專利名稱：聚合物－因子Ⅷ部分共軛物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及包括因子VIII部分(即具有因子VIII活性的部分)和聚合物的共軛物。
此外，本發(fā)明涉及包括所述共軛物的組合物、合成所述共軛物的方法和治療患者的方法。
背景技術(shù)：
止血是阻止血液從損傷血管流出的過程。就哺乳動物以及許多其它生物而言，止血過程對繼續(xù)存活來說具有決定性的重要意義。例如，止血過程中的缺陷可以導(dǎo)致不能有效形成用于使血管損傷后失血停止的血塊。在人體中，患有不能形成血塊的個體稱作血友病患者。對血友病患者特別關(guān)注的是危及生命的危險，出血一旦開始，它就從不會停止。
一般來說，血友病患者缺乏產(chǎn)生形成血塊所需的有效量的一種或多種物質(zhì)的能力。例如，患有血友病A(也稱作典型血友病″)的血友病患者不能產(chǎn)生有效水平的因子VIII(也稱作″抗血友病因子A″、″抗血友病球蛋白″和″AHG″)。因子VIII是導(dǎo)致血塊形成的幾種″級聯(lián)″反應(yīng)之一中的關(guān)鍵成分。對稱作″內(nèi)在途經(jīng)″的反應(yīng)級聯(lián)關(guān)鍵的，因子VIII最終影響血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血塊的主要成分血纖蛋白。
盡管血塊形成的內(nèi)在途經(jīng)相對復(fù)雜，但是可以簡單描因子VIII的作用。在有相對少量凝血酶存在下(例如，由破裂的組織細(xì)胞釋放)，因子VIII被轉(zhuǎn)化成其活化形式，稱作因子VIIIa。因子VIIIa(與其它物質(zhì)一起)依次使另一種因子，因子X活化成因子Xa。此后，因子Xa(與其它物質(zhì)一起)將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，結(jié)果隨時間內(nèi)產(chǎn)生相對大量的凝血酶。相對大量的凝血酶有效地將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白。血纖蛋白依次形成導(dǎo)致血塊形成的基質(zhì)或晶格。將因子VIII在凝血的內(nèi)在途經(jīng)中的作用圖示如下。
在所有群體中，每10,000個生下來活著的嬰兒中影響1個或2個男性，所以血友病A可能因位于X-染色體上的因子VIII基因各種突變中的任意一個所致。隨特定突變的不同，血友病A自身可以表現(xiàn)為重度、中度或輕度?；加凶顕?yán)重形式血友病A的個體完全缺乏表達(dá)因子VIII的活性形式的能力。在臨床上，受血友病A侵害的個體遭受肌肉出血、關(guān)節(jié)出血、易青腫和從傷口出血延長。患血友病A的未經(jīng)治療的個體平均年齡為20歲。目前對血友病A的治療包括輸注收集自人血漿或通過重組DNA技術(shù)制備的外源性因子VIII濃縮物。因為這些治療僅用于補充缺乏的有效水平的因子VIII，所以因因子VIII受到損害的個體需要在其整個生命過程中定期注射因子VIII濃縮物。
可以得到因子VIII濃縮物的幾種商品形式以提供對患有血友病A的患者的代替療法。例如，以HemofilM(Baxter，Deerfield，IL)、Koate-DVI(Bayer，Research Tringle Park，NC)、Monarc-MTM(American Red Cross，Washington，D.C.)和Monoclate-P(Aventis，Bridgewater，NJ)商標(biāo)銷售的血液衍生的因子VIII濃縮物產(chǎn)品。就以重組方式制備的因子VIII濃縮物而言，以HelixateFS(Aventis，Bridgewater，NJ)、Kogenate FS(Bayer，ResearchTriangle Park，NC)、Recombinate(Baxter，Deerfield，IL)、Advate(Baxter，Deerfield，IL)和ReFacto(Wyeth/GeneticsInstitute，Cambridge，MA)商標(biāo)提供商品。
一般來說，重組來源的因子VIII濃縮物優(yōu)于血液衍生來源，因為后者涉及傳播病毒和/或其它與獻(xiàn)血相關(guān)的疾病的風(fēng)險。盡管基于重組的制品避免了這些缺陷，但是基于重組的產(chǎn)品的加工通常需要存在某些蛋白質(zhì)，諸如清蛋白，它們不可避免地存在于給予患者的最終制品中。接受這類制品的患者通常發(fā)生對這些外來蛋白的過敏反應(yīng)。在任何情況下，血液衍生和基于重組的產(chǎn)品均遭受反復(fù)給藥的缺點。
已經(jīng)將聚乙二醇化或聚(乙二醇)衍生物與蛋白質(zhì)結(jié)合描述為減輕免疫原性的方式以及延長蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期的方式。然而，就因子VIII而言，先前形成蛋白質(zhì)-聚合物共軛物的經(jīng)驗已經(jīng)證實與聚合物與因子VIII偶聯(lián)相比較幾乎沒有預(yù)測值。參見美國專利No.4,970,300。
盡管存在這些困難，但是已經(jīng)描述了制備令人滿意的某些聚合物與因子VIII的共軛物的組合物的嘗試。例如，上述參照的美國專利No.4,970,300中描述了使用具有約500-5,000分子量的特定聚(乙二醇)衍生物使因子VIII聚乙二醇化。另外，美國專利No.6,048,720中描述了當(dāng)4至5個一甲氧基聚(乙二醇)鏈與因子VIII軛合時有效保護免受體外環(huán)境中的降解。
然而，證實這些所述的共軛物中沒有一種可以令人滿意地解決與目前基于因子VIII療法相關(guān)的難題。例如，由相對小的聚合物(例如約5,000道爾頓或5,000道爾頓以下)組成的共軛物可能無法適當(dāng)提供延長的體內(nèi)半衰期和/或充分減輕的免疫反應(yīng)。此外，帶有多種與因子VIII結(jié)合的個體聚合物的共軛物因聚合物封閉位點對活性而言必不可少而更可能具有下降的活性。
因此，本領(lǐng)域中仍然存在提供另外的水溶性聚合物與具有因子VIII活性的部分之間的共軛物的需求。本發(fā)明由此涉及這類共軛物以及包括所述共軛物的組合物和本文所述的相關(guān)方法，認(rèn)為它們是新的且在本領(lǐng)域中完全沒有啟示。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的主要目的在于提供包括多種共軛物的組合物，盡管不必需地，但是優(yōu)選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物優(yōu)選具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約100,000道爾頓的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供這類共軛物，其中所述每一水溶性聚合物為聚(環(huán)氧烷)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供這類共軛物，其中所述每一水溶性聚合物為聚(乙二醇)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供包括多種單聚乙二醇化因子VIII部分共軛物的共軛物。
本發(fā)明的還另一個目的在于提供制備聚合物共軛物的方法，該方法包括在足以產(chǎn)生多種共軛物的條件下使一種或多種活化的水溶性聚合物與因子VIII部分接觸的步驟，盡管不必需地，但是優(yōu)選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物，其中所述的水溶性聚合物優(yōu)選具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供治療需要因子VIII療法的患者的方法，該方法包括對所述患者給予本文所述的組合物的步驟，其中該組合物含有治療有效量的一種或多種所述共軛物。
本發(fā)明的還另一個目的在于提供制備水溶性聚合物-因子VIII部分共軛物的方法，該方法包括在共軛條件下使因子VIII部分與聚合物試劑接觸的步驟。
如下的本說明書中將列出本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新特征且部分對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀下文后將變得顯而易見或可以通過實施本發(fā)明而得知。
然后在一個實施方案中，提供了包括多種共軛物的組合物，盡管不必需地，但是優(yōu)選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物優(yōu)選具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍內(nèi)。盡管可以使用任意的因子VIII部分，但是優(yōu)選該組合物包括因子VIII本身(例如，如美國專利No.4,757,006中所述)、因子VIIIa(即當(dāng)因子VIII與相對少量凝血酶接觸時產(chǎn)生因子VIII的活化形式)、因子VIIIvWF(即與馮維勒布蘭德因子結(jié)合的因子VIII)和/或因子VIII的截短形式，諸如B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(例如，如美國專利No.4,868,112中所述)。
聚合物可以為任意的水溶性聚合物且本發(fā)明在這方面沒有限制。不過，優(yōu)選共軛物中存在的各聚合物選自由聚(環(huán)氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰嗎啉)及其組合組成的組。然而，特別優(yōu)選將聚(環(huán)氧烷)，諸如聚(乙二醇)衍生物用作本發(fā)明中的聚合物。
本文所述的共軛物有利地減輕免疫原性，即許多用外源性來源的因子VIII治療的血友病患者遇到的問題。此外，本發(fā)明的共軛物與不含共軛物的因子VIII組合物相比對給藥頻率的需求減少。通過減少給藥頻率，所述的共軛物有利地減少了血友病患者必須耐受以提供持續(xù)水平的具有因子VIII活性的藥劑的疼痛注射次數(shù)。
在另一個實施方案中，提供了制備共軛物的方法。該方法包括使一種或多種活化的、水溶性聚合物(即聚合物試劑)與因子VIII部分接觸的步驟，其中所述的一種或多種活化的、水溶性聚合物優(yōu)選具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍內(nèi)?？梢栽诒绢I(lǐng)域中任意公知的方法條件下完成所述的水溶性聚合物的活化，只要所得聚合物在適當(dāng)pH、溫度等條件下將形成共價鍵，使得因子VIII部分與所述聚合物共價結(jié)合。在活化的、水溶性聚合物在所述部分的所需位置上形成共價結(jié)合所要求的那些條件下進行一種或多種活化的、水溶性聚合物與因子VIII部分的接觸。該方法產(chǎn)生多種共軛物，盡管不必需地，但是優(yōu)選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物。在某些情況中，所述的共軛物可以包括與2、3、4、5、6、7、8或更多因子VIII部分結(jié)合的單一聚合物。任選地，可以將所得組合物進一步加工以除去不需要的種類，諸如帶有不需要數(shù)量聚合物的共軛物。為了除去這類不需要的種類，可以使用純化技術(shù)，諸如尺寸排阻色譜法。
在本發(fā)明的還另一個實施方案中，提供了包括與藥物上可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明共軛物的組合物。該組合物包括所有類型的制劑且特別是那些適合于注射的制劑，諸如可以被重構(gòu)的粉末和液體(例如混懸液和溶液)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了給予所述共軛物的方法。這種給藥方法包括對患者給予本文所述的組合物的步驟，其中該組合物含有治療有效量的所述共軛物。一般來說，通過注射(例如肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射等)進行含有共軛物的組合物的給藥步驟。
附圖簡述附

圖1是對應(yīng)于如實施例6中所述的用30K的mPEG-SPA使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化時形成的反應(yīng)混合物的SEC圖。
附圖2是對應(yīng)于如實施例6中所述的通過使蛋白質(zhì)與30K的mPEG-SPA軛合制備的純化的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII-PEG共軛物的SEC圖。
附圖3是對應(yīng)于如實施例7中所述的用20K的mPEG-MAL使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化時形成的反應(yīng)混合物的SEC圖。正如可以觀察到的，單聚乙二醇化產(chǎn)物的產(chǎn)率約為33％。
附圖4是對應(yīng)于如實施例7中所述的通過使蛋白質(zhì)與20K的mPEG-MAL軛合制備的純化的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII-PEG共軛物的SEC圖。
附圖5是對應(yīng)于如實施例8中所述的用30K的mPEG-SMB使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化時形成的反應(yīng)混合物的SEC圖。單聚乙二醇化產(chǎn)蛋白質(zhì)(1-鏈節(jié))的產(chǎn)率約為41％。
發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)理解本發(fā)明并非限于特定的聚合物、合成技術(shù)、因子VIII部分等，因為它們可以改變。
必須注意，除非上下文中另有清楚的說明，作為本說明書和權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式″一個(a)″、″一種(an)″和″所述的(the)″包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如涉及的″聚合物″包括單一聚合物和兩種或更多種相同或不同的聚合物，涉及的″任選的賦形劑″指的是單一可選的賦形劑和兩種或更多種相同或不同的可選賦形劑等。
在描述和要求保護本發(fā)明中，按照下文所述的定義使用下列術(shù)語。
本文所用的″PEG″、″聚乙二醇″和″聚(乙二醇)″可以互換使用且用以包括任意水溶性聚(環(huán)氧乙烷)。一般來說，用于本發(fā)明的PEGs包括如下結(jié)構(gòu)″-(OCH2CH2)n-″，其中(n)為2至4000。本文所用的PEG還包括″-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-″和″-(OCH2CH2)nO-″，這取決于末端氧是否被取代。在說明書和權(quán)利要求的全文中，應(yīng)記住術(shù)語″PEG″包括帶有各種末端或″封端″基團等的結(jié)構(gòu)。術(shù)語″PEG″還指含有大多數(shù)，即大于50％的-OCH2CH2-重復(fù)亞單位的聚合物。就具體形式而言，PEG可以采用任意數(shù)量的不同分子量以及結(jié)構(gòu)或幾何結(jié)構(gòu)，諸如″支化″、″線型″、″叉形″、″多官能″等，在下文中更詳細(xì)地描述。
術(shù)語″封端″和″末端封端″在本文中可以互換使用以指帶有封端部分的聚合物末端或端點。一般來說，盡管不必需地，但是封端部分包括羥基或C1-20烷氧基，更優(yōu)選C1-10烷氧基且更優(yōu)選C1-5烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和芐氧基)以及芳基、雜芳基、環(huán)、雜環(huán)等。必須記住封端部分可以包括聚合物上末端單體中的一個或多個原子[例如在CH3(OCH2CH2)n-上的封端部分″甲氧基″]。此外，設(shè)想到上述物質(zhì)中每一種的飽和、不飽和、取代和未被取代的形式。此外，封端基還可以為硅烷。封端基還可以有利地包括可檢測標(biāo)記。當(dāng)聚合物帶有包括可檢測標(biāo)記的封端基時，可以通過使用合適的檢測器測定聚合物和/或聚合物所偶聯(lián)的部分(例如活性劑)的量或位置。這類標(biāo)記包括，但不限于熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、用于酶標(biāo)記的部分、比色劑(例如染料)、金屬離子、放射性部分等。合適的檢測器包括光度計、薄膜、分光光度計等。封端基還可以有利地包括磷脂。當(dāng)聚合物帶有包括磷脂的封端基時，獨特特性可以被賦予給聚合物和所得共軛物。典型的磷脂類包括，但不限于那些選自稱作磷脂酰膽堿類的磷脂類。具體的磷脂類包括，但不限于那些選自二月桂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、山萮酰磷脂酰膽堿、花生四烯酰磷脂酰膽堿(arachidoylphosphatidylcholine)和卵磷脂組成的組的磷脂。
就本文所述的聚合物，″非天然存在的″指的是其整體在天然中未發(fā)現(xiàn)的聚合物。不過，本發(fā)明非天然存在的聚合物可以含有一種或多種天然存在的單體或單體鏈段，只要總體聚合物結(jié)構(gòu)在天然中未發(fā)現(xiàn)。
作為″水溶性聚合物″中的術(shù)語″水溶性″聚合物是在室溫下溶于水的任意聚合物。一般來說，水溶性聚合物將透過至少約75％，更優(yōu)選至少約95％的由過濾后相同溶液透過的光。以重量為基礎(chǔ)，水溶性聚合物將優(yōu)選至少約35％(按重量計)溶于水，更優(yōu)選至少約50％(按重量計)溶于水，更優(yōu)選至少約70％(按重量計)溶于水且更優(yōu)選至少約85％(按重量計)溶于水。不過，最優(yōu)選水溶性聚合物約95％(按重量計)溶于水或完全溶于水。
就諸如PEG這類水溶性、非天然存在的聚合物而言的″標(biāo)稱平均分子量″指的是該聚合物的質(zhì)量平均分子量，一般通過尺寸排阻色譜法MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸/離子化)、光散射技術(shù)或在1，2，4-三氯苯中內(nèi)在速度測定來測定。這些聚合物一般為多分散系，具有的低多分散性值優(yōu)選小于約1.2，更優(yōu)選小于約1.15，更優(yōu)選小于約1.10，更優(yōu)選小于約1.05和最優(yōu)選小于約1.03。
與特定官能團結(jié)合使用的術(shù)語″活性″或″活化的″指的是易于與另一分子上的親電體或親核體反應(yīng)的反應(yīng)性官能團。這與需要強催化劑或非常不實際反應(yīng)條件才能反應(yīng)的那些基團(即″非反應(yīng)性″或″惰性″基團)相反。
本文所用的術(shù)語″官能團″或其任意的同義詞用以包括其被保護形式和未被保護形式。
本文所用的術(shù)語″鍵″或″連接體″指的是任選用于連接互聯(lián)部分的原子或原子團，所述的互聯(lián)部分諸如聚合物鏈段和因子VIII部分的末端或因子VIII部分的親電子體或親核體。本發(fā)明的連接體可以是水解穩(wěn)定的或可以包括生理上可水解的或酶可降解的鍵。
″烷基″指的是一般長度約1至15個原子的烴鏈。優(yōu)選這類烴鏈，但不必需是飽和的且可以為支鏈或直鏈，不過一般優(yōu)選直鏈。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。本文所用的″烷基″包括環(huán)烷基以及含有亞環(huán)烷基的烷基。
″低級烷基″指的是含有1至6個碳原子的烷基且可以為直鏈或支鏈，作為典型的有甲基、乙基、正丁基、異丁基和叔丁基。
″環(huán)烷基″指的是飽和或不飽和的環(huán)狀烴鏈，包括橋連、稠合或螺環(huán)化合物，優(yōu)選由3至約12個碳原子，更優(yōu)選由3至約8個原子構(gòu)成?！鍋啳h(huán)烷基″指的是通過在環(huán)系上的任意兩個碳上結(jié)合鏈被插入烷基鏈的環(huán)烷基。
″烷氧基″指的是-O-R基團，其中R為烷基或取代的烷基，優(yōu)選C1-6烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
作為例如″取代的烷基″中的術(shù)語″取代的″指的是被一個或多個非干擾取代基取代的部分(例如烷基)，諸如，但不限于烷基；C3-8環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基等；鹵素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低級苯基；取代的苯基等?！迦〈姆蓟鍨閹в幸粋€或多個非干擾基團作為取代基的芳基。就苯基環(huán)上的取代基而言，取代基可以為任意方向(即鄰位、間位或?qū)ξ?。
″非干擾取代基″是那些當(dāng)存在于分子上時，一般不與該分子內(nèi)包含的其它官能團反應(yīng)的基團。
″芳基″指的是一種或多種各自有5或6個核碳原子的芳族環(huán)。芳基包括可以作為在萘基上稠合或在作為聯(lián)苯基上未稠合的多個芳基環(huán)。芳基環(huán)也可以與一種或多種環(huán)烴、雜芳基或雜環(huán)稠合或不與它們稠合。本文所用的″芳基″包括雜芳基。
″雜芳基″為含有1至4個雜原子，優(yōu)選硫、氧或氮或其組合的芳基。雜芳基環(huán)還可以與一種或多種環(huán)烴、雜環(huán)、芳基或雜芳基環(huán)稠合。
″雜環(huán)(heterocycle)″或″雜環(huán)(heterocyclic)″指的是一個或多個5-12個原子，優(yōu)選5-7個原子的環(huán)，它們具有或沒有不飽和性或芳香性且?guī)в兄辽僖粋€不為碳的環(huán)原子。優(yōu)選的雜原子包括硫、氧和氮。
″取代的雜芳基″為帶有一個或多個非干擾基團作為取代基的雜芳基。
″取代的雜環(huán)″為帶有一個或多個由非干擾取代基形成的側(cè)鏈的雜環(huán)。
″親電子體″和″親電子基團″指的是可以為離子的、帶有親電中心的離子或原子或原子團，即所述的親電中心是尋找電子、能夠與親核體反應(yīng)的中心。
″親核體″和″親核基團″指的是可以為離子的帶有親核中心的離子或原子或原子團，即所述的親核中心是尋找親電子中心或帶有親電子體的中心。
″生理上可裂解的″或″可水解的″或″可降解的″鍵為在生理條件下與水反應(yīng)(即被水解的)鍵。優(yōu)選的是在25℃、pH 8下具有小于約30分鐘的水解半衰期的鍵。鍵在水中水解的趨向?qū)⒉粌H取決于連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且取決于與這些中心原子連接的取代基。合適的水解不穩(wěn)定或弱的鍵包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐類、縮醛類、酮縮醇類、酰氧基烷基醚、亞胺類、原酸酯類、肽類和寡核苷酸類。
″酶可水解的鍵″指的是易受一種或多種酶降解的鍵。
″水解穩(wěn)定的″鍵(linkage)或鍵(bond)指的是在水中實質(zhì)上穩(wěn)定的化學(xué)鍵，一般為共價鍵，即在生理條件下在延長時間期限內(nèi)不會水解至任何可察覺的程度。水解穩(wěn)定鍵的實例包括，但不限于如下碳-碳鍵(例如在脂族鏈上)、醚類、酰胺類、尿烷類等。一般來說，水解穩(wěn)定的鍵為在生理條件下表現(xiàn)出低于約1-2％/天的水解速率的鍵。有代表性的化學(xué)鍵的水解速率可以在大部分標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)教科書中找到。
″藥物上可接受的賦形劑或載體″指的是可以任選被包括在本發(fā)明組合物中且不會對患者產(chǎn)生明顯不良毒理學(xué)作用的賦形劑。″藥理有效量″、″生理有效量″和″治療有效量″在本文中可以互換使用以指在血流或靶組織中提供所需水平的共軛物(或相應(yīng)的未軛合的因子VIII部分)所需要的聚合物-因子VIII部分共軛物的量。精確量將取決于許多因素，例如特定的因子VIII部分、治療組合物中的成分和物理特性、所針對的患者群體、個體患者的考慮等且易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文提供的信息確定。
″多官能″指的是帶有其中含有的3個或更多官能團的聚合物，其中所述的官能團可以相同或不同。本發(fā)明的多官能團聚合物試劑將一般在聚合物骨架內(nèi)含有約3-100個官能團或3-50個官能團或3-25個官能團或3-15個官能團或3-10個官能團或?qū)⒑?、4、5、6、7、8、9或10個官能團。
本文所用的術(shù)語″因子VIII部分″指的是具有因子VIII活性的部分。因子VIII部分還將帶有至少一個適合于與聚合物試劑反應(yīng)的親電子基團或親核基團。盡管不必需是，但是因子VIII部分一般為蛋白質(zhì)。此外，術(shù)語″因子VIII部分″包括軛合前的因子VIII部分和軛合后的因子VIII部分殘基。正如下文進一步具體解釋的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定任意指定的部分是否具有因子VIII活性。
術(shù)語″患者″指的是患有或易患可以通過給予活性劑(例如共軛物)預(yù)防或治療的狀況的活生物且包括人和動物。
″任選″或″任選地″指的是隨后所述的情況可以發(fā)生，也可以不發(fā)生，使得該描述包括情況發(fā)生的實例和情況不發(fā)生的實例。
將肽類中的氨基酸殘基縮寫如下苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為Leu或L；異亮氨酸為Ile或I；甲硫氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為Lys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；且甘氨酸為Gly或G。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)向本發(fā)明的第一個實施方案，該實施方案提供了包括多種共軛物的組合物，盡管不必需地，但優(yōu)選所述的共軛物各自帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物優(yōu)選具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍內(nèi)。
天然因子VIII為2,351個氨基酸的單鏈糖蛋白，它在結(jié)構(gòu)上構(gòu)成為A1-A2-B-A3-C1-C2。表達(dá)的2,351個氨基酸序列作為SEQ.ID.NO1提供。然而，當(dāng)表達(dá)的多肽被易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中時，19-氨基酸信號序列被裂解，產(chǎn)生第二序列。研究人員通常將本文作為SEQ.ID.NO2提供、缺少引導(dǎo)的19個氨基酸的這第二序列用于給指定的因子VIII的氨基酸殘基指定位置編號(例如Arg372)。因此，除非有特別的說明，本文提供的氨基酸殘基的所有指定的編號位置均基于SEQ.ID.NO2。
在有相對少量凝血酶存在下，因子VIII在Arg372、Arg740和Arg1689上被凝血酶裂解而產(chǎn)生因子VIIIa。因子VIIIa是由與凝血酶-裂解的輕鏈A3-C1-C2結(jié)合(通過銅離子)的A1亞單位和通過離子相互作用與A1結(jié)合的游離A2亞單位組成的異三聚體。將理解因子VIII部分并不僅限于因子VIII″活性″形式(例如因子VIIIa)且術(shù)語″因子VIII部分″包括″前體″形式和具有類似的前凝血劑作用的其它物質(zhì)。
對任何指定的部分而言，測定該部分是否具有因子VIII活性是可能的。例如，已經(jīng)有意識地繁殖了存在血友病遺傳突變的幾種動物品系，使得由這類品系產(chǎn)生的動物具有極低和不足水平的因子VIII。這類品系可獲自各種來源，諸如，但不限于Division of Laboratoriesand Research，New York Department of Public Health，Albany，NY；和Department of Pathology，University of North Carolina，ChapelHill，NC。例如，這兩種來源提供了患有犬血友病A的犬。為了測試討論中任何指定部分的因子VIII活性，將該部分注入患病動物，做小切口并與健康對照比較出血時間。另一種適用于測定因子VIII活性的方法在于測定輔因子和前凝血劑活性。例如，參見Mertens等(1993)《英國血液病學(xué)雜志》(Brit.J.Haematol.)85133-42。還可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法用于測定指定部分是否具有因子VIIII活性。這類方法適用于測定所述部分自身(且由此可被用作″因子VIII部分)以及相應(yīng)的聚合物-部分共軛物的因子VIII活性。
因子VIII部分的非限制性實例包括如下因子VIII；因子VIIIa；因子VIIIC；因子VIIIvWF；B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(和因子VIII的其它截短形式)；雜交蛋白，諸如那些描述在美國專利No.6,158,888中的蛋白；具有因子VIII活性的糖基化蛋白，諸如那些描述在美國專利申請No.2003/0077752中的蛋白；和具有因子VIII活性的肽模擬物。優(yōu)選的截短的因子VIII形式(被術(shù)語″B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII包括的)對應(yīng)于具有人因子VIII的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)的蛋白質(zhì)，所述的人因子VIII的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)帶有對應(yīng)于Arg759和Ser1709之間區(qū)內(nèi)至少581個氨基酸的缺失，更優(yōu)選其中的缺失對應(yīng)于Pro1000和Asp1582之間的區(qū)和Thr778和Pro1659之間的區(qū)和Thr778和Glu1694之間的區(qū)之一。維持至少一定程度因子VIII活性的上述任意的生物活性片段、缺失變體、取代變體或添加變體也可起因子VIII部分的作用。
還可以將具有因子VIII活性的部分有利地修飾成包括一種或多種氨基酸殘基，諸如賴氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸以便提供聚合物與氨基酸側(cè)鏈內(nèi)原子的便利結(jié)合。用于添加氨基酸殘基的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。參考下列文獻(xiàn)J.March，《高級有機化學(xué)反應(yīng)機制和結(jié)構(gòu)》(Advanced Organic ChemistryReactionsMechanisms and Structure)，第4版(New YorkWiley-Interscience，1992)。
因子VIII部分可以獲自血液衍生的來源。例如，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的沉淀和離心技術(shù)從人血漿中分級分離因子VIII。例如，參見Wickerhauser(1976)《輸血》(Transfusion)16(4)345-350；和Slichter等(1976)《輸血》(Transfusion)16(6)616-626。因子VIII還可以分離自人粒細(xì)胞。參見Szmitkoski等(1977)《血液病學(xué)》(Haematologia)(Budap.)11(1-2)177-187。
此外，因子VIII部分還可以獲自重組方法。簡單的說，重組方法包括構(gòu)建編碼所需多肽或片段的核酸、將該核酸克隆入表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞或幼倉鼠腎細(xì)胞)并表達(dá)該核酸以產(chǎn)生所需多肽或片段。用于在體外和原核和真核宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和表達(dá)重組多肽類的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，參見美國專利No.4,868,122。
為了有利于鑒定和純化重組多肽，可以符合編碼序列讀框地插入或加入編碼表位tag或其它親和結(jié)合序列的核酸序列，由此產(chǎn)生由所需多肽和適合于結(jié)合的多肽組成的融合蛋白?？梢酝ㄟ^下列步驟鑒定和純化融合蛋白首先使含有所述融合蛋白的混合物通過帶有定向于融合蛋白中的表位tag或其它結(jié)合序列的結(jié)合部分(例如抗體)的親和柱，由此結(jié)合柱內(nèi)的融合蛋白。此后，可以通過用合適的溶液(例如酸)洗滌該柱以釋放結(jié)合的融合蛋白回收所述的融合蛋白。還可以通過裂解宿主細(xì)胞、例如通過尺寸排阻色譜法分離多肽并收集該多肽來鑒定和純化重組多肽。這些和其它用于鑒定和純化重組多肽類的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本發(fā)明的組合物可以包括多種共軛物，每一共軛物由相同的因子VIII部分組成(即在完整的組合物內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)有一種類型的因子VIII部分)。此外，該組合物可以包括多種共軛物，其中任何給定的共軛物均由選自由兩種或更多種不同因子VIII部分組成的組的部分組成(即在完整的組合物內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種或更多種不同的因子VIII部分)。然而，最佳情況的是，在該組合物中實質(zhì)上所有數(shù)量的共軛物(例如在該組合物中85％或更多數(shù)量的共軛物)各自由相同的因子VIII部分組成。
此外，優(yōu)選含有所述共軛物的組合物不含或?qū)嵸|(zhì)上不含清蛋白。還優(yōu)選該組合物不含或?qū)嵸|(zhì)上不含不具有因子VIII活性的蛋白質(zhì)。因此，優(yōu)選該組合物85％，更優(yōu)選95％且最優(yōu)選99％不含清蛋白。另外，優(yōu)選該組合物85％，更優(yōu)選95％且最優(yōu)選99％不含不具有因子VIII活性的任何蛋白質(zhì)。
如上所述，每一共軛物包括與水溶性聚合物結(jié)合的因子VIII部分。就所述的水溶性聚合物而言，該水溶性聚合物是非肽的、無毒性的、非天然存在的和生物相容性的。就生物相容性而言，將物質(zhì)視為生物相容性的條件是與單獨使用該物質(zhì)或與活組織相關(guān)(例如對患者給藥)的另一種物質(zhì)(例如活性劑，諸如因子VIII部分)一起使用有關(guān)的有益作用超過了由臨床醫(yī)師，例如內(nèi)科醫(yī)師評價的任何有害作用。就非免疫原性而言，將物質(zhì)視為無免疫原性的條件是該物質(zhì)在體內(nèi)的計劃應(yīng)用不會產(chǎn)生不需要的免疫反應(yīng)(例如形成抗體)或即使產(chǎn)生免疫反應(yīng)，那么也不認(rèn)為這類反應(yīng)是由臨床醫(yī)師評價的臨床上顯著的或重要的。特別優(yōu)選所述的水溶性聚合物是生物相容性的和非免疫原性的。
此外，所述的聚合物的一般特征在于帶有2至約300個末端。這類聚合物的實例包括，但不限于聚(亞烷基二醇類)諸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羥基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羥基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷嗪，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)和任意上述物質(zhì)的組合。
所述的聚合物并不限于特定的結(jié)構(gòu)且可以為線型(例如烷氧基PEG或雙官能PEG)、支化或多臂的(例如叉形PEG或與多元醇核結(jié)合的PEG)、樹枝狀的或帶有可降解的鍵。此外，可以以任意數(shù)量的不同模式構(gòu)成聚合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)且這些結(jié)構(gòu)可以選自均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體。
一般來說，用適合于與因子VIII部分上的所需位質(zhì)偶聯(lián)的合適活化基團活化PEG和其它水溶性聚合物?；罨木酆衔镌噭в信c因子VIII部分反應(yīng)的反應(yīng)基團。用于使這些聚合物與活性部分軛合的有代表性的聚合物試劑和方法是本領(lǐng)域中公知的且進一步描述在Zalipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽類修飾中的應(yīng)用”(″Useof Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification ofPolypeptides″)-《聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnical and BiomedicalApplications)，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)；和Zalipsky(1995)《高級藥物綜述》(Advanced Drug Reviews)16157-182。
一般來說，共軛物中任意指定聚合物的標(biāo)稱平均分子量為約100道爾頓至約150,000道爾頓。然而，典型范圍包括大于5,000道爾頓至約100,000道爾頓范圍、約6,000道爾頓至約90,000道爾頓范圍、約10,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍、約20,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍和約53,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍內(nèi)的標(biāo)稱平均分子量。對任意指定的水溶性聚合物而言，優(yōu)選具有這些分子量范圍的PEGs。
水溶性聚合物鏈段的典型標(biāo)稱平均分子量包括約100道爾頓、約200道爾頓、約300道爾頓、約400道爾頓、約500道爾頓、約600道爾頓、約700道爾頓、約750道爾頓、約800道爾頓、約900道爾頓、約1,000道爾頓、約2,000道爾頓、約2,200道爾頓、約2,500道爾頓、約3,000道爾頓、約4,000道爾頓、約4,400道爾頓、約5,000道爾頓、約6,000道爾頓、約7,000道爾頓、約7,500道爾頓、約8,000道爾頓、約9,000道爾頓、約10,000道爾頓、約11,000道爾頓、約12,000道爾頓、約13,000道爾頓、約14,000道爾頓、約15,000道爾頓、約20,000道爾頓、約22,500道爾頓、約25,000道爾頓、約30,000道爾頓、約40,000道爾頓、約50,000道爾頓、約60,000道爾頓和約75,000道爾頓。
當(dāng)用作聚合物時，PEGs一般包括許多(OCH2CH2)單體。本說明書上下文中所用的重復(fù)單元數(shù)量由″(OCH2CH2)n″中的下標(biāo)″n″確定。因此，(n)值一般在如下范圍中的一種或多種2至約2,300；約100至約2,300；約135至約2,000；約230至約1,900；約450至約1,900；和約1,200至約1,900。對分子量已知的任意指定聚合物而言，通過用聚合物的總分子量除以重復(fù)單元的分子量確定重復(fù)單元的數(shù)量(即″n″)是可能的。
用于本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的聚合物為封端聚合物，即帶有至少一個被相對惰性的基團，諸如低級C1-6烷氧基封端的末端的聚合物。例如，當(dāng)聚合物為PEG時，優(yōu)選使用甲氧基-PEG(常稱作mPEG)，它是PEG的線性形式，其中聚合物的一個末端為甲氧基(-OCH3)，而另一個末端為羥基或可以任選進行化學(xué)修飾的其它官能團。
在適用于本發(fā)明的一種形式中，游離或未結(jié)合的PEG為在每一末端上被羥基終止的線型聚合物HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-OH，其中(m′)一般在0至約4,000的范圍。
可以將上述聚合物α-，ω-二羥基聚(乙二醇)表示為HO-PEG-OH的簡單形式，其中可以理解-PEG-符號可以表示下列結(jié)構(gòu)單元-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-，其中(m′)如上述所定義。
適用于本發(fā)明的另一種類型的PEG為甲氧基-PEG-OH或簡寫為mPEG，其中一個末端為相對惰性的甲氧基，而另一個末端為羥基。mPEG的結(jié)構(gòu)如下所示。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-OH其中(m′)如上述所定義。
諸如描述在美國專利No.5,932,462中的那些多臂或支化PEG分子也可以被用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有如下結(jié)構(gòu) 其中polya和polyb為PEG骨架(相同或不同)，諸如甲氧基聚(乙二醇)；R″為非反應(yīng)性部分，諸如H、甲基或PEG骨架；且P和Q為非反應(yīng)性鍵。在優(yōu)選的實施方案中，支化PEG聚合物為甲氧基聚(乙二醇)二取代的賴氨酸。隨所用具體因子VIII部分的不同，二取代的賴氨酸的反應(yīng)性酯官能團可以被進一步修飾成適合于與因子VIII部分中的靶基團反應(yīng)的官能團。
這些聚合物可以為線型或可以為任意上述形式。
此外，PEG可以包括叉形PEG。叉形PEG的實例由下列結(jié)構(gòu)表示 其中X為一個或多個原子的間隔基部分且Z各自為通過確定長度的原子鏈與CH連接的活化的末端基團。國際申請?zhí)朠CT/US99/05333中公開了能夠用于本發(fā)明的各種叉形PEG結(jié)構(gòu)。使Z官能團與支鏈碳原子連接的原子鏈用作束縛基團且可以包括例如烷基鏈、醚鏈、酯鏈、酰胺鏈及其組合。
PEG聚合物可以包括帶有諸如羧基這類反應(yīng)基團的側(cè)基PEG分子，所述的反應(yīng)基團沿PEG的長度而非在PEG鏈末端上共價結(jié)合。側(cè)反應(yīng)基可以與PEG直接或通過諸如亞烷基這類間隔基部分結(jié)合。
除上述PEG形式外，還可以制備在聚合物上帶有一種或多種弱的或可降解的鍵的聚合物，包括任意上述聚合物。例如可以制備聚合物上帶有可以進行水解的酯鍵的PEG。如下所示，這種水解導(dǎo)致聚合物裂解成更低分子量的碎片
適用作聚合物骨架內(nèi)可降解鍵的其它水解可降解的鍵包括碳酸酯鍵；例如由胺與醛反應(yīng)產(chǎn)生的亞胺鍵(例如，參見Ouchi等(1997)《聚合物預(yù)制》(Polymer Preprints)38(1)582-3)；例如，通過使醇與磷酸基之間的反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；一般通過酰肼與醛之間的反應(yīng)形成的腙鍵；一般通過醛與醇之間的反應(yīng)形成的乙縮醛鍵；例如，通過甲酸與醇之間的反應(yīng)形成的原酸酯鍵；例如，由諸如PEG這類聚合物末端上的胺基和另一PGE鏈上的羧基形成的酰胺鍵；由例如帶有末端異氰酸基的PEG與PEG醇反應(yīng)形成的尿烷鍵；例如，由諸如PEG這類聚合物末端上的胺基和肽的羧基形成的肽鍵；和例如由聚合物末端上的亞磷酰胺(phosphoramidite)基與寡核苷酸的5′羥基形成的寡核苷酸鍵。
聚合物共軛物的這類可選特征，即將一種或多種可降解的鍵引入聚合物鏈，可以在給藥時對共軛物的最終所需藥理特性提供附加的控制。例如，可以給予大的和相對惰性的共軛物(即帶有與之結(jié)合的一種或多種高分子量PEG鏈，例如一種或多種具有大于約10,000的分子量的PEG鏈，其中所述共軛物基本上沒有生物活性)，它可以被水解生成帶有原始PEG鏈部分的生物活性共軛物。在這種方式中，共軛物的特性可被更有效地適合于隨時間平衡共軛物的生物活性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為實質(zhì)上涉及水溶性聚合物鏈段的上述討論絕非詳盡無遺的，而僅是舉例說明性的，且想到具有上述特性的聚合物材料。本文所用的術(shù)語″聚合物試劑″一般指的是可包括水溶性聚合物鏈段和官能團的完整分子。
如上所述，本發(fā)明的共軛物包括與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物。對任何指定的共軛物而言，一般有1至3種水溶性聚合物與一個或多個具有因子VIII活性的部分共價結(jié)合。然而，在某些情況中，所述的共軛物可以帶有1、2、3、4、5、6、7、8或更多各自與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物。
具有因子VIII活性的部分和聚合物內(nèi)的特定鍵取決于許多因素。這類因素包括例如所用的特定鍵化學(xué)、具有因子VIII活性的特定部分、具有因子VIII活性的部分內(nèi)可利用的官能團(用于結(jié)合聚合物或轉(zhuǎn)化至合適的結(jié)合位置)，具有因子VIII活性的部分內(nèi)可能存在其它反應(yīng)性官能團等。
盡管不必需是，但是本發(fā)明的共軛物可以為前體藥物，即聚合物與因子VIII部分之間的鍵可水解降解以釋放母體部分。典型的可降解鍵包括羧酸酯、磷酸酯、硫酯、酸酐類、乙縮醛類、酮縮醇類、酰氧基烷基醚、亞胺類、原酸酯類、肽類和寡核苷酸。通過使用常用于本領(lǐng)域的偶聯(lián)方法對因子VIII部分(例如蛋白質(zhì)的羧基C末端或蛋白質(zhì)內(nèi)包含的諸如絲氨酸或蘇氨酸這類氨基酸的側(cè)鏈羥基)和/或聚合物試劑進行適當(dāng)修飾可輕易地制備這類鍵。不過，最優(yōu)選的是易于由適當(dāng)活化的聚合物與具有因子VIII活性的部分中包含的未修飾官能團反應(yīng)形成的可水解鍵。
或者，水解穩(wěn)定的鍵，諸如酰胺、尿烷(也稱作氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也稱作硫化物)或脲(也稱作尿素)鍵也可被用作偶聯(lián)因子VIII部分的鍵。然而，在某些情況中，優(yōu)選所述的鍵不為氨基甲酸酯鍵且不為尿素鍵，且此外，沒有基于帶有異氰酸酯或異硫氰酸酯類的聚合物衍生物與因子VIII部分反應(yīng)形成的鍵。此外，優(yōu)選的水解穩(wěn)定的鍵為酰胺。通過使因子VIII部分中包含的羧基(例如具有因子VIII活性的肽部分的末端羧基)與氨基終止的聚合物反應(yīng)可輕易地制備酰胺。
共軛物(與未軛合的因子VIII部分相反)可以具有可測定程度的因子VIII活性，也可以不具有這種活性。即本發(fā)明的聚合物共軛物在任何情況下將具有約0.1％至約100％或更多的未修飾母體因子VIII部分的生物活性。優(yōu)選幾乎沒有或無因子VIII活性的化合物一般含有使所述聚合物與所述部分連接的可水解鍵，使得在水誘導(dǎo)的可水解鍵裂解時釋放活性母體分子(或其衍生物)而與共軛物中缺乏活性無關(guān)?？梢允褂煤线m的體內(nèi)或體外模型測定這類活性，這取決于所用具有因子VIII活性的特定部分的已知活性。
就帶有使具有因子VIII活性的部分與所述聚合物偶聯(lián)的水解穩(wěn)定的鍵的共軛物而言，該共軛物一般將具有可測定程度的特異性活性。例如，這類聚合物共軛物的一般特征在于當(dāng)在諸如本領(lǐng)域眾所周知的合適模型中測定時，它們具有相對于具有因子VIII活性的未修飾母體部分活性的至少約2％、5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或更多的活性。優(yōu)選具有水解穩(wěn)定鍵(例如酰胺鍵)的化合物將具有至少一定程度的具有因子VIII活性的未修飾母體部分的生物活性。
現(xiàn)在描述本發(fā)明典型的聚合物共軛物，其中具有因子VIII活性的部分為蛋白質(zhì)。一般預(yù)計這類蛋白質(zhì)共有(至少部分)與天然因子VIII相似的氨基酸序列。因此，盡管涉及了天然因子VIII蛋白中具體的位置或原子，但是這類涉及僅是便利性的且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠輕易地測定具有因子VIII活性的其它部分中相應(yīng)的位置或原子。本文提供的對天然因子VIII的描述特別應(yīng)用于因子VIIIa、因子VIIIvWF和B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII形式以及任意上述的片段、缺失變體、取代變體或添加變體。
因子VIII部分上的氨基提供了因子VIII部分與水溶性聚合物之間的結(jié)合點。天然因子因子VIII包括含有158個胺的賴氨酸殘基(完整蛋白質(zhì)的6.8重量百分比)和1個氨基末端。就因子VIIIa而言，存在78個賴氨酸殘基(完整蛋白質(zhì)的5.5重量百分比)和2個氨基末端(因裂解因子VIII所得)。因此，盡管考慮二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，但是因子VIII和因子VIIIa(以及任意的肽因子VIII部分，例如B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII)二者都帶有幾種可用于參與共軛反應(yīng)的胺。
存在大量適用于與因子VIII部分的可利用胺形成共價鍵的合適的水溶性聚合物試劑的實例。將具體實例與相應(yīng)的共軛物一起提供在下表1中。在該表中，變量(n)表示重復(fù)單體單元的數(shù)量且″-NH-F8″表示與水溶性聚合物軛合后的因子VIII部分。盡管表1中列出的每種聚合部分以″CH3″基團終止，但是可以用其它基團(諸如H和芐基)取代。
表1胺-特異性聚合物試劑和由其形成的因子VIII部分共軛物



本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不經(jīng)過度實驗完成聚合物試劑與因子VIII部分的氨基的軛合。一種方法的代表為還原氨基化反應(yīng)，其例如被用于使因子VIII部分的伯胺與用酮、醛或其水合形式(例如酮水合物、醛水合物)官能化的聚合物軛合。在這種方法中，使因子VIII部分的伯胺與醛或酮的羰基(或水合醛或酮相應(yīng)含有羥基的基團)反應(yīng)，由此形成席夫堿。然后可以通過使用諸如硼氫化鈉這類還原劑依次將該席夫堿還原轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的共軛物。選擇性反應(yīng)(例如在N-末端上是可能的)是可能的，特別是使用以酮或α-甲基支化的醛官能化的聚合物和/或在特定反應(yīng)條件(例如降低的pH)下。
因子VIII中可以用作結(jié)合聚合物的位置的優(yōu)選胺基包括那些在下列賴氨酸殘基中發(fā)現(xiàn)的胺基Lys493、Lys496、Lys499、Lys1904、Lys1808、Lys1813、Lys1818、Lys2183、Lys2207、Lys2227、Lys2236，其中特別優(yōu)選Lys496、Lys1804和Lys1908。編號對應(yīng)于以SEQ.ID.NO.2提供的序列。如上所述，對應(yīng)于人因子VIII以外的蛋白質(zhì)中的這些賴氨酸殘基中的每一種的胺基可以用作軛合的有用位置。此外，為蛋白質(zhì)的任意因子VIII部分的N-末端可以用作聚合物的結(jié)合位置。
羧基代表可以用作因子VIII部分上結(jié)合點的另一個官能團。結(jié)構(gòu)上，共軛物將包括如下結(jié)構(gòu) 其中F8和相鄰的羰基對應(yīng)于含有羧基的因子VIII部分，X為鍵，優(yōu)選選自O(shè)、N(H)和S的雜原子，且POLY為任選在封端部分上終止的水溶性聚合物，諸如PEG。
C(O)-X鍵因帶有末端官能團的聚合物衍生物與含有羧基的因子VIII部分反應(yīng)而產(chǎn)生。如上所述，具體的鍵將取決于所用官能團的類型。如果使用羥基使聚合物末端官能化或″活化″，那么所得的鍵將為羧酸酯且X將為0。如果使用巰基使聚合物骨架官能化，那么所得的鍵將為硫酯且X將為S。當(dāng)使用某些多臂、支化或叉形聚合物時，C(O)X部分且特別是X部分可能相對更為復(fù)雜且可以包括更長的鍵結(jié)構(gòu)。
含有酰肼部分的水溶性衍生物也適用于羧基上的軛合。這類衍生物的實例包括具有如下結(jié)構(gòu)的聚合物 在與因子VIII部分軛合時，其具有如下結(jié)構(gòu) 其中F8軛合后的因子VIII部分且POLY為任選在封端部分上終止的水溶性聚合物，諸如PEG。
因子VIII部分中含有的巰基可以用作結(jié)合水溶性聚合物的有效位置。特別是在因子VIII部分為蛋白質(zhì)時，半胱氨酸殘基提供了巰基。然后這類胱氨酸殘基上的巰基可以與活化的PEG反應(yīng)，如美國專利No.5,739,208和國際專利公開號WO 01/62827中所述，這種活化的PEG對與巰基的反應(yīng)而言是特異性的，例如N-馬來酰亞胺基聚合物或其它衍生物。
將具體實例與相應(yīng)的共軛物一起提供在下表2中。在該表中，變量(n)表示重復(fù)單體單元的數(shù)量且″-S-F8″表示與水溶性聚合物軛合后的因子VIII部分。盡管表1中列出的每種聚合部分以″CH3″基團終止，但是可以用其它基團(諸如H和芐基)取代。
表2巰基-特異性聚合物試劑和由其形成的因子VIII部分共軛物
就由帶有一個或多個馬來酰亞胺官能團的水溶性聚合物形成的共軛物而言(不論該馬來酰亞胺是否與因子VIII部分上的胺或巰基反應(yīng))，水溶性聚合物相應(yīng)的馬來酰胺酸形式也可以與因子VIII部分反應(yīng)。在某些條件下(例如pH約7-9和有水存在下)，馬來酰亞胺環(huán)將″開放″而形成相應(yīng)的馬來酰胺酸。馬來酰胺酸依次可以與因子VIII部分上的胺或巰基反應(yīng)。典型的基于馬來酰胺酸的反應(yīng)如下圖示。POLY表示水溶性聚合物且F8表示因子VIII部分。
本發(fā)明有代表性的共軛物可以具有如下結(jié)構(gòu)POLY-L0,1-C(O)Z-Y-S-S-F8其中POLY為水溶性聚合物，L為任選的連接體，Z為選自由O、NH和S組成的組的雜原子，且Y選自由C2-10烷基、C2-10取代的烷基、芳基和取代的芳基組成的組?？梢耘c因子VIII部分反應(yīng)并產(chǎn)生這類共軛物的聚合物試劑描述在2004年1月6日提交的標(biāo)題為“巰基選擇性水溶性聚合物衍生物”且給定的美國順序號為10/753,047的待審申請中。
因子VIII上可以用作結(jié)合聚合物試劑的位置的優(yōu)選巰基包括那些在下列半胱氨酸殘基中發(fā)現(xiàn)的巰基Cys248、Cys310、Cys329、Cys630、Cys692、Cys711、Cys1899、Cys1903和Cys2000，其中特別優(yōu)選Cys630、Cys711和Cys1903。編號對應(yīng)于以SEQ.ID.NO.2提供的序列。
就聚合物試劑而言，本文所述的以及它處描述的那些均可以購自商業(yè)來源(例如Nektar Therapeutics，Huntsville AL)。此外，用于制備聚合物試劑的方法描述在文獻(xiàn)中。
一般來說，盡管不必需地，但是因子VIII部分與聚合物試劑之間的鍵包括包括一個或多個原子，諸如一個或多個碳、氮、硫及其組合。優(yōu)選所述的鍵包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚或二硫基。任選地，其它原子可以使該鍵連接在聚合物試劑中的重復(fù)單體鏈上。使因子VIII部分與重復(fù)單體鏈連接的具體系列原子的非限制性實例選自由下列組成的組-O-，-S-，S-S-，-C(O)-，-O-C(O)-，-C(O)-O-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-，-CH2-O-，-O-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH2-，-CH2-C(O)-O-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-，-C(O)-O-CH2-CH2-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-NH-CH2-，-NH-CH2-CH2-，-CH2-NH-CH2-，-CH2-CH2-NH-CH2-，-C(O)-CH2-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-，-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-O-C(O)-CH2-，-O-C(O)-CH2-CH2-，和-O-C(O)-CH2-CH2-CH2-。
共軛物一般為組合物的組成部分。一般來說，該組合物包括多種共軛物，盡管不必需地，但是優(yōu)選每一共軛物帶有1至3種與一種因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物。然而，該組合物還可以包括帶有4、5、6、7、8或更多與具有因子VIII活性的任意指定部分結(jié)合的聚合物的其它共軛物。此外，本發(fā)明包括下列情況其中組合物包括多種共軛物，每一共軛物包括與一種因子VIII部分共價結(jié)合的一種水溶性聚合物；以及組合物包括2、3、4、5、6、7、8或更多與一種因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物。
可以通過選擇合適的聚合物試劑、聚合物試劑與因子VIII部分的比例、溫度、pH條件和共軛反應(yīng)的其它方面，實現(xiàn)對任意指定部分所需的聚合物數(shù)量的控制。此外，可以通過純化方式減少或消除不需要的共軛物(例如那些帶有4個或更多結(jié)合的聚合物的共軛物)。
例如，可以純化聚合物-因子VIII部分共軛物以獲得/分離變體的軛合種類。特別地，可以純化產(chǎn)物混合物以獲得每個因子VIII部分中有平均大致1、2、3、4、5或更多PEGs，一般每個因子VIII部分中有1、2或3個PEGs。用于純化最終共軛物反應(yīng)混合物的策略將取決于許多因素，包括例如所用聚合物試劑的分子量、特定的因子VIII部分、所需的給藥放案和各共軛物的殘留活性和體內(nèi)特性。
如果需要，可以使用凝膠過濾色譜法和/或離子交換色譜法分離具有不同分子量的共軛物。即基于其不同分子量(其中差異基本上對應(yīng)于水溶性聚合物的平均分子量)將凝膠過濾色譜法用于對不同計數(shù)的聚合物-因子VIII部分比例(例如1-鏈節(jié)、2-鏈節(jié)、3-鏈節(jié)等，其中″1-鏈節(jié)″表示1個聚合物與因子VIII部分，″2-鏈節(jié)″表示2個聚合物與因子VIII部分等)進行分級分離。例如，在100,000道爾頓蛋白質(zhì)隨機與具有約20,000道爾頓分子量的聚合物試劑軛合的典型反應(yīng)中，所得反應(yīng)混合物可以含有未修飾的蛋白質(zhì)(具有約100,000道爾頓的分子量)、單聚乙二醇化的蛋白質(zhì)(具有約120,000道爾頓的分子量)、二聚乙二醇化的蛋白質(zhì)(具有約140,000道爾頓的分子量)等。
盡管可以將這種手段用于分離具有不同分子量的PEG和其它聚合物-因子VIII部分共軛物，但是這種手段一般對分離具有因子VIII部分中不同聚合物結(jié)合位置的位置異構(gòu)體無效。例如，凝膠過濾色譜法可被用于將PEG 1-鏈節(jié)、2-鏈節(jié)、3-鏈節(jié)等的混合物彼此分離，不過，每一回收的PEG-鏈節(jié)組合物可以含有與因子VIII部分中不同反應(yīng)性氨基(例如賴氨酸殘基)結(jié)合的PEGs。
適合于進行這類分離的凝膠過濾柱包括可購自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)的SuperdexTM和SephadexTM柱。特定柱的選擇將取決于所需要求的分級分離范圍。一般使用合適的緩沖液進行洗脫，諸如磷酸鹽、乙酸鹽等?？梢酝ㄟ^許多不同的方法分析收集的級分，例如(i)用于蛋白質(zhì)含量的280nm處的光密度(OD)，(ii)牛血清清蛋白(BSA)蛋白質(zhì)分析，(iii)對PEG含量的碘測試(Sims等(1980)《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem)，10760-63)，和(iv)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)，隨后用碘化鋇染色。
通過反相色譜法，使用反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)；或通過離子交換色譜法，使用離子交換柱，例如可購自Amersham Biosciences的SepharoseTM離子交換柱進行位置異構(gòu)體的分離?？梢詫⑸鲜鍪侄沃械娜我庖环N用于分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構(gòu)體(位置異構(gòu)體)。
組合物優(yōu)選實質(zhì)上不含不具有因子VIII活性的蛋白質(zhì)。此外，組合物優(yōu)選實質(zhì)上不含所有其它未共價結(jié)合的水溶性聚合物。此外，組合物中至少一類共軛物帶有至少一種與將因子X轉(zhuǎn)化成因子Xa的部分結(jié)合的水溶性聚合物。然而，在某些情況中，組合物可以含有聚合物-因子VIII部分共軛物與未軛合因子VIII的混合物。
任選地，本發(fā)明的組合物進一步包括藥物上可接受的賦形劑。如果需要，可以將藥物上可接受的賦形劑加入到共軛物中形成組合物。
典型賦形劑包括，但不限于那些選自由碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖劑、酸、堿及其組合組成的組的賦形劑。
碳水化合物，諸如糖，衍生的糖，諸如糖醇、糖醛酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。具體的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖類，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖類，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖類，諸如棉子糖、木蜜三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇類，諸如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。
賦形劑還可以包括無機鹽或緩沖劑，諸如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。
組合物還可以包括用于防止或阻止微生物生長的抗微生物劑。適合于本發(fā)明的抗微生物劑的非限制性實例包括苯扎氯銨、芐索氯銨、芐醇、西吡氯銨、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)及其組合。
組合物中可以也可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┍挥糜诜乐寡趸纱朔乐怪苿┲械墓曹椢锘蚱渌煞肿冑|(zhì)。用于本發(fā)明的合適的抗氧化劑包括例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、一硫代甘油、棓酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉及其組合。
表面活性劑可以作為賦形劑存在。典型的表面活性劑包括聚山梨酯類，諸如″Tween 20″和″Tween 80″；和普郎尼克類，諸如F68和F88(兩者可購自BASF，Mount Olive，New Jersey)；失水山梨糖醇酯類；脂質(zhì)，諸如磷脂類，諸如卵磷脂和其它磷脂酰膽堿類、磷脂酰乙醇胺類(不過優(yōu)選不呈脂質(zhì)體形式)；脂肪酸類和脂肪酯類；類固醇，諸如膽固醇；和螯合劑，諸如EDTA、鋅和其它這類合適的陽離子。
酸或堿可以作為賦形劑存在于組合物中?？梢允褂玫乃岬姆窍拗菩詫嵗切┻x自由鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸及其組合組成的組的酸。合適的堿的實例包括，但不限于選自由氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀及其組合組成的組的堿。
共軛物(即活性劑與聚合物試劑之間形成的共軛物)在組合物中的量將隨許多因素改變，但當(dāng)將組合物儲存在單位劑量容器(例如小瓶)中時最佳將是治療有效劑量。此外，可以將藥物制劑置于注射器中?？梢酝ㄟ^反復(fù)給予增加量的共軛物以測定哪個量產(chǎn)生臨床所需終點而實驗確定治療有效劑量。
組合物中任意各賦形劑的量將隨賦形劑活性和組合物的特定要求的不同而改變。一般來說，通過常規(guī)實驗測定任意各賦形劑的最佳量，即通過制備含有不同量賦形劑(范圍從低到高)的組合物，檢驗穩(wěn)定性和其它參數(shù)且然后測定獲得最佳性能而沒有明顯不良作用的范圍。
然而，一般地，賦形劑在組合物中的含量將為約1％至約99％重量，優(yōu)選約5％至約98％重量，更優(yōu)選約15至約95％重量的賦形劑，最優(yōu)選濃度小于30％重量。
上述這些藥物賦形劑與其它賦形劑被描述在下列文獻(xiàn)中《Remington制藥可選與實踐》(″RemingtonThe Science & Practiceof Pharmacy″)第19版Williams & Williams，(1995)；《醫(yī)師案頭參考》(″Physician′s Desk Reference″)第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)；和Kibbe，A.H.《藥物賦形劑手冊》(Handbookof Pharmaceutical Excipients)第3版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000。
組合物包括所有類型的制劑且特別是那些適合于注射的制劑，例如可被重構(gòu)的粉末或凍干物以及液體。用于在注射前重構(gòu)固體組合物的合適稀釋劑的實例包括注射用抑菌水、5％葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩沖鹽水、林格液、鹽水、無菌水、去離子水及其組合。就液體藥物組合物而言，預(yù)見溶液和混懸液。
盡管不必需地，一般通過注射給予本發(fā)明的組合物且由此它們一般為在給藥前即刻制成的液體溶液或混懸液。藥物制劑還可以采用其它劑型，諸如糖漿劑、霜劑、軟膏劑、片劑、粉劑等。還包括其它給藥方式，諸如肺、直腸、透皮、透粘膜、口服、鞘內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)等。
本發(fā)明還提供了本文對患有對使用共軛物治療起反應(yīng)的狀況的患者給予本申請?zhí)峁┑墓曹椢锏姆椒āＴ摲椒òㄒ话阃ㄟ^注射給予治療有效量的共軛物(優(yōu)選作為藥物組合物的組成部分提供)。如上所述，可以通過靜脈內(nèi)注射或較少優(yōu)選通過肌內(nèi)或通過皮下注射經(jīng)胃腸道外注射給予所述共軛物。用于胃腸道外給藥的合適的劑型包括預(yù)備注射溶液、使用前與溶劑混合的干粉、預(yù)備注射的混懸液、使用前與媒介物混合的干不溶性組合物以及給藥前稀釋的乳劑和液體濃縮物等。
所述的給藥方法可被用于治療可以通過給予所共軛物治療或預(yù)防的任意狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得具體共軛物可以有效治療的狀況。例如，共軛物可被用于治療患有血友病A的個體。此外，共軛物適合于用作任選在未患血友病的患者中抗不受控制的出血的預(yù)防劑。因此，例如，手術(shù)前可以將共軛物對處于不受控制出血危險中的患者給藥。
確切的給藥劑量將隨受治療者的年齡、體重和一般情況以及所治療狀況的嚴(yán)重程度、保健專業(yè)人員的判斷和給予的共軛物的不同而改變。治療有效量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和/或描述在相關(guān)參考書和文獻(xiàn)中。一般來說，治療有效量將在約0.001mg至100mg，優(yōu)選劑量在0.01mg/天至75mg/天且更優(yōu)選劑量在0.10mg/天至50mg/天。
可以按照不同給藥放案給予任意指定共軛物(也優(yōu)選作為藥物制劑的組成部分提供)的單位劑量，這取決于臨床醫(yī)師的判斷、患者需求等。具體的給藥方案將是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或可以使用常規(guī)方法經(jīng)實驗測定。典型給藥方案包括，但不限于一天給藥5次、一天4次、一天3次、每天2次、每天1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、每月1次及其組合。一旦達(dá)到臨床終點，則停止組合物的給藥。
給予本發(fā)明某些共軛物的一個優(yōu)點在于可以裂解各水溶性聚合物部分。這一結(jié)果在因聚合物大小而使從體內(nèi)清除成為潛在問題時是有利的。最好的情況是，通過使用生理上可裂解和/或酶可降解的鍵促進每一水溶性聚合物部分的裂解，所述的鍵諸如尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯的堿。以這種方式，可以通過選擇聚合物的分子大小和將提供所需清除特性的官能團類型來調(diào)節(jié)共軛物的清除(通過裂解各水溶性聚合物部分)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的聚合物分子大小和可裂解官能團。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實驗，可以確定合適的分子大小和可裂解官能團，通過首先制備具有不同聚合物重量和可裂解官能團的各種聚合物衍生物，然后通過將該聚合物衍生物給予患者并定期采血和/或尿樣品得到清除曲線(例如通過定期采血樣或尿樣)。一旦對每一測試共軛物獲得了一系列清除曲線，則可以鑒定合適的共軛物。
應(yīng)理解盡管結(jié)合優(yōu)選的具體實施方案描述了本發(fā)明，但是上述描述和下文的實施例用于解釋而不用來限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點和修改對本發(fā)明所涉及的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參照本文參考的所有論文、書籍、專利和其它公開文獻(xiàn)。
實驗除非另有說明，本發(fā)明的實施使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所屬范圍的常規(guī)的有機合成技術(shù)等。這類技術(shù)完整地解釋在文獻(xiàn)中。例如，參見J.March《高級有機化學(xué)反應(yīng)機制和結(jié)構(gòu)》(Advanced OrganicChemistryReactions Mechanisms and Structure)第4版(New YorkWiley-Interscience，1992)，上文。
在下列實施例中，已經(jīng)進行了嘗試來確保所用數(shù)字的準(zhǔn)確性(例如量、溫度等)，但應(yīng)說明有一定程度的實驗誤差和偏差。除非另有說明，溫度為℃且壓力為或接近海平面的大氣壓。
縮寫DCM 二氯甲烷mPEG-SPA mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯mPEG-SBA mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸酯mPEG-OPSS mPEG-鄰吡啶基-二硫化物
mPEG-MAL mPEG-馬來酰亞胺，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-MALmPEG-SMB mPEG-琥珀酰亞胺基α-甲基丁酸酯，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CH(CH3)-C(O)-O-琥珀酰亞胺mPEG-ButyrALD CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2CH2O)4CH2CH2CH2C(O)HmPEG-PIP CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-C(O)-哌啶-4-酮SUC 琥珀酰亞胺或琥珀酰亞胺基NaCNBH3氰基硼氫化鈉HCl 鹽酸HEPES 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸NMR 核磁共振DCC 1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺DI去離子MW分子量r.t. 室溫K或kDa千道爾頓SEC 尺寸排阻色譜法HPLC 高效液相色譜法FPLC 快速蛋白質(zhì)液相色譜法SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳MALDI-TOF 基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間材料除非另有說明，附帶實施例中涉及的所有PEG試劑均為可商購的。
mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯，mPEG-SPA，分子量30K(Mn＝31.3kDa，Nektar Therapeutics)mPEG-鄰吡啶基-二硫化物，mPEG-OPSS，分子量10K(Mn＝10.3kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-馬來酰亞胺，mPEG-MAL，分子量20K(Mn＝21.8kDa，NektarTherapeutics)mPEG-馬來酰亞胺，mPEG-MAL，分子量30K(Mn＝31.4kDa，NektarTherapeutics)mPEG-琥珀酰亞胺基α-甲基丁酸酯，mPEG-SMB，分子量30K(Mn＝30.5kDa，Nektar Therapeutics)mPEG-丁醛，mPEG-ButyrALD，分子量30K(Mn＝31.5kDa，NektarTherapeutics)L-組氨酸，生物技術(shù)操作證明的(Sigma)HEPES，生物技術(shù)操作證明的99.5+％(Sigma)氯化鈣，二水合物，用于分子生物學(xué)，99％(Sigma)氯化鈉，用于分子生物學(xué)(Sigma)Tween80，Sigma Ultra，(Sigma)乙醇，USP，Absolute-200 Proof(AAPER)聚乙二醇，MW 3,350，SigmaUltra(Sigma)Slide-A-Lyzer透析盒，0.5-3ml或3-12ml容量(Pierce)乙酸，A.C.S.試劑，99.7+％(Aldrich)1N乙酸，體積標(biāo)準(zhǔn)(VWR)1N氫氧化鈉，體積標(biāo)準(zhǔn)(J.T.Baker)氰基硼氫化鈉95％(Aldrich)Tris/甘氨酸/SDS，10x，蛋白電泳緩沖液(Bio-Rad)Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad)SigmaMarker，低范圍(M.W.6,500-66,000)(Sigma)SigmaMarker，高范圍(M.W.36,000-205,000)(Sigma)7.5％Tris-HCl備用凝膠(10-孔，30ul，Bio-Rad)GelCode藍(lán)染色試劑(Pierce)方法(分析型)SEC-HPLC分析使用Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)(Agilent)進行尺寸排阻色譜法(SEC)。使用BIOSEP-SEC-S 4000柱(Phenomenex)和流動相45mM組氨酸、4.5mM氯化鈣、0.36M氯化鈉、0.009％(v/v)Tween 80和10％乙醇，pH 6.7分析樣品。柱流速為0.3ml/分鐘。通過在280nm波長處的UV檢測洗脫的蛋白和PEG-蛋白質(zhì)共軛物。
SDS-PAGE分析通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使用小型-PROTEAN 3預(yù)制凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)分析樣品。將樣品與2xLaemmli樣品緩沖液混合并置于95℃水浴中～5分鐘。然后將制備的樣品上7.5％裝載在Tris-HCl備用凝膠上并在200V下使用Tris/甘氨酸/SDS電泳緩沖液進行實驗約30分鐘。
其它方法PEG-因子VIII共軛物的純化將Superose 6 HR 10/30，24ml凝膠過濾柱(Amersham)與FPLC系統(tǒng)和AKTA主系統(tǒng)(Amersham)一起用于純化實施例6-11中的PEG-因子VIII共軛物。流速為0.3ml/分鐘且洗脫緩沖液為50mM組氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2和0.01％(w/v)Tween 80，pH 6.7。
因子VIII儲備溶液的緩沖液交換從防護袋中取出Slide-A-Lyzer透析盒(3-12ml，10,000MWCO，Pierce)并浸入MiliQ H2O中15分鐘(每5分鐘改變一次水)。然后通過密封襯墊頂部上的導(dǎo)向口之一將因子VIII儲備溶液[在50mM組氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 6.7中0.398mg/ml]轉(zhuǎn)入盒腔。將該盒置于帶有與盒頂部連接的浮標(biāo)的1L燒杯中的HEPES緩沖液[50mM HEPES、0.5M NaCl、5mMCaCl2、0.1％(w/v)PEG3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]中。然后將燒杯放在攪拌板而在4℃下開始透析。以2～3小時的間隔改變HEPES緩沖液4次且然后留在冷室溫(4℃)下透析過夜。透析后，給盒室內(nèi)注入空氣并從盒中抽吸透析的樣品。在來自SPECTRA max PLUS分光光度計(Molecular Devices)的UV280nm處測定HEPES緩沖液中因子VIII的濃度。
實施例1使用20K mPEG-SPA使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化具有20,000道爾頓分子量的mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯獲自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。將該聚合物試劑的基本結(jié)構(gòu)提供如下 將B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII溶于去離子水，向其中加入三乙胺以使pH升至7.2-9。向上述溶液中加入1.5至10倍摩爾過量的PEG試劑mPEG-SPA。將所得混合物在室溫下攪拌幾小時。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物以測定蛋白質(zhì)聚乙二醇化的程度。還可以通過適合于這種大小蛋白質(zhì)的許多分析技術(shù)中的任一種，諸如光角散射測定聚乙二醇化程度，即1-鏈節(jié)、2-鏈節(jié)等。天然和單聚乙二醇化種類展示出的峰相差約20,000Da。增加PEG試劑與蛋白質(zhì)的比例增加聚乙二醇化的程度，即形成2-鏈節(jié)、3-鏈節(jié)等。
實施例2使用mPEG-SBA使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化具有10,000道爾頓分子量的mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸酯獲自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。將該聚合物試劑的基本結(jié)構(gòu)提供如下 將B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII溶于去離子水，向其中加入三乙胺以使pH升至7.2-9。向上述溶液中加入1.5至10倍摩爾過量的mPEG-SBA。將所得混合物在室溫下攪拌幾小時。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物以測定蛋白質(zhì)聚乙二醇化的程度。
實施例3使用20K mPEG-MAL使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化具有20,000道爾頓分子量的mPEG-馬來酰亞胺獲自NektarTherapeuics(Huntsville，AL)。將該聚合物試劑的基本結(jié)構(gòu)提供如下 將B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII溶于緩沖液。向該蛋白質(zhì)溶液中加入3-5倍摩爾過量的mPEG-MAL。將所得混合物在室溫下惰性氣體環(huán)境中攪拌幾小時。通過HPLC分析并純化反應(yīng)混合物而得到軛合種類的混合物。
實施例4使用20K mPEG-OPSS使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化 具有20,000道爾頓分子量的硫氫基-選擇性聚合物試劑mPEG-鄰吡啶基-二硫化物(結(jié)構(gòu)如上所示)獲自NektarTherapeuics(Huntsville，AL)。將5倍摩爾過量的mPEG-OPSS加入到在緩沖溶液中的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII中。將該反應(yīng)混合物在室溫下惰性氣體環(huán)境中攪拌幾小時而形成帶有使聚合物與蛋白質(zhì)連接的二硫鍵的所需共軛物。
實施例5使用5K mPEG-PIP使B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII聚乙二醇化 按照Nektar Therapeutic在標(biāo)題為″聚合物衍生物及其共軛物″的臨時專利申請No.60/437,325中所述，制備作為酮和相應(yīng)酮縮醇表示的上述聚合物試劑。
為了制備上述聚合物試劑，向具有5,000道爾頓重均分子量的甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亞胺基丙酸酯(1.0g，0.002摩爾)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入三乙胺(0.084ml，0.006摩爾)和4-哌啶酮一水合物鹽酸鹽(0.077g，0.005摩爾)。將該反應(yīng)混合物在室溫下氮氣環(huán)境中攪拌過夜且然后在軛合前純化。或者，該聚合物試劑可以購自Nektar Therapeutics。
為了實現(xiàn)軛合，向B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII在含水緩沖液中的溶液中加入20-倍摩爾過量的5K mPEG-PIP。將所得溶液置于設(shè)定在慢速下的Roto MixTM定軌振蕩器(Thermolyne Corp.，Dubuque，IA)上以促使在室溫下反應(yīng)。15分鐘后，加入NaCNBH3水溶液，其用量等于與B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII相比50倍摩爾過量。在定時間隔從反應(yīng)混合物中抽取等分試樣并通過SDS-PAGE分析(使用可購自Bio-RadLaboratories，Hercules，CA的凝膠)。
SDS-PAGE分析顯示存在結(jié)合了1、2、和3個PEG部分的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的PEG衍生物。
實施例6
B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與30K mPEG-SPA的軛合在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的30K mPEG-SPA溫至環(huán)境溫度。將溫?zé)岬腜EG-SPA(2.2mg)溶于0.022ml 2mM HCl以得到10％的聚合物試劑溶液。將PEG-SPA溶液快速加入到3ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 7.0中0.412mg/ml]中并充分混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至冷室(4℃)并向該反應(yīng)混合物中再加入0.022mlmPEG-SPA溶液并充分混合。測定pH(pH 7.0±0.2)。PEG-SPA與蛋白質(zhì)的摩爾比為20∶1。最終mPEG-SPA濃度為1.445mg/ml且最終因子VIII濃度為0.406mg/ml。讓反應(yīng)在4℃下和Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行過夜。將所得共軛物定為鑒定物″pz041701″。
使用凝膠過濾色譜法純化該共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。
共軛物表征正如通過SEC測定的，在純化前，所得共軛物混合物為分別對應(yīng)于鑒定物″pz041701(低)″、″pz041701(中)″和″pz041701(高)的因子VII PEG-單體(或1-鏈節(jié))、二聚體(或2-鏈節(jié))和三聚體(或3-鏈節(jié))的混合物。即″pz041701(低)″對應(yīng)于主要是因子VIII單聚乙二醇化種類或帶有一個與之結(jié)合的PEG部分的因子VIII；″pz041701(中)″對應(yīng)于主要是因子VIII二-聚乙二醇化種類，即帶有兩個與之結(jié)合的PEG部分的因子VIII；且″pz041701(高)″對應(yīng)于主要是帶有三個與之結(jié)合的PEG部分的因子VIII。相應(yīng)的SEC圖如附圖1和2中所示。附圖1顯示對應(yīng)于對因子VIII反應(yīng)混合物SEC時收集的級分的SEC圖。根據(jù)尺寸排阻色譜法(SEC)結(jié)果，mPEG-SPA-30K-FVIII(pz041701低)的聚乙二醇化產(chǎn)率為～39％。mPEG30-SPA-30K-FVIII(pz041701中)的聚乙二醇化產(chǎn)率為～32％，且mPEG-SPA-30K-FVIII(pz041701高)的聚乙二醇化產(chǎn)率為～11％，其中的百分比基于與存在于所得反應(yīng)混合物中所有種類相比得到的相對量。通過FPLC進一步純化共軛物混合物并通過SDS-PAGE分析。
實施例7B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與20K mPEG-MAL的軛合在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的20K mPEG-MAL溫至環(huán)境溫度。將溫?zé)岬腜EG-MAL試劑(4.4mg)溶于0.044ml HEPES緩沖液[50mM HEPES、0.15M NaCl、4.0mM CaCl2、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]而制成10％mPEG-MAL溶液。將PEG-MAL溶液快速加入到4ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.4324mg/ml]中并充分混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至冷室(4℃)并向該反應(yīng)混合物中再加入0.044ml mPEG-MAL溶液，隨后在2小時過程中再添加三份等分試樣的mPEG-MAL溶液。測定pH(pH 7.0±0.2)。PEG-MAL與蛋白質(zhì)的摩爾比為100∶1。最終mPEG-MAL濃度為5.123mg/ml且最終因子VIII濃度為0.410mg/ml。讓反應(yīng)在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行過夜。將所得共軛物定為鑒定物″pz061201″。
使用凝膠過濾色譜法純化該共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。
共軛物表征(單聚乙二醇化產(chǎn)物)。根據(jù)尺寸排阻色譜法(SEC)結(jié)果，單聚乙二醇化共軛物(1-鏈節(jié))的聚乙二醇化產(chǎn)率為～33％(附圖3)。合并因子VIII共軛物混合物級分并通過FPLC純化且通過凝膠過濾色譜法進一步純化。通過SDS-PAGE和SEC分析pz061201終產(chǎn)物并將″pz061201″產(chǎn)物純度測定約為94％因子VIII PEG單體(即單聚乙二醇化因子VIII)，其中-6％因子VIII PEG為高-鏈節(jié)(附圖4)。
實施例8B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與30K mPEG-SMB的軛合 在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的30K mPEG-SMB溫至環(huán)境溫度。將溫?zé)岬腜EG-SMB(6.5mg)溶于0.065ml 2mM HCl而形成10％mPEG-SMB溶液。將PEG-SMB溶液快速加入到4ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、5.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.435mg/ml]中并充分混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至冷室(4℃)下。測定pH(pH 7.0±0.2)。mPEG-SMB與蛋白質(zhì)的摩爾比為20∶1。最終mPEG-SMB濃度為1.559mg/m 且最終因子VIII濃度為0.428mg/ml。讓反應(yīng)在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行約48小時且然后通過添加乙酸(99.7+％)以便將pH降至6.0±0.3而猝滅反應(yīng)。將所得共軛物定為鑒定物″pz082501″。
使用凝膠過濾色譜法純化該共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。
共軛物表征命名為″pz082501″的混合物通過用30K mPEG-SMB在pH 7.0±0.2下使因子VIII聚乙二醇化得到。純化該共軛物混合物并通過SEC分析?；诔叽缗抛枭V法(SEC)結(jié)果，pz082501、即單聚乙二醇化共軛物(因子VIII 1-鏈節(jié))的聚乙二醇化產(chǎn)率為～41％(附圖5)。通過FPLC進一步純化產(chǎn)物混合物并通過SDS-PAGE和SEC分析。純化因子VIII PEG共軛物產(chǎn)物pz082501的表征約為95％單-軛合的PEG因子VIII，其中-5％為高-鏈節(jié)。
實施例9B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與10K mPEG-OPSS的軛合在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的10K mPEG-OPSS溫至環(huán)境溫度。將mPEG-OPSS(1.2mg)溶于0.012ml H2O而制成10％mPEG-OPSS溶液。將mPEG-OPSS溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM組氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 6.7中0.398mg/ml]中并充分混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至冷室(4℃)。測定pH(pH 6.7±0.2)。mPEG-OPSS-10K與蛋白質(zhì)的摩爾比為100∶1。最終mPEG-OPSS濃度為2.344mg/ml且最終因子VIII濃度為0.3890mg/ml。讓反應(yīng)在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行過夜。
使用凝膠過濾色譜法純化共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。使用mPEG-OPSS試劑得到的聚乙二醇化結(jié)果和產(chǎn)率與實施例7中使用具有20K分子量的mPEG-MAL試劑獲得的結(jié)果和產(chǎn)率相似。
實施例10B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與30K mPEG-MAL的軛合在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的30K mPEG-MAL溫至環(huán)境溫度。將溫?zé)岬膍PEG-MAL(1.0mg)溶于0.010ml HEPES緩沖液[50mM HEPES、0.15M NaCl、4.0mM CaCl2、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]中而形成10％mPEG-MAL溶液。將mPEG-MAL溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.447mg/ml]中并充分混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至冷室溫(4℃)下并下反應(yīng)混合物中再加入0.010ml的mPEG-MAL溶液，隨后在2小時過程中再添加三份等分試樣的0.010ml mPEG-MAL溶液。測定pH(pH 7.0±0.2)。mPEG-MAL與蛋白質(zhì)的摩爾比為100∶1。最終mPEG-MAL濃度為9.091mg/ml且最終因子VIII濃度為0.406mg/ml。讓反應(yīng)在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行過夜。
使用凝膠過濾色譜法純化共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。使用具有30K分子量的mPEG-MAL試劑得到的聚乙二醇化結(jié)果和產(chǎn)率與實施例7中使用具有20K分子量的mPEG-MAL試劑獲得的結(jié)果和產(chǎn)率相似。
實施例11B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII與30K mPEG-Butyr-ALD的軛合在軛合前，對B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(因子VIII)進行緩沖液交換以便用HEPES取代組氨酸。
將儲存在-20℃氬氣下的30K mPEG-Butyr-ALD溫至環(huán)境溫度。將溫?zé)岬膍PEG-Butyr-ALD(3.8mg)溶于0.038ml H2O而形成10％mPEG-Butyr-ALD溶液。將mPEG-Butyr-ALD溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、5mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.400mg/ml]中并充分混合。15分鐘后，加入0.060ml 10mM氰基硼氫化鈉溶液。測定pH(pH7.0±0.2)。mPEG-Butyr-ALD與蛋白質(zhì)的摩爾比為100∶1。最終mPEG-Butyr-ALD濃度為6.355mg/ml。最終因子VIII濃度為0.334mg/ml且最終NaCNBH3濃度為1.003mM。讓反應(yīng)在室溫下進行5小時且然后在4℃Rotomix(慢速，Thermolyne)上進行過夜。
使用凝膠過濾色譜法純化該共軛物混合物。開發(fā)用于分析該反應(yīng)混合物和終產(chǎn)物的尺寸排阻色譜法。還將SDS-PAGE分析用于表征樣品。因子VIII單PEG共軛物的產(chǎn)率約為20％。
實施例12典型因子VIII-PEG共軛物的體外活性測定實施例6、7和8中所述因子VIII-PEG共軛物的體外活性。測試的所有因子VIII共軛物均為生物活性的。
序列表<110>Bentley，MichaelMary J.Bossard<120>包含具有因子VIII活性的部分的共軛物的組合物<130>SHE-0081.00<140>待分配<141>2003-02-26<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2351<212>PRT<213>智人<400>1Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe1 5 10 15Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser20 25 30Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg35 40 45Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val50 55 60Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile65 70 75 80Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln85 90 95Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser100 105 110His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser115 120 125Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp130 135 140Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu145 150 155 160Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser165 170 175Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile180 185 190Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
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116011651170Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro117511801185Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu119011951200Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu120512101215Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile122012251230His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu123512401245Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr125012551260Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn126512701275Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu128012851290Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu129513001305Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln131013151320Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg132513301335Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp134013451350Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro135513601365Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala137013751380Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser138513901395Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser140014051410Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe141514201425Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys143014351440Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys144514501455Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly146014651470
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權(quán)利要求
1.組合物，包括多種共軛物，每個共軛物帶有1至3種與因子VIII部分共價結(jié)合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物具有的標(biāo)稱平均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍內(nèi)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中每個共軛物中的水溶性聚合物選自由聚(環(huán)氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)、聚噁唑啉，和聚(丙烯酰嗎啉)組成的組。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中每一水溶性聚合物為聚(環(huán)氧烷)。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中每一聚(環(huán)氧烷)為聚(乙二醇)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的聚(乙二醇)被封端部分封端，所述的封端部分選自由羥基、烷氧基、取代的烷氧基、鏈烯氧基、取代的鏈烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基組成的組。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的聚(乙二醇)被甲氧基封端。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的聚(乙二醇)被羥基封端。
8.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約6,000道爾頓至約100,000道爾頓的范圍內(nèi)。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約10,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍內(nèi)。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約20,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約53,000道爾頓至約75,000道爾頓的范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求3的組合物，其中每一水溶性聚合物為線型的。
13.權(quán)利要求3的組合物，其中每一水溶性聚合物為支化的。
14.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的因子VIII部分選自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIIIC、因子VIIIvWF、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII和任意上述的生物活性片段、缺失變體、取代變體或添加變體組成的組。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述的因子VIII部分選自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIIIC和因子VIIIvWF組成的組。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中所述的因子VIII部分為B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。
17.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的因子VIII部分為為重組衍生的。
18.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的因子VIII部分為血液衍生的。
19.權(quán)利要求3的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含清蛋白。
20.權(quán)利要求3的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含不具有因子VIII活性的蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求3的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含非共價結(jié)合的水溶性聚合物。
22.權(quán)利要求3的組合物，其中至少一種水溶性聚合物與具有因子VIII活性的部分的活性形式上的位置共價結(jié)合。
23.權(quán)利要求1的組合物，呈凍干形式。
24.權(quán)利要求1的組合物，呈液體形式。
25.權(quán)利要求1的組合物，進一步包括藥物上可接受的賦形劑。
26.權(quán)利要求1的組合物，其中每一共軛物包括酰胺鍵。
27.權(quán)利要求1的組合物，其中每一共軛物包括仲胺鍵。
28.權(quán)利要求1的組合物，其中每一共軛物包括氨基甲酸酯鍵。
29.權(quán)利要求1的組合物，其中每一共軛物包括硫醚鍵。
30.權(quán)利要求1的組合物，其中每一共軛物包括二硫鍵。
31.組合物，包括多種單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括一種被封端部分封端的聚(乙二醇)，所述的封端部分選自由羥基、烷氧基、取代的烷氧基、鏈烯氧基、取代的鏈烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基組成的組。
33.權(quán)利要求31的組合物，其中所述的聚(乙二醇)被甲氧基封端。
34.權(quán)利要求31的組合物，其中所述的聚(乙二醇)被羥基封端。
35.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括具有在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓范圍內(nèi)的標(biāo)稱平均分子量的聚(乙二醇)。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約6,000道爾頓至約100,000道爾頓的范圍內(nèi)。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約10,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍內(nèi)。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約20,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍內(nèi)。
39.權(quán)利要求38的組合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的標(biāo)稱平均分子量在約53,000道爾頓至約75,000道爾頓的范圍內(nèi)。
40.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括線型聚(乙二醇)。
41.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分包括支化聚(乙二醇)。
42.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括因子VIII部分，所述的因子VIII部分選自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIIIC、因子VIIIvWF、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII和任意上述的生物活性片段、缺失變體、取代變體或添加變體組成的組。
43.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括因子VIII部分，所述的因子VIII部分選自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIIIC和因子VIIIvWF組成的組。
44.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。
45.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括重組衍生的因子VIII部分。
46.權(quán)利要求31的組合物，其中每一單聚乙二醇化的因子VIII部分共軛物包括血液衍生的因子VIII部分。
47.權(quán)利要求31的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含清蛋白。
48.權(quán)利要求31的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含不具有因子VIII活性的蛋白質(zhì)。
49.權(quán)利要求31的組合物，其中該組合物實質(zhì)上不含非共價結(jié)合的水溶性聚合物。
50.權(quán)利要求31的組合物，呈凍干形式。
51.權(quán)利要求31的組合物，呈液體形式。
52.權(quán)利要求31的組合物，它進一步包括藥物上可接受的賦形劑。
53.權(quán)利要求31的組合物，其中每一共軛物包括酰胺鍵。
54.權(quán)利要求31的組合物，其中每一共軛物包括仲胺鍵。
55.權(quán)利要求31的組合物，其中每一共軛物包括氨基甲酸酯鍵。
56.權(quán)利要求31的組合物，其中每一共軛物包括硫醚鍵。
57.權(quán)利要求31的組合物，其中每一共軛物包括二硫鍵。
58.制備共軛物的方法，該方法包括在共軛條件下使因子VIII部分與聚合物試劑接觸。
59.治療需要因子VIII療法的患者的方法，該方法包括對所述患者給予權(quán)利要求1或權(quán)利要求31的組合物的步驟，其中該組合物含有治療有效量的所述共軛物。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述的患者患有血友病A。
61.權(quán)利要求59的方法，其中在進行手術(shù)前2天內(nèi)對患者給予所述組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了因子VIII部分與一種或多種水溶性聚合物的共軛物。一般來說，所述的水溶性聚合物為聚(乙二醇)或其衍生物。本發(fā)明還提供了包括所述共軛物的組合物、制備所述共軛物的方法和對患者給予包括所述共軛物的組合物的方法。
文檔編號A61K47/48GK1767857SQ200480008422
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者M·J·博薩德, M·D·本特利 申請人:尼克塔治療亞拉巴馬公司