專利名稱：一種不飽和內(nèi)酯化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不飽和內(nèi)酯化合物及其制備方法，并將該化合物用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑及抗腫瘤劑，以及含有該類化合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
天然和人工合成的的2-丁烯-4-內(nèi)酯類化合物已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)于該類化合物的抗腫瘤、抗艾滋病等生物活性也有報(bào)道，如文獻(xiàn)[Fang XP，et al.，Gigantetronenin andgigantrioneninnovel cytotoxic acetogenins from Goniothalamus giganteus.J Nat Prod.1992，55(11)1655-1663]，文獻(xiàn)[Paleta Oldrich，et al.，F(xiàn)luorine-Containing Butanolides andButenolides.Vinylic Fluorine Displacement in 4，4-Dialkyl-2，3-difluoro-2-buten-4-olides and aNovel Rearrangement Induced by Organolithium Addition to a Carbonyl Group.Tetrahedron，2000，56，3197-3207]和文獻(xiàn)[Roggo BE，et al.3-Alkanoyl-5-hydroxymethyl tetronic acidhomologuesnew inhibitors of HIV-1 protease.II.Structure determination.J Antibiot，1994，47，143-147]。但該式I類化合物為首次報(bào)道，對(duì)該類化合物具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性也未見(jiàn)報(bào)道。
Aspergillus terreus Thom(保藏編號(hào)為CGMCCNo.1170)菌株是從一種海洋的樣品中分離得到，該海洋樣品為膠州灣海底沉積物。
本發(fā)明人研究得知，Aspergillus terreus Thom(保藏編號(hào)為CGMCCNo.1170)菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期抑制及對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制等抗腫瘤活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)所示內(nèi)酯類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見(jiàn)對(duì)該菌株的抗腫瘤活性成分研究、該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見(jiàn)有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在提供一種不飽和內(nèi)酯化合物及其制備方法和具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。其特征是含有2-丁烯-4-內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)骨架，結(jié)構(gòu)如式I所示 式I式I中R1，R2，R3，R4均可為飽和或不飽和的C1-C10烴基，均可為C1-C10烴氧基、酰氧基、氨基、酰氨基；上述不飽和內(nèi)酯化合物的制備方法，將Aspergillus terreus Thom(保藏編號(hào)為CGMCCNo.1170)菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后用乙酸乙酯提取，得粗浸膏用甲醇提取該浸膏得到提取物；將該提取物經(jīng)反復(fù)的硅膠和Sephadex LH-20柱層析、制備薄層層析、反相制備高壓液相和重結(jié)晶，分離純化。
上述式I化合物用于制作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
上述式I化合物用于制備抗腫瘤藥物。
一種藥物組合物，其特征是它含有上述的化合物和可藥用的載體。
本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的方法，測(cè)試了式I化合物對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)式I化合物對(duì)癌細(xì)胞具有誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用表明它在不同濃度或不同作用時(shí)間的條件下，可通過(guò)誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡，顯示出其抗腫瘤作用，因此可用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的內(nèi)酯類化合物可通過(guò)加入藥物或試劑可接受的輔料或溶劑制成抗腫瘤劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，來(lái)用于腫瘤的治療。本發(fā)明的化合物可溶于甲醇、含水甲醇中使用，也可以用二甲基亞砜的含水溶液溶解使用，在生命科學(xué)研究中作為誘發(fā)細(xì)胞凋亡的低分子生物探針加以利用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 本發(fā)明的化合物I的制備 化合物I式中，阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位。
取Aspergillus terreus Thom(保藏編號(hào)為CGMCCNo.1170)菌株液體發(fā)酵液10升，發(fā)酵所用的培養(yǎng)基配方為山梨醇2％、麥芽糖2％、谷氨酰胺1％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂(含結(jié)晶水)0.03％、色氨酸0．05％、酵母0.3％，其余為陳海水，培養(yǎng)基的pH為6.5。將發(fā)酵物超聲破碎后加入等體積的乙酸乙酯提取三次，合并提取液，減壓濃縮得到粗浸膏20.2克，用甲醇萃取得到萃取物15.8克。將該萃取物用甲醇-氯仿1∶1混合溶液溶解后，加入21克薄層層析用硅膠H拌樣，用119克硅膠H干法裝柱，采用真空柱層析(VLC)，以不同比例的石油醚-丙酮溶液(99∶1，98∶2，97∶3，96∶4，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30)進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫100ml，洗脫同時(shí)應(yīng)用TLC薄層監(jiān)控，當(dāng)洗脫劑石油醚-丙酮比例變到70∶30之后換成純丙酮洗脫，之后換為丙酮-甲醇70∶30，50∶50，純甲醇洗脫，得到22個(gè)流份。對(duì)各流份進(jìn)行薄層檢查及在每毫升50微克濃度下的活性測(cè)試，并根據(jù)結(jié)果合并相關(guān)流份，得到活性組份Fr 1-5(1.59克，石油醚-丙酮90∶10洗脫部分)。將Fr 1-5上Sephadex-LH20柱，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫層析，收集組分Fr 1-5-4，制備高壓液相(HPLC)分離，甲醇-水(55∶45)洗脫，8分鐘的流份收集得化合物I(30mg)。
本發(fā)明的化合物I為白色油狀物，分子式為C9H12O5，Positive ESI-MS(m/z)201[M+H]+，218[M+H2O]+；Nagative ESI-MS(m/z)199[M-H]-。UVλmaxMeOH(logε)196(5.17)，205(5.17)，220(5.27)，233(5.33)，240(5.59)。IR vmaxKBr3386(O-H)，2925，2854，1770(C＝O)，1724(C＝O)，1632(C＝C)，1462，1373，1330，1247(O-C＝O)，1221，1136，1041，956，916，772cm-1。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
Table 1 NMR data for compound I(in CDCl3)positionδH(J in Hz) δC(DEPT) HMBC1H-1H COSY1 /172.04s / /2 /139.12s / /3 /148.32s / /4 /106.99s / /6 /163.16s / /7 1.77(3H，s) 24.72qC-2，C-3 /8 2.13(3H，s) 10.83qC-4，C-3，C-5，C-6w /1′ 4.34(2H，q，J＝7.1) 62.54tC-2′，C-6， H-2′2′ 1.35(3H，t，J＝7.1) 14.40qC-1′ H-1′實(shí)施例2 化合物I對(duì)癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的測(cè)試1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測(cè)樣品溶液的配制取實(shí)施例1中分離精制的純品化合物I，精密稱取適量1.005mg，用甲醇配制成1.56，3.13，6.25μg/ml的溶液，供測(cè)活性。
細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)活性測(cè)試采用哺乳動(dòng)物的癌細(xì)胞系小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞。細(xì)胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(shí)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無(wú)細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時(shí)進(jìn)行拍照。繼而將細(xì)胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細(xì)胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸鈉和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量分布。細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)相中的分布利用庫(kù)爾特公司產(chǎn)計(jì)算機(jī)軟件WinCycle進(jìn)行分析計(jì)算。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果用不同濃度的化合物I分別處理tsFT210細(xì)胞17小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)得的化合物I的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)表明，化合物I在3.13μg/ml濃度時(shí)，顯著地誘導(dǎo)了tsFT210細(xì)胞的凋亡。
表1 tsFT210細(xì)胞經(jīng)化合物I處理17小時(shí)后的測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)濃度(μg/ml) sub-G0/G1％ G0/G1％S％ G2/M％Cotroll 0.3±0.3 34.1±4.249.5±0.816.4±3.31.561.4±0.6 32.1±4.447.5±5.020.4±1.33.139.0±3.3 44.0±4.840.0±0.115.5±5.16.2511.3±0.3 34.9±3.050.8±3.213.9±0.2注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細(xì)胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)得結(jié)果。
3結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I主要通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，來(lái)發(fā)揮其對(duì)癌細(xì)胞增殖的抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的式I化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為誘發(fā)細(xì)胞凋亡的低分子生物探針用于探索生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中。
權(quán)利要求
1.一種不飽和內(nèi)酯化合物，其特征是含有2-丁烯-4-內(nèi)酯，結(jié)構(gòu)式為I所示 式I式I中R1，R2，R3，R4均可為飽和或不飽和的C1-C10烴基，均可為C1-C10烴氧基、酰氧基、氨基、酰氨基。
2.如權(quán)利要求1所述的式I化合物，其特征示所述的R1為甲基，R2為乙基，R3為甲基，R4為羥基。
3.權(quán)利要求1所述的式I化合物的制備方法，將Aspergillus terreus Thom(保藏編號(hào)為CGMCCNo.1170)菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后用乙酸乙酯提取，得粗浸膏；用甲醇提取該浸膏得到提取物；將該提取物經(jīng)反復(fù)的硅膠和Sephadex LH-20柱層析、制備薄層層析、反相制備高壓液相層析和重結(jié)晶，分離純化。
4.權(quán)利要求1所述的式I化合物用于制作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
5.權(quán)利要求1所述的式I化合物用于制備抗腫瘤藥物。
6.一種藥物組合物，其特征是它含有上述的化合物和可藥用的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種內(nèi)酯類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明從來(lái)源于海洋樣品中真菌Aspergillus terreus Thom菌株發(fā)酵產(chǎn)物提取得到一種2－丁烯－4－內(nèi)酯類新化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物可作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗腫瘤劑。
文檔編號(hào)A61K31/365GK1616444SQ20041003578
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者崔承彬, 顧謙群, 于垂亮, 朱偉明, 朱天驕, 劉紅兵, 方玉春 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)