專利名稱：湖北貝母中提取的單體生物堿在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥提取物及其應(yīng)用，具體涉及從湖北貝母中提取的幾種單體生物堿在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
湖北貝母為百合科貝母屬植物湖北貝母(Fritillaria Hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)的干燥鱗莖，微苦、涼，入肺、心經(jīng)，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳及散結(jié)之功效。1991年湖北貝母被部頒中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載，現(xiàn)已收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(2000年版)中，發(fā)展成為僅次于浙貝母的第二大主流品種。在化學(xué)成分研究方面，已從湖北貝母(簡(jiǎn)稱湖貝)的鱗莖中分離鑒定了11種生物堿湖貝酯(Hupeheninetate)、浙貝甲素(peimine)、浙貝乙素(peiminine)、湖貝甲素(hupehenine)、湖貝乙素(hupehenirine)、湖貝嗪(hupehenizine)、湖貝甲素苷(hupeheninoside)、湖貝苷(hupehemonoside)、湖貝啶(hupehenidine)、湖貝新(hupehenisine)和鄂貝新(ebeiensine)。另外，我們從湖北產(chǎn)貝母屬植物中鄂北貝母和紫花鄂北貝母中分離得到鄂貝甲素(ebeinine)、鄂貝乙素(ebeinone)等生物堿。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[參見(jiàn)熊瑋，郭小玲，何嘉瑯.湖北貝母藥理作用的初步研究(J).中草藥，1986，17(3)115-118.]湖北貝母乙醇提取物對(duì)多種平滑肌有明顯松弛作用，對(duì)豚鼠有平喘作用，能提高小鼠耐受常壓缺氧能力；總生物堿是其生物活性有效部位；總生物堿有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用，其生物堿含量及生物活性較川貝、浙貝高，但毒性也較川貝、浙貝大。
咳、痰、喘是呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)癥狀，尤其是支氣管哮喘。目前在這一領(lǐng)域的治療藥物研究進(jìn)展緩慢，尚無(wú)理想藥物。常見(jiàn)的止咳平喘藥物如麻黃制劑，不良反應(yīng)多，如血壓升高，失眠、頭痛、及快速耐受現(xiàn)象。西藥如氨茶堿只可平喘而無(wú)鎮(zhèn)咳、祛痰作用，且可產(chǎn)生耐受現(xiàn)象。因此，從祖國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)藥寶庫(kù)中挖掘一種安全、穩(wěn)定、高療效、無(wú)耐受性的止咳平喘藥物有著重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在湖北產(chǎn)貝母中的幾種單體生物堿中篩選出鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性優(yōu)良的單體，開(kāi)發(fā)成為一種天然、高效、低毒的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘藥物。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到從湖北產(chǎn)貝母中提取分離得到生物堿和生物堿苷單體，分別在同等劑量條件下和同等毒性條件下對(duì)生物堿和生物堿苷單體進(jìn)行了鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘實(shí)驗(yàn)。
對(duì)湖北產(chǎn)貝母生物堿和生物堿苷單體進(jìn)行了鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘實(shí)驗(yàn)，并與總生物堿比較，得出如下結(jié)論(1)在同等劑量條件下鄂貝甲素、湖貝甲素苷顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用；鄂貝甲素、鄂貝新顯示顯著的祛痰活性；鄂貝乙素、浙貝乙素、鄂貝新具較好的平喘作用；(2)在同等毒性條件下，湖貝乙素、浙貝乙素、湖貝甲素苷、湖貝甲素在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的1/10量時(shí)顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用；湖貝甲素苷、浙貝乙素劑量為L(zhǎng)D50的1/10，浙貝甲素、湖貝甲素、鄂貝新劑量為L(zhǎng)D50的1/5時(shí)顯示顯著的祛痰活性；浙貝甲素、浙貝乙素、鄂貝新在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的3/20量時(shí)顯示非常顯著的平喘活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1同等劑量條件下各單體鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性實(shí)驗(yàn)樣品的配制用萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取各單體3mg，用0.1％CMC-Na溶液定容至10ml，至超聲波清洗器中超聲10分鐘，搖勻，備用。
(一)鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)取體重20±2g小白鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為10組，按表1i.g給藥1h后，置于倒置的500ml燒杯內(nèi)，用1ml注射器吸取氨水0.15ml注入燒杯內(nèi)放的一棉球中，觀察咳嗽潛伏期和3分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)。
表1湖北貝母各單體灌胃給藥小鼠鎮(zhèn)咳作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劑量及途徑 咳嗽次數(shù)組別 咳嗽潛伏期(秒)只數(shù)(mg/kg) (3分鐘內(nèi))陰性 10 0 i.g58.9±14.1 13.1±4.2陽(yáng)性 10 30 i.g91.1±25.2**7.4±2.4*鄂貝甲素 10 3 i.g87.0±30.7*3.9±1.9**鄂貝乙素 10 3 i.g71.1±18.6 15.2±6.1浙貝甲素 10 3 i.g76.2±25.2 12.0±5.7浙貝乙素 10 3 i.g65.5±21.9 11.0±4.2湖貝甲素苷 10 3 i.g83.6±24.4*10.8±5.1湖貝甲素 10 3 i.g50.3±13.9 15.3±7.8
鄂貝新 103 i.g62.1±28.1 15.1±5.8總堿103 i.g98.7±15.6 6.8±1.7陰性組0.1％CMC-Na溶液；陽(yáng)性組可待因與陰性比較*P＜0.05**P＜0.01鄂貝甲素、湖貝甲素、總堿組顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用，與陰性比較有顯著性差異(p＜0.01-0.05)。
(二)祛痰實(shí)驗(yàn)取體重20±2g小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為10組，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，按表2i.g給藥，給藥后0.5h腹腔注射0.5％酚紅溶液0.5ml，30分鐘后處死小鼠(盡量不損傷氣管)，仰位固定于手術(shù)板上，剪開(kāi)頸正中皮膚，分離氣管，于喉頭下將頭磨平的7號(hào)針頭插入氣管內(nèi)0.3cm，用絲線結(jié)扎固定后以1ml注射器吸取5％NaHCO3溶液0.5ml，通過(guò)針頭來(lái)回灌洗呼吸道3次(每次不作停留)，將灌洗液注入一比色管中，重新吸取5％NaHCO3溶液0.5ml如上再灌洗3次，再第3次同樣灌洗，如此共用洗液1.5ml，抽洗9次，合并洗出液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)546nm處測(cè)A值。
表2湖北貝母各單體灌胃給藥小鼠祛痰作用實(shí)驗(yàn)劑量及途徑酚紅排泌量(ug/ml)組別動(dòng)物數(shù)(mg/kg) (X±SD)陰性10 0 i.g 0.0760±0.03陽(yáng)性10 25i.g 0.1020±0.03*鄂貝甲素10 3 i.g 0.0994±0.02**鄂貝乙素10 3 i.g 0.0582±0.03浙貝甲素10 3 i.g 0.0610±0.01浙貝乙素10 3 i.g 0.0650±0.02湖貝甲素甙 10 3 i.g 0.0780±0.03湖貝甲素10 3 i.g 0.0800±0.03鄂貝新 10 3 i.g 0.0910±0.03*總堿10 3 i.g 0.0730±0.03陰性組0.1％CMC-Na溶液；陽(yáng)性組愈創(chuàng)木酚甘油醚與陰性比較*P＜0.05**P＜0.01鄂貝甲素、鄂貝新顯示顯著的祛痰活性，與陰性比有顯著性差異，其中鄂貝甲素P＜0.01，鄂貝新P＜0.05，均強(qiáng)于總堿。
(三)平喘實(shí)驗(yàn)取170±20g的豚鼠(幼年豚鼠)，雌雄均可，逐一測(cè)定引喘潛伏期，挑選合格者。將豚鼠放入402型超聲霧化器中，以53Kpa(400mmHg)的恒壓噴入2％氯化乙酰膽堿和0.4％組胺的等量混合液15秒，密切注意豚鼠的反應(yīng)，觀察6分鐘內(nèi)豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期即引喘潛伏期(從噴霧停止到出現(xiàn)喘息性抽搐的時(shí)間)與發(fā)生抽搐的動(dòng)物數(shù)。如見(jiàn)到豚鼠跌倒應(yīng)立即將取出，以免死亡，并記錄引喘潛伏期，若引喘潛伏期大于150秒則認(rèn)為不敏感而不予選用，次日將合格豚鼠(60只)按體重隨機(jī)分組，每組6只，將9組豚鼠分別給予待試樣品及對(duì)照組，i.g給藥30分鐘后以同樣條件引喘并測(cè)定引喘潛伏期與發(fā)生抽搐動(dòng)物數(shù)的變化。如引喘潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)生抽搐的動(dòng)物數(shù)減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理有顯著意義的，即可認(rèn)為該藥具有平喘作用。
表3湖北貝母各單體灌胃給藥小鼠平喘作用實(shí)驗(yàn)用藥前 用藥后動(dòng)物 劑量及途 抽搐組別 引喘潛伏期 引喘潛伏期差值(秒)只數(shù) 徑(mg/kg) 動(dòng)物數(shù)(秒)(秒)陰性6 0 34.2±9.9 0/6 49.2±16.8 15.0±12.07陽(yáng)性6 4 35.0±9.566/6 76.7±15.1 41.8±17.0*鄂貝甲素6 3.3 33.2±9.1 6/6 47.5±9.714.3±7.9鄂貝乙素6 3.3 31.0±9.4 6/6 78.7±57.6 47.7±49.9浙貝甲素6 3.3 33.0±6.7 6/6 68.0±21.0 35.0±26.0浙貝乙素6 3.3 32.8±8.7 6/6 81.7±57.8 48.8±56.2湖貝甲素苷 6 3.3 33.7±12.76/6 48.5±21.5 14.8±16.4湖貝甲素6 3.3 33.7±5.4 6/6 50.2±15.7 16.5±15.2鄂貝新 6 3.3 33.0±13.16/6 82.0±42.4 49.0±38.3總堿6 3.3 30.5±3.6 6/6 52.7±16.2 22.2±13.8陰性組0.1％CMC-Na溶液；陽(yáng)性組麻黃堿與陰性比較**P＜0.01鄂貝乙素、浙貝乙素、鄂貝新給藥前與給藥后引喘潛伏期差值較接近，差值較大，雖與陰性比P＞0.05，但差值明顯長(zhǎng)于總生物堿，可能是動(dòng)物數(shù)較少的原因。
結(jié)論在同等劑量條件下，湖北產(chǎn)貝母各單體灌胃給藥對(duì)小鼠(3mg/kg)的鎮(zhèn)咳祛痰作用，對(duì)豚鼠(3.3mg/kg)的平喘作用(1)鄂貝甲素、湖貝甲素苷顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用，與陰性比較有顯著性差異(p＜0.01-0.05)，而總堿在同等劑量條件下顯示很強(qiáng)的毒性。
(2)鄂貝甲素、鄂貝新顯示顯著的祛痰活性，與陰性比較有顯著性差異，其中鄂貝甲素P＜0.01，鄂貝新P＜0.05，均強(qiáng)于總堿。
(3)鄂貝乙素、浙貝乙素、鄂貝新具較好的平喘作用，給藥前與給藥后引喘潛伏期差值長(zhǎng)于總生物堿。
實(shí)施例2同等毒性條件下各單體鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性實(shí)驗(yàn)樣品的配制按藥理要求配制樣品，小鼠按每只0.2ml(相當(dāng)于LD50的1/5量)尾靜脈給藥；豚鼠按每只0.4ml(相當(dāng)于LD50的1/10量)腹腔注射給藥；并用稀硫酸調(diào)PH約5，搖勻，備用。
(一)鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)取體重20±2g小白鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為10組，按表4i.v(尾靜脈注射)給藥1h后，置于倒置的500ml燒杯內(nèi)，用1ml注射器吸取氨水0.15ml注入燒杯內(nèi)放的一棉球中，觀察咳嗽潛伏期和3分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)。
表4湖北貝母各單體尾靜脈注射小鼠鎮(zhèn)咳作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 LD50咳嗽潛伏期 咳嗽次數(shù)組別 劑量(mg/kg)只數(shù)(mg/kg)(秒)(3分鐘內(nèi))陰性 10 0 58.3±34.84 81.8±31.16陽(yáng)性 10 4 75.6±48.22 53.3±28.30*總堿 10 1.3 13.17 77.8±35.59 102.3±59.33湖貝乙素 10 5.2 51.89 100.6±50.75*74.6±46.32浙貝甲素 10 1.5 14.29 93.7±47.77 63.6±40.07浙貝乙素 10 1.3 13.08 46.4±36.80 38.2±22.46**湖貝甲素苷 10 2.0 20.80 51.6±25.29 53.3±27.47*湖貝甲素 10 4.2 41.84 57.0±28.51 52.3±29.50*鄂貝新 10 3.9 39.31 66.1±33.60 55.4±28.35陰性組注射用水；陽(yáng)性組磷酸可待因，i.g與陰性比較*p＜0.05**p＜0.01
湖貝乙素、浙貝乙素、湖貝甲素苷、湖貝甲素在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的1/10量時(shí)顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用，優(yōu)于總堿，與陰性比有顯著性差異(p＜0.01-0.05)。
(二)祛痰實(shí)驗(yàn)取體重20±2g小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為10組，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，按表5i.g給藥，給藥后0.5h腹腔注射0.5％酚紅溶液0.5ml，30分鐘后處死小鼠(盡量不損傷氣管)，仰位固定于手術(shù)板上，剪開(kāi)頸正中皮膚，分離氣管，于喉頭下將頭磨平的7號(hào)針頭插入氣管內(nèi)0.3cm，用絲線結(jié)扎固定后以1ml注射器吸取5％NaHCO3溶液0.5ml，通過(guò)針頭來(lái)回灌洗呼吸道3次(每次不作停留)，將灌洗液注入一比色管中，重新吸取5％NaHCO3溶液0.5ml如上再灌洗3次，再第3次同樣灌洗，如此共用洗液1.5ml，抽洗9次，合并洗出液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)546nm處測(cè)OD值。
表5湖北貝母各單體尾靜脈注射小鼠祛痰作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劑量 LD50酚紅排泌量(ug/ml)組別只數(shù) (mg/kg) (mg/kg) X±SD陰性10 0 0.207±0.039陽(yáng)性10 5000.273±0.040**總堿10 2.6 13.17 0.263±0.040*湖貝乙素10 10.451.89 0.215±0.030浙貝甲素10 3.0 14.29 0.242±0.033*浙貝乙素10 1.3 13.08 0.244±0.032*湖貝甲素苷 10 2.0 20.80 0.298±0.032***湖貝甲素10 8.4 41.84 0.271±0.046***鄂貝新 10 7.8 39.31 0.257±0.031*陰性組注射用水；陽(yáng)性組愈創(chuàng)木酚甘油醚，皮下注射與陰性比較*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001浙貝甲素、浙貝乙素、湖貝甲素苷、湖貝甲素、鄂貝新(其中湖貝甲素苷、浙貝乙素劑量為L(zhǎng)D50的1/10，浙貝甲素、湖貝甲素、鄂貝新劑量為L(zhǎng)D50的1/5)顯示顯著的祛痰活性，與陰性比有顯著性差異，其中湖貝甲素苷、湖貝甲素p＜0.001，強(qiáng)于總堿，浙貝甲素、浙貝乙素、鄂貝新p＜0.05。
(三)平喘實(shí)驗(yàn)取170±20g的豚鼠(幼年豚鼠)，雌雄均可，逐一測(cè)定引喘潛伏期，挑選合格者。將豚鼠放入402型超聲霧化器中，以53Kpa(400mmHg)的恒壓噴入2％氯化乙酰膽堿和0.4％組胺的等量混合液15秒，密切注意豚鼠的反應(yīng)，觀察6分鐘內(nèi)豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期即引喘潛伏期(從噴霧停止到出現(xiàn)喘息性抽搐的時(shí)間)與發(fā)生抽搐的動(dòng)物數(shù)。如見(jiàn)到豚鼠跌倒應(yīng)立即將取出，以免死亡，并記錄引喘潛伏期，若引喘潛伏期大于150秒則認(rèn)為不敏感而不予選用，次日將合格豚鼠(72只)按體重隨機(jī)分組，每組8只，將9組豚鼠分別給予待試樣品及對(duì)照組，i.g給藥30分鐘后以同樣條件引喘并測(cè)定引喘潛伏期與發(fā)生抽搐動(dòng)物數(shù)的變化。
表6湖北貝母各單體豚鼠腹腔注射平喘作用實(shí)驗(yàn)用藥前 用藥后動(dòng)物劑量 差值組別LD50引喘潛伏期 引喘潛伏期只數(shù) (mg/kg) (秒)(mgg/kg) (秒)(秒)陰性8 0 58.09±13.78 69.6±31.8316.91±37.89258.13±陽(yáng)性8 12577.75±30.45 335.88±68.2470.25**總堿8 1.98 13.17 53.14±12.12 62.71±28.63 9.57±29.31湖貝乙素8 7.8 51.89 67.88±20.30 66.00±18.32 5.38±23.83浙貝甲素8 2.28 14.29 53.38±11.73 151.88±132.17 95.51±121.79*浙貝乙素8 2.28 13.08 62.63±28.48 161.13±128.98 98.51±131.34*湖貝甲素苷 8 1.98 20.80 53.25±14.08 71.38±37.40 18.12±27.12湖貝甲素8 3.06 41.84 58.88±17.61 55.38±25.63 -4.13±30.39鄂貝新 8 5.88 39.31 49.25±7.8184.5±39.5141.63±51.16*陰性組注射用水；陽(yáng)性組氨茶堿與陰性比較*p＜0.05**p＜0.01浙貝甲素、浙貝乙素、鄂貝新在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的3/20量時(shí)顯示非常顯著的平喘活性，用藥前后引喘潛伏期差值有較大的增加，差值與陰性比有顯著性差異(p＜0.05)。
結(jié)論在同等毒性條件下，湖北產(chǎn)貝母中各單體對(duì)小鼠尾靜脈給藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用，對(duì)豚鼠腹腔注射的平喘作用(1)湖貝乙素、浙貝乙素、湖貝甲素甙、湖貝甲素在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的1/10量時(shí)顯示顯著的鎮(zhèn)咳作用，優(yōu)于總堿，與陰性比有顯著性差異(p＜0.01-0.05)。
(2)浙貝甲素、浙貝乙素、湖貝甲素甙、湖貝甲素、鄂貝新(其中湖貝甲素苷、浙貝乙素劑量為L(zhǎng)D50的1/10，浙貝甲素、湖貝甲素、鄂貝新劑量為L(zhǎng)D50的1/5)顯示顯著的祛痰活性，與陰性比有顯著性差異，其中湖貝甲素苷、湖貝甲素p＜0.001，強(qiáng)于總堿，浙貝甲素、浙貝乙素、鄂貝新p＜0.05。
(3)浙貝甲素、浙貝乙素、鄂貝新在相當(dāng)于各生物堿樣品LD50的3/20量時(shí)顯示非常顯著的平喘活性，用藥前后引喘潛伏期差值有較大的增加，差值與陰性比有顯著性差異(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.從湖北貝母中提取的生物堿或生物堿苷單體在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的從湖北貝母中提取的生物堿或生物堿苷單體包括浙貝甲素、浙貝乙素、湖貝甲素、湖貝乙素、湖貝嗪、湖貝甲素苷、湖貝苷、湖貝啶、湖貝新、鄂貝甲素、鄂貝乙素和鄂貝新。
3.湖貝甲素苷在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應(yīng)用。
4.鄂貝甲素、鄂貝新、湖貝甲素苷、湖貝甲素、浙貝甲素或浙貝乙素在制備祛痰藥物中的應(yīng)用。
5.鄂貝新制備祛痰藥物中的應(yīng)用。
6.鄂貝乙素、浙貝甲素、浙貝乙素或鄂貝新在制備平喘藥物中的應(yīng)用。
7.浙貝乙素或鄂貝新在制備平喘藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了湖北貝母生物堿或生物堿苷單體在鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥物中的用途。湖北貝母生物堿和生物堿苷單體的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性與總生物堿比較在同等劑量條件下，鄂貝新具有較好作用；在同等毒性條件下，浙貝乙素具有較好作用。
文檔編號(hào)A61K36/888GK1739528SQ20041006075
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者吳繼洲, 張勇慧, 阮漢利, 皮慧芳 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院