七個保守半胱氨酸殘基由符號(″*″,″#″,″+″及″|″)指示來標明成熟的二聚化神經(jīng)胚素配體中形成的分子內(nèi)(*與*,#與#,及+與+)及分子間(″|″)的二硫鍵。脫字符號(“^”)指NBN106-N95K中被賴氨酸取代的氨基酸位置95的天冬酰胺殘基。

在可選的實施方案中,上述確定的神經(jīng)胚素多肽的序列在其氨基末端氨基酸序列處被截短。其實例包括 (iv)本文命名為NBN112的112AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的112個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO8)的氨基酸29-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸2-113。
(v)本文命名為NBN111的111AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的111個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO9)的氨基酸30-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸3-113。
(vi)本文命名為NBN110的110AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的110個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO10)的氨基酸31-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸4-113。
(vii)本文命名為NBN109的109AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的109個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO11)的氨基酸32-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸5-113。
(viii)本文命名為NBN108的108AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的108個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO12)的氨基酸33-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸6-113。
(ix)本文命名為NBN107的107AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的107個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO13)的氨基酸34-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸7-113。
(x)本文命名為NBN106或N-7之一的106AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的106個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO14)的氨基酸35-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸8-113。
(xi)本文命名為NBN105的105AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的105個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO15)的氨基酸36-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸9-113。
(xii)本文命名為NBN104或N-9之一的104AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的104個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO16)的氨基酸37-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸10-113。
(xiii)本文命名為NBN103的103AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的103個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO17)的氨基酸38-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸11-113。
(xiv)本文命名為NBN102的102AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的102個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO18)的氨基酸39-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸12-113。
(xv)本文命名為NBN101的101AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的101個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO19)的氨基酸40-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸13-113。
(xvi)本文命名為NBN100的100AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的100個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO20)的氨基酸41-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸14-113。
(xiii)本文命名為NBN99或N-14之一的99AA多肽序列,其具有神經(jīng)胚素多肽羧基末端的99個氨基酸,如SEQ ID NO6(SEQ ID NO21)的氨基酸42-140或SEQ ID NO1、3或4的氨基酸15-113。
這些截短的神經(jīng)胚素多肽的多肽序列從NBN113到NBN99如表4所示。二硫鍵形成如表3所述。

依據(jù)本發(fā)明的突變型神經(jīng)胚素多肽可,如與SEQ ID NO1的氨基酸8-113具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。在一些實施方案中,突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列包括在突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸1-94及96-113的天然存在的大鼠、人或小鼠的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列,如,所述多肽在這些位置具有SEQ ID NO2、3或4的氨基酸序列。
在序列上不同于SEQ ID NO1-4公開的那些序列的突變型神經(jīng)胚素多肽可包括一種或更多種保守的氨基酸取代。任選地,或此外,突變型神經(jīng)胚素多肽可由于一種或更多種非保守氨基酸取代或缺失或插入而不同。優(yōu)選地,取代、插入或刪除不消除分離的蛋白的生物學活性。
保守取代是一種氨基酸被另一種特性相似的氨基酸取代。保守取代包括在以下組內(nèi)的取代纈氨酸、丙氨酸及甘氨酸;亮氨酸、纈氨酸及異亮氨酸;天冬氨酸及谷氨酸;天冬酰胺及谷氨酰胺;絲氨酸、半胱氨酸及蘇氨酸;賴氨酸及精氨酸;苯丙氨酸及酪氨酸。非極性的疏水的氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸及組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。以上提到的極性、堿性或酸性組的一個成員被同組的另一成員的任意取代可被認為是保守取代。
其他取代可為本領域技術人員輕易識別。例如,對于氨基酸丙氨酸的取代,可從D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、半胱氨酸及D-半胱氨酸之一中選取。對于賴氨酸,可以用D-賴氨酸、精氨酸、D-精氨酸、同型精氨酸、蛋氨酸、D-蛋氨酸、鳥氨酸或D-鳥氨酸中任一取代。一般地,預期可誘導分離的多肽的性質(zhì)變化的功能上重要的區(qū)域中的取代是這樣的替代,其中(i)一種極性殘基,如絲氨酸或蘇氨酸,取代(或被取代成)疏水殘基,如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸;(ii)半胱氨酸殘基取代(或被取代成)任何其他殘基;(iii)有帶正電側鏈的殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸,取代(或被取代成)有帶負電側鏈的殘基如谷氨酸或天冬氨酸;或(iv)帶有龐大側鏈的殘基如苯丙氨酸,取代(或被取代成)沒有這種側鏈的殘基如甘氨酸。前述非保守性取代之一可改變該蛋白功能性質(zhì)的可能性也與取代相對于該蛋白功能重要區(qū)的位置有關。一些非保守取代可相應地很少或不影響生物學性質(zhì)。
在許多情況下,聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽相對于野生型多肽或在無聚合物時的突變型多肽而言具有更長的血清半衰期。在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽相對于在無聚合物時的多肽或糖基化的多肽而言具有顯著增加的體內(nèi)效力。
聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽可作為包括至少一種聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的二聚體來提供。在一些實施方案中,此二聚體是聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽的同源二聚體。在其他的實施方案中,此二聚體是聚合物偶聯(lián)的突變型截短的神經(jīng)胚素多肽的同源二聚體。在其他的實施方案中,此二聚體是包括一種聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽和一種野生型神經(jīng)胚素多肽的異源二聚體。在其他的實施方案中,此二聚體是包括一種聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽和一種聚合物偶聯(lián)的野生型神經(jīng)胚素多肽的異源二聚體,其中該聚合物偶聯(lián)在氨基末端,并且該多肽可被截短或可不被截短。其他的二聚體包括可被截短或可不被截短的聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽類型的異源二聚體或同源二聚體。
本發(fā)明提供的是成熟且截短的突變多肽序列,其包括前原NBN多肽的羧基-末端-大多數(shù)(carboxy-terminal-most)氨基酸殘基,諸如SEQ ID NO5給出的那些,它們在本文稱為NBN#,#代表保存在參照神經(jīng)胚素多肽的羧基末端殘基的數(shù)目。生物活性神經(jīng)胚素二聚體中存在的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽可以為蛋白酶裂解反應或化學裂解反應的產(chǎn)物,或可由重組DNA構建體表達,或可被合成。示例性的神經(jīng)胚素多肽包括,如,NBN140、NBN116及NBN113。本發(fā)明另外的神經(jīng)胚素多肽包括NBN112、NBN111、NBN110、NBN109、NBN108、NBN107、NBN106、NBN105、NBN104、NBN103、NBN102、NBN101、NBN100及NBN99(SEQ ID NO8-21)。
一種優(yōu)選的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽是偶聯(lián)與或三個10kDa PEG組分(″3×10kDa PEG NBN106-N95K″)或四個10kDa PEG組分NBN106-N95K(″4×10kDa PEG NBN106-N95K″)相偶聯(lián)的同源二聚體。同樣優(yōu)選的是偶聯(lián)于或三個10kDa PEG組分(″3×10kDa PEG NBN106-N95K″)或四個10kDa PEG組分的NBN106-N95K同源二聚體,本文中稱為“3(,4)×10kDa PEG NBN106-N95K”。同樣優(yōu)選的是3(,4)×10kDa PEGNBN106-N95K同源二聚體,其中兩個氨基末端共價連接于PEG組分,且第三和/或第四PEG組分共價連接于一或兩個取代的N95K殘基。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽基于SEQ ID NO1的共有序列。在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽除了包括SEQ IDNO1的氨基酸8-113,還包括SEQ ID NO1的氨基酸1-7。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽在二聚化時,其與GFRα3結合。在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽在二聚化時,其或單獨或在與GFRα3結合的情況下,刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽在二聚化時,其增強神經(jīng)元的存活,如增強感覺神經(jīng)元的存活。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽在二聚化時,其減輕或逆轉神經(jīng)元諸如感覺神經(jīng)元的病理改變。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽在二聚化時,其增強神經(jīng)元如自主神經(jīng)元或多巴胺能神經(jīng)元的存活。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽包括一種、兩種、三種、四種或更多種氨基酸取代,所述取代選自下組氨基酸的取代在聚合物偶聯(lián)的多肽氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸,在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中39位的、除精氨酸以外的氨基酸,在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中68位的、除精氨酸以外氨基酸,及在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中95位的、除天冬酰胺以外的氨基酸。在一些實施方案中,14、39、68及95位中的一種或更多位置的氨基酸是賴氨酸。優(yōu)選地,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸8-94及96-113與SEQ ID NO1的氨基酸8-94及96-113具有至少90%的同一性。更優(yōu)選地,所述氨基酸序列與其至少95%相同。最優(yōu)選地,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列包括在聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸8-94及96-113位的、天然存在的人、小鼠或大鼠神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列。例如,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸8-94及96-113可包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO4的氨基酸8-94及96-113位的氨基酸序列。在上述實施方案,95位氨基酸的優(yōu)選殘基是賴氨酸或半胱氨酸。
本發(fā)明包括一種構建體,其為含有聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素融合蛋白的異源二聚體或同源二聚體,如SEQ ID NO36的聚組氨酸(His)標記的神經(jīng)胚素,或神經(jīng)胚素融合蛋白,其中融合組分是免疫球蛋白(Ig)多肽,血清白蛋白多肽或復制酶來源的多肽。神經(jīng)胚素融合蛋白可增強體內(nèi)藥物動力學及生物利用率性質(zhì)。
本發(fā)明提供了用突變的多肽序列編碼成熟的或截短的神經(jīng)胚素多肽的核酸分子。該編碼給定的神經(jīng)胚素多肽的核酸分子優(yōu)選地在載體中如表達載體中給出。突變的神經(jīng)胚素核苷酸分子,或包括相同核苷酸分子的載體,可在細胞中提供。這種細胞可以是,如,哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞(“CHO細胞”)。
此外,本發(fā)明提供一種制備聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的方法,其通過在允許神經(jīng)胚素多肽表達的條件下,培養(yǎng)含有編碼神經(jīng)胚素多肽的核酸的細胞來進行。在一些實施方案中,神經(jīng)胚素偶聯(lián)于天然存在的組分。在具體的實施方案中,天然存在的組分是糖基組分。在一些實施方案中,糖基化的神經(jīng)胚素在如CHO細胞中表達。本發(fā)明進一步包括在細胞中表達的神經(jīng)胚素多肽。為本文本發(fā)明的融合蛋白(諸如神經(jīng)胚素血清白蛋白融合蛋白),公開了相似的核苷酸、載體、宿主細胞及多肽制備方法。
在一些實施方案中,在細胞中表達的神經(jīng)胚素多肽可回收并偶聯(lián)于聚合物。在一些實施方案中,該聚合物是聚亞烷基二醇組分。在具體的實施方案,聚合物是PEG組分。
具體來說,本發(fā)明給出一種組合物,其包括偶聯(lián)于非天然存在的聚合物的突變型神經(jīng)胚素多肽。該組合物中突變型神經(jīng)胚素多肽優(yōu)選地包括與SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列,條件是該聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽包括一種或更多種氨基酸取代,所述取代選自以下氨基酸的取代在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中39位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中68位的、除精氨酸以外的氨基酸,及在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中95位的、除天冬酰胺以外的氨基酸,其中氨基酸位置的編號與SEQ ID NO1的多肽序列一致。
本發(fā)明包括穩(wěn)定的、水溶性的偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽,或包含偶聯(lián)于PEG組分的神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的突變神經(jīng)胚素多肽復合體,其中神經(jīng)胚素多肽或突變神經(jīng)胚素多肽通過不穩(wěn)定鍵偶聯(lián)于PEG組分。在一些實施方案中,這種不穩(wěn)定鍵可通過生物化學的水解作用、蛋白水解作用或巰基裂解作用裂解。在一些實施方案中,這種不穩(wěn)定鍵在體內(nèi)條件下是可裂解的。
此外,本發(fā)明提供一種制備相對于野生型神經(jīng)胚素而言血清半衰期延長的修飾型神經(jīng)胚素多肽的方法。該方法包括提供一種神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽,并且使多肽或突變神經(jīng)胚素多肽偶聯(lián)于非天然存在的聚合物組分,從而形成偶聯(lián)的聚合物神經(jīng)胚素多肽組合物。
本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)的突變神經(jīng)胚素多肽包括一種或更多種氨基酸取代,例如,在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中39位中存在的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中68位存在的、除精氨酸以外的氨基酸,及在聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基酸序列中95位存在的、除天冬酰胺以外的氨基酸,其中氨基酸位置的編號與SEQ ID NO1多肽序列一致。
野生型及突變型神經(jīng)胚素多肽的合成及分離 神經(jīng)胚素多肽可用本領域已知的方法分離。天然存在的神經(jīng)胚素多肽可通過合適的純化方案、應用標準的蛋白純化技術從細胞或組織源分離得到。可選地,突變型神經(jīng)胚素多肽可用標準的肽合成技術通過化學方法合成。短氨基酸序列的合成在肽領域已確定。見,如,Stewart,等,Solid PhasePeptide Synthesis(2d ed.,1984).。
在一些實施方案中,突變型神經(jīng)胚素多肽通過重組DNA技術產(chǎn)生。例如,編碼突變型神經(jīng)胚素多肽的核酸分子可插入載體如表達載體中,且該核酸可被插入到細胞中。適合的細胞包括,如哺乳動物細胞(諸如人細胞或CHO細胞)、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞以及細菌細胞。當在重組細胞中表達時,該細胞優(yōu)選地培養(yǎng)在容許突變型神經(jīng)胚素多肽表達的條件下。如果需要,突變型神經(jīng)胚素多肽可從細胞懸液中回收。本文所用“回收”意思是從在回收過程前已存在于細胞或培養(yǎng)基的那些成分中取出突變的多肽。回收過程可包括一種或更多個再折疊或純化的步驟。
突變型神經(jīng)胚素多肽可用本領域已知的數(shù)種方法的任一種構建。一種這樣的方法就是定點誘變,其中在編碼的神經(jīng)胚素多肽中,為了改變單個的氨基酸(或,如果需要,小量預先確定的氨基酸殘基),具體的核苷酸被改變(或,如果需要,小量的特定的核苷)。本領域技術人員認為定點誘變是一種常規(guī)且廣泛使用的技術。事實上,許多定點誘變試劑盒可購得。ClontechLaboratories(Palo Alto,Calif.)出售的“轉移物定點誘變試劑盒(TransformerSite Directed Mutagenesis Kit)”就是一種這樣的試劑盒。
除非另行說明,本發(fā)明的實踐將應用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白化學及免疫學的常規(guī)技術,其在本領域技術人員技能范圍內(nèi)。這些技術在文獻中有描述。見,例如, Molecular CloningA Laboratory Manual,2nd edition.(Sambrook,F(xiàn)ritsch and Maniatis,eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989;DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glover,ed),1985;Oligonucleotide Synthesis,(M.J.Gait,ed.),1984;U.S.Patent No.4,683,195(Mulliset al.,);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Haines and S.J.Higgins,eds.),1984;Transcriptionand Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins,eds.),1984;Culture ofAnimal Cells(R.I.Freshney,ed).Alan R.Liss,Inc.,1987;Immobilized Cells and Enzymes,IRL Press,1986;APractical Guide to Molecular Cloning(13.Perbal),1984;Methods in Enzymology,Volumes154 and 155(Wu et al.,eds),Academic Press,New York;Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos,eds.),1987,Cold Spring Harbor Laboratory;Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.),Academic Press,London,1987;Handbook of Experiment Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.),1986;Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,1986. 神經(jīng)胚素多肽的聚合物偶聯(lián) 化學修飾的神經(jīng)胚素多肽可基于本發(fā)明公開內(nèi)容由本領域的技術人員制備。優(yōu)選偶聯(lián)于神經(jīng)胚素多肽的化學組分是水溶性的聚合物。水溶性的聚合物是有利的,因為其附著的蛋白在水環(huán)境如生理環(huán)境下不沉淀。優(yōu)選地,這種聚合物將在制藥學可用于制備治療性產(chǎn)品或組合物。
盡管也可附著多于一種聚合物分子,如果需要,可使單一的聚合物分子與神經(jīng)胚素多肽偶聯(lián)。本發(fā)明的偶聯(lián)的神經(jīng)胚素組合物可用于體內(nèi)及非體內(nèi)應用中。此外,經(jīng)驗證偶聯(lián)聚合物可利用任何其他的組、組分或其他偶聯(lián)的種類,并適于最終用途的應用。例如,將賦予聚合物UV抗性、抗氧化或其他性質(zhì)或特性的功能性組分共價結合到該聚合物上在一些應用中是有用的。作為進一步的實例,使聚合物功能化使得它具有反應性或可交聯(lián)性的特征來增強整個偶聯(lián)物質(zhì)的各種性質(zhì)或特征在一些應用中是有用的。因此,聚合物可含有不防礙偶聯(lián)的神經(jīng)胚素組合物用于其意圖目的的效力的任何功能(functionality)、重復基團(repeating group)、連接或其他構成性結構。
本領域技術人員將能夠基于對聚合物/蛋白偶聯(lián)物是否有治療用途的考慮及如果有治療用途,所需劑量、循環(huán)時間、抵抗蛋白水解的能力及其他考慮而選出所需聚合物。衍生化的效能可通過以所需的形式給予衍生物(如,通過滲透泵,或更優(yōu)選地,通過注射或輸入,或進一步配制為經(jīng)口服、肺部吸入或其他遞送途徑)并測定其有效性來確定。
適宜的水溶性聚合物包括,但不限于,PEG、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊烷、聚1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(或同源聚合物或隨機共聚物),及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)PEG、原丙二醇同源聚合物(propropylene glucol homopolymer)、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧化的多元醇(polyoxyethylated polyol)(如,丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。
該聚合物可以為任何適宜的分子量,可以是分支的或未分支的。
對于PEG,適宜的平均分子量在2KDa及100KDa間。這點為處理和制造提供了方便。本領域的那些技術人員將意識到在PEG制備中,一些分子的分子量可重于所述的分子量,一些分子的分子量則可輕于所述的分子量。因此,分子量通常規(guī)定為“平均分子量”??筛鶕?jù)所需治療譜(如,所需的持續(xù)釋放時間;對生物活性的影響(如果有的話);處理的便利性;抗原性程度或缺乏以及PEG對治療蛋白的其他已知影響)來利用其它分子量(大小)。在不同的實施方案中,分子量大約為2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa或100kDa。在一些優(yōu)選的實施方案中,每條PEG鏈的平均分子量大約為20KDa。在一些優(yōu)選的實施方案中,平均分子量大約為10KDa。
這樣附著的聚合物分子的數(shù)目可改變,本領域的技術人員能夠確定其對功能的影響。可進行單衍生化(mono-derivatize),或二-、三-、四-衍生衍生化,或組合的衍生化,所述衍生化利用相同或不同的化學組分(如,聚合物,諸如不同分子量的PEG)。聚合物分子與蛋白(或多肽)分子的比例如它們反應混合物中的濃度那樣可改變。一般地,最適宜的比例(就其中沒有過多未反應的蛋白或聚合物的反應的功效來說)可由諸如所需的衍生化程度(如,單,二-,三-等等)、所選聚合物的分子量、聚合物是否分支及反應條件等因子來決定。
考慮到對蛋白功能性或抗原性區(qū)域的影響,PEG分子(或其他化學組分)應當附著于蛋白。許多附著的方法可為本領域技術人員所用。如見EP 0401384(PEG與G-CSF偶聯(lián));Malik等,Exp.Hematol.201028-1035,1992(報道了用tresyl chloride的GM-CSF的PEG化)。
例如,PEG可通過氨基酸殘基經(jīng)由反應性基團諸如游離氨基或羧基而共價結合(PEG化)。具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基及氨基末端氨基酸殘基。具有游離羧基的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基及C末端氨基酸殘基。巰基也可用作反應基團用于附著PEG分子。對于治療目的,可附著在氨基基團,如,N末端或賴氨酸基團。技術人員可具體地期望氨基末端化學修飾的蛋白。
用PEG作為該組合物的例證,技術人員可從多種PEG分子(依據(jù)分子量、分支等)中選擇反應混合物中PEG分子與蛋白(或多肽)的比例、所實施的PEG化反應的類型,以及獲得所選氨基末端PEG化的蛋白的方法。獲得氨基末端PEG化制備物(即如果需要從其他單PEG化組分中分離這種組分)的方法可通過從一群PEG化的蛋白分子中純化氨基末端PEG化的物質(zhì)來進行。選擇性的氨基末端化學修飾可通過還原性烷基化作用來實現(xiàn),所述還原性烷基化作用利用可用于具體蛋白中的衍生化的不同類型的伯氨基團(賴氨酸對氨基末端)的差異反應性。在適宜的反應條件下,利用含有羧基基團的聚合物,在氨基末端對蛋白基本上選擇性的衍生化可實現(xiàn)。例如,通過在容許利用賴氨酸殘基的ε氨基基團與該蛋白氨基末端殘基的α氨基基團之間的PKa差異的PH值下進行該反應,技術人員可選擇性地PEG化該蛋白的氨基末端。通過這樣一種選擇性的衍生化,水溶性聚合物對蛋白的附著是受控的與聚合物的偶聯(lián)主要發(fā)生在該蛋白的氨基末端,并且其他反應性基團諸如賴氨酸側鏈的氨基基團沒有顯著的修飾發(fā)生。
利用還原性烷基化作用,水溶性的聚合物可以為上述類型,且應具有單一反應性醛以偶聯(lián)蛋白??衫肞EG丙醛,其含有單一反應性醛。
本發(fā)明包括表達于原核生物或真核生物中或利用合成法制備的突變型神經(jīng)胚素多肽。在一些實施方案中,神經(jīng)胚素是糖基化的。在一些具體的實施方案,神經(jīng)胚素二聚體在每一氨基末端處與聚合物偶聯(lián)且在每一內(nèi)部Asn95殘基處糖基化。在其他的實施方案中,突變型神經(jīng)胚素二聚體在每一氨基末端處與聚合物偶聯(lián)且在一或所有兩個內(nèi)部Lys95殘基處與聚合物偶聯(lián)。
PEG化可通過任何適宜的PEG化反應來實現(xiàn)。各種PEG化化學為本領域所知。見,如Focus on Growth Factors,3(2)4-10,1992;EP 0 154 316;EP0 401 384;及在此引用的有關PEG化的其他出版物。PEG化可經(jīng)由與反應性PEG分子(或反應性水溶性聚合物的類似物)的酰基化反應或烷基化反應來實現(xiàn)。
通過?;腜EG化一般包含活性PEG酯衍生物的反應。任何已知的或隨后發(fā)現(xiàn)的反應性PEG分子可用來實現(xiàn)PEG化。一種優(yōu)選的活化的PEG酯是酯化為N-羥基琥珀琥珀酰亞胺(NHS)的PEG。本文所用“?;睙o限地包括在治療性蛋白及水溶性聚合物諸如PEG間的下述類型的連接酰胺、氨基甲酸酯(carbamate)、氨甲酸乙酯(urethane)等等。見Bioconjugate Chem.5133-140,1994。反應條件可從PEG化領域那些已知的任意條件或那些后繼發(fā)展起來的條件中選出,但應當避免使要修飾的神經(jīng)胚素蛋白或多肽失活的條件諸如溫度、溶解性及PH值。
通過?;腜EG化將通常產(chǎn)生多PEG化的神經(jīng)胚素蛋白產(chǎn)物。優(yōu)選地,連接鍵可以是酰胺。同樣優(yōu)選地,所得的產(chǎn)物將基本上只是(例如>95%)單、二-或三-PEG化。然而具有更高程度的PEG化的一些種類可依所用具體反應條件而大量形成。如果需要,更多純化的PEG化的種類可從混合物中分離出來,具體是未反應的種類,所述分離可通過標準的純化技術包括透析、鹽析、超濾、離子交換層析法、凝膠過濾層析法及電泳等技術來進行。
通過烷基化的PEG化一般地涉及在還原劑存在的條件下,PEG末端醛基衍生物與神經(jīng)胚素的反應。通過烷基化的PEG化也可以產(chǎn)生多PEG化的神經(jīng)胚素蛋白產(chǎn)物。另外,技術人員可以將反應條件控制基本在上僅有利于在神經(jīng)胚素氨基末端的α氨基基團的(即,PEG化的單-PEG化的蛋白)。在單-的PEG化或多-PEG化的任一種情況下,PEG基團優(yōu)選地通過-CH2-NH-基團附著于該蛋白。具體地對于-CH2-基團,這種類型的鍵在本文稱為“烷基”連接。
經(jīng)由可產(chǎn)生單-PEG化產(chǎn)物的還原性烷基化作用的衍生化,利用可用于衍生化的不同類型的伯氨基基團(賴氨酸,相對氨基末端)的差異反應性。該反應在這樣一種pH進行,所述pH容許利用賴氨酸殘基的ε氨基基團與該蛋白氨基末端殘基的α氨基基團間PKa的差異。通過這種選擇性衍生化,含有反應基團諸如一種醛的水溶性的聚合物與蛋白的連接是受控的與聚合物的偶聯(lián)主要發(fā)生在該蛋白的氨基末端,并且其他反應基團諸如賴氨酸側鏈氨基基團,沒有出現(xiàn)明顯的修飾發(fā)生。
?;巴榛椒▋烧叨加玫降木酆衔锓肿涌蓮纳鲜鏊苄缘木酆衔镏羞x出。選出的聚合物優(yōu)選應被修飾成具有單一反應基團,諸如用于?;幕钚怎セ蛴糜谕榛娜沟镁酆铣潭瓤扇绫景l(fā)明該方法中提供的那樣受控。一種示例性的反應性PEG醛是PEG丙醛,其為在水中穩(wěn)定的、或其單-C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(見美國專利5,252,714)。聚合物可以是分支的或不分支的。對于?;磻x的聚合物應當具有單個反應性酯基團。對于本發(fā)明還原性的烷基化作用,所選的聚合物應當具有單個的反應性醛基團。通常,水溶性的聚合物不從天然存在的糖基殘基中選出,由于這些聚合物通??煞奖愕赜刹溉閯游镏亟M表達系統(tǒng)制備。該聚合物可以為任意分子量、可為分支的或未分支的。
本文所用的常見的水溶性聚合物是PEG。本文所用,聚乙二醇包括任何用于衍生其他蛋白的PEG形式,包括但不限于,如,單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-PEG。
一般地,化學衍生化可在任何適于使生物活性物質(zhì)與活化的聚合物分子反應的條件下實施。制備PEG化的神經(jīng)胚素的方法通常包括以下步驟,(a)在適宜條件下使神經(jīng)胚素蛋白或多肽與PEG(諸如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應,由此該分子結合一種或多個PEG基團,及(b)獲得反應產(chǎn)物。一般地,?;磻淖罴逊磻獥l件將逐例基于已知參數(shù)和所需結果來確定。例如,較大的PEG與蛋白的比率,較大的多PEG化產(chǎn)物百分比。
為制備大量的均質(zhì)單-聚合物/神經(jīng)胚素群,還原性烷基化作用通常包括兩個步驟,(a)在還原性烷基化的條件下,在適于pen-nit選擇性修飾神經(jīng)胚素氨基末端的α氨基基團的PH值條件下,使神經(jīng)胚素蛋白或多肽與反應性的PEG分子反應;及(b)獲得反應產(chǎn)物。
對于基本均質(zhì)的單一聚合物/神經(jīng)胚素群,還原性烷基化反應條件是允許水溶性的聚合物組分選擇性附著于神經(jīng)胚素的氨基末端的條件。這種反應條件一般提供賴氨酸氨基基團與氨基末端α氨基基團之間的pKa差異(pKa是只有50%氨基基團被質(zhì)子化而50%的氨基基團沒有被質(zhì)子化的PH)。PH也影響所用到的聚合物與蛋白的比率。一般地,如果PH值較低,將需要相對于蛋白而言大大過量聚合物(即,氨基末端α氨基基團的反應性越低,獲得適宜的條件需要的聚合物越多)。如果PH值更高,聚合物蛋白的比率不必要同樣大(即,更多的反應簇可用時,需要更少的聚合物分子)。為本發(fā)明的目的,PH值通常在3-9之間,優(yōu)選的3-6。
另一重要的考慮是聚合物的分子量。一般地,聚合物的分子量越高,附著于蛋白的聚合物分子越少。相似地,當使這些參數(shù)最優(yōu)化時,應當考慮聚合物的分支。一般地,分子量越高(或分支越多),聚合物蛋白的比率越高。通常,對于本文包括的PEG化反應,優(yōu)選的平均分子量是約2kDa到約100kDa。優(yōu)選的平均分子量是約5kDa到約50kDa,具體優(yōu)選地約10kDa到約20kDa.。優(yōu)選的總分子量是約10kDa到約40kDa。
在一些實施方案中,神經(jīng)胚素多肽通過多肽上的末端反應基團連接于聚合物??蛇x地或另外,神經(jīng)胚素多肽可通過內(nèi)部賴氨酸殘基的側鏈氨基基團連接,所述內(nèi)部賴氨酸殘基如引入到天然存在的神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的賴氨酸殘基,因此,偶聯(lián)(conjugation)也可從非末端反應性基團中分支。具有反應基團的聚合物本文命名為“活化的聚合物”。反應基團選擇性地與蛋白上的反應基團如游離氨基反應。
附著可以發(fā)生在活化的聚合物中任何可用的神經(jīng)胚素氨基基團,諸如賴氨酸殘基的α氨基基團或ε氨基基團或引入到神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的殘基。神經(jīng)胚素的游離羧基基團、適宜地活化的羰基基團、羥基、胍基、咪唑、氧化的碳水化合物部分及疏基基團(如果可利用的話)也可用作附著位點。
通常利用約1.0摩爾到10摩爾活化的聚合物每摩爾蛋白,這依據(jù)蛋白的濃度而不同。最終量是在使反應程度最大化而使產(chǎn)物非特異修飾最小化之間的平衡,并且同時限定維持最適活性的化學,而且如果可能同時最優(yōu)化該蛋白的半衰期。優(yōu)選地,該蛋白至少大約50%的生物活性被保留,最優(yōu)選地,近100%的生物活性被保留。
聚合物可用本領域已知的方法偶聯(lián)于神經(jīng)胚素多肽。例如,在一個實施方案,聚亞烷基二醇組分偶聯(lián)于突變型神經(jīng)胚素多肽的賴氨酸基團。賴氨酸基團的連接可用N-羥基琥珀琥珀酰亞胺(NHS)活性酯諸如PEG琥珀琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽(SS-PEG)及琥珀琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)。適宜的聚亞烷基二醇組分包括,如,羧甲基NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、乙醛(aldehyde)、環(huán)氧化物、羰基咪唑及PNP碳酸鹽。
其它氨基反應性PEG連接物可代替琥珀琥珀酰亞胺組分。這些包括,如,異硫氰酸酯(isothiocyanate)、硝基苯基碳酸酯(nitrophenylcarbonate)、環(huán)氧化物、苯并三唑(benzotriazole)。優(yōu)選選擇的條件使反應的選擇性和程度最大化。
如果需要,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽可含有標記,如可以隨后經(jīng)蛋白水解而釋放的一種標記。因此,賴氨酸組分可通過以下方法選擇性地被修飾首先使His-標記與低分子量連接物諸如Traut′s試劑(Pierce)等反應對其進行修飾(first reacting a His-tag modified with a low molecular wight linkersuch as Traut’s reagent(Pierce)),所述試劑與賴氨酸和氨基末端兩者都反應,然后釋放his標記。所述多肽將含有游離SH基團,其被含有硫醇(thiol)反應性頭部基團(諸如馬來酰亞胺(maleimide)基團、乙烯砜(vinylsulfone)基團、鹵代乙酸酯(haloacetate)或游離或被保護的SH的PEG選擇性地修飾。
Traut′s試劑可被任何可建立PEG附著特異性位點的連接物取代。例如,Traut′s試劑可被SPDP、SMPT、SATA或SATP(都可從Pierce購買)取代。相似地,技術人員可使蛋白與胺反應性連接物反應,其可插入馬來酰亞胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、鹵代乙酸酯基團(SBAP、SIA、SIAB)或乙烯砜基團,使產(chǎn)生的產(chǎn)物與含有游離SH的PEG反應。使用的連接物的大小的唯一限制是它不能阻止氨基末端標簽隨后的移除。
因此,在其他實施方案中,聚亞烷基二醇組分偶聯(lián)于突變型神經(jīng)胚素多肽的半胱氨酸基團。偶聯(lián)可用馬來酰亞胺基團、乙烯砜基團、鹵代乙酸酯基團以及硫醇基團來實現(xiàn)。
在優(yōu)選的實施方案中,所述組合物中的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽與缺乏聚合物的神經(jīng)胚素多肽相比具有更長的半衰期。另外,或此外,組合物中的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體可結合GFRα,活化RET,使神經(jīng)元病理改變正?;?,增強神經(jīng)元的存活,或改善神經(jīng)性疼痛,或執(zhí)行這些生理功能的組合。測定多肽是否增強神經(jīng)元的存活、是否使神經(jīng)元病理改變正?;膶嶒炘谌鏦O00/01815描述。優(yōu)選地,所述神經(jīng)元是感覺神經(jīng)元,自主神經(jīng)元或多巴胺能神經(jīng)元。
在優(yōu)選的實施方案中,所述組合物被提供為一種穩(wěn)定的、水溶性的、偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽復合體,其包括偶聯(lián)于PEG組分的神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽。如果需要,神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽可通過不穩(wěn)定鍵偶聯(lián)于PEG組分。該不穩(wěn)定鍵可被裂解,如在生化水解、蛋白水解或疏基裂解中。例如,在體內(nèi)(生理)條件下,該鍵可以被裂解。
其他反應參數(shù),諸如溶劑(solvent)、反應時間、溫度等,及產(chǎn)物純化的手段可逐例基于有關利用水溶性的聚合物的蛋白衍生化的公開信息來確定。
如果需要,可用單個聚合物分子與每個神經(jīng)胚素多肽偶聯(lián)??蛇x地,可以附著一種或一種以上聚合物分子。本發(fā)明的偶聯(lián)的神經(jīng)胚素組合物可用于體內(nèi)及非體內(nèi)應用中。此外,認識到偶聯(lián)型聚合物(conjugating polymer)可利用任何其他基團、組分或其他偶聯(lián)的種類,條件是其適于最終的應用。例如,將賦予聚合物UV抗性、抗氧化或其他性質(zhì)或特性的功能性組分共價結合到該聚合物上在一些應用中是有用的。作為進一步的實例,使聚合物功能化使得它具有反應性或可交聯(lián)性的特征來增強整個偶聯(lián)物質(zhì)的各種性質(zhì)或特點在一些應用中是有用的。因此,聚合物可含有不防礙偶聯(lián)的神經(jīng)胚素組合物用于其意圖目的的效力的任何功能、重復基團、連接或其他構成性結構。
可用于獲得這些所需特性的示例性聚合物在下面的示例性反應方案中描述。在共價結合的肽的應用中,聚合物可被功能化,然后偶聯(lián)于這些肽的游離氨基酸以形成不穩(wěn)定鍵。
該反應可通過任一適宜的方法進行,所述方法用于使生物活性物質(zhì)與惰性聚合物反應,如果反應基團在氨基末端的α氨基基團上,優(yōu)選地在pH5-8,如pH 5、6、7或8。一般地,這個過程涉及制備活化的聚合物,及其后使蛋白與活化的聚合物反應以產(chǎn)生適于配制的可溶性蛋白。上述修飾反應可通過數(shù)種方法實行,所述方法包括一或多步。
線型或分支型PEG以及其他的烷基化形式可用。PEG的長度可變化。大多數(shù)常見形式大小為2K-100kDa。雖然本實施例報告在氨基末端的靶向的PEG化不影響藥物動力學性質(zhì),該物質(zhì)保留了生理功能的事實提示本文公開的位點的修飾無害(not deleterious)。因而,在產(chǎn)生通過插入賴氨酸殘基提供額外的附著位點的神經(jīng)胚素突變型的過程中,這些形式在賴氨酸及氨基末端都被PEG化的可能結果包含于本發(fā)明范圍內(nèi)。
神經(jīng)胚素多肽的一種或多種位點可偶聯(lián)于聚合物。例如,一、二、三、四或五個PEG組分可附著于該多肽。在一些實施方案中,PEG組分附著于神經(jīng)胚素多肽的氨基末端及/或氨基酸14、39、68及95,其中氨基酸編號如表1及SEQ ID NO1所示。
在有利的實施方案,組合物中聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽相對于無聚合物時神經(jīng)胚素多肽野生型或突變型多肽而言具有更長的半衰期。另外,或此外,組合物中聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽結合GFRα,活化RET,使神經(jīng)元病理改變正?;?,增強神經(jīng)元的存活,改善神經(jīng)性疼痛,或執(zhí)行這些生理功能的組合。
在一些實施方案中,復合體中的突變型神經(jīng)胚素多肽或聚合物偶聯(lián)物具有選自下組的一種生理活性GFRα3結合,RET活化,神經(jīng)元病理改變正常化,增強神經(jīng)元的存活,改善神經(jīng)性疼痛。
本發(fā)明也提供了包括聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的多聚體多肽。多聚體多肽優(yōu)選作為純化的多聚體多肽被提供。多聚體復合體的實施例包括,如二聚體復合體。多聚體復合體可作為異基因或同基因復合體提供。因此,多聚體復合體可以是包括一種突變型神經(jīng)胚素多肽及一種非突變型神經(jīng)胚素多肽的異二聚體聚合物偶聯(lián)的多肽復合體,或包括兩種或更多種突變型神經(jīng)胚素多肽的異二聚體聚合物偶聯(lián)的多肽復合體。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽可結合GFRα3。優(yōu)選地,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽的結合刺激RET多肽的磷酸化。為測定多肽是否結合GFRα3,可如WO 00/01815所述進行測定。例如,CHO細胞系培養(yǎng)基上清中神經(jīng)胚素的存在可用Sanicola等.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,946238)所述的三重(ternary)復合體測定法的修飾形式描述。在這種測定法中,可評估GDNF樣分子介導RET細胞外結構域與各種共同受體GFRα1、GFRα2及GFRα3之間的結合的能力。RET的可溶形式及共同受體作為融合蛋白產(chǎn)生。大鼠RET的細胞外結構域與胎盤堿性磷酸酶(RET-AP)的融合蛋白以及大鼠GFRα-1的細胞外結構域(在公開的申請WO9744356;Nov.27,1997中公開)與人IgG1的Fc結構域(rGFR(αl-Ig)的融合蛋白已經(jīng)被描述(在Sanicola等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,946238中)。
本發(fā)明的聚合物優(yōu)選地是聚亞烷基二醇組分,并且更優(yōu)選地是PEG組分。在一些實施方案中,多聚體組分的平均分子量在約100Da到約25,000Da;約1000Da到約20,000Da;或約5000Da到約20,000Da。在一些實施方案中,至少一種多聚體組分具有約5000Da的平均分子量;約10,000Da;的平均分子量或約20,000Da.的平均分子量。
聚亞烷基二醇組分的功能基團可以是,如羧甲基NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、乙醛、環(huán)氧化物、羰基咪唑或PNP碳酸酯。通過N-羥基琥珀琥珀酰亞胺(NHS)活性酯發(fā)生偶聯(lián)。這種活性酯可以是,如PEG琥珀琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS-PEG)、琥珀琥珀酰亞胺基丁酸酯(SPB-PEG)及琥珀琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)。在一些實施方案中,聚亞烷基二醇組分偶聯(lián)于神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的半胱氨酸基團。例如,經(jīng)由馬來酰亞胺基團、乙烯砜基團、鹵代乙酸酯及硫醇發(fā)生偶聯(lián)。在各種實施方案中,所述神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽包括一、二、三或四個PEG組分。
在一些實施方案中,所述聚合物在神經(jīng)胚素的N末端位點偶聯(lián)于多肽。在一些實施方案中,所述聚合物在神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的非末端氨基酸位點偶聯(lián)于多肽。在一些實施方案中,所述聚合物偶聯(lián)于神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的溶劑暴露的氨基酸。
在一些實施方案中,所述聚合物在以下位置偶聯(lián)于神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽聚合物偶聯(lián)的多肽的氨基末端氨基酸、神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的位置14、神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的位置39、神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的位置68、神經(jīng)胚素多肽或突變型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸序列中的位置95。
聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素融合蛋白 如果需要,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽可以作為融合蛋白被提供。本發(fā)明的蛋白的融合多肽衍生物也包括各種保留生物活性的一級蛋白的各種結構形式。
聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素-血清白蛋白融合物可用本領域已知的方法構建。許多含有相應的氨基酸反應性基團與硫醇反應基團的交聯(lián)體中的任何一種可用于連接神經(jīng)胚素與血清白蛋白。適宜的連接物的實例包括插入硫醇反應性馬來酰亞胺的胺反應性交聯(lián)劑。這些包括,如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS。其他適宜的連接物插入硫醇反應性-鹵代乙酸酯基團。這些包括,如SBAP、SIA、SIAB,那些提供保護的或非保護的硫醇用于與巰基基團反應產(chǎn)生可還原鍵的是SPDP、SMPT、SATA或SATP,所有的這些物質(zhì)都可購得(例如PierceChemicals)。本領域技術人員可同樣預見可連接神經(jīng)胚素氨基末端與血清白蛋白的可選方案。
也可預見本領域技術人員能產(chǎn)生與血清白蛋白的偶聯(lián)物,所述血清白蛋白非靶向于神經(jīng)胚素氨基末端或血清白蛋白上的硫醇組分。如果需要,神經(jīng)胚素-血清白蛋白融合物可用基因工程技術產(chǎn)生,其中,神經(jīng)胚素在氨基末端和/或羧基末端與血清白蛋白基因融合。
任何造成產(chǎn)物半衰期延長的神經(jīng)胚素偶聯(lián)物,例如,在體內(nèi)或具體地,在動物(包括人)中可用相似的方案產(chǎn)生。造成產(chǎn)物的體內(nèi)半衰期延長的神經(jīng)胚素偶聯(lián)物的另一個實例是融合伴侶是Ig的神經(jīng)胚素融合蛋白。
聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素的其他衍生物包括突變的神經(jīng)胚素或其片段與其它蛋白或多肽的共價或聚合偶聯(lián)物,諸如通過作為額外的氨基末端或羧基末端在重組培養(yǎng)物中合成。例如,偶聯(lián)的多肽可以是蛋白的氨基末端區(qū)域的信號(或前導)多肽序列,該蛋白以共翻譯或翻譯后方式指導該蛋白從合成位點轉移到細胞膜或細胞壁內(nèi)外的功能位點(如,酵母α因子前導鏈)。神經(jīng)胚素受體蛋白可包括被加入以便于神經(jīng)胚素純化或鑒別的多肽(組氨酸/神經(jīng)胚素融合物)。神經(jīng)胚素的氨基酸序列也能連于肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO22)(Hopp等,Biotechnology 61204(1988))。后者的序列具有高度的抗原性,并提供可逆地與特異性單克隆抗體結合的表位,能使所表達的重組蛋白得以快速測定并便于純化。
這種序列也可被牛粘膜腸激酶在直接跟于Asp-Lys對后的殘基處特異性斷裂。
生物活性多肽 本發(fā)明的多肽可以任何生物活性的形式提供,包括前原蛋白、原蛋白、成熟蛋白、或糖基化的蛋白、非糖基化的蛋白、磷酸化的蛋白、非磷酸化的蛋白的形式、截短的形式或任何其他翻譯后修飾的蛋白。生物活性神經(jīng)胚素多肽包括一種多肽,例如,當該多肽二聚化時,其單獨或有輔因子(諸如GFRα3或RET)存在的條件下可結合RET誘導RET的二聚化及RET的自身磷酸化。
本發(fā)明的多肽具體地可以為N-糖基化多肽,該多肽優(yōu)選地在序列表中指定的N-殘基處糖基化。
在一些實施方案中,本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO6給出的氨基酸序列,并在122位有糖基化的天冬酰胺殘基;或SEQ ID NO14給出的氨基酸序列,并在95位具有糖基化的天冬酰胺殘基,或當通過如ClustalW計算機軟件比對時任何突變型神經(jīng)胚素多肽中的相似位點。
在一些實施方案中,本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO23給出的氨基酸序列,本文稱為NBN113-N95K,其含有取代SEQ ID NO2的95位天冬酰胺殘基的賴氨酸殘基;或SEQ ID NO24給出的氨基酸序列,本文稱為NBN106-N95K;或當通過如ClustalW計算機軟件比對時任何突變型神經(jīng)胚素多肽中的相似位點。
本發(fā)明也包括突變的神經(jīng)胚素融合蛋白,諸如在美國專利5,434,131中所述的Ig-融合物,或血清白蛋白融合物。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO1所示的氨基酸序列,或與SEQ ID NO1給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在其他實施方案,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQ IDNO2的氨基酸序列,或與SEQ ID NO2給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO3的氨基酸序列,或與SEQ ID NO3給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO4的氨基酸序列,或與SEQ ID NO4給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO5的氨基酸序列,或與SEQ ID NO5給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO6的氨基酸序列,或與SEQ ID NO6給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代SEQ IDNO7的氨基酸序列,或與SEQ ID NO7給出的序列有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO8-21中任一種的氨基酸序列,或與SEQ ID NO8-21中任一種的序列具有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQID NO36氨基酸序列,或與SEQ ID NO36給出的序列具有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在進一步的實施方案,本發(fā)明提供一種多肽,其具有包含一處取代的SEQ ID NO1-21及36中任一種的氨基酸序列,或與SEQ ID NO1-21及36給出的序列具有至少大約85%、優(yōu)選地至少大約90%、更優(yōu)選地至少大約95%、更優(yōu)選地至少大約98%及最優(yōu)選地至少大約99%的同一性的氨基酸序列。
在其他實施方案中,本發(fā)明的突變多肽具有GDNF亞家族指紋結構(fingerprint),如,表3及4所示的保守的半胱氨酸殘基。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種突變的多肽,其由在高度嚴格的條件下能與編碼SEQ ID NO1多肽的多核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列雜交的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中,本發(fā)明的突變多肽由與編碼SEQ ID NO1.的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列編碼。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供新異的多肽,其由在高度嚴格的條件下能與編碼SEQ ID NO2多肽的多核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列雜交的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中,本發(fā)明的突變多肽由與編碼SEQ ID NO2.的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列編碼。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供突變的多肽,其由在高度嚴格的條件下能與編碼SEQ ID NO8-21之一的多肽的多核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列雜交的多核苷酸序列編碼。在其他實施方案,本發(fā)明的突變多肽由與編碼SEQ ID NO8-21之一的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列編碼。
在一些實施方案中,本發(fā)明提供新異的多肽,其由在高度嚴格的條件下能與編碼SEQ ID NO36多肽的多核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列雜交的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中,本發(fā)明的突變多肽由與編碼SEQ ID NO36的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的一種多核苷酸序列編碼。
生物學起源 非偶聯(lián)神經(jīng)胚素多肽二聚體可以被分離出來,再被偶聯(lián)于一種或更多種聚合物,以獲得本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體。神經(jīng)胚素多肽二聚體可從哺乳動物細胞中分離出,優(yōu)選地從人細胞或從鼠源的細胞或從中國倉鼠卵巢來源的細胞分離。
神經(jīng)營養(yǎng)活性 本發(fā)明的修飾的神經(jīng)胚素多肽,包括截短的神經(jīng)胚素多肽,可用于神經(jīng)細胞或神經(jīng)元細胞的適度的代謝、生長、分化或存活。具體地,修飾的神經(jīng)胚素多肽可用于治療或緩解有生命的動物如人類的疾病,所述疾病對神經(jīng)營養(yǎng)試劑的活性有反應。這些治療與方法如下詳述。
包括神經(jīng)胚素-聚合物偶聯(lián)物的制藥組分 本發(fā)明也提供包括本發(fā)明的修飾的神經(jīng)胚素多肽二聚體的藥物組分。
本發(fā)明的聚合物-神經(jīng)胚素偶聯(lián)物可以以本來的形式給藥,也可以以可藥用的酯類、鹽類及其其它生理功能衍生物的形式給藥。在這些藥物配方及藥劑配方中,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素偶聯(lián)物優(yōu)選地與一種或多種可藥用的載體及任選的任何其它治療成分一起利用。
載體從與配方中其它成分相容及對其受體不適當?shù)赜泻Φ囊饬x上講必須是可藥用的。聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素以有效獲得本文描述的所需藥物效應或醫(yī)學有利的效應的量,以及以適于獲得所需生物可用體內(nèi)劑量或濃度的量提供。
這些配方包括那些不僅適于胃腸外給藥也適于非胃腸外給藥以及具體的給藥方式的配方,所述給藥方式包括經(jīng)口服、經(jīng)直腸、經(jīng)頰、局部、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、經(jīng)皮下、經(jīng)肌肉內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)鞘內(nèi)、經(jīng)關節(jié)內(nèi)、經(jīng)動脈內(nèi)、經(jīng)蛛網(wǎng)膜下、經(jīng)支氣管、經(jīng)淋巴、經(jīng)陰道、經(jīng)子宮內(nèi)給藥。適于氣溶劑及局部及系統(tǒng)胃腸外給藥的配方是優(yōu)選的。
當聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素用于包括水溶液的配方中時,這種配方可方便地通過口服、經(jīng)氣管或經(jīng)胃腸外給藥。當聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素在應用于液體混懸液配方中或以粉末形式用于生物相容的載體配方時,這種配方可方便地通過口服、經(jīng)直腸或經(jīng)氣管給藥??蛇x地,它可經(jīng)鼻或經(jīng)氣管給藥,其經(jīng)由載氣中粉末的霧化,形成粉末的氣體分散相,病人從包括合適的噴霧器裝置的呼吸回路中吸入所述粉末。
包括本發(fā)明蛋白的配方可方便的以單位劑量的形式給出,以及可通過藥劑學領域熟知的任何方法制備。這些方法通常包括將活性成分與構成一種或更多種輔助成分的載體結合這一步。
通常,這些配方通過均勻地密切地將活性成分與液相載體聯(lián)合和/或與精確分開的固相載體聯(lián)合,然后如果需要,將產(chǎn)物加工成所需配方的劑量形式制備而得。
本發(fā)明適于口服給藥的配方可以以離散的單位給出,諸如膠囊、扁囊劑、片劑或錠劑,每一種包括預定量的粉末或顆粒形式活性成分;或以在水溶液或非水溶液諸如漿劑、酏劑、乳劑及飲劑(draught)中的混懸液形式給出。
適于胃腸外給藥的配方方便地包括活性偶聯(lián)物的無菌含水制備物,其優(yōu)選地與受者的血液等滲(如,生理鹽水溶液)。這些配方可包括被設計使得所述化合物針對血液成分或一種或多種器官的混懸劑、增稠劑、或其它微顆粒系統(tǒng)。這些配方可以單位劑量或多劑量形式給出。
鼻噴霧配方包括與防腐劑及等滲劑偶聯(lián)的活性偶聯(lián)物的純化的水溶液。這些配方優(yōu)選地被調(diào)節(jié)為與鼻腔粘膜相容的PH值與等滲狀態(tài)。
直腸給藥配方可與合適的載體諸如可可脂、氫化脂肪或氫化脂肪酸一起以栓劑的形式給出。眼部配方諸如滴眼劑可通過與鼻噴霧相似的方法制備,除了PH值與等滲因素優(yōu)選地被調(diào)適到與眼部相配。
局部配方包括溶解或懸浮于一種或更多種介質(zhì)中的本發(fā)明的偶聯(lián)物,諸如礦物油、石油、多羥基乙醇或用于局部藥物配方的其它基質(zhì)。
除了前述的成分外,本發(fā)明的配方可進一步包括從稀釋劑、緩沖液、調(diào)味劑、崩解劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等等中選出的一種或多種輔助成分。上述考慮也適用于本發(fā)明的神經(jīng)胚素融合蛋白(如,神經(jīng)胚素-人血清白蛋白融合蛋白)。
相應地,本發(fā)明包括提供適宜的融合蛋白,用于體外穩(wěn)定溶液中的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素偶聯(lián)物,其可作為本發(fā)明優(yōu)選的例證應用。融合蛋白可用于例如增強聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽對酶降解的抵抗力,以及提供改善保質(zhì)期、室溫穩(wěn)定性等等的方法。應當明白上述考慮也適用于本發(fā)明的神經(jīng)胚素-血清白蛋白融合蛋白(如,人神經(jīng)胚素-人血清白蛋白融合蛋白)。
治療方法 本發(fā)明的組合物可用于治療或緩解哺乳動物靈長類包括人類中的疾病,例如,所述疾病對神經(jīng)營養(yǎng)劑的活性敏感。
本發(fā)明的組合物可經(jīng)注射、種植或攝入的藥物組合物直接用于治療對神經(jīng)胚素多肽有反應的病理過程。這些組合物可用于緩解活動物體包括人中的疾病,所述疾病對神經(jīng)營養(yǎng)劑的活性有反應。該疾病可具體是由創(chuàng)傷、外科手術、局部缺血、感染、代謝疾病、營養(yǎng)缺陷、惡性腫瘤或有毒試劑以及遺傳或特發(fā)性過程造成的神經(jīng)系統(tǒng)的破壞。
這種破壞可具體地發(fā)生于感覺神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,包括背根神經(jīng)節(jié)或任何下述組織中的神經(jīng)元膝狀神經(jīng)節(jié)(geniculate)、巖神經(jīng)節(jié)和結狀神經(jīng)節(jié)(petrosal and nodosalganglia);第八腦神經(jīng)的前庭聽覺復合物(thevestibuloacoustic complex of the eigthth cranial nerve)、三叉神經(jīng)節(jié)上下頜葉的腹外側極(the ventrolateral pole of the maxillomandibular lobe of the trigeminalganglion)以及中腦的三叉神經(jīng)核(the mesencephalic trigeminal nucleus)。
本發(fā)明這種方法的一些實施方案中,所述疾病是涉及受損及受創(chuàng)傷的神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病,諸如外周神經(jīng)的創(chuàng)傷性損害、延髓及/或脊髓、大腦缺血性神經(jīng)元損害、神經(jīng)病變,具體為外周神經(jīng)病變、外周神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、缺血性中風、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、暴露于神經(jīng)毒素,代謝性疾病諸如糖尿病、腎功能不全以及由傳染原引起的損害,神經(jīng)變性疾病包括阿爾茲海默病(Alzhimer’s disease)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、Parkinson-Plus綜合征、進行性核上性麻痹(progressive Supranuclear Palsy)(斯-理-奧綜合征(Steele-Richardson-Olszewski syndrome))、橄欖體腦橋小腦萎縮(Olivopontocerebellar Atrophy)(OPCA)、夏-德綜合征(Shy-DragerSyndrome)(多系統(tǒng)萎縮癥)、Guamanian帕金森癡呆復征(Guammanianparkinsonism dementia complex)、肌萎縮性脊髓側索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)或任何其它先天的或神經(jīng)變性疾病,及癡呆相關的記憶損害。
在一些實施方案中,能治療感覺及/或自主系統(tǒng)神經(jīng)元。具體地,能治療痛覺感受性(norciceptive)及機械刺激感受性(mechanoreceptive)神經(jīng)元,更具體地為A-δ纖維、C-纖維、A-β纖維神經(jīng)元。此外,能治療自主神經(jīng)系統(tǒng)的交感及副交感神經(jīng)元。
在一些實施方案中,能治療運動神經(jīng)元疾病諸如肌萎縮性脊髓側索硬化(″ALS″)及脊髓性肌萎縮。在其它實施方案,本發(fā)明的神經(jīng)胚素分子可用于增強創(chuàng)傷或損傷后的神經(jīng)恢復??蛇x地,或此外,利用含有聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽或突變的神經(jīng)胚素多肽的融合物或偶聯(lián)物的基質(zhì)的神經(jīng)導向通道(nerve guidance channel)可用于本文描述的方法。這些神經(jīng)導向通道在如美國專利5,834,029中公開。
在一些實施方案中,本文公開的組合物(及組成相同的藥物組合物)用于治療外周神經(jīng)病??捎帽景l(fā)明的分子治療的外周神經(jīng)病包括創(chuàng)傷誘導的神經(jīng)病,如那些由物理(physical)損傷或疾病狀態(tài)、對腦的物理損傷、對脊髓的物理損傷、中風相關的腦損傷、神經(jīng)變性相關的神經(jīng)疾病引起的神經(jīng)病。本文也包括那些繼發(fā)于感染、毒素暴露及藥物暴露的神經(jīng)病。本文還進一步包括那些繼發(fā)于系統(tǒng)性或代謝性疾病的神經(jīng)病。例如,本文公開的組合物也用于治療化療誘導的神經(jīng)病(諸如那些由于化療藥如紫杉醇、順鉑的遞送引起的)、毒素誘導的神經(jīng)病、藥物誘導的神經(jīng)病、維生素缺乏誘導的神經(jīng)病、特發(fā)性神經(jīng)病、糖尿病性神經(jīng)病以及皰疹后神經(jīng)痛。見,如美國專利5,496,804及5,916,555。
根據(jù)本發(fā)明可以治療的其它疾病可以是單發(fā)神經(jīng)病變(mono-neuropathy)、單發(fā)多路神經(jīng)病變(mono-multiplex neuropathy)及多發(fā)性神經(jīng)病(poly-neuropathy),包括軸突及脫髓鞘性神經(jīng)病變。
在一些實施方案中,本發(fā)明的組合物(及組成相同的藥物組合物)用于眼部各種病癥的治療,包括黃斑變性(macular degeneration)、色素性視網(wǎng)膜炎(tetinitis pigmentosa)、青光眼(glaucoma)及相似的疾病導致的患者的光感受器丟失。
方法及藥物組合物 本發(fā)明提供治療神經(jīng)性疼痛、觸覺異常性疼痛、減輕神經(jīng)病變伴發(fā)的疼痛敏感性喪失的方法。本方法利用聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體,包括包含生物活性全長的神經(jīng)胚素多肽或生物活性截短的神經(jīng)胚素多肽的二聚體。此外,本發(fā)明提供包含懸浮的、溶解的或分散在可藥用的載體中的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體的藥物組合物。
神經(jīng)性疼痛的治療 在一個實施方案,本發(fā)明包括一種治療受治療者中神經(jīng)性疼痛的方法,其包含給予受治療者有效量的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體。在一些實施方案中,本發(fā)明包括一種治療受治療者中神經(jīng)性疼痛的方法,其包含給予受治療者藥物有效量的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體,其包含截短的野生型或突變型神經(jīng)胚素多肽,其包括如SEQ ID NO1、2、6-21及36中至少一種或其突變形式,所述二聚體可或單獨給藥,或同時給予受試者有效量的神經(jīng)胚素多肽和有效量的止痛誘導型化合物,該止痛-誘導型化合物選自類鴉片物質(zhì)(opioid)、抗心律不齊藥、局部鎮(zhèn)痛藥、局部麻醉藥、抗驚厥藥(anticonvulsant)、抗抑郁藥(antidepressant)、皮質(zhì)激素(corticosteroid)及非甾體抗炎藥(NSAIDS)組成的組中。在一個優(yōu)選實施方案中,止痛誘導型化合物是抗驚厥藥。在另外一個優(yōu)選實施方案中,所述止痛誘導型化合物是加巴噴丁(gabapentin)(1-氨甲基)乙酸環(huán)己烷)(1-aminomethyl)cyclohexane acetic acid)或普加巴林(pregabalin)(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
本發(fā)明的神經(jīng)胚素多肽及核酸(及包含本文描述的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體的藥物組合物)被用于治療外周神經(jīng)病相關的疼痛??筛鶕?jù)本發(fā)明治療的外周神經(jīng)病包括創(chuàng)傷誘導的神經(jīng)病,如那些由物理(physical)損傷或疾病狀態(tài)、對腦的物理損傷、對脊髓的物理損傷、中風相關的腦部損傷、神經(jīng)變性相關的神經(jīng)疾病引起的神經(jīng)病。
本發(fā)明也提供對以下疾病的治療化療誘導的神經(jīng)病(諸如那些由于給予化療藥如紫杉醇、順鉑引起的神經(jīng)病)、毒素誘導的神經(jīng)病、藥物誘導的神經(jīng)病、病原誘導(如,病毒誘導的)的神經(jīng)病、維生素缺乏誘導的神經(jīng)病、特發(fā)性神經(jīng)病、糖尿病性神經(jīng)病。見如美國專利5,496,804及5,916,555,通過引用將每篇文獻并入本文。本發(fā)明還進一步用本發(fā)明的神經(jīng)胚素核苷酸及多肽來治療單發(fā)神經(jīng)病變、單發(fā)多路神經(jīng)病變及多發(fā)性神經(jīng)病,包括軸突及脫髓鞘神經(jīng)病變。
神經(jīng)性疼痛可與許多外周神經(jīng)病相關,包括(a)創(chuàng)傷誘導的神經(jīng)病,(b)化療誘導的神經(jīng)病,(c)毒素誘導的神經(jīng)病(包括但不限于酒精中毒、維生素B6中毒、六碳中毒(hexacarbon)、胺碘酮(amiodarone)、氯霉素(chloramphenicol)、雙硫侖(disulfiram)、異煙肼(isoniazide)、金、鋰、metronidazole、醚醇硝唑(misonidazole)、呋喃旦啶(nitrofurantoin)),(d)藥物誘導的神經(jīng)病,包括治療性藥物誘導的神經(jīng)性疼痛(諸如由抗癌藥引起的,所述抗癌藥具體地選自紫杉醇(taxol)、泰索帝(taxotere)、順鉑(cisplatin)、噻氨酯噠唑(nocodazole)、長春新堿(vincristine)、長春酰胺(vindestine)及長春堿(vinblastin)組成的組中;以及諸如由抗病毒劑引起的,所述抗病毒劑具體地選自ddI、DDC、d4T、膦甲酸(foscarnet)、氨苯砜(dapsone)、甲硝唑(metronidazole)及異煙肼(isoniazid)組成的組)、(e)維生素缺乏誘導的神經(jīng)病(包括但不限于維生素B12缺乏、維生素B6缺乏及維生素E缺乏)、(f)特發(fā)性神經(jīng)病、(g)糖尿病性神經(jīng)病、(h)病原誘導的神經(jīng)損傷、(i)炎癥誘導的神經(jīng)損傷、(j)神經(jīng)變性、(k)遺傳性神經(jīng)病(包括但不限于弗里德賴希共濟失調(diào)(Friedreich’s ataxia)、家族性淀粉樣多神經(jīng)病(familial amyloidpolyneuropathy)、丹吉爾病(Tangier disease)、法布里病(Fabry disease))、(l)代謝性疾病(包括但不限于腎功能不全及甲狀腺功能減退)、(m)傳染性及病毒性神經(jīng)病(包括但不限于麻風病、萊姆病(Lyme disease)相關的神經(jīng)性疼痛,病毒感染相關的神經(jīng)性疼痛、所述病毒具體選自皰疹病毒(herpes virus)(例如導致皰疹后神經(jīng)痛的帶狀皰疹(herpes zoster))、人免疫缺陷病毒(HIV)及乳頭瘤病毒組成的組)、(n)自身免疫性神經(jīng)病(包括但不限于格林-巴利綜合征(Guallain-Barre syndrome)、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(chronic inflammatoryde-myelinating polyneuropathy)、意義未定的單克隆丙種球蛋白病(monoclonalgammopathy ofundetermined significance)以及多發(fā)性神經(jīng)病)、(o)三叉神經(jīng)痛及陷壓綜合征(trigeminal neuralgia and entrapment syndrome)(包括但不限于Carpel tunnel)以及(p)其它神經(jīng)性疼痛綜合征,包括創(chuàng)傷后神經(jīng)痛、假性肢痛(phantom limb pain)、多發(fā)性硬化疼痛(multiple sclerosis pain)、復合區(qū)域性疼痛綜合征(complex regional pain syndrome)(包括但不限于交感反射性營養(yǎng)不良(reflex sympathetic dystrophy)、灼痛(causalgia))、腫瘤相關性疼痛(neoplasia-associated pain)、脈管炎/血管病性神經(jīng)病變(vasculitic/angoipathicneuropathy)以及坐骨神經(jīng)痛(sciatica)。神經(jīng)性疼痛表現(xiàn)為異常性疼痛、痛覺過敏、自發(fā)性疼痛或幻痛。
2.觸覺異常性疼痛的治療 術語“觸覺異常性疼痛(tactile allodynia)”通常指受試者中由皮膚的正常的無害刺激(如,接觸)激發(fā)疼痛的疾病。本發(fā)明包括治療受試者觸覺異常性疼痛的方法。
在一些實施方案中,治療觸覺異常性疼痛是通過單獨給予受試者藥物有效量的聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體進行的。
在一個相關的實施方案中,本發(fā)明包括治療受試者中觸覺異常性疼痛的方法,或者通過給予受試者有效量的聚合物偶聯(lián)的的神經(jīng)胚素多肽二聚體,該二聚體包含截短的野生型或突變型神經(jīng)胚素多肽,其包括如SEQ IDNO1、2、6-21及36中至少一種或其突變形式,所述二聚體可或單獨給藥,或同時給予受試者有效量的神經(jīng)胚素多肽和有效量的止痛誘導型化合物,該化合物選自類鴉片物質(zhì)、抗心律不齊藥、局部鎮(zhèn)痛藥、局部麻醉藥、抗驚厥藥(anticonvulsant)、抗抑郁藥(antidepressant)、皮質(zhì)激素(corticosteroid)及非甾體抗炎藥(NSAIDS)組成的組。在一個優(yōu)選實施方案中,所述止痛誘導型化合物是抗驚厥劑。在另外一個優(yōu)選實施方案,止痛誘導型化合物是加巴噴丁((1-氨甲基)乙酸環(huán)己烷)或普加巴林(pregabalin)(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
在一些實施方案中,聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體與一種治療劑聯(lián)合給予,所述治療劑包括但不限于抗癌藥或抗病毒劑。所述抗癌藥包括但不限于紫杉醇、泰索帝、順鉑、噻氨酯噠唑、長春新堿、長春酰胺及長春堿??共《緞┌ǖ幌抻赿dI、DDC、d4T、膦甲酸、氨苯砜、甲硝唑及異煙肼。
3.減輕疼痛敏感性喪失的治療 本發(fā)明包括可減輕患神經(jīng)病變的受試者的疼痛敏感性喪失的方法。在一個優(yōu)選實施方案中,所述神經(jīng)病變是糖尿病性神經(jīng)病變。在一個優(yōu)選實施方案中,疼痛敏感性喪失是熱疼痛敏感性的喪失。本發(fā)明涉及預防性及治療性治療。
在預防性治療中,將所述聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體給予患有疼痛敏感性喪失的受試者;這些受試者被預期為具有早期的神經(jīng)病變的受試者。在這種情況下用神經(jīng)胚素治療可用來預防性地治療有患病風險(at-risk)的受試者。
在治病性治療中,將所述聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體給予患有疼痛敏感性喪失的受試者;這些受試者被預期為具有晚期的神經(jīng)病變的受試者。在這種情況下,用聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體治療可用于恢復受試者中適宜的疼痛敏感性。
4.病毒感染及病毒相關神經(jīng)病變的治療 涉及傳染性及病毒性神經(jīng)病變的預防療法。預防處理是在病毒感染確定后神經(jīng)性疼痛發(fā)作前。治療期間,給予聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體以預防神經(jīng)性疼痛的出現(xiàn),該神經(jīng)性疼痛包括但不限于麻風病、萊姆病相關的神經(jīng)性疼痛,病毒感染相關的神經(jīng)性疼痛、所述病毒具體選自皰疹病毒(例如導致皰疹后神經(jīng)痛的帶狀皰疹)、人免疫缺陷病毒(HIV)及乳頭瘤病毒組成的組。在一個可選的實施方案中,如果神經(jīng)性疼痛出現(xiàn),可給予聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體來減輕神經(jīng)性疼痛的嚴重程度。
急性病毒感染的癥狀經(jīng)常包括皮疹的出現(xiàn)。其它癥狀包括,例如,身體受影響區(qū)中持續(xù)性疼痛的發(fā)生,這是帶狀皰疹(shingle)感染的常見并發(fā)癥。皰疹后神經(jīng)痛可持續(xù)一個月或更長時間,并可以在任何疹樣癥狀消失后數(shù)個月出現(xiàn)。
5.疼痛性糖尿病神經(jīng)病變的治療 涉及疼痛性糖尿病神經(jīng)病變的預防療法。糖尿病神經(jīng)病變的預防療法開始于初次診斷糖尿病或糖尿病相關癥狀的確定后、神經(jīng)性疼痛發(fā)作前。疼痛性糖尿病神經(jīng)病變的預防療法也可以開始于確定受試者有患糖尿病或糖尿病相關癥狀的危險時。治療期間,給予聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體以預防神經(jīng)性疼痛的出現(xiàn)。在一個可選的實施方案,給予聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體可減輕已出現(xiàn)的神經(jīng)性疼痛的嚴重程度。
6.神經(jīng)系統(tǒng)疾病 此外,本發(fā)明提供治療或預防受試者(諸如人)中的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法,所述方法通過給予需要的受者其治療有效量的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽,包含神經(jīng)胚素多肽的組合物或偶聯(lián)于聚合物的突變型神經(jīng)胚素多肽,或包括以下物質(zhì)的復合體穩(wěn)定的水溶性偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽,或包含神經(jīng)胚素多肽或偶聯(lián)于聚烯烴組分(polyalkylene moiety)諸如PEG的突變型神經(jīng)胚素多肽的突變型神經(jīng)胚素多肽復合體。
神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病,諸如外周神經(jīng)病或神經(jīng)性疼痛綜合征。人類是優(yōu)選的治療受試者。
本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體可用于治療神經(jīng)元中的缺陷,無限制地包括受損害的神經(jīng)元及受外傷的神經(jīng)元。經(jīng)受外傷的外周神經(jīng)元包括但不限于延髓或脊髓的神經(jīng)。本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體可用于治療神經(jīng)變性疾病,如,大腦缺血性神經(jīng)元損傷;神經(jīng)病,如,外周神經(jīng)病、阿爾茲海默病、亨廷頓舞蹈病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)。這種神經(jīng)胚素多肽二聚體可用于治療被損害的記憶,如癡呆相關的記憶損害。
疾病的其它實例是外周神經(jīng)系統(tǒng)、延髓或脊髓的疾病及創(chuàng)傷誘導的神經(jīng)病,化療誘導的神經(jīng)病,毒素誘導的神經(jīng)病,藥物誘導的神經(jīng)病,維生素缺乏誘導的神經(jīng)病;特發(fā)性神經(jīng)??;以及糖尿病性神經(jīng)病,與以下疾病相關的神經(jīng)性疼痛毒素誘導的神經(jīng)損害,病原誘導的神經(jīng)損害,炎癥誘導的神經(jīng)損害或神經(jīng)變性。本發(fā)明的神經(jīng)胚素多肽二聚體另外可用于治療神經(jīng)性疼痛、治療觸覺異常性疼痛、治療減緩神經(jīng)病變相關的疼痛敏感性喪失。
7.劑量 上述方法涉及優(yōu)選系統(tǒng)性地給予受者包括可為截短的或非截短的、聚合物偶聯(lián)的突變神經(jīng)胚素多肽二聚體的配方,其劑量為每劑從0.01μg/kg到1000μg/kg受者體重。優(yōu)選地,所述劑量為每劑1μg/kg到100μg/kg受者體重。更優(yōu)選地所述劑量為每劑1μg/kg到30μg/kg受者體重,如每劑3μg/kg到10μg/kg受者體重。本發(fā)明配方的治療有效量可以在本領域技術人員無需不適當?shù)脑囼灳涂纱_知的給藥方案中給予需要其的受試者。
8.遞送 用于上述方法中的多肽二聚體可通過任何合適的遞送系統(tǒng)給藥,優(yōu)選地選自經(jīng)靜脈內(nèi)遞送、經(jīng)肌肉內(nèi)遞送、經(jīng)肺內(nèi)遞送、經(jīng)皮下遞送及經(jīng)腹膜內(nèi)遞送,最優(yōu)選地經(jīng)由經(jīng)肌肉內(nèi)遞送、經(jīng)靜脈內(nèi)遞送或經(jīng)皮下遞送。用于上述方法中的神經(jīng)胚素多肽也可通過經(jīng)鞘膜內(nèi)遞送給藥。
聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體的給藥可以是,如系統(tǒng)或局部給藥。這些配方包括這樣的配方,其不僅適于胃腸外給藥也適于非胃腸外給藥以及具體的給藥方式包括口服、經(jīng)直腸、經(jīng)頰、局部、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、經(jīng)皮下、經(jīng)肌肉內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)鞘內(nèi)、經(jīng)關節(jié)內(nèi)、經(jīng)動脈內(nèi)、經(jīng)蛛網(wǎng)膜下、經(jīng)支氣管、經(jīng)淋巴、經(jīng)陰道、經(jīng)子宮內(nèi)給藥。適于氣溶膠以及局部及系統(tǒng)胃腸外給藥的配方也包括在內(nèi)。優(yōu)選的配方適于經(jīng)皮下、經(jīng)肌肉內(nèi)或經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。
9.方案 在一些實施方案中,本發(fā)明的多肽二聚體的給藥頻率為每星期三次將配方給予受試者、持續(xù)兩個星期。為了優(yōu)化治療效果,聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚素多肽二聚體以不同的給藥方案首次給藥。單位劑量及方案依賴于包括,如所免疫的哺乳動物的種類、其免疫狀態(tài)、哺乳動物的體重等因素。通常,組織中的蛋白水平可作為臨床試驗程序的一部分用合適的篩選試驗監(jiān)測,例如用來測定給定的治療方案的有效性。
本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)的突變型神經(jīng)胚素多肽二聚體的用藥頻率在醫(yī)生的技能和臨床判斷之內(nèi)。通常,給藥方案是由可確定最佳給藥參數(shù)的臨床試驗確定的。然而,醫(yī)生可根據(jù)受試者的年齡、健康狀況、體重、性別及醫(yī)學狀況可變化這些給藥方案。給藥頻率也可在神經(jīng)病的急性治療與慢性治療之間變化。此外,用藥頻率可根據(jù)所述治療是預防性的還是治療性的而變化。
本發(fā)明在下述非限性的實施例中進一步描述。
實施例 實施例1氨基末端PEG化的神經(jīng)胚素的生物利用度 如果經(jīng)靜脈給藥大鼠,可觀察到CHO細胞及大腸桿菌(E.coli)衍生的重組神經(jīng)胚素可很快從循環(huán)中清除。皮下給藥后血清中的蛋白低于檢測閾值。為提高神經(jīng)胚素的生物利用度,構建了突變的神經(jīng)胚素PEG化的形式。
由于神經(jīng)胚素序列中沒有賴氨酸存在,胺特異性PEG化化學將在野生型神經(jīng)胚素多肽的氨基末端產(chǎn)生PEG化。因此,對每一神經(jīng)胚素二聚體,應當附著兩個PEG組分。相應地,PEG形式通過胺特異性化學首先直接靶向氨基末端。令人驚訝的是,大腸桿菌表達的野生型神經(jīng)胚素(甚至附著有兩種20kDa PEG)的PEG化,對半衰期幾乎沒有益處,表明基于清除途徑的機制超過期望通過PEG化實現(xiàn)的半衰期延長作用。
實施例2構建PEG化的突變型神經(jīng)胚素(N95K) 隨后檢測在內(nèi)部氨基酸殘基PEG化的突變型神經(jīng)胚素形式的生物利用度。一系列取代了位置14、39、68、及95(按SEQ ID NO1所示編號)的天然存在的殘基的四種突變體被設計用于在所述序列的選定位點插入賴氨酸。這些賴氨酸可為PEG附著提供可選位點。用GDNF的晶體結構(Nat.Struct.Biol.4435-8,1997)選出這些位點作為框架來鑒別表面殘基。Persephin/神經(jīng)胚素嵌合體誘變研究(J.Biol.Chem.2753412-20,2000)被用于鑒別應當被避免的結構的功能上重要的區(qū)域。
為在大腸桿菌中表達野生型神經(jīng)胚素基因,同基因(syngene)用GC含量更低且優(yōu)選的大腸桿菌密碼子構建。將所述同基因克隆入兩種載體pET19b及pMJB164,后者為pET19b的衍生物。在pET19b中,編碼神經(jīng)胚素的成熟結構域(NBN113)的序列直接融合于起始蛋氨酸。在pMJB 164中,神經(jīng)胚素的成熟結構域融合于組氨酸標記(即10個組氨酸),并通過腸激酶切割位點(SEQ ID NO35和36)與組氨酸標記分離。起始蛋氨酸在組氨酸標記之前。
表5標記的野生型神經(jīng)胚素核苷酸和多肽序列 His-標記的NEN 1 ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCG AGC GGC45 1 M G H H H H H H H H H H S S G 15 46CAT ATC GAC GAC GAC GAC AAG GCT GGA GGA CCG GGA TCT CGT GCT90 16 H I D D D D K A G G P G S R A 30 91CGT GCA GCA GGA GCA CGT GGC TGT CGT CTG CGT TCT CAA CTA GTG135 31 R A A G A R G C R L R S Q L V 45 136 CCG GTG CGT GCA CTC GGA CTG GGA CAC CGT TCC GAC GAA CTA GTA180 46 P V R A L G L G H R S D E L V 60 181 CGT TTT CGT TTT TGT TCA GGA TCT TGT CGT CGT GCA CGT TCT CCG225 61 R F R F C S G S C R R A R S P 75 226 CAT GAT CTA TCT CTA GCA TCT CTA CTA GGA GCC GGA GCA CTA AGA270 76 H D L S L A S L L G A G A L R 90 271 CCG CCG CCG GGA TCT AGA CCT GTA TCT CAA CCT TGT TGT AGA CCT315 91 P P P G S R P V S Q P C C R P 105 316 ACT AGA TAC GAA GCA GTA TCT TTC ATG GAC GTA AAC TCT ACA TGG360 106T R Y E A V S F M D V N S T W 120 361 AGA ACC GTA GAT AGA CTA TCT GCA ACC GCA TGT GGC TGT CTA GGA405 121R T V D R L S A T A C G C L G 135 406 TGA TAA TAG414 (SEQ ID NO35) 136* * *(SEQ ID NO36) 突變中有兩種(R39及R68)靶向于基于表面正電荷的分布可能代表肝素結合位點的區(qū)域。這種位點可能有利于蛋白的快速清除。第三個位點靶向N95,N95為野生型神經(jīng)胚素中的天然的糖基化位點。該位點天然地被復合糖結構修飾。因此,預期在該位點用PEG修飾不影響功能。第四個位點(R14)在一種不為任何其它修飾覆蓋的區(qū)域中選出。選取由賴氨酸取代95位天冬酰胺殘基的突變體為(″N95K突變體″),用于本文公開的研究。
構建包含大鼠神經(jīng)胚素多肽的野生型序列中的一種或多種改變的四種不同的突變型大鼠神經(jīng)胚素。這些突變的神經(jīng)胚素包含單個氨基酸取代R14K、R68K、R39K或N95K。表1A以粗體字確定這些示例性的點突變。在″X1N1X2″命名法中,X1指野生型神經(jīng)胚素多肽的氨基酸,N1指序列中X1氨基酸的位置編號,如依據(jù)SEQ ID NO1編號,X2指取代指定的位置號N1處的野生型氨基酸的氨基酸。
為構建大鼠N95K神經(jīng)胚素突變,在pCMB020上實施定點誘變,pCMB020為編碼野生型大鼠神經(jīng)胚素的質(zhì)粒。野生型大鼠神經(jīng)胚素的核酸及由其編碼的多肽的氨基酸序列如下所示 表6野生型大鼠NBN序列 1 ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA 101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT 151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG 201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC 251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT 301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG 351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG 401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACAGCTCCGACGA GCTGATACGT 451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT 501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT 551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC 601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCGGC 651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (SEQ ID NO25) 1 MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP 101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR 151 FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV 201 SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG* (SEQ ID NO26) 用寡核苷酸KD3-210及KD3-211誘變pCM020導致質(zhì)粒pCMB027的形成。
KD3-2105′-GTATCTTTCATGGACGTTATGTTCTACATGGAGAACC-3′ (SEQ ID NO27) KD3-211 5′-GGTTCTCCATGTAGAACATACGTCCATGAAAGATAC-3′(SEQ ID NO28) 在pCMB027中,編碼95位天冬酰胺的密碼子被編碼賴氨酸的密碼子代替。
A R14K突變的神經(jīng)胚素通過在pCMB020神經(jīng)胚素編碼序列中用編碼賴氨酸的密碼子代替編碼14位精氨酸的密碼子而形成。用寡核苷酸KD3-254及KD3-255在pCMB020進行定點誘變 KD3-254 5′-GCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCGTCTGCG-3′ (SEQ ID NO29) KD3-2555′-CGCAGACGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGC-3′ (SEQ ID NO30) 合成的構建體命名為pCMB029。
R68K突變的神經(jīng)胚素通過在pCMB020神經(jīng)胚素編碼序列中用編碼賴氨酸的密碼子代替編碼68位精氨酸的密碼子而形成。用寡核苷酸KD3-258及KD3-259在pCMB020進行定點誘變 KD3-258 5′-GGAGGCGGAGCACTAAAATCTCCCCCGGGATCTAGACC-3′(SEQ ID NO31) KD3-259 5′-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3′(SEQ ID NO32) 合成的構建體命名為pCMB030。
R39K突變的神經(jīng)胚素通過在pCMB020神經(jīng)胚素編碼序列中用賴氨酸代替氨基酸39位的精氨酸而形成。用寡核苷酸KD3-256及KD3-257在pCMB020進行定點誘變 KD3-2565′-GACGAATTAATTAAGTTTGGTTTTTGTTCAGG-3′(SEQ ID NO33) KD3-2575′-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3′(SEQ ID NO34) 大腸桿菌中突變的神經(jīng)胚素的表達及定性 為表達及純化,編碼大鼠神經(jīng)胚素N95K多肽的質(zhì)粒在大腸桿菌中被表達為His標記的融合蛋白,該融合蛋白具有在緊鄰成熟的113個氨基酸的神經(jīng)胚素序列的起始位置的腸激酶切割位點。大腸桿菌在500L發(fā)酵罐中生長,并為其提供凍存的細胞糊。大腸桿菌細胞在APV Gaulin細胞壓碎器(press)中裂解,大鼠神經(jīng)胚素N95K從不溶性經(jīng)洗泡沉淀部分中回收。
N95K突變的神經(jīng)胚素用鹽酸胍從沉淀中提取、再重疊、用腸激酶除去組氨酸標記(見實施例5)。然后使產(chǎn)物在Ni NTA瓊脂糖(Qiagen)及BakerbondWP CBX陽離子交換樹脂上層析。
組氨酸標記的產(chǎn)物的腸激酶處理導致在成熟序列中精氨酸7位點處對蛋白的異常切割。合成的des 1-7神經(jīng)胚素產(chǎn)物(NBN106-N95K)在KIRA ELISA中可完全活化,在對胍-誘導的變性敏感方面從結構上與成熟型不能區(qū)別,因此可用于后繼的工作。
大鼠突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K用分子量10,000Da的甲氧基聚(乙二醇)-琥珀琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)作為反應物,以平均每個神經(jīng)胚素分子3.3PEG組分進行PEG化。對產(chǎn)生的PEG化產(chǎn)物進行多方面的定性,包括通過以下方法進行分析SDS-PAGE、大小排阻層析法(SEC)、逆相HPLC、基質(zhì)輔助激光解析/離子化質(zhì)譜法(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight)(MALD/IMS)、肽鏈圖譜法、KIRA ELISA中的活性評估及內(nèi)毒素含量的確定。用SDS-PAGE及SEC測定的神經(jīng)胚素N95K產(chǎn)物在PEG化前的純度大于95%。神經(jīng)胚素N95K產(chǎn)物在非還原條件下作為二聚體遷移,與其預測的結構一致。在PEG化后,產(chǎn)生的產(chǎn)物由一系列修飾的加合物組成,這些加合物包含每分子2個PEG、占產(chǎn)物的5%;每分子3個PEG、占產(chǎn)物的60%;每分子4個PEG、占產(chǎn)物的30%及一些更高分子量的較次要的形式。在PEG化的樣品中沒有聚集物的證據(jù)。產(chǎn)物中未修飾的神經(jīng)胚素的殘基水平低于定量的限(limits of quantitation)。該物質(zhì)中的內(nèi)毒素含量常規(guī)地低于1EU/mg。KIRA ELISA中PEG化的神經(jīng)胚素的比活性是10nM。該PEG化的產(chǎn)物被配制成1.1mg/mL、PBS中、pH 6.5。這種物質(zhì)(與野生型神經(jīng)胚素(NBN113)的效力相似),可以作為貯藏于-70℃的冷凍液體供給。
R14K、R39K及R68K突變型神經(jīng)胚素多肽在大腸桿菌中表達,并經(jīng)過與如上對NBN106-N95K神經(jīng)胚素所述相同的方法進行純化、PEG化及功能的評定。
PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的制備 大腸桿菌中產(chǎn)生,并貯藏于4℃、5mM磷酸鈉pH6.5、100mM NaCl中的230mL再折疊的大鼠N95K突變神經(jīng)胚素(2.6mg/mL)用77mL水、14.4mL 1M HEPES pH7.5及2.8g(終濃度10mg/mL)PEG SPA 10,000Da(Shearwater Polymers,Inc.)稀釋。該樣品在室溫暗處保溫4小時,然后用5mM咪唑處理、過濾并于4℃貯藏過夜。這種產(chǎn)物分兩批產(chǎn)生,一批含有130MLN95K部分(bulk)而另一批含有100ML所述部分。PEG化的神經(jīng)胚素在Fractogel EMD S03-(M)(EM Industries)從反應混合物中純化。這種柱在室溫下運行。所有的緩沖液制備為無致熱原的。將氯化鈉加入反應混合物至終濃度87mM,并將樣品上樣于45mL pH6.5,80mM NaCl Fractogel柱(5cm內(nèi)徑)。
用一個柱體積的5mM磷酸鈉pH6.5,80mM NaCl洗柱,然后用三倍單個柱體積的含有50mM NaCl的5mM磷酸鈉的等分試樣洗柱。將樹脂轉移入2.5cm直徑柱內(nèi),用六個10ML含有5mM磷酸鈉pH6.5、400mM NaCl的步驟(six ten mL steps containing 5mM sodium phosphate pH6.5)、三個含有500mL NaCl步驟(three steps containg 500mL NaCl)、和六個含有600mMNaCl的步驟(six steps containing 600mM NaCl)從柱上洗脫PEG化的神經(jīng)胚素。用280nm的吸光度分析洗脫級分的蛋白含量,再用SDS-PAGE分析修飾的程度。收集所選的級分,用0.2μm的濾級過濾,并用水稀釋至1.1mgPEG化的大鼠神經(jīng)胚素/ML。在單獨的批次中測定了內(nèi)毒素水平后,收集它們并通過0.2μm膜再過濾。終物質(zhì)被分裝并貯藏于-70℃。
純化的PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的UV光譜 自純樣品獲得PEG化的NBN N95K的UV光譜。對該樣品一式三份的分析。PEG化的樣本在275-277nm處顯示最大的吸光度,247-249nm處顯示最小的吸光度。這個結果與觀察體中間的結果是一致的。PEG化的產(chǎn)物的蛋白濃度可從光譜中用吸光系數(shù)∑2800.1%=0.50估計。PEG化的神經(jīng)胚素部分的蛋白濃度是1.1mg/mL。樣品中不存在混濁,如缺乏320nm處的吸光度所證實。
用SDS-PAGE定性PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K 對含有3、1.5、0.75及0.3μg產(chǎn)物的PEG化神經(jīng)胚素的等分試樣在4-20%梯度凝膠(Owl)上進行SDS-PAGE。該凝膠用考馬斯亮藍R-250染色。分子量標記(GIBCO-BRL)被平行測定。
在非還原條件下,PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的SDS-PAGE分析顯示一系列對應每分子2、3、4及多于4個PEG修飾的條帶。表觀分子量98kDa的主要條帶含有每分子3個PEG。在純化的PEG化產(chǎn)物中,沒有檢測到非PEG化的神經(jīng)胚素。附著有2、3及4個PEG的產(chǎn)物混合物的存在通過MALDI質(zhì)譜分析可查證。含有2、3及4個PEG的產(chǎn)物的比率可通過密度計量學測定,并且分別被測定為占總量的7%、62%、30%。
用大小排阻層析法(size exclusion chromatography)表征PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K 將PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K置于分析型Superose 6HR1O/30FPLC柱上,用5mM MES pH6.5,300mM NaCl作為流動相進行大小排阻層析法。以20mL/h走柱。監(jiān)則洗脫級分在280nm的吸光度。PEG化的突變型神經(jīng)胚素以單一峰監(jiān)測洗脫,其表觀分子量大約200kDa,與PEG大的流體體積(hydrodynamic volumn)相一致。沒有觀察到聚集物的跡象。在制備物中沒有檢測到游離神經(jīng)胚素,其洗脫后的表觀分子量約為30kDa。
用逆相HPLC分析PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K 將PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K置于Vydac C4(5μm 1*250mm)柱進行逆相HPLC。用從40%到60%B(緩沖液A0.1%TFA、緩沖液B75%乙腈/0.085%TFA)的60mm梯度展開柱子。監(jiān)控柱子的流出液在214nm的吸光度,并收集級分用于后續(xù)分析。PEG化的NBN106-N95K通過在C4柱上進行逆相HPLC被分級成它的各種二(60.5mm)、三(63.3mm)及四(67.8mm)PEG化組分。峰值的相對強度提示組分的比率分別是5.4%、60.5%及30.1%。峰的鑒定通過MALDI-MS驗證。產(chǎn)物中沒有非PEG化NBN106-N95K(在5-15mm洗脫)的證據(jù)。
用質(zhì)譜法分析PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K在C4Zip Tip上脫鹽,并在用芥子酸作為基質(zhì)的Voyager-DE(TM)STR(PerSeptive Biosystems)基質(zhì)輔助激光解離/離子化飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀上、通過質(zhì)譜法分析。在目標板上混合0.5μL純化蛋白和0.5μL基質(zhì)。PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的質(zhì)譜法顯示三種加合物的單荷電(singly charged)及雙荷電(doubly charged)形式。觀察到的43803Da、54046Da及64438Da的分子量與每分子2、3及4個PEG修飾一致。
用肽圖譜法(peptide mapping)分析PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K PEG化反應的特異性用肽圖譜法評估。PEG化神經(jīng)胚素被分成二、三及四PEG化組分,其隨后被還原、烷基化并在C4柱上用HPLC進一步分離成它們的單鏈組分。這些組分與作為對照的還原的、烷基化的、非PEG化NBN106-N95K用Asp-N蛋白酶消化,所得切割產(chǎn)物在Vydac C18(5μm,1*250mm)柱上用從0到60%B(緩沖液A0.1%TFA,緩沖液B75%乙腈/0.085%TFA)的60mm梯度通過逆相HPLC分級分離。監(jiān)控柱流出液在214nm的吸光度。
大鼠神經(jīng)胚素序列包含五個內(nèi)部天冬氨酸,由此當用內(nèi)蛋白酶(endoproteinase)Asp-N消化時,被期望為產(chǎn)生簡單的切割剖圖譜。大鼠N95K的Asp-N消化的所有峰值已由質(zhì)譜法及/或Edman氨基末端測序法確定,因此肽圖譜可作為一種簡單的工具通過峰的存在或缺失檢測修飾的位點。各種峰的鑒定在如下表7中總結。
表7 (M)monolostopic質(zhì)量 *由于MALDI上包含蛋氨酸的肽的氧化。
由于神經(jīng)胚素天然以同源二聚體的形式存在,大鼠突變的神經(jīng)胚素NBN106-N95K產(chǎn)物含有四個PEG化的潛在位點,來自每一條鏈的兩個氨基末端胺及改造到該構建體中的兩個N95K位點。在二-PEG化的鏈的肽圖譜中,只有含有具N95K突變的肽的峰可被PEG化修飾而改變。其他的峰不受PEG化修飾的影響。繪圖數(shù)據(jù)因此表明PEG組分特異性附著在這種肽而不是任何其他被篩選的肽。第二潛在的附著位點氨基末端在只有三個氨基酸長并且在肽圖譜上不能被檢測到的肽上。據(jù)推斷其它PEG附著存在于此位點。與這個概念相一致,大鼠突變神經(jīng)胚素N95K的小部分是非截短的,并且含有成熟Ala-1序列。這種肽在30μm處被洗脫并且在得自非-PEG化的消化物(digest)的肽圖譜中可見,但在PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K消化物中不存在。
實施例3.在激酶受體活化(KIRA)ELISA中評價內(nèi)部PEG化的突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的效力 PEG化的突變型大鼠神經(jīng)胚素的效力用c-Ret的神經(jīng)胚素依賴的活化/磷酸化作為神經(jīng)胚素活性的報道分子、在特異于磷酸化的RET存在的ELISA中測定。將NB41A3-mRL3細胞(表達Ret及GFRα3的貼壁性(adherent)大鼠神經(jīng)瘤母細胞系)以每孔2*105個細胞鋪板于24孔板中的補充了10%胎牛血清Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中,于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)18h。
所述細胞用PBS洗滌,再用0.25mL DMEM中的神經(jīng)胚素的連續(xù)稀釋液在37℃、5%CO2的條件下處理10min。每個樣品進行一式兩份的分析。所述細胞用1mL PBS洗滌,4℃、用0.30mL 10mM Tris HCl、pH8.0,0.5%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P4),0.2%去氧膽酸鈉,50mM NaF,0.1mM Na3VO4,1mM苯甲基磺?;?phenylmethylsulfonyl fluoride)在輕搖細胞板的條件下裂解1h。裂解產(chǎn)物進一步通過反復吸液攪動,并將0.25mL樣品轉移入96孔ELISA板中,所述板已用5μg/mL 50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液中的抗Ret mAb(AA.GE7.3)、在4℃包被18h,并用封閉液(20mM Tris HClpH 7.5、150mM NaCl、0.1%吐溫20(TBST),其中含有1%正常鼠血清及3%牛血清白蛋白)在室溫封閉1h。
室溫保溫2h后,用TBST洗孔六次。對磷酸化的Ret的檢測是通過如下過程進行的用封閉緩沖液中2g/mL辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)4G10抗體、在室溫保溫所述孔2h,用TBST洗滌六次,并用顯色檢測試劑測量HRP在450nm的活性。測定用裂解產(chǎn)物處理或用裂解緩沖液處理的孔的吸光度值,并將背景校正的信號作為存在于活化混合物中的神經(jīng)胚素的濃度函數(shù)作圖。KIRA ELISA中PEG化的突變的神經(jīng)胚素(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)的效力與野生型NBN113物質(zhì)的效力(圖1及表8)不能被區(qū)別。兩次凍融循環(huán)對效力沒有影響,并且這種處理后樣品的混濁度沒有顯著增加,表明樣品可以可靠地被融化用于研究。在分別評估每分子具有三或四個10kDa PEG的產(chǎn)物的活性的研究中,具有三個PEG的加合物測具有完全的活性,而具有四個PEG的產(chǎn)物的效力減低(圖2及表8)。這些數(shù)據(jù)證明(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)(圖1)與3×10kDa PEG NBN106-N95K(圖2)對Ret活化的程度相同,并具有與非突變型(野生型)神經(jīng)胚素NBN113相同的劑量依賴性。但是,盡管4×10kDa PEGNBN106-N95K(圖2)與非突變型(野生型)神經(jīng)胚素NBN113對Ret活化的程度相同,4×10kDa PEG NBN106-N95K活化Ret的效力大約比非突變型(野生型)神經(jīng)胚素NBN113的效力低十倍。估計的EC50在表8中給出。
實施例4大鼠及小鼠中內(nèi)部PEG化的突變型大鼠神經(jīng)胚素NBN106-N95K的藥物動力學研究 在大鼠及小鼠模型中檢測各種PEG化及非PEG化的突變型神經(jīng)胚素產(chǎn)物的藥物動力學特性。
數(shù)據(jù)顯示具有3.310000Da PEG的大鼠突變型神經(jīng)胚素NBN106-N95K的PEG化產(chǎn)生對神經(jīng)胚素的半衰期及生物利用率有顯著影響。在以1mg/kg經(jīng)靜脈注射給藥Sprague Dawley大鼠后,3000ng/mL PEG化的突變型神經(jīng)胚素的峰值水平在7分鐘后檢測到,700ng/mL的水平在24h后檢測到,200ng/mL在48h后檢測到,100ng/mL在72h后檢測到。非PEG化的突變型神經(jīng)胚素N95K則相反,其以1mg/kg靜脈注射給藥后,在7分鐘后檢測到1500ng/mL的水平,但3h后所述水平就很快降至70ng/mL,7h后不能檢測到。PEG化的影響在用PEG化的神經(jīng)胚素經(jīng)皮下給藥處理的動物中更加顯著。
1mg/kg皮下給藥后,PEG化的神經(jīng)胚素24h后在循環(huán)中的水平達最大值200ng/mL,并在三天研究期間持續(xù)保持這種水平。相反,對于給予非PEG化的突變型神經(jīng)胚素的情況,在任何時間點沒有觀察到可檢測的神經(jīng)胚素。
PEG化的N95K樣品的分析由于每分子包含2、3及4個PEG的加合物的存在而復雜化,每一種顯示不同的PK圖譜。在早期PK研究中,小鼠通過多種給藥候選物及途徑而被用于易化篩選。對小鼠的研究顯示,候選物生物利用率有很大差異。然而,當在大鼠中評估3.3 10kDa PEG加合物時,發(fā)現(xiàn)它在大鼠中的生物利用率比小鼠中的生物利用率低。生物利用率的不同在經(jīng)腹腔給藥后更顯著。7hr后小鼠中的水平達1600ng/mL,并在24hr后保持在400ng/mL。相反,大鼠中的水平在100ng/mL持續(xù)4-48hr。
兩種令人吃驚的意外結果在PK研究中出現(xiàn),所述結果總結于表81)非糖基化的神經(jīng)胚素的氨基末端氨基酸的PEG化不足以大量(substantially)增加血清暴露(serum exposure);并且2)神經(jīng)胚素的氨基末端氨基酸的PEG化以及氨基酸95的修飾(PEG化或糖基化)一起足以大量增加血清接觸。例如,糖基化的NBN104(CHO)在經(jīng)皮下給藥后沒有可檢測到的暴露;但是,糖基化的1×20kDa PEG NBN104(CHO)在皮下給藥后顯示高血清暴露。相似地,2×20kDa PEG NBN113在皮下給藥后顯示低度到中度的血清露;但是,糖基化的2×20kDa PEG NBN104(CHO)在皮下給藥后顯示高血清暴露。這些結果提示神經(jīng)胚素的氨基末端氨基酸與聚合物的偶聯(lián)與以及內(nèi)部氨基酸(如95位氨基酸)的聚合物偶聯(lián)或內(nèi)部氨基酸(如95位)的糖基化在系統(tǒng)給藥后導致大量增加的血清暴露。
為在STZ糖尿病大鼠神經(jīng)病變模型中進行效力實驗,野生型大鼠神經(jīng)胚素及突變型神經(jīng)胚素N95K都被再折疊并純化至>95%。野生型神經(jīng)胚素被配制或直接進行動物實驗,而N95K被制備為用于利用10kDa PEG-SPA的PEG化。為實現(xiàn)再折疊及純化目的,發(fā)展利用大小排阻層析法的再折疊方法,其容許來源于大量、高濃度的大腸桿菌包涵體的神經(jīng)胚素的復性。除SEC外,Ni-NTA及CM二氧化硅柱層析步驟都可用于增加最終的蛋白純度。這些蛋白經(jīng)廣泛的表征,所述表征包括SDS-PAGE分析、大小排阻層析法、ESMS、通過KIRAELISA評估活性及內(nèi)毒素含量測定。最終蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE及SEC提示純度大于95%。每種產(chǎn)物的內(nèi)毒素水平<0.2EU/mg。KIRA ELISA中兩種蛋白的比活性大約在10nM。野生型神經(jīng)胚素以1.0mg/ml、N95K以2.6mg/ml在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)pH6.5配制。野生型神經(jīng)胚素被分裝入15ml試管并凍存于-70℃,而N95K在分裝及凍存前要進行PEG化。
實施例5.野生型神經(jīng)胚素及突變型N95K神經(jīng)胚素的再折疊及純化。
兩種神經(jīng)胚素的形式在大腸桿菌中均表達為具有在緊鄰成熟113氨基酸序列的起始位置的、有腸激酶切割位點的組氨酸(His)標記的融合蛋白。表達或野生型(1.8kg 沉淀)或N95K(2.5kg沉淀)神經(jīng)胚素的細菌在2升PBS中用APV Gaulin細胞壓碎器裂解。離心(10,000rpm)以沉淀包涵體后,棄去每次制備物的上清。包涵體沉淀物用洗滌緩沖液(0.02M Tris-HCl pH8.5,0.5mM EDTA)洗滌兩次,再用含有Triton X-100(2%,v/v)的相同緩沖液洗滌兩次,后再用另外兩種無洗滌劑的緩沖液沖洗。兩種沉淀都用6M鹽酸胍、0.1MTris pH8.5、0.1M DTT及1mM EDTA溶解。為幫助溶解過程,每一種沉淀都用polytron勻漿器勻漿,并在室溫攪拌過夜。溶解的蛋白通過離心澄清化后,通過Superdex 200柱(用0.05M pH 3.0的甘氨酸/H3PO4及2M鹽酸胍平衡的5.5升柱)以每分鐘20ml進行變性層析(denaturing chromatography)。
變性的神經(jīng)胚素通過SDS-PAGE鑒別。匯集含有或野生型神經(jīng)胚素或N95K的級分并用Amicon 2.5升攪拌的細胞濃縮器(stirred cell concentrator)濃縮至大約250mL。過濾后除去任何沉淀物,濃縮的蛋白通過用0.1M pH7.8的Tris-HCl、0.5M鹽酸胍、8.8mM還原型谷胱甘肽及0.22mM氧化的谷胱甘肽平衡的Superdex 200柱進行復性層析(renaturing chromatography)。用0.5M鹽酸胍以每分鐘20ml洗柱。含有復性的野生型神經(jīng)胚素或N95K神經(jīng)胚素的級分通過SDS-PAGE、匯集并貯藏于4℃直到需要移除His標記。
通過稀釋對野生型神經(jīng)胚素或N95K神經(jīng)胚素進行再折疊的可選方法 為通過稀釋對神經(jīng)胚素進行再折疊,溶解的蛋白在再折疊緩沖液(0.5M鹽酸胍、0.35M L-精氨酸、50mM磷酸鉀(pH 7.8)、0.2mM還原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、及0.1%吐溫(Tween)-80)中快速稀釋至終濃度0.1mg/ml,并在不攪動的條件下在室溫保溫48h。再折疊的神經(jīng)胚素再濃縮25倍,加入40mM咪唑,并加樣到含有Ni-NTA瓊脂糖的層析柱上以進一步濃縮產(chǎn)物并除去宿主細胞蛋白。用10倍柱體積的洗脫緩沖液(40mM,0.5M鹽酸胍)洗柱。再用0.2M咪唑及0.5M鹽酸胍從樹脂洗脫神經(jīng)胚素。
用Ni-NTA層析法濃縮柱-再折疊的神經(jīng)胚素 柱-復性的神經(jīng)胚素在進行純化前貯藏于4℃至少24小時,以促進神經(jīng)胚素單體間形成二硫化物。這期間,沉淀形成并通過0.2μ聚醚砜(PES)過濾裝置過濾除去。為減少非特異性結合,將蛋白溶液加入20mM咪唑,以每分鐘50ml加樣于100ml Ni-NTA(Qiagen)柱,該柱用柱緩沖液(0.5M胍及20mM咪唑)平衡。蛋白上柱后,用相同的緩沖液洗柱到基線。用大約300mL含有0.5M鹽酸胍及0.4M咪唑的洗脫緩沖液從樹脂洗脫神經(jīng)胚素。洗脫后,神經(jīng)胚素在室溫用10體積5mM HCl透析用10kDa透析管(dialysistubing))過夜。透析促進污染物質(zhì)的水解,并分別降低鹽酸胍和咪唑的濃度至0.05M及0.04M。
用賴氨酰內(nèi)肽酶或腸激酶切割His標記 第二天,透析過程中形成的任何沉淀過濾除去。下述純化步驟適用于柱-及稀釋-再折疊化的神經(jīng)胚素產(chǎn)物。通過加入5M母液中的NaCl,使蛋白樣品的終末鹽濃度為0.1M NaCl,所述終末鹽濃度包括剩余的大約150mM的鹽酸胍。這種濃度可用電導儀(conductivity meter)證實。另外,加入1M pH 7.8的HEPES至25mM的終濃度。為切去His標記,加入賴氨酰內(nèi)肽酶到野生型神經(jīng)胚素中并加入腸激酶到N95K突變型神經(jīng)胚素中,兩者均為蛋白酶神經(jīng)胚素的比率大約為1∶300。對于N95K突變型神經(jīng)胚素,用腸激酶代替賴氨酰內(nèi)肽酶,這是由于突變蛋白Lys95有額外的蛋白酶切割位點。所述樣品在室溫攪動2小時用SDS-PAGE監(jiān)測消化作用。
通過Ni-NTA色譜儀除去His標記 蛋白酶處理的神經(jīng)胚素以每分鐘50ml加樣于100mL Ni-NTA柱,所述柱用0.5M鹽酸胍及20mM咪唑平衡。用相同的緩沖液洗柱到基線。從柱洗脫的任何蛋白與含有不帶His標記的神經(jīng)胚素的流出蛋白混合。
CM二氧化硅層析法 Ni-NTA層析后,立即通過CM二氧化硅樹脂對蛋白進行進一步的純化。將神經(jīng)胚素以每分鐘20ml加樣于用上樣緩沖液(5mM磷酸鹽pH 6.5,150mM NaCl)平衡的20mL CM二氧化硅柱上。用20倍柱體積的洗滌緩沖液(5mM磷酸鹽pH 6.5,400mM NaCl)洗柱,并且蛋白用含有5mM磷酸鹽pH6.5并含有1M NaCl的洗脫緩沖液逐步洗脫(step elution)。洗脫的蛋白用單獨的磷酸鹽透析過夜,使N95K的鹽濃度降至100mM、野生型神經(jīng)胚素的鹽濃度降至150mM。兩種樣品通過0.2μPES過濾裝置過濾,用SDS-PAGE分析,并貯藏于4℃,直到需要進一步定性和/或PEG化時。
對野生型及N95K突變型神經(jīng)胚素蛋白制備物進行UV光譜分析,以評估其在280nm的吸光度。用微型石英杯(micro quartz)并用單獨的緩沖液作空白(blanking against buffer alone),100μl野生型或N95K突變型神經(jīng)胚素用貝克曼分光光度計(Beckman spectrophotometer)連續(xù)地從230到330進行掃描。根據(jù)這種分析,野生型神經(jīng)胚素濃度被測定為1.1mg/ml而且N95K突變型神經(jīng)胚素的濃度為2.6mg/ml(對于每一種蛋白,為A280nm-E0.1%=0.5)?;?30nm的吸光度,鑒定出少于1%沉淀的物質(zhì)。
為評估兩種蛋白制備物的純度,通過16/30Superdex 75柱對每種樣品(0.5mg)進行大小排阻層析。該柱用含有400mM NaCl的5mM磷酸鹽pH6.5平衡,并以每分鐘1.5mL流速展開?;?80nm的吸光度,野生型及N95K突變型神經(jīng)胚素制備物以預期分子量(23-24kDa)作為單峰遷移,并且它們不含有任何明顯的蛋白污染。
野生型及N95K突變型神經(jīng)胚素蛋白在2.5M鹽酸胍,60mM Tris pH8.0及16mM DTT中被還原。被還原的樣品經(jīng)短C4柱脫鹽,并通過ESMS用三聯(lián)四極儀器(triple quadrupole instrument)聯(lián)機(on-line)分析。ESMS原始數(shù)據(jù)用MaxEnt程序去卷積化(deconvolute)以產(chǎn)生質(zhì)譜。這個程序容許三重荷電信號折(collapse)成峰,其直接對應于千道爾頓分子量(kDa)。野生型的去卷積化的質(zhì)譜顯示主要的(predominant)種類是12046Da,與該蛋白113個氨基酸形式的預測分子量12046.7Da相一致。也觀察到次要成分(compoent)(12063Da),提示氧化產(chǎn)物的存在。N95K突變型神經(jīng)胚素蛋白樣品中識別了三個峰。主要成分表明表觀分子量11345Da,與該蛋白106個氨基酸形式的預測分子量相一致。其他兩個峰的分子量為11362及12061Da,分別提示N95K氧化及113個氨基酸形式的存在。
N95K突變型神經(jīng)胚素蛋白制備物中106及113個氨基酸形式的存在可歸因于腸激酶的消化。來自Biozyme的這種蛋白酶是從小牛腸粘膜中純化而來的天然酶制備物,據(jù)報道其含有輕度的胰島素污染(每μg腸激酶0.25ng胰島素)。因此,胰島素可能作用于N95K突變型神經(jīng)胚素蛋白的羧基端Arg7以產(chǎn)生主要為106個氨基酸的形式。另一方面,用于切割野生型神經(jīng)胚素的賴氨酰內(nèi)肽酶是單獨的蛋白酶活性,其作用于包含在His標記中的賴氨酸殘基的羧基端以產(chǎn)生成熟的113個氨基酸神經(jīng)胚素形式。神經(jīng)胚素的106及113個氨基酸的形式在所有試驗的測定中活性等同,并在鹽酸胍穩(wěn)定性試驗中反應相似。
神經(jīng)胚素活性通過其刺激c-Ret在NB41A3-mRL3細胞中磷酸化的能力用實施例3中所述的KIRA ELISA來測定。磷酸化的Ret通過保溫(2小時)捕獲的受體以及HRP-偶聯(lián)的磷酸酪氨酸抗體(4G10;每孔0.2μg)來檢測。保溫后,用TBST洗孔六次,并用比色測定法在450nm測定HRP活性。測定單獨用裂解物或裂解溶液處理的加樣孔中的吸光度值,相對于背景校準,作為活化混合物中存在的神經(jīng)胚素的濃度的函數(shù)對數(shù)據(jù)作圖。這些數(shù)據(jù)說明純化的神經(jīng)胚素多肽導致磷酸化的RET的出現(xiàn),表明純化的神經(jīng)胚素在這種測定法中有活性。
實施例6血清白蛋白-神經(jīng)胚素偶聯(lián)物的制備 PBS中濃度為1mg/ml的野生型大鼠神經(jīng)胚素用1mM硫代-SMCC(Pierce)處理,并經(jīng)脫鹽以除去過量的交聯(lián)劑。由于野生型神經(jīng)胚素蛋白在氨基末端僅含有單個胺而沒有游離的巰基基團,預期與SMCC的反應導致對其氨基末端附著有SMCC的神經(jīng)胚素的位點特異性修飾。
下一步,60μg神經(jīng)胚素-SMCC偶聯(lián)物與120μg牛血清白蛋白一起保溫,用SDS-PAGE分析交聯(lián)的程度。BSA含有單個游離SH基團,并因此預期與神經(jīng)胚素-SMCC偶聯(lián)物的反應導致通過SMCC上的馬來酰亞胺在該位點的修飾。在這些條件下,觀察到更高分子量的兩種額外的條帶,其質(zhì)量與用單一BSA組分及兩種BSA分子(由于每一種神經(jīng)胚素分子含有兩種能進行反應的氨基末端)修飾的神經(jīng)胚素一致,并由此與這個概念(notion)一致。與這些條帶的形成同時存在的是神經(jīng)胚素-SMCC及BSA條帶的強度減小?;谑S嗌窠?jīng)胚素條帶的強度,該反應呈現(xiàn)出已有70-80%完成。
單置換的(monosubstituted)產(chǎn)物通過在基本上如上述用于PEG化研究的Superdex 200柱(Pharmacia)上,對所述物質(zhì)進行陽離子交換層析及大小排阻層析而從反應混合物中純化而來。凝膠過濾所得的柱級分用SDS-PAGE分析,那些含有單置換產(chǎn)物的級分在280nm的吸光度來分析蛋白含量。由于BSA的質(zhì)量大約兩倍于神經(jīng)胚素,表觀濃度除以因子3以產(chǎn)生神經(jīng)胚素等同物。對這個級分進行上述實驗,以分析其在KIRA ELISA中的功能。野生型及BSA偶聯(lián)的神經(jīng)胚素兩者的IC50值是3-6nM,表明偶聯(lián)于BSA不損害功能。
這些初步研究雖然用BSA產(chǎn)生,大鼠及人類的相應血清白蛋白蛋白也含有游離的SH。因此相似的方法可應用于產(chǎn)生大鼠血清白蛋白-大鼠神經(jīng)胚素偶聯(lián)物實行大鼠體內(nèi)PK及效力,并用人血清白蛋白-人神經(jīng)胚素進行臨床試驗。相似地,SMCC可用在一側含有氨基反應基團、另一側含有硫醇反應基團的許多交聯(lián)劑中的任一種代替。插入硫醇反應性馬來酰亞胺的胺反應性交聯(lián)劑的例子是AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS;插入硫醇反應性的鹵代乙酸鹽基團的胺反應性交聯(lián)劑的例子是SBAP、SIA、SIAB;提供保護的或非保護的硫醇用于與巰基基團反應以產(chǎn)生可還原鍵的胺反應交聯(lián)劑的例子是SPDP、SMPT、SATA或SATP,所有這些可從Pierce購買。這些交聯(lián)劑僅僅是示例性的,預期許多可選的方案可連接神經(jīng)胚素氨基末端與血清白蛋白。熟練的技術人員也能產(chǎn)生非靶向神經(jīng)胚素氨基末端或血清白蛋白硫醇組分的血清白蛋白偶聯(lián)物。用基因工程創(chuàng)造的神經(jīng)胚素預期是功能性的,其中神經(jīng)胚素與血清白蛋白基因在氨基末端和/或羧基末端融合。
這種方法可通過常規(guī)改造而擴大,適應任何神經(jīng)胚素-血清白蛋白偶聯(lián)物,其在動物從而人類中產(chǎn)生具有延長半衰期的產(chǎn)物。
實施例7人類神經(jīng)胚素的結晶及結構測定 硒蛋氨酸(selenomethionine)標記的神經(jīng)胚素用標準的程序表達以抑制蛋氨酸的生物合成(Van Duyne,等,1991,Science 252,839-842)。野生型神經(jīng)胚素及硒蛋氨酸摻入的神經(jīng)胚素濃縮至17mg/ml、0.8M精氨酸中。蛋白母液濃縮至17mg/ml、0.8M精氨酸中。通過懸滴蒸汽擴散法(hanging-dropvapor diffusion method)(Jancarik,J.&Kim,S.H.,1991,J.Appl.Crystallogr.24,409-411)從1.25M硫酸鎂,0.1M MES pH 6.5、在20℃長出晶體。通過微播種法獲得可再生性最強的晶體。這些晶體的低溫防護是通過每60秒加入5%乙二醇至終濃度1.25M硫酸鎂、0.1M MES pH 6.5及30%(v/v)乙二醇,然后快速轉移入液氮中冷凍來進行。
晶體每一側大約100微米,用National Synchrotron Light Source(Upton,N.Y.)在射束(beamline)X4A衍射(diffract)至1.6A。用HKL程序包(Otwinowski(1993 inProceeding of the CCP4Study WeekendData Collection andProcessing(Sawer等,Eds.)pp.56-62,Daresbury Laboratory,Warrington))處理數(shù)據(jù)顯示,晶體屬于C2空間群,具有1個共價二聚體每個非對稱單位及大約細胞維數(shù)

及α=γ=90°,β=99°。
晶體結構通過多重同形晶替換(multiple isomorphous replacement)解決。天然神經(jīng)胚素晶體浸于1mM PtCl44小時,10mM IrCl372小時及10mMIrCl618小時,收集數(shù)據(jù)并通過HKL組(suit)(Otwinowski等,見上文)處理。兩種硒蛋氨酸位點通過同形(isomorphous)及異常(anomalous)差異帕特森圖(difference patterson)檢測而定位。剩余的位點用SOLVE(4)定位。這些階段(phase)通過RESOLVE(Terwilliger等,1999,Acta Crystallogr.D.55,849-861)改善稱為靈敏值(merit)0.56的圖,且所得圖譜(map)有充足的質(zhì)量(sufficientquality)來追蹤(trace)神經(jīng)胚素模型。利用O2D的交替循環(huán)的模型構建(Alternating cycles of model building with O2D)(5G J Kleywegt & T A Jones,″O2D-the manual″,software manual,Uppsala,1994)、以及利用mlhl靶用CNX的精制并相對于硒蛋氨酸數(shù)據(jù)進行改進(refinement with CNX using a mlhltarget and refined against the selenomethionine data)可產(chǎn)生出神經(jīng)胚素蛋白的完整模型,其中除外89個水分子及6個硫酸根陰離子,也除外氨基末端前13個氨基酸(the first amino-terminal 13amino acids)。對于2.0

,最終的R游離(free)是28.5%且R因子是24.7%,并具有很好的立體化學。
實施例8硫酸肝素的結合位點及模擬(modeling) 在近似的等邊三角形的頂角的三個硫酸酯的簇(a cluster of three sulfateat the vertices of an approximate equilateral triangle)位于神經(jīng)胚素表面的前螺旋區(qū)并可代表硫酸肝素的結合位點。存在三個看上去與這些硫酸根有主要作用的精氨酸殘基。精氨酸殘基R48共連接三個硫酸酯(#2、#6及#3)。其主鏈酰胺與硫酸酯#2相互作用,而其側鏈胍基與硫酸酯#6及#3形成分叉的氫鍵。第二精氨酸殘基(R49)與硫酸根#2形成氫鍵,且第三精氨酸殘基(R51)與硫酸酯#6形成長氫鍵。
這些硫酸酯可代表硫酸肝素的結合袋(binding pocket),其如突變成非正電荷殘基可減弱硫酸肝素的結合,并在體內(nèi)給藥時可能降低及/或延遲神經(jīng)胚素分子的清除。硫酸肝素結合于神經(jīng)胚素的模型可通過用神經(jīng)胚素晶體結構中存在的硫酸酯與氨基葡聚糖的硫酸根重疊(superimpose)構建而成。在來自復合于硫酸肝素的FGF-1的晶體結構的硫酸肝素中,n及n+2個糖連接的硫酸酯可以以大約

(Pellegrini等,(2000)Nature 407,1029-1034)分開。這種測量法與硫酸根與神經(jīng)胚素結構中3-硫酸酯簇的硫酸酯間的間距非常匹配,硫酸酯#3及#6以

分開而且硫酸酯#3及#2以

分開。這種間距測量的相符性表明這種R48/R49/R51基序是肝素結合位點的一部分。這提示R48、R49或R51的單點突變?yōu)楣劝彼峄蛱於彼峄蚱渌钦姾砂被幔赡軠p弱硫酸肝素的結合親和力而并不減弱神經(jīng)胚素的受體結合活性,從而在動物并由此至人類中產(chǎn)生具有延長的半衰期的生物活性產(chǎn)物。為驗證這種可能性,我們產(chǎn)生了一系列含有突變成谷氨酸的一或多個精氨酸的構建體。突變型神經(jīng)胚素產(chǎn)物在大腸桿菌中表達、純化及再折疊,并測驗其功能。最終,檢測產(chǎn)物的結合肝素的能力及在動物中的藥物動力學和藥效動力學。
這些位點的一或多個位點可能也提供通過可用K或C代替R并應用上述的方法來實現(xiàn)PEG化的其他位點。
實施例9PEG化的突變性神經(jīng)胚素NBN106-N95K對于逆轉神經(jīng)性疼痛的神經(jīng)結扎動物模型(Nerve Ligation Animal Model)中的觸覺及熱痛覺過敏的劑量 先前我們已經(jīng)證明每周三次皮下給予大鼠1mg/kg野生型神經(jīng)胚素可幾乎完全逆轉并正?;杉股窠?jīng)結扎誘導的神經(jīng)性疼痛行為(觸覺異常性疼痛(tactile allodynia)及熱痛覺過敏)。然而,每周三次皮下給予這個模型0.03mg/kg野生型神經(jīng)胚素沒有效應,而每周三次皮下給予這個模型0.1mg/kg及0.6mg/kg野生型神經(jīng)胚素有即刻的效應。
本文,我們描述以說明在Chung L5/L6脊神經(jīng)結扎(″SNL″)模型中PEG化的N95K神經(jīng)胚素對觸覺異常性疼痛及熱痛覺過敏的逆轉效應的研究。Sprague-Dawley雄性大鼠(230-380g)分成兩組。所有的大鼠接受脊神經(jīng)結扎。對一組大鼠(n=6)經(jīng)皮下注射給予載體。對第二組大鼠(n=6,每組)經(jīng)皮下注射給予PEG化N95K神經(jīng)胚素((3(4,)×10kDa PEGNBN106-N95K))10μg/kg。(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)包含大腸桿菌-衍生的神經(jīng)胚素蛋白并含有95位Asn至Lys的氨基酸取代,然后被截短(7個氨基酸的氨基末端截短,NBN106),并最終用每個NBN二聚體平均3.3PEG組分進行PEG化,用分子量10,000Da的甲氧聚(乙二醇)琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)作為反應劑。這種載體由5mM磷酸鹽及150mM氯化鈉pH 6.5組成。在手術后(SNL后)第3、5、7、10、12及14天經(jīng)皮下注射給藥。Von Frey(Chaplan等(1994),J.Neurosci.Meth.5355-63)及Hargreave′s(Hargreaves等(1988),Pain 3277-88)的行為實驗分別用于監(jiān)控觸覺及溫覺反應。在脊神經(jīng)結扎前監(jiān)控這些痛覺反應,建立基線反應,SNL后第2天證實觸覺及熱痛覺過敏的存在,然后在SNL后第3、5、7、10、12、14及15天進行上述證實。為評估藥物處理相對于載體處理的統(tǒng)計學意義,進行1-途徑(1-way)變量分析(1-way ANOVA),然后進行Student NeumanKeuls(SNK)檢驗。
這些結果在圖3-4中描述為均值的平均±標準誤。神經(jīng)性疼痛行為的兩種類型(觸覺異常性疼痛如圖3所示,熱痛覺過敏如圖4所示)在SNL后第二天如預期完全發(fā)生。經(jīng)皮下給予脊神經(jīng)結扎的大鼠10μg/kg 3(4,)×10kDa PEG N95K-NBN106(如圖3及4下箭頭所示)導致兩種類型的神經(jīng)性疼痛(圖3觸覺、圖4溫覺)基本上及統(tǒng)計學上的顯著逆轉。脊神經(jīng)結扎大鼠內(nèi),10μg/kg(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)對溫度敏感性及觸覺異常性疼痛的影響在最初給予PEG化的N95K神經(jīng)胚素4天后變得在統(tǒng)計學上顯著。10μg/kg(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)對溫度敏感性及異常性疼痛的影響在最初給予PEG化的N95K神經(jīng)胚素大約4天后達到一個平臺期。(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)的效應在給藥的2-3天間隔期中沒有消失。事實上,在給予PEG化的N95K神經(jīng)胚素的第5天及第7天之間,疼痛行為基本正?;?。在另一個試驗(數(shù)據(jù)未顯示)中,盡管開始的效應有些低,在第3、5、7、10、12及14天皮下給予3μg/kg(3(4,)×10kDa PEGNBN106-N95K)在SNL模型中導致疼痛行為(觸覺及熱痛覺過敏)的顯著正常化。
這些結果表明在SNL模型中,3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)對于觸覺異常性疼痛及熱痛覺過敏疼痛行為的效力比非突變型非糖基化的神經(jīng)胚素的效力增加了至少100到333倍。3(4,)×10kDaPEG N95K NBN106與非突變非糖基化神經(jīng)胚素相比增強的藥物代謝動力學特性,表明系統(tǒng)地給予神經(jīng)胚素的效力與神經(jīng)胚素的血清水平相關。這些結果表明突變型神經(jīng)胚素的聚合物偶聯(lián)物可以以大大降低的劑量以及很可能(potentially)降低的劑量頻率用于治療病人的神經(jīng)性疼痛,這是由于其相對于非偶聯(lián)的神經(jīng)胚素而言具有增強的生物利用率。
表8.PEG化的NBN的生物學特征 NBN的形式 PEG化的 糖基化的 經(jīng)皮下給藥后KIRA KIRA 氨基酸 氨基酸 小鼠中的暴露~EC50 ~相對于WT的 最大效力 NBN nd 0.4-1.2nM 100% NBN104(CHO) 95,95 nd 0.7nM 90% 2X 5kDa 1,1 nd 0.2nM 105% PEG-NBN 4X5kDa PEG 1,1,95,95 nd 1nM80% NBN106-N95K 2X 10kDa 1,1 nd 0.2nM 72% PEG-NBN 1X 20kDa 1 nd 0.2nM 83%分支的 PEG-NBN 1X20kDa 1 95,95 ++ 0.3nM 110%PEG-NBN104 (CHO) 3X 10kDa 1,1,95 ++ 0.7nM 115% PEG-WT/ N95K-NBN106 3X 10kDaPEG 1,1,95 ++ 0.8nM 100% NBN106-N95K 3(,4)X 10kDa 1,1,95(,95) ++ 1.6nM 90% PEG NBN106- N95K 4X 10kDa PEG 1,1,95,95 ++ 11nM >80% NBN106-N95K 2X20kDa 1,1 + 0.6nM 80% PEG-NBN 2X 20kDa 1,95 ++ 無活性 無活性 分支的PEG NBN106-N95K 2X20kDa 1,1 95,95 ++ 1nM105%PEG-NBN104 (CHO) 注釋nd表示不可檢測,+表示低-中度暴露,++表示高暴露 注釋所有都是NBN113,除非特別指明 注釋所有都是大腸桿菌來源的,除非指明是CHO 其他實施方案 盡管具體的實施方案已詳細地在本文公開,僅是出于示例的目的而通過實施例公開,并不旨在限制所附權利要求的有關范圍。具體地,發(fā)明者認為,可以在不脫離如權利要求定義的本發(fā)明的精神或范圍的情況下對本發(fā)明進行各種取代、變化和修改。
權利要求
1.與聚合物偶聯(lián)的二聚體,其包含含有第一氨基末端氨基酸的第一多肽以及含有第二氨基末端氨基酸的第二多肽,其中每一種多肽各自包含
a)以與SEQ ID NO1的氨基酸8-113具有至少70%的序列同一性為特征的氨基酸序列;
b)當所述多肽與SEQ ID NO1的編號一致時,在位置16、43、47、80、81、109及111中每一位置的半胱氨酸殘基;
c)當與SEQ ID NO1的編號一致時,如下每一種氨基酸殘基
16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C;以及
d)LGLG重復、FRFC基序、QPCCRP基序以及SATACGC基序;
其中至少第一多肽與SEQ ID NO1相比包含至少一種氨基酸取代、插入或融合,并且其中所述取代、插入或融合提供與聚合物偶聯(lián)的內(nèi)部聚合物偶聯(lián)位點。
2.權利要求1的二聚體,其中該氨基酸序列的特征在于其與SEQ IDNO1的氨基酸8-113具有至少95%的序列同一性。
3.與聚合物偶聯(lián)的二聚體,其包含含有第一氨基末端氨基酸的第一多肽以及含有第二氨基末端氨基酸的第二多肽,其中每一種多肽各自包含SEQ ID NO6的90到140位氨基酸且其中具有1-6個氨基酸取代,每一種取代提供與聚合物偶聯(lián)的聚合物偶聯(lián)位點。
4.權利要求1的二聚體,其中該第一多肽選自由NBN113、NBN140、NBN116、NBN112、NBN111、NBN110、NBN109、NBN108、NBN107、NBN106、NBN105、NBN104、NBN103、NBN102、NBN101、NBN100及NBN99(分別為SEQ ID NO2,6-21)組成的組中。
5.權利要求1或3的二聚體,其中所述第一氨基末端氨基酸或第二氨基末端氨基酸與聚合物偶聯(lián)。
6.權利要求5的二聚體,其中所述第一氨基末端氨基酸及第二氨基末端氨基酸與聚合物偶聯(lián)。
7.權利要求3的二聚體,其中至少一種取代選自下組
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置14;
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置39;
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置68;以及
除天冬酰胺以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置95;
其中所述氨基酸位置的編號與SEQ ID NO1的多肽序列一致。
8.權利要求1的二聚體,其中所述氨基酸取代是賴氨酸取代天冬酰胺。
9.權利要求3的二聚體,其中所述氨基酸取代是賴氨酸取代天冬酰胺。
10.利要求1的二聚體,其中所述氨基酸取代是賴氨酸取代精氨酸。
11.權利要求3的二聚體,其中所述氨基酸取代是賴氨酸取代精氨酸。
12.權利要求1的二聚體,其中所述氨基酸取代是中性或酸性氨基酸取代48、49或51位的精氨酸。
13.權利要求12的二聚體,其中所述中性或酸性氨基酸選自谷氨酸或天冬氨酸。
14.權利要求9的二聚體,其中所述取代在95位。
15.權利要求1的二聚體,其中所述取代是天冬氨酸取代95位天冬酰胺。
16.權利要求1或2的二聚體,其中所述聚合物的平均分子量是約2000Da到約100,000Da。
17.權利要求11的二聚體,其中所述聚合物的平均分子量是約5000Da到約50,000Da。
18.權利要求12的二聚體,其中所述聚合物的平均分子量是約10,000Da到約20,000Da。
19.權利要求1或3的二聚體,其中所述聚合物是線性的。
20.權利要求1或3的二聚體,其中所述聚合物是分支的。
21.權利要求1或3的二聚體,其中所述聚合物基本上由聚亞烷基二醇組分組成。
22.權利要求16的二聚體,其中所述聚亞烷基二醇組分是PEG組分。
23.權利要求1或3的二聚體,其中至少一種多肽是糖基化的。
24.與聚合物偶聯(lián)的二聚體,其包含第一多肽及第二多肽,其中(a)每一種多肽各自包含SEQ ID NO1的100到110個氨基酸,(b)每一種多肽在SEQ ID NO1中的氨基酸95包含天冬酰胺-到-賴氨酸的取代,(c)且該二聚體包含3或4個PEG組分,其中每個PEG組分的分子量大約10,000Da,且每個PEG組分在氨基末端或在95位賴氨酸處偶聯(lián)。
25.一種組合物,其包含
a)NBN106-N95K的同源二聚體,其與分子量大約10,000Da的三個PEG聚合物相偶聯(lián);
b)NBN106-N95K的同源二聚體,其與分子量大約10,000Da的四個PEG聚合物相偶聯(lián);或
c)至少兩種不同的根據(jù)權利要求1或3所述的二聚體的混合物。
26.核酸,其編碼權利要求1或3的第一多肽。
27.宿主細胞,其由權利要求21的核酸轉化。
28.一種治療哺乳動物中的神經(jīng)性疼痛的方法,該方法包括給予哺乳動物治療有效量的權利要求1或3的二聚體。
29.權利要求23的方法,其中所述治療有效量為從0.01μg/kg到1000μg/kg。
30.權利要求24的方法,其中所述治療有效量為從1μg/kg到100μg/kg。
31.權利要求25的方法,其中所述治療有效量為從1μg/kg到30μg/kg。
32.權利要求26的方法,其中所述治療有效量為從3μg/kg到10μg/kg。
33.權利要求23的方法,其中所述二聚體通過經(jīng)肌肉內(nèi)遞送或經(jīng)皮下遞送給藥。
34.一種在哺乳動物中活化RET受體的方法,該方法包括給予該哺乳動物有效量的權利要求1或3的二聚體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種二聚體,其包含與聚合物偶聯(lián)的突變的神經(jīng)胚素多肽。這些二聚體呈現(xiàn)延長的生物利用率,并且在優(yōu)選實施方案中,相對于神經(jīng)胚素的野生形式的延長的生物活性。
文檔編號A61P25/02GK101166753SQ200480009133
公開日2008年4月23日 申請日期2004年2月2日 優(yōu)先權日2003年1月31日
發(fā)明者迪納·W·Y·薩, R·布萊克·佩平斯基, 葆拉·A·博里亞克-肖丁, 斯蒂芬·S·米勒, 安東尼·羅索曼多, 勞拉·西爾維安 申請人:比奧根艾迪克Ma公司
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