專利名稱：一種含三七總皂苷和淫羊藿苷的藥物組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物組合物，尤其涉及三七總皂苷和淫羊藿苷的組合物及其在制備治療老年性癡呆癥藥物中的用途。
背景技術(shù)：
隨著我國社會結(jié)構(gòu)改變，總?cè)丝诶淆g化比率日益突出，老年性癡呆的發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，但是能夠達(dá)到療效肯定、不良反應(yīng)輕微、用藥方便、療程適中的藥物卻明顯缺乏。中國加入WTO后，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的該類新藥更少，亟待研制開發(fā)具有我國獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的，并具有我國特色的療效肯定、不良反應(yīng)輕微的治療老年性癡呆高技術(shù)含量新藥。
對老年性癡呆中醫(yī)講究辨證論治，認(rèn)為該病既為虛癥，又為實(shí)癥。從虛癥論治，認(rèn)為由于諸臟虧損，氣血不足引起的，認(rèn)為與腎腦有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為精藏于腎，腎精不足不能生髓，“腦為髓之?！?，從而引起腦海空虛。因此腎精虧虛，精奪髓枯，而髓海不足，發(fā)為腦海。從實(shí)癥論治，認(rèn)為多因痰瘀，血瘀，引起腦絡(luò)阻死有關(guān)。因此治療多運(yùn)用補(bǔ)腎填精益髓、活血化瘀的治則。
以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)，老年性癡呆的發(fā)病機(jī)理較復(fù)雜，一些發(fā)病環(huán)節(jié)已經(jīng)得到證實(shí)。其中β淀粉樣蛋白(Aβ)肽的生成和蓄積是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，而血管硬化等又是血管性癡呆的重要原因。其中腦組織和血管的氧化和脂質(zhì)過氧化，以及雌激素水平改變與老年性癡呆發(fā)病的相關(guān)性已經(jīng)獲得了共識[1，2]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供三七總皂苷和淫羊藿苷組合物，三七總皂苷和淫羊藿苷是從祖國醫(yī)學(xué)中具有活血化瘀、補(bǔ)腎溫陽的中藥三七和淫羊藿中提取單一的具活性的有效部位，本發(fā)明組合物組成是三七總皂苷∶淫羊藿苷的重量比值是0.01∶0.99～0.50∶0.50。相當(dāng)于相應(yīng)的三七∶淫羊藿兩藥材重量比值為0.01∶0.99～0.50∶0.50。
組合物與藥用賦形劑制備的制劑形式主要包括液體制劑和固體制劑。固體制劑主要包括顆粒劑、片劑、膠囊劑(含軟膠囊)、滴丸劑。液體制劑主要包括口服液體制劑和注射液體制劑。
所述制劑的給藥形式主要包括口服給藥或非腸道給藥，優(yōu)選口服給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該組合物在制備治療老年性癡呆癥(阿爾茨海默病和血管性癡呆)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該組合物在制備改善老年性癡呆癥(阿爾茨海默病和血管性癡呆)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是1.該組合物基于中醫(yī)藥理論，參考循證醫(yī)學(xué)資料，選用了兩種藥材中具有活血化瘀、補(bǔ)腎溫陽、補(bǔ)益強(qiáng)壯之功效的有效部位組合，因此具有我國獨(dú)特的經(jīng)歷了長期用藥證實(shí)的治療作用理論基礎(chǔ)，并能獲相得益彰的作用。
2.該組合物在制備用于治療和改善老年性癡呆(阿爾茨海默病和血管性癡呆)藥物中應(yīng)用，可解決該類疾病治療中，明顯缺乏療效肯定、不良反應(yīng)輕微、用藥方便的藥物的問題。
3.采用多種經(jīng)典的生物評價(jià)系統(tǒng)，在細(xì)胞水平和基因水平證實(shí)組合物之一的淫羊藿苷經(jīng)口給藥后，其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗氧化作用和雌激素樣作用，可提供該組合物制備的藥物在治療上述疾病中具有多層次、多靶點(diǎn)作用的依據(jù)。
4.經(jīng)動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，該組合物具有以下作用(1)大鼠活血化瘀作用(調(diào)節(jié)凝血作用，抗血栓形成作用，調(diào)節(jié)血液流變學(xué)作用)。
(2)促進(jìn)大鼠空間記憶作用，對D-半乳糖所致亞急性衰老合并鵝膏蕈酸損傷Meynert基底核的老年性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有顯著改善作用。
5.經(jīng)拆方研究，組合物將兩種有效部位合用，比單用其中任何一種作用顯著增強(qiáng)，并非簡單作用疊加。該組合物的上述作用顯著強(qiáng)于兩種藥材的常規(guī)水煎液。本組合物毒理作用研究結(jié)果表明，兩種有效部位合用的小鼠急性毒性研究結(jié)果，與單用其中任何一種相仿，均未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀。
6.本發(fā)明從三七和淫羊藿藥材中提取單一的有效部位三七總皂苷和淫羊藿苷，各達(dá)到＞50％以上，并獲得用于治療老年性癡呆的兩種有效部位最佳配比，可用于研制5類以上中藥新藥，拓展了單一藥物用途。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1本發(fā)明三七總皂苷和淫羊藿苷的制備方法(一)稱取三七粉末(20-40目)，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并濾液，減壓濃縮至一定體積(0.33g生藥/ml)，即得上柱溶液。吸取該溶液上大孔樹脂，用7倍量75％乙醇洗脫，分段收集洗脫液。洗脫液水浴揮干，減壓濃縮，真空干燥，稱量總固體物并測定三七總皂苷含量。本批三七總皂苷含量＞80％。
(二)稱取淫羊藿干燥原料(地上部分粉碎料，包括莖葉)乙醇提取3次(1小時(shí)/次)提取液濃縮烘干，干燥物HPLC檢測，提取物淫羊藿苷含量為4.9％)。繼而分離精制如下提取液→DM130大孔樹脂吸附→蒸餾水洗脫雜質(zhì)→低醇洗脫雜質(zhì)→高醇洗脫有效成分→樹脂再生。60％乙醇洗脫液獲淫羊藿苷76.9％。
上述兩種制備方法提取的三七總皂苷(含量＞80％)和淫羊藿苷(含量76.9％)，以下簡稱“三七總皂苷和淫羊藿苷提取物”。
實(shí)施例2本發(fā)明組合物的最大耐受量實(shí)驗(yàn)(1)材料與方法三七總皂苷和淫羊藿苷提取物參照實(shí)施例1方法獲得，以0.5％羧甲基纖維素鈉配制成懸液。藥物濃度各相當(dāng)于在10g生藥中含量/ml，臨用前按照三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.01∶0.99混勻成為組合物A和三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.5∶0.5混勻成為組合物B。
采用最大濃度(相當(dāng)于10g生藥/ml)、最大給藥容量0.4ml/10g/次灌胃給藥，一天給與小鼠組合物和兩藥材單個(gè)提取物及各兩次，間隔5～6小時(shí)，觀察給藥當(dāng)天及隨后兩周內(nèi)小鼠的體重和各種癥狀。
(2)結(jié)果小鼠灌胃給藥當(dāng)天和次日均有拉稀便現(xiàn)象，給藥當(dāng)天尚出現(xiàn)耳廓血管擴(kuò)張現(xiàn)象，但組合物和兩藥材單個(gè)提取物之間未見差異。所有給藥組均未出現(xiàn)死亡，隨后兩周內(nèi)未見表觀不良癥狀。
(3)結(jié)論組合物和兩藥材單個(gè)提取物小鼠灌胃給予800g生藥中相應(yīng)含量/kg，除給藥當(dāng)天有拉稀便現(xiàn)象外和耳廓血管擴(kuò)張現(xiàn)象，未出現(xiàn)死亡及其它明顯毒性反應(yīng)。
實(shí)施例3本發(fā)明組合物的最大耐受量實(shí)驗(yàn)2
(1)材料與方法參見實(shí)施例2，供試藥物為三七總皂苷和淫羊藿苷以重量比0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.4∶0.6的組合物A～D。
(2)結(jié)果小鼠灌胃給藥當(dāng)天和次日均有拉稀便現(xiàn)象，給藥當(dāng)天尚出現(xiàn)耳廓血管擴(kuò)張現(xiàn)象，但組合物A～D之間未見顯著差異。所有給藥組均未出現(xiàn)死亡，隨后兩周內(nèi)未見表觀不良癥狀。
(3)結(jié)論組合物A～D小鼠灌胃給予800g生藥中相應(yīng)含量/kg，除給藥當(dāng)天有拉稀便現(xiàn)象外和耳廓血管擴(kuò)張現(xiàn)象，未出現(xiàn)死亡及其它明顯毒性反應(yīng)。
實(shí)施例4抗大鼠凝血酶原(PT)和部分凝血活酶(KPTT)實(shí)驗(yàn)(1)材料與方法三七總皂苷和淫羊藿苷提取物參照實(shí)施例1方法獲得，并組成組合物A(三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.01∶0.99)和組合物B(三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.50∶0.50)。
肝素鈉注射液上海第一生化藥業(yè)有限公司 批號031101。復(fù)方丹參片杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司 批號031030。枸櫞酸鈉西安化學(xué)試劑廠 批號980602。PT試劑盒上海榮盛生物技術(shù)有限公司 批號20040302。KPTT試劑盒上海榮盛生物技術(shù)有限公司 批號20040223。
Sprage-Dawley大鼠，清潔級，體重180～200g，雌雄各半。
設(shè)溶劑對照蒸餾水，陽性對照復(fù)方丹參片(1g/kg，灌胃)、肝素鈉(1000u/kg，腹腔注射)，組合物A和組合物B的低劑量組(總10g生藥/kg，灌胃)和高劑量組(總20g生藥/kg，灌胃)，三七總皂苷和淫羊藿苷提取物單獨(dú)給藥組(均各為10g生藥/kg，灌胃)。
除陽性對照肝素鈉組外，其他各組連續(xù)給藥7天，期間肝素鈉組每天灌胃10ml/kg蒸餾水。末次給藥前禁飼不禁水12～16小時(shí)。并于末次給藥后1小時(shí)(肝素鈉組為結(jié)扎前30min，腹腔注射)，用烏拉坦(1g/kg)麻醉固定大鼠，打開腹腔分離下腔靜脈。用一次性注射器順利從下腔靜脈抽取1.8ml靜脈血，立即滴入硅化試管(事先注入0.2ml 3.2％枸櫞酸鈉)，輕搖試管使抗凝劑和血漿混勻。將標(biāo)本于3000rpm離心5min，上清分裝于75×10mm的硅化試管，每個(gè)標(biāo)本分裝四份，每份0.1ml血清。
按試劑盒說明測定PT及KPTT，每個(gè)指標(biāo)測兩份復(fù)管取均值。比較給藥組和對照組的差異。
(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理PT和KPTT測得數(shù)據(jù)以秒單位和溶劑對照進(jìn)行t檢驗(yàn)(3)結(jié)果大鼠用相當(dāng)于20g總生藥中含量/kg的組合物A和組合物B連續(xù)灌胃，9天后均能延長KPTT(P＜0.05)，但不能延長PT(P＞0.05)；用相當(dāng)于總生藥10g/kg的組合物A和組合物B或各10g生藥/kg單一提取物連續(xù)灌胃，9天后均不能延長大鼠PT和KPTT(P＞0.05)。詳細(xì)結(jié)果參見表1表1 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物抗大鼠凝血酶原(PT)和部分凝血活酶(KPTT)作用組別 劑量 動(dòng)物數(shù) PT(秒) KPTT(秒)溶劑對照10ml/kg 10 18.1±1.5 28.6±2.6肝素鈉 1000u/kg 10 23.3±5.5 111.2±44.3**三七總皂苷 10g生藥/kg 10 18.9±1.7 31.6±4.9淫羊藿苷10g生藥/kg 10 18.3±1.3 30.2±4.6組合物A 10g生藥/kg 10 18.7±2.2 31.8±5.7組合物A 20g生藥/kg 10 20.2±3.7 39.3±4.0*組合物B 10g生藥/kg 10 18.6±1.4 30.4±5.7組合物B 20g生藥/kg 10 19.2±3.1 36.7±2.8*復(fù)方丹參片 1g生藥/kg10 19.5±1.9 34.4±6.4*P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照相比(4)結(jié)論大鼠用相當(dāng)于20g總生藥中含量/kg的組合物A和組合物B連續(xù)灌胃9天，能抑制內(nèi)源性凝血活酶(P＜0.05)，比單用其中任何一種作用顯著增強(qiáng)；對外源性凝血酶原沒有顯著性抑制作用(P＞0.05)。
實(shí)施例5抗大鼠凝血酶原(PT)和部分凝血活酶(KPTT)實(shí)驗(yàn)2(1)材料與方法參見實(shí)施例4，供試藥物為三七總皂苷和淫羊藿苷以重量比0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.4∶0.6的組合物A～D。
設(shè)溶劑對照蒸餾水，陽性對照復(fù)方丹參片(1g/kg，灌胃)、肝素鈉(1000u/kg，腹腔注射)，組合物A～D的低劑量組(總10g生藥/kg，灌胃)和高劑量組(總20g生藥/kg，灌胃)。
(2)結(jié)果大鼠用相當(dāng)于20g總生藥中含量/kg的組合物A～D連續(xù)灌胃，9天后均能延長KPTT(P＜0.05)，但不能延長PT(P＞0.05)；用相當(dāng)于總生藥10g/kg的組合物A～D連續(xù)灌胃，9天后均不能延長大鼠PT和KPTT(P＞0.05)。詳細(xì)結(jié)果參見表2表2 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物抗大鼠凝血酶原(PT)和部分凝血活酶(KPTT)作用組別 劑量 動(dòng)物數(shù) PT(秒) KPTT(秒)溶劑對照 10ml/kg 10 18.3±1.4 27.6±2.0肝素鈉 1000u/kg 10 22.6±4.7 109.2±40.3**組合物A 10g生藥/kg 10 18.6±1.4 30.4±5.7組合物A 20g生藥/kg 10 18.9±3.3 37.6±2.1*組合物B 10g生藥/kg 10 18.5±2.7 32.8±6.1組合物B 20g生藥/kg 10 20.7±2.3 38.4±2.9*組合物C 10g生藥/kg 10 17.9±1.8 31.2±3.6組合物C 20g生藥/kg 10 20.1±3.7 38.8±2.3*組合物D 10g生藥/kg 10 18.7±2.0 31.6±2.7組合物D 20g生藥/kg 10 19.8±2.8 35.9±2.0*復(fù)方丹參片 1g生藥/kg10 19.9±1.5 34.3±4.7*P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照相比(3)結(jié)論大鼠用相當(dāng)于20g總生藥中含量/kg的組合物A～D連續(xù)灌胃9天，能抑制內(nèi)源性凝血活酶(P＜0.05)；對外源性凝血酶原沒有顯著性抑制作用(P＞0.05)。
實(shí)施例6三七總皂苷和淫羊藿苷提取物抗大鼠血栓形成試驗(yàn)(下腔靜脈結(jié)扎法)(1)材料與方法三七總皂苷和淫羊藿苷提取物參照實(shí)施例1方法獲得，組合物制備與實(shí)施例3同，批號040330，藥物濃度4g生藥/ml。
肝素鈉注射液上海第一生化藥業(yè)有限公司 批號031101。烏拉糖曹揚(yáng)第二中學(xué)化工廠 批號19971022。
Sprage-Dawley大鼠，清潔級，體重220～240g，雌雄各半。
設(shè)溶劑對照蒸餾水，陽性對照肝素鈉(1000u/kg，腹腔注射)、三七總皂苷組、淫羊藿苷組(各折合生藥量10g/kg，灌胃)、三七總皂苷和淫羊藿苷組合物按0.01∶0.99組合物(組合物A)和0.50∶0.50(組合物B)低劑量組(折合總生藥量10g/kg，灌胃)、高劑量組(折合總生藥量20g/kg，灌胃)。
除陽性對照外，其他各組連續(xù)給藥7天，期間陽性組灌胃10ml/kg蒸餾水。末次給藥前禁飼不禁水12～14h。末次給藥后1h(陽性對照為結(jié)扎前30分鐘，腹腔注射)，用烏拉坦(1g/kg)麻醉固定大鼠，于腹中線切開皮膚及肌肉約3cm打開腹腔，找到下腔靜脈并分離，于左腎靜脈下方用7號粗絲線結(jié)扎下腔靜脈，縫合腹壁。2h后重新打開腹壁，用止血鉗夾住結(jié)扎下方2cm處下腔靜脈(髂靜脈分支處附近)，并用止血鉗夾住2cm段內(nèi)主要靜脈分支。縱行切開該段靜脈，濾紙條吸盡管腔內(nèi)血液，觀察有無血栓形成。如有則取出用濾紙吸盡血液稱重。比較用藥組和對照組間差異。
(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對血栓重量進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
(3)結(jié)果大鼠用組合物A和組合物B的低劑量組和高劑量組連續(xù)灌胃(折合總生藥量10g/kg、20g/kg)7天后，均能顯著抑制血栓的形成(P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果參見表3。
表3 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物抗大鼠血栓形成作用組別 劑量 動(dòng)物數(shù) 血栓重量(mg)溶劑對照 10ml/kg 103.50±1.22三七總皂苷 10g生藥/kg101.69±0.63*淫羊藿苷 10g生藥/kg102.28±0.67組合物A 10g生藥/kg101.47±0.98*組合物A 20g生藥/kg100.64±0.52**組合物B 10g生藥/kg101.97±0.78*組合物B 20g生藥/kg100.82±0.57**肝素鈉 1000u/kg 100****P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與溶劑對照相比
(4)結(jié)論大鼠用組合物A和組合物B低劑量組(均折合總生藥量10g/kg)和高劑量組(均折合總生藥量20g/kg)連續(xù)灌胃7天，對下腔靜脈結(jié)扎引起的血栓形成有顯著抑制作用(P＜0.05，P＜0.01)，比單用其中任何一種作用顯著增強(qiáng)。
實(shí)施例7三七總皂苷和淫羊藿苷提取物抗大鼠血栓形成試驗(yàn)2(下腔靜脈結(jié)扎法)(1)材料與方法參見實(shí)施例6，供試藥物為三七總皂苷和淫羊藿苷以重量比0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.4∶0.6的組合物A～D。
設(shè)溶劑對照蒸餾水，陽性對照肝素鈉(1000u/kg，腹腔注射)、三七總皂苷和淫羊藿苷組合物A～D低劑量組(折合總生藥量10g/kg，灌胃)、高劑量組(折合總生藥量20g/kg，灌胃)。
(3)結(jié)果大鼠用組合物A～D的低劑量組和高劑量組連續(xù)灌胃(折合總生藥量10g/kg、20g/kg)7天后，均能顯著抑制血栓的形成(P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果參見表4。
表4 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物抗大鼠血栓形成作用組別劑量 動(dòng)物數(shù) 血栓重量(mg)溶劑對照10ml/kg 103.89±1.42組合物A 10g生藥/kg101.45±0.59*組合物A 10g生藥/kg102.09±0.62組合物B 10g生藥/kg101.50±0.66*組合物B 20g生藥/kg100.68±0.57**組合物C 10g生藥/kg102.08±0.80組合物C 20g生藥/kg101.33±0.72*組合物D 10g生藥/kg100.69±0.46**組合物D 20g生藥/kg100.78±0.49**肝素鈉 1000u/kg 100****P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與溶劑對照相比(4)結(jié)論大鼠用組合物A～D低劑量組(均折合總生藥量10g/kg)和高劑量組(均折合總生藥量20g/kg)連續(xù)灌胃7天，對下腔靜脈結(jié)扎引起的血栓形成有顯著抑制作用(P＜0.05，P＜0.01)。
實(shí)施例8淫羊藿苷大鼠灌胃后體內(nèi)代謝產(chǎn)物測定及其代謝產(chǎn)物體外抗氧化作用取Sprage-Dawley大鼠8只，經(jīng)18h空腹(禁食不禁水)后灌胃給予淫羊藿120mg/kg，予給藥后240min尾靜脈取血，同時(shí)收集0-96h的尿液和糞便，作生物樣品預(yù)處理，并以毛細(xì)管電泳法測定血清，尿液和糞便中代謝產(chǎn)物，并以液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)分析確證結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，尿液與糞便中幾乎未見淫羊藿苷，但是可見淫羊藿素與去甲淫羊藿素。
體外抗氧化活性通過Photochem抗氧化測定儀測定。采用水溶性物質(zhì)抗氧化能力測定法(ACW法)，先用維生素C為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，淫羊藿苷、及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物淫羊藿素與去甲淫羊藿素用工作液溶解后使最終實(shí)驗(yàn)量分別為6nmol、0.6nmol、0.6nmol，并進(jìn)行抗氧化活性測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以維生素C當(dāng)量表示，結(jié)果參見表5。
表5 淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物的體外抗氧化活性樣品遲滯時(shí)間 抗氧化當(dāng)量 x 標(biāo)準(zhǔn)差 相對標(biāo)準(zhǔn)差(nmol維生素C) (S.D.)R.S.D(％)13.10.28淫羊藿苷15.10.32 0.30 0.021 7.0(6nmol)14.50.317.9 0.17淫羊藿素8.2 0.17 0.17 0.006 3.5(0.6nmol)7.6 0.1636.90.77去甲淫羊藿素38.10.80 0.84 0.091 10.8(0.6nmol)44.90.94參見

圖1，采用PHOTOCHEM化學(xué)發(fā)光法獲得抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)光發(fā)射曲線，樣品具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可消除較多的自由基，從而使發(fā)光強(qiáng)度減小、信號減弱、出現(xiàn)時(shí)間變遲。圖中內(nèi)標(biāo)氨基苯二酰肼(1)，淫羊藿素0.6nmol、淫羊藿苷6.0nmol，、去甲淫羊藿素0.6nmol(2-4)的曲線。
結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝47.86×-0.16(R2＝0.9990)。以維生素C為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與遲滯時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其他測定樣品的信號通過標(biāo)準(zhǔn)取消的轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素C當(dāng)量，定量比較如下去甲淫羊藿素的抗氧化能力最強(qiáng)，(相當(dāng)于1.400nmol維生素C/nmol)，淫羊藿素其次(相當(dāng)于0.289nmol維生素C/nmol)，淫羊藿苷最弱(相當(dāng)于0.051nmol維生素C/nmol)，結(jié)果見表6。
表6 采用PHOTOCHEM化學(xué)發(fā)光法獲得水系統(tǒng)中樣品抗氧化活性抗氧化劑nmol維生素C/nmol樣品淫羊藿苷0.051±0.003淫羊藿素0.289±0.009去甲淫羊藿素1.400±0.146結(jié)果提示，淫羊藿苷經(jīng)口給藥后，其主要代謝產(chǎn)物淫羊藿素與去甲淫羊藿素具有顯著的抗氧化活性，目前認(rèn)為腦組織和血管的氧化和脂質(zhì)過氧化與老年性癡呆發(fā)生發(fā)展有關(guān)，藥物抗氧化作用與防治老年性癡呆有關(guān)[2]，由此可在口服后產(chǎn)生抗老年性癡呆作用。
實(shí)施例9淫羊藿苷大鼠灌胃后體內(nèi)代謝產(chǎn)物雌激素樣活性測定雌激素樣活性通過人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外增殖法測定。將常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后分置24孔細(xì)胞培養(yǎng)版中，貼壁48h后換用實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)48h，加入不同濃度的受試物和陽性藥雌二醇(17-β-estradiol，E2)，繼續(xù)培養(yǎng)6天，并于結(jié)束前加入噻唑藍(lán)(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀在570nm波長處比色，吸光度與活細(xì)胞數(shù)成反比。
參見圖2，淫羊藿苷、淫羊藿素、去甲淫羊藿素對雌激素敏感型MCF-7/BUS細(xì)胞的促增殖作用。1nM雌二醇設(shè)為100％，結(jié)果均為相對于1nM雌二醇的相對增殖率。表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用t-檢驗(yàn)(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與溶劑二甲基亞砜相比)。
參見圖3，淫羊藿素、去甲淫羊藿素對雌激素敏感型MCF-7/BUS細(xì)胞PR、PS2基因mRNA表達(dá)的影響。組別分別是(a.溶劑對照；b.1nM 17-β雌二醇；c.0.1μM淫羊藿素；d.1μM淫羊藿素；e.10μM淫羊藿素；f.1μM淫羊藿素+雌激素受體拮抗劑100nM ICI 182，780；g.1μM淫羊藿素；h.1μM淫羊藿素+100nM ICI 182，780；i.1nM 17-β雌二醇+100nM ICI 182，780).圖3A、圖3B分別為RT-PCR方法檢測到的PR、PS2 mRNA水平，β-actin為內(nèi)標(biāo)，結(jié)果所示為PR、PS2相對于β-actin的相對值。
結(jié)果顯示，與溶劑組相比，10-9mol/L E2引起MCF-7細(xì)胞的顯著增殖(P＜0.01)；10-8-10-10mol/L淫羊藿素與去甲淫羊藿素也均可引起MCF-7細(xì)胞的顯著增殖(P＜0.05或P＜0.01)；同樣濃度范圍內(nèi)淫羊藿苷的促細(xì)胞增殖作用不顯著(P＞0.148)。
結(jié)果提示，淫羊藿苷經(jīng)口給藥后，其主要代謝產(chǎn)物淫羊藿素與去甲淫羊藿素呈現(xiàn)顯著雌激素樣活性，目前認(rèn)為雌激素樣活性作用與防治老年性癡呆有關(guān)[1]，由此可在服用淫羊藿苷后產(chǎn)生抗老年性癡呆作用。
實(shí)施例10三七總皂苷和淫羊藿苷對老年性癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力影響(1)材料與方法三七總皂苷和淫羊藿苷提取物制備與實(shí)施例1同，并組成組合物A(三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.01∶0.99)和組合物B(三七總皂苷∶淫羊藿苷重量比0.50∶0.50)，濃度相當(dāng)于總10g生藥中含量/ml。喜德鎮(zhèn)片由瑞士山德士藥廠和天津華津制藥廠合作生產(chǎn)，批號021085。D-半乳糖由上海華舜生物工程有限公司提供；鵝膏蕈氨酸(IBO)由Sigma公司提供。
Sprage-Dawley大鼠，清潔級，體重220～240g，雌雄各半。
將大鼠隨機(jī)分為5組設(shè)溶劑對照每天腹腔注射(ip)蒸餾水6周后，腦內(nèi)雙側(cè)Meynert基底核注射生理鹽水。老年性癡呆模型組每天腹腔注射D-半乳糖50mg//kg6周，同時(shí)腦內(nèi)雙側(cè)Meynert基底核注射IBO。陽性對照喜德鎮(zhèn)片(0.36mg//kg，腹腔注射)，組合物A和組合物B分低劑量組(均折合疊加生藥量10g/kg，灌胃)和高劑量組(均折合疊加生藥量20g/kg，灌胃)，三七總皂苷和淫羊藿苷單獨(dú)給藥組(均各為10g生藥/kg，灌胃)。造模方法均同癡呆模型組。溶劑對照組和模型組每天給予生理鹽水5ml/kg灌胃，陽性對照組給予喜德鎮(zhèn)片，實(shí)驗(yàn)組給予組合物A和B的低、高劑量。參照大鼠立體定位解剖圖譜[4，5]，每側(cè)Meynert基底核緩慢注射1μm生理鹽水或生理鹽水溶解的IBO(1μm含IBO 5μg)。
(2)跳臺試驗(yàn)于末次給藥后1小時(shí)，將大鼠放入跳臺儀中開始實(shí)驗(yàn)。
將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以30v的交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺，以躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊又迅速跳回平臺上，如此訓(xùn)練5min，記錄大鼠第一次跳下平臺的潛伏期以及5min的錯(cuò)誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24后重作測驗(yàn)，記錄潛伏期及3min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，作為記憶保持成績。
(3)統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)用均數(shù)±SD表示，各組間用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果見表7表7 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物對老年性癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力影響(n＝10)組別 治療劑量 學(xué)習(xí)能力 記憶能力潛伏期(秒)錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(秒)錯(cuò)誤次數(shù)(次)溶劑對照 生理鹽水5ml/kg63.3±8.9 1.7±0.8 159.9±18.2 1.2±0.5模型組生理鹽水5ml/kg133.2±22.3**4.9±1.2**89.3±24.4*3.3±0.9**三七總皂苷10g生藥/kg106.6±17.6 3.1±0.8 121.0±23.8#2.6±0.9淫羊藿苷 10g生藥/kg92.5±11.3#2.9±1.0#127.0±19.5#1.9±1.0組合物A 10g生藥/kg63.4±9.8 2.7±0.7 138.7±25.2#1.5±0.5#組合物A 20g生藥/kg60.8±16.7##2.4±0.8#156.3±16.3##1.2±0.6##組合物B 10g生藥/kg60.4±7.2 2.1±0.4#142.7±22.7#1.4±0.6#組合物B 20g生藥/kg60.8±16.7##2.4±0.8#156.3±14.9##1.2±0.4##喜德鎮(zhèn)片 0.36mg//kg89.3±18.7##3.2±1.1#126.5±28.6#1.8±0.8#與溶劑組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.01，##P＜0.01。
(4)結(jié)論大鼠灌胃相當(dāng)于總生藥10g/kg、20g/kg的三七總皂苷和淫羊藿苷組合物A和組合物B，在學(xué)習(xí)能力測試中，能顯著延長老年性癡呆大鼠跳臺期潛伏期并顯著降低錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.05)，(P＜0.01)；在記憶能力測試中，也能顯著延長老年性癡呆大鼠跳臺期潛伏期并顯著降低錯(cuò)誤次數(shù)，上述作用比單用其中任何一種作用顯著增強(qiáng)。
實(shí)施例11三七總皂苷和淫羊藿苷對老年性癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力影響2(1)材料與方法參見實(shí)施例10，供試藥物為三七總皂苷和淫羊藿苷以重量比0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.4∶0.6的組合物A～D。
設(shè)溶劑對照(生理鹽水5ml/kg，灌胃)、陽性對照組(喜德鎮(zhèn)片0.36mg//kg，腹腔注射)，組合物A～D低劑量組(均折合疊加生藥量10g/kg，灌胃)和高劑量組(均折合疊加生藥量20g/kg，灌胃)。造模方法均同癡呆模型組。
結(jié)果見表8表8 三七總皂苷和淫羊藿苷組合物對老年性癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力影響(n＝10)組別 治療劑量 學(xué)習(xí)能力記憶能力潛伏期(秒)錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(秒)錯(cuò)誤次數(shù)(次)溶劑對照 生理鹽水5ml/kg 62.9±8.1 1.9±0.7 150.9±19.2 1.5±0.4模型組 生理鹽水5ml/kg 130.7±24.4**5.1±1.2**87.9±25.6*3.5±0.6**組合物A 10g生藥/kg 100.5±12.6 3.1±0.8 123.0±22.9#2.7±0.7組合物A 20g生藥/kg 90.5±11.7#2.3±1.4#130.0±18.6#1.8±1.1組合物B 10g生藥/kg 64.3±7.5 2.8±0.9 140.7±24.6#1.4±0.3#組合物B 20g生藥/kg 61.6±12.8##2.5±0.7#155.7±16.0##1.3±0.8##組合物C 10g生藥/kg 60.9±5.7 2.3±0.5#140.8±21.9#1.4±0.4#組合物C 20g生藥/kg 62.0±17.2##2.5±0.7#150.1±10.7##1.5±0.7##組合物D 10g生藥/kg 60.9±10.0 2.2±0.7#144.6±21.5#1.4±0.7#組合物D 20g生藥/kg 61.3±15.9##2.9±0.8#150.3±12.99##1.3±0.5##喜德鎮(zhèn)片 0.36mg//kg 90.1±16.3##3.1±1.4#127.5±25.0#1.8±0.7#與溶劑組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.01，##P＜0.01。
(4)結(jié)論大鼠灌胃相當(dāng)于總生藥10g/kg、20g/kg的三七總皂苷和淫羊藿苷組合物A～D，在學(xué)習(xí)能力測試中，能顯著延長老年性癡呆大鼠跳臺期潛伏期并顯著降低錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.05)，(P＜0.01)；在記憶能力測試中，也能顯著延長老年性癡呆大鼠跳臺期潛伏期并顯著降低錯(cuò)誤次數(shù)。
實(shí)施例12膠囊制劑及其輔料的一個(gè)實(shí)例組成 三七總皂苷 30mg淫養(yǎng)藿苷 150mg藥用淀粉 適量制備方法
取三七總皂苷和淫養(yǎng)藿苷干浸膏細(xì)粉(80-100目)加入適量淀粉，混合均勻。按以下工藝流程填充取2號空心膠囊→排列→校正方向→膠囊帽、體分開→藥物填入→殘品剔除→膠囊帽、體結(jié)合→成品(粒重250mg)。
可以根據(jù)藥劑學(xué)允許的制劑方法，制備液體制劑和固體制劑。固體制劑主要包括顆粒劑、片劑、膠囊、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑、栓劑。液體制劑主要包括口服液體制劑和注射液體制劑。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)1.楊華，等雌激素與阿爾茨海默病 中國臨床康復(fù) 2004；8(1)148-150。
2.盛樹力老年性癡呆的藥物治療和藥物作用靶位 2003；5(6)402-404。
3.潘竟鏘，等中藥對D-半乳糖誘導(dǎo)病理模型作用的研究進(jìn)展 廣東醫(yī)藥 2001；11(5)1-5。
4.Riekkinen PJR，et alThe effects of THA on scopolamine and basalislesioninduced EEG slowing[J].Brain Res Bull，1991，26(4)623-637.
5.Riekkinen PJR，et alComparison of the effects of acute and chronicibotenic and quisqualic acid nucleus basalis leioning[J].Brain Res Bull，1991，27(2)199-126.
權(quán)利要求
1.一種含三七總皂苷和淫羊藿苷的組合物，三七總皂苷和淫羊藿苷是從中藥三七和淫羊藿中提取單一的具活性的有效部位，其特征是組合物的組成為三七總皂苷∶淫羊藿苷的重量比值是0.01∶0.99～0.50∶0.50。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含三七總皂苷和淫羊藿苷的組合物，其特征是組合物可與藥用賦形劑制備成藥物制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物制劑，其特征是制劑形式主要包括液體制劑和固體制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物制劑，其特征是固體制劑主要包括顆粒劑、片劑、膠囊、軟膠丸、滴丸劑、栓劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物制劑，其特征是液體制劑主要包括口服液體制劑和注射液體制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征是所述制劑的給藥形式主要包括口服給藥或非腸道給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的一種含三七總皂苷和淫羊藿苷的組合物的用途，其特征是該組合物在制備治療老年性癡呆癥(阿爾茨海默病和血管性癡呆)的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的一種含三七總皂苷和淫羊藿苷的組合物的用途，其特征是該組合物在制備改善老年性癡呆癥(阿爾茨海默病和血管性癡呆)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含三七總皂苷和淫羊藿苷的藥物組合物，該組合物組成是三七總皂苷∶淫羊藿苷的重量比值是0.01∶0.99～0.50∶0.50。組合物與藥用賦形劑可制備成主要包括液體和固體的藥物制劑。本發(fā)明提供的組合物可在制備治療和改善老年性癡呆癥(阿爾茨海默病和血管性癡呆)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的組合物將兩種有效部位合用，作用比單用其中任何一種顯著增強(qiáng)，也顯著強(qiáng)于兩種藥材的常規(guī)水煎液。本發(fā)明從三七和淫羊藿藥材中提取單一的有效部位三七總皂苷和淫羊藿苷，各達(dá)到＞50％以上，并獲得用于治療老年性癡呆的兩種有效部位最佳配比，可用于研制5類以上中藥新藥，拓展了單一藥物用途。
文檔編號A61K9/00GK1626103SQ20041005369
公開日2005年6月15日 申請日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月10日
發(fā)明者樓宜嘉, 王志強(qiáng), 肖幸豐, 吳洪海, 劉健 申請人:浙江大學(xué)