專利名稱：納豆激酶純化工藝及微囊制劑工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化藥物的純化工藝及其微囊劑和微囊制劑工藝，特別是涉及一種納豆激酶純化工藝及其腸溶微囊和腸溶微囊制劑工藝。
背景技術(shù)：
納豆(natto)及納豆激酶(Nattokinase)作為現(xiàn)代食品和功能食品的研發(fā)得到國內(nèi)外普遍重視。納豆是日本的傳統(tǒng)食品，食用已逾千年。納豆激酶從1987年須見洋行博士發(fā)現(xiàn)至今更為人們關(guān)注，關(guān)注的焦點是食用納豆激酶食品與人的健康長壽緊密相關(guān)。據(jù)報道納豆激酶制品具有很強的溶解纖維蛋白作用，降低血液粘度、降血脂、降膽固醇，改善血液循環(huán)狀況，維持血細胞的正常形態(tài)和功能等多種生理功能。因此納豆激酶制劑主要用于預(yù)防和治療心腦血栓、腦中風(fēng)、老年癡呆癥等。根據(jù)WHO公布的統(tǒng)計數(shù)字，全世界現(xiàn)在患有各種血栓性疾病的患者在1500萬之多，其中每年約有300萬患者死亡，同時還發(fā)現(xiàn)這種狀況向低年齡化發(fā)展。開發(fā)納豆激酶產(chǎn)品作為預(yù)防和治療血栓性疾病、老年癡呆癥等具有深遠的意義。
目前納豆激酶的純化工藝采用以下步驟疏水層析(填料為Butyl-Toyopearl)、離子交換(填料為CM-Toyopearl)、凝膠過濾(SephadexG-50)以及透析、離心、溶縮等才能得到納豆激酶的精品(SDS-PAGE呈單條帶)，缺點是其制取步驟繁多，不利于放大、生產(chǎn)。
納豆激酶是一種單鏈多肽酶。由于測定技術(shù)的不同，測得的分子量由27300KD至35000KD不等。根據(jù)已測得的氨基酸序列計算出準確分子量為27728KD。納豆激酶的等電點為8.6±0.3左右。對底物特異性的研究表明，納豆激酶的最敏感底物為Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA，其次為H-D-Val-Leu-Lys-PNA(S 2251)，對底物S 2238、S 2266和S 2302有一定活性。納豆激酶在自然pH狀態(tài)下比較穩(wěn)定；pH從7升至12時，10min內(nèi)穩(wěn)定；pH低于5時，迅速變性失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種納豆激酶純化工藝；本發(fā)明目的還在于提供一種納豆激酶腸溶微囊及其制劑工藝。
本發(fā)明的納豆激酶純化工藝是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的按常規(guī)方法制備納豆芽孢桿菌發(fā)酵液(如02116667.6號專利申請所述)或市售納豆激酶粗品按常規(guī)方法制成制成溶液；3000-6000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘；取上清，加硫銨至飽和度為30-50％；3000-6000轉(zhuǎn)/分離心；取沉淀，用5倍沉淀體積量的含0.8-1.2摩爾/升硫酸銨的磷酸鹽緩沖液溶解，緩沖液PH6.0-10.0，0.05摩爾/升；室溫放置12-24小時；3000-6000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘；取上清，上疏水層析柱，填料為苯基類疏水層析介質(zhì)；以含0.4-1.0摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液，緩沖液PH6.0-10.0，0.05摩爾/升；硫銨濃度以0.4-1.0摩爾/升逐漸至零梯度洗脫，時間為約3-6小時，收集活性最高峰；超濾，得納豆激酶精品。
其中所述的納豆激酶粗品液體可以按如下方法制成取100毫克納豆激酶粗品，溶于20-40毫升pH6-9，0.01-0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，30-50℃水浴8-12小時；本發(fā)明還提供一種納豆激酶微囊劑，該微囊劑中的微囊丸芯中含凍干粉38-60％，交聯(lián)CMC-Na 10-25％，微晶纖維素15-30％；所述凍干粉是由納豆激酶精品按常規(guī)方法加入注射劑的附加劑或附形劑制成凍干粉。
上述納豆激酶微囊劑中的微囊丸芯中優(yōu)選凍干粉50％，交聯(lián)CMC-Na25％，微晶纖維素25％。
本發(fā)明的微囊制劑工藝方案是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的按本發(fā)明方法或者其它常規(guī)方法制備納豆激酶精品，納豆激酶精品按常規(guī)方法加入注射劑的附加劑或附形劑(如右旋糖酐40)制成凍干粉；凍干粉加入濃度為20％-40％乙醇溶液，凍干粉和乙醇溶液的重量比為1∶0.8-1.2，再按凍干粉38-60％，交聯(lián)CMC-Na 10-25％，微晶纖維素15-30％加入交聯(lián)CMC-Na和微晶纖維素，混合，制軟材，擠出滾圓機制微囊丸芯；30℃烘干；按EUDRAGIT L30D-55(丙烯酸樹脂聚合物)40％，檸檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入滑石粉檸檬酸三乙酯，乳勻機高速乳勻30分鐘，得包衣液，將其攪拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，攪拌致均勻；將小丸倒入流化床包衣機內(nèi)，噴入包衣液包衣；包衣參數(shù)為流化床溫度25-28℃，噴霧壓力0.2Mpa，進風(fēng)流量0.4-0.45m3/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小時；包衣小丸裝膠囊。
本發(fā)明納豆激酶的純化工藝采用一次柱層析，以Phenyl Sepharose 6Fast flow為填料柱層析，產(chǎn)率高，速度快，可室溫操作，條件易控制，處理方便。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)納豆激酶相對穩(wěn)定，從而使納豆激酶粗品的純化大為簡化。實際上，從發(fā)酵液離心后所得的上清開始，通過醇沉(得粗品)、熱降解(或鹽析)，層析這主要三步，基本上完成了純化，使工藝大為簡化，產(chǎn)品純度高，成本低，收率較高，可大規(guī)模生產(chǎn)。納豆激酶精品及凍干粉SDS-PAGE顯示呈單條帶，分子量為28,000-30,000Dalton；凝塊溶解時間法測定活性為1020尿激酶單位/毫克；Lowry法測定蛋白質(zhì)含量為105微克/毫升；澄明度和不溶性微粒符合規(guī)定；細菌內(nèi)毒素檢查和無菌實驗合格。4℃-10℃保存6個月，復(fù)測SDS-PAGE仍呈單條帶，分子量為28,000-30,000Dalton；凝塊溶解時間法測定活性為1008尿激酶單位/毫克，凝塊溶解時間法(CLT)顯示精品較粗品的上清液比活性提高10倍以上；Lowry法測定蛋白質(zhì)含量為103微克/毫升；澄明度和不溶性微粒符合規(guī)定。
發(fā)明采用腸溶微囊制劑技術(shù)，有利于減少活性損失，微囊技術(shù)制劑顆粒小，均勻度好，活性損失小，體內(nèi)生物利用度高。
下列實驗例用于說明但不限于本發(fā)明。
實驗例1苯基疏水層析填料(Phenyl--)與辛基疏水層析填料(Octyl-)之比較1.上樣量的比較1.1填料Phenyl--；柱體積2.6×30cm；流速5.8cm/min表一苯基填料檢測
1.2填料Octyl--；柱體積2.6×30cm；流速5.8cm/min表二辛基填料檢測 有以上兩表可知苯基填料(Phenyl--)的上樣量大些，即每次的樣品處理量較辛基(Octyl--)大約20％。
2.流速的比較2.1填料Phenyl--；柱體積2.6×30cm；上樣量5ml表三苯基填料檢測 2.2填料Octyl-；柱體積2.6×30cm；上樣量5ml表四辛基填料檢測 由表三，四可知，苯基填料的最高流速遠大于辛基填料的最高流速；在相同的分離條件下，苯基填料分離納豆激酶的生產(chǎn)周期遠小于辛基填料。
綜上所述，苯基填料分離納豆激酶的上樣量和流速均大于辛基填料。生產(chǎn)中使用苯基填料分離納豆基酶樣品處理量較大，生產(chǎn)周期短。
實驗例2微囊檢測指標(biāo)(注“2、釋放度檢查”這一部分文章最后有全文)1、外觀黃白色小丸，球形圓整，流動性好，小丸粒徑400-700μm。
2、釋放度檢查溶出測定方法小杯法，轉(zhuǎn)速100rpm，溫度37℃，溶出介質(zhì)0.1mol/L HCl 150ml中2小時，取樣；向溶出杯中加入0.2mol/L磷酸鈉溶液50ml，繼續(xù)溶出45分鐘，取樣。溶出介質(zhì)使用前脫氣處理。
3、對照樣品酶活分別取上訴6批樣品三粒，去調(diào)膠囊殼，準確稱重，置250ml燒杯中，加入100mlPBS緩沖液(0.2mol/L PH6.8，于37℃水浴45分鐘，加磁力攪拌，使其充分溶解，再離心(4000rpm20min)，取上清夜測定酶活。
結(jié)果(1)2小時0.1mol/l鹽酸釋放液中均未測出酶活；(2)45分鐘PH6.8PBS釋放酶活及對照樣品酶活測定結(jié)果，微囊制劑酶活的平均釋放度為96％。
實驗例3微囊檢測指標(biāo)釋放度的檢查溶出測定方法小杯法，轉(zhuǎn)速100rpm，溫度37℃，溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸150ml中2小時，取樣；向溶出杯中加入0.2mol/L磷酸鈉溶液50ml，繼續(xù)溶出45分鐘，取樣測定酶活。溶出介質(zhì)使用前脫氣處理。
對照樣品酶活準確稱取上述微囊樣品，置250ml燒杯中，加入100mlPBS緩沖液(0.2mol/L PH6.8)，于37℃水浴45分鐘，加磁力攪拌，使其充分溶解，再離心(4000rpm20min)，取上清液測定酶活。
結(jié)果(1)2小時0.1mol/l鹽酸釋放液中均未測出酶活；(2)45分鐘PH6.8PBS釋放酶活及對照樣品酶活測定結(jié)果，微囊制劑酶活的平均釋放度為96％。
具體實施例方式實施例1納豆激酶發(fā)酵液500毫升，4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清，加硫銨至飽和度為40％；4000轉(zhuǎn)/分離心；取沉淀，溶于50ml 1.0摩爾/升硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，PH7.0，0.05摩爾/升；室溫放置過夜；2000轉(zhuǎn)/分離心15分；取上清，上疏水層析柱；填料為苯基瓊脂糖，柱尺寸內(nèi)徑1.6厘米，高20厘米，預(yù)先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩爾/升的含0.8摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液平衡；上樣量為30ml，流速8ml/min，梯度洗脫；即硫酸銨濃度由0.8摩爾/升逐漸至零，時間約為4小時；蛋白核酸紫外檢測在開始有一個大通過峰，無活性；在硫酸銨濃度接近40％時，出現(xiàn)了一個活性最高峰，收集此峰，超濾除鹽得40毫升納豆激酶精品，收率為15％(精品蛋白質(zhì)毫克/粗品毫克*100％)；納豆激酶精品經(jīng)SDS-PAGE(考馬斯亮蘭R250染色和銀染法)呈單條帶，分子量為28,000-30,000Dalton；凝塊溶解時間法測定活性為1500尿激酶單位/毫克；Lowry法(微量法)測蛋白質(zhì)含量為117.8微克/毫升；比活性為12733尿激酶單位/毫克蛋白質(zhì)。
實施例2取100毫克納豆激酶粗品，溶于30毫升PH7.4，0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液；40℃水浴10小時；5000轉(zhuǎn)/分離心20分；取上清加硫酸銨，使終溶度達1.0摩爾/升；4000轉(zhuǎn)/分離心20分；取上清，上疏水層析柱，填料為苯基瓊脂糖，柱尺寸內(nèi)徑1.6厘米，高20厘米，予先用PH7.0，0.05摩爾/升的含0.8摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液平衡；上樣量為10ml，流速8ml/min，梯度洗脫，即硫酸銨濃度由0.8摩爾/升逐漸至零，洗脫時間約3小時；蛋白紫外檢測開始有一個大通過峰，無活性；在硫酸銨濃度接近40％時，出現(xiàn)了一個活性最高峰，收集此峰，超過濾除鹽得25毫升納豆激酶精品，收率為20％(精品蛋白質(zhì)毫克/粗品毫克*100％)；納豆激酶精品經(jīng)SDS-PAGE(考馬斯亮蘭R250染色和銀染法)呈單條帶，分子量為28,000-30,000Dalton；凝塊溶解時間法測定活性為1200尿激酶單位/毫克；Lowry法(微量法)測蛋白質(zhì)含量為93.57微克/毫升；比活性為12824尿激酶單位/毫克蛋白質(zhì)。
實施例3將納豆激酶精品調(diào)節(jié)濃度為1000尿激酶單位/毫升，加入3％-10％右旋糖酐20-80；分裝為1.25毫升/西林瓶，30帕，最低溫度為-40℃冷凍干燥24小時；壓塞即得納豆激酶的注射用凍干粉；取納豆激酶精品的凍干粉按重量比為1∶1加入濃度為30％乙醇溶液，按凍干粉交聯(lián)CMC-Na微晶纖維素制軟材，擠出滾圓機制微囊丸芯，30℃烘干；按EUDRAGIT L30D-5540％，檸檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入檸檬酸三乙酯，乳勻機高速乳勻30分鐘，得包衣液；將其攪拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，攪拌致均勻；將小丸倒入流化床包衣機內(nèi)，噴入包衣液包衣；包衣參數(shù)為流化床溫度25-28℃，噴霧壓力0.2Mpa，進風(fēng)流量0.4-0.45m3/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小時；包衣小丸裝膠囊。
納豆激酶精品腸溶微囊的外觀黃白色小丸，球形圓整，流動性好，小丸粒徑400-700μm。2小時0.1mol/l鹽酸釋放液中均無酶活。45分鐘PH6.8PBS緩沖液中酶活的釋放度約為96％。
權(quán)利要求
1.一種納豆激酶純化工藝，其特征在于該工藝方法為取按常規(guī)方法制備納豆芽孢桿菌發(fā)酵液或市售納豆激酶粗品按常規(guī)方法制成的溶液，3000-6000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘；取上清，加硫銨至飽和度為30-50％；3000-6000轉(zhuǎn)/分離心；取沉淀，用5倍沉淀體積量的含0.8-1.2摩爾/升硫酸銨的磷酸鹽緩沖液溶解，緩沖液PH6.0-10.0，0.05摩爾/升；室溫放置12-24小時；3000-6000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘；取上清，上疏水層析柱，填料為苯基類疏水層析介質(zhì)；以含0.4-1.0摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液，緩沖液PH6.0-10.0，0.05摩爾/升；硫銨濃度以0.4-1.0摩爾/升逐漸至零梯度洗脫，時間為約3-6小時，收集活性最高峰；超濾，得納豆激酶精品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種納豆激酶純化工藝，其特征在于該工藝方法為取納豆激酶發(fā)酵液500毫升，4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清，加硫銨至飽和度為40％；4000轉(zhuǎn)/分離心；取沉淀，溶于50ml 1.0摩爾/升硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，PH7.0，0.05摩爾/升；室溫放置過夜；2000轉(zhuǎn)/分離心15分；取上清，上疏水層析柱；填料為苯基瓊脂糖，柱尺寸內(nèi)徑1.6厘米，高20厘米，預(yù)先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩爾/升的含0.8摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液平衡；上樣量為30ml，流速8ml/min，梯度洗脫；即硫酸銨濃度由0.8摩爾/升逐漸至零，時間約為4小時；得納豆激酶精品。
3.如權(quán)利要求1所述的一種納豆激酶純化工藝，其特征在于該工藝方法為取納豆激酶粗品100毫克，常規(guī)方法制成溶液，5000轉(zhuǎn)/分離心20分；取上清加硫酸銨，使終溶度達1.0摩爾/升；4000轉(zhuǎn)/分離心20分；取上清，上疏水層析柱，填料為苯基瓊脂糖，柱尺寸內(nèi)徑1.6厘米，高20厘米，予先用PH7.0，0.05摩爾/升的含0.8摩爾/升硫酸銨磷酸鹽緩沖液平衡；上樣量為10ml，流速8ml/min，梯度洗脫，即硫酸銨濃度由0.8摩爾/升逐漸至零，洗脫時間約3小時；蛋白紫外檢測開始有一個大通過峰，無活性；在硫酸銨濃度接近40％時，出現(xiàn)了一個活性最高峰，收集此峰，超過濾除鹽得25毫升納豆激酶精品。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種納豆激酶純化工藝，其特征在于該工藝方法中納豆激酶粗品溶液是由如下方法制成的取100毫克納豆激酶粗品，溶于20-40毫升pH6-9，0.01-0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，30-50℃水浴8-12小時。
5.如權(quán)利要求4所述的一種納豆激酶純化工藝，其特征在于該工藝方法中納豆激酶粗品溶液是由如下方法制成的納豆激酶粗品100毫克，溶于30毫升PH7.4，0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液；40℃水浴10小時，即得。
6.一種納豆激酶微囊劑，其特征在于該微囊劑中的微囊丸芯中含凍干粉38-60％，交聯(lián)CMC-Na 10-25％，微晶纖維素15-30％；所述凍干粉由納豆激酶精品按常規(guī)方法加入注射劑的附加劑或附形劑制成凍干粉。
7.如權(quán)利要求6所述的一種納豆激酶微囊劑，其特征在于該微囊劑中的微囊丸芯中含凍干粉50％，交聯(lián)CMC-Na 25％，微晶纖維素25％。
8.如權(quán)利要求6或7的所述一種納豆激酶微囊劑的制備方法，其特征在于該方法為納豆激酶精品按常規(guī)方法加入注射劑的附加劑或附形劑制成凍干粉；凍干粉加入濃度為20％-40％乙醇溶液，凍干粉和乙醇溶液的重量比為1∶0.8-1.2，再加交聯(lián)CMC-Na和微晶纖維素混合，制軟材，擠出滾圓機制微囊丸芯；30℃烘干；按丙烯酸樹脂聚合物40％，檸檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入滑石粉檸檬酸三乙酯，乳勻機高速乳勻30分鐘，得包衣液，將其攪拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，攪拌致均勻；將小丸倒入流化床包衣機內(nèi)，噴入包衣液包衣；包衣參數(shù)為流化床溫度25-28℃，噴霧壓力0.2Mpa，進風(fēng)流量0.4-0.45m3/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小時；包衣小丸裝膠囊。
9.如權(quán)利要求8所述的一種納豆激酶微囊劑的制備方法，其特征在于該方法為納豆激酶精品按常規(guī)方法加入注射劑的附加劑或附形劑制成凍干粉；取納豆激酶精品凍干粉按重量比為1∶1加入30％乙醇溶液，再加入交聯(lián)CMC-Na和微晶纖維素混合，制軟材，擠出滾圓機制微囊丸芯，30℃烘干；按EUDRAGITL30D-55 40％，檸檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入檸檬酸三乙酯，乳勻機高速乳勻30分鐘，得包衣液；將其攪拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，攪拌致均勻；將小丸倒入流化床包衣機內(nèi)，噴入包衣液包衣；包衣參數(shù)為流化床溫度25-28℃，噴霧壓力0.2Mpa，進風(fēng)流量0.4-0.45m3/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小時；包衣小丸裝膠囊。
10.如權(quán)利要求8所述的一種納豆激酶微囊劑的制備方法，其特征在于該方法為將納豆激酶精品調(diào)節(jié)濃度為1000尿激酶單位/毫升，加入3％-10％右旋糖酐20-80；分裝為1.25毫升/西林瓶，30帕，最低溫度為-40℃冷凍干燥24小時；壓塞即得納豆激酶的注射用凍干粉；取納豆激酶精品凍干粉按重量比為1∶1加入30％乙醇溶液，再按凍干粉50％，交聯(lián)CMC-Na 25％，微晶纖維素25％加入交聯(lián)CMC-Na和微晶纖維素，制軟材，擠出滾圓機制微囊丸芯，30℃烘干；按EUDRAGIT L30D-55 40％，檸檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入檸檬酸三乙酯，乳勻機高速乳勻30分鐘，得包衣液；將其攪拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，攪拌致均勻；將小丸倒入流化床包衣機內(nèi)，噴入包衣液包衣；包衣參數(shù)為流化床溫度25-28℃，噴霧壓力0.2Mpa，進風(fēng)流量0.4-0.45m3/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小時；包衣小丸裝膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納豆激酶純化工藝及其腸溶微囊和腸溶微囊制劑工藝。納豆激酶純化工藝步驟主要包括取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液或納豆激酶粗品溶液；離心、上清加硫銨，再離心；取沉淀，用磷酸鹽緩沖液溶解，緩沖液室溫放置后再離心，取上清，上疏水層析柱，用硫銨梯度洗脫，收集、超濾，得納豆激酶精品。本發(fā)明納豆激酶微囊劑的微囊丸芯中含由納豆激酶精品制成的凍干粉38－60％，交聯(lián)CMC－Na10－25％，微晶纖維素15－30％；其制劑方法為凍干粉加乙醇溶解，再加交聯(lián)CMC－Na和微晶纖維素混合，制軟材，制丸芯；噴入包衣液包衣，裝膠囊。
文檔編號A61K9/50GK1766096SQ20041008615
公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者段震文, 郭樹仁, 何大林 申請人:北京北大維信生物科技有限公司