專利名稱：穩(wěn)定等滲的凍干蛋白質(zhì)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凍干的蛋白質(zhì)制劑。更具體地，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的凍干蛋白質(zhì)制劑，它可用稀釋劑重建生成一種適用于皮下給藥的穩(wěn)定的重建的制劑。
相關(guān)技術(shù)在過去的十年內(nèi)，生物技術(shù)的發(fā)展使得可以用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)各種用于藥物用途的蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)比常用的有機(jī)和無機(jī)藥物更大更復(fù)雜(即除了有復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)外還有多個官能團(tuán))，因此這些蛋白質(zhì)的制劑引起了一些特殊的問題。為了使蛋白質(zhì)有生物活性，制劑必須保證至少蛋白質(zhì)氨基酸核心序列的構(gòu)象完整性，而且同時還要保護(hù)蛋白質(zhì)的多官能團(tuán)防止其降解。蛋白質(zhì)降解的途徑包括化學(xué)不穩(wěn)定性(即，任何通過鍵的形成或斷裂來修飾蛋白質(zhì)生成新的化學(xué)物質(zhì))或物理不穩(wěn)定性(即，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變)。化學(xué)不穩(wěn)定性可由脫氨基、外消旋化、水解、氧化、β消去或二硫化物交換引起。物理不穩(wěn)定性是由例如變性、凝聚、沉淀或吸附引起。三種最常見的蛋白質(zhì)降解途徑是蛋白質(zhì)凝聚、脫氨和氧化(Cleland等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4)307-377(1993))。
冷凍干燥是一種常用的保藏蛋白質(zhì)的技術(shù)，它可將所關(guān)心的蛋白質(zhì)制品中的水除去。冷凍干燥或凍干的方法是先將待干燥的物質(zhì)冷凍，然后在真空環(huán)境下升華除去冰或冷凍的溶劑。在凍干前的制劑中可包括一種賦形劑，以在冷凍干燥過程中提高穩(wěn)定性和/或在保藏時提高凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性(Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)285-291(1991))。
本發(fā)明的一個目的是提供一種在保藏和運輸時穩(wěn)定的凍干蛋白質(zhì)制劑。還有一個目的是提供一種用于皮下給藥的穩(wěn)定的重建的蛋白質(zhì)制劑。在某些例子中，本發(fā)明的一個目的是提供一種多次性使用的制劑，它至少在對病人給藥的時間內(nèi)是穩(wěn)定的。
發(fā)明概述本發(fā)明的根據(jù)是發(fā)現(xiàn)用一種溶解保護(hù)劑(最好是糖類如蔗糖或海藻糖)可制得穩(wěn)定的凍干蛋白質(zhì)制劑，凍干的制劑可重建生成穩(wěn)定的重建制劑，制劑的蛋白質(zhì)濃度比凍干前的制劑內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度高的多(如，約高2-40倍，較佳為高3-10倍，更佳的高3-6倍)。具體地說，如果凍干前的制劑內(nèi)蛋白質(zhì)濃度為5mg/mL或更低，則重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度通常為50mg/mL或更多。重建制劑中如此高的蛋白質(zhì)濃度被認(rèn)為特別適用于當(dāng)制劑用于皮下給藥的情況。盡管重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度非常高，但是發(fā)現(xiàn)重建制劑在2-8℃在約至少30天內(nèi)是穩(wěn)定的(即，蛋白質(zhì)沒有表現(xiàn)出明顯的或不適用的化學(xué)或物理不穩(wěn)定性)。在一些例子中，重建制劑是等滲的。盡管使用了較低濃度的溶解保護(hù)劑就可在重建時獲得這種等滲制劑，但是發(fā)現(xiàn)凍干制劑中的蛋白質(zhì)基本上在凍干和保藏時保持了其物理和化學(xué)的穩(wěn)定性和完整性。
當(dāng)用包含防腐劑(如用于注射的抑菌劑，BWFI)的稀釋劑來重建時，重建制劑可用作多次性使用的制劑。這種制劑適用于，例如當(dāng)病人需要經(jīng)常進(jìn)行皮下蛋白質(zhì)給藥來治療慢性疾病。多次性使用制劑的優(yōu)點是它能更容易地用于患者，通過瓶內(nèi)含量全部使用可減少浪費，并為生產(chǎn)者節(jié)省了很大成本，因為幾種藥劑被裝在一個小瓶中(較低的裝料和運輸成本)。
根據(jù)這里描述的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個方面是提供一種穩(wěn)定、等滲的重建制劑，它包括含量至少約為50mg/mL的蛋白質(zhì)和稀釋劑，重建制劑通過蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的凍干混合物來制得，其中重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍。
在另一個例子中，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的重建制劑，它包括含量至少約為50mg/mL的抗體和稀釋劑，重建制劑通過抗體和溶解保護(hù)劑的凍干混合物來制得，其中重建制劑中的抗體濃度比凍干前混合物中抗體濃度高約2-40倍。
前段中凍干制劑中的溶解保護(hù)劑與蛋白質(zhì)之比與例如所選的蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑以及重建制劑中所需的蛋白質(zhì)濃度和等滲性有關(guān)。在用全長抗體(作為蛋白質(zhì))和海藻糖或蔗糖(作為溶解保護(hù)劑)制備高蛋白質(zhì)濃度等滲重建制劑時，比例例如可以是每1摩爾抗體為約100-1500摩爾海藻糖或蔗糖。
通常，蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的未凍干制劑還可包括一種緩沖液來根據(jù)制劑的蛋白質(zhì)為制劑提供合適的pH。為了這個目的，發(fā)現(xiàn)最好用下述的組氨酸緩沖液，它表現(xiàn)出有溶解保護(hù)性能。
制劑還可包括一種表面活性劑(如多乙氧基醚)，發(fā)現(xiàn)它可減少重建蛋白質(zhì)的凝聚和/或減少重建制劑中顆粒的形成。表面活性劑可按需加入未凍干制劑、凍干制劑和/或重建制劑(但最好是未凍干制劑)中。
本發(fā)明還提供一種制備穩(wěn)定的等滲重建制劑的方法，它包括對蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的凍干混合物在稀釋劑中重建，使得重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度至少為50mg/mL，其中重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中的蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍。
在還有一個實施例中，本發(fā)明提供一種制備一種制劑的方法，包括(a)將蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的混合物凍干；和(b)在稀釋劑中重建步驟(a)中的混合物，使得重建的制劑是等滲穩(wěn)定的，且蛋白質(zhì)濃度至少約為50mg/mL。例如，重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度可以是約為80mg/mL至約300mg/mL。通常，重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中的蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍。
本發(fā)明也提供一種產(chǎn)品，它包括(a)一個裝有蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的凍干混合物的容器；和(b)將凍干混合物在稀釋劑中重建成重建制劑中蛋白質(zhì)濃度約為50mg/mL的說明。產(chǎn)品還包括另一個裝有稀釋劑(如包括一種芳香醇的注射用抑菌劑(BWFI))的容器。
本發(fā)明還提供一種治療哺乳動物的方法，包括對哺乳動物施用這里公開的治療有效量的重建制劑，其中哺乳動物患有用制劑中的蛋白質(zhì)來治療的疾病。例如，制劑可進(jìn)行皮下給藥。
下面詳述的例子中發(fā)現(xiàn)了一種有用的抗HER2抗體的未凍干制劑，它包括含量為約5-40mg/mL(如20-30mg/mL)的抗HER2和含量為約10-100mN(如40-80mM)的蔗糖或海藻糖，緩沖液(如組氨酸，pH6或琥珀酸，pH5)和表面活性劑(如多乙氧基醚)。發(fā)現(xiàn)凍干制劑在40℃下在至少3個月內(nèi)保持穩(wěn)定，在30℃下在至少6個月內(nèi)保持穩(wěn)定。這種抗HER2制劑可用一種稀釋劑重建成適用于靜脈內(nèi)給藥的制劑，它包含含量約為10-30mg/mL的抗HER2，并在2-8℃下在至少約30天保持穩(wěn)定。當(dāng)需要更高濃度的抗HER2抗體時(例如，當(dāng)抗體皮下輸遞是對患者給藥的方式時)，凍干制劑可重建生成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)濃度為50mg/mL或更多的重建制劑。
這里發(fā)現(xiàn)的一種所需的抗IgE抗體未凍干制劑包含含量約為5-40mg/mL(如20-30mg/mL)的抗IgE和含量約為60-300mM(如80-300mM或80-170mM)的蔗糖或海藻糖，緩沖液(最好是組氨酸，pH6)和表面活性劑(如多乙氧基醚)。凍干的抗IgE可在30℃下在至少1年內(nèi)保持穩(wěn)定。該制劑可重建生成一種抗IgE含量約為15-45mg/ml(如15-25mg/mL)的制劑，它適用于靜脈內(nèi)給藥，且在2-8℃下在至少1年內(nèi)保持穩(wěn)定?；蛘撸?dāng)制劑中需要更高濃度的抗IgE時，凍干制劑可重建以生成一種抗IgE濃度≥50mg/mL的制劑。
本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的等滲重建制劑，它包含含量至少約為50mg/mL的蛋白質(zhì)和稀釋劑，重建制劑是從蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的凍干混合物制得的，其中重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中的蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍，優(yōu)選溶解保護(hù)劑是蔗糖或海藻糖，優(yōu)選所述制劑中還包含緩沖液，更優(yōu)選所述緩沖液是組氨酸或琥珀酸鹽，優(yōu)選所述制劑還包括表面活性劑。
本發(fā)明還提供了上述制劑用于制備治療哺乳動物的藥物的應(yīng)用，其中哺乳動物患有需要用制劑中蛋白質(zhì)來治療的疾病，優(yōu)選所述制劑用于皮下給藥。
本發(fā)明還提供了一種穩(wěn)定的重建制劑，它包含含量至少約為50mg/mL的抗體和稀釋劑，重建制劑是從抗體和溶解保護(hù)劑的凍干混合物制得的，其中重建制劑中抗體濃度比凍干前混合物中抗體濃度高約2-40倍，優(yōu)選所述制劑中抗體是抗IgE抗體或抗HER2抗體。優(yōu)選所述制劑是等滲性的。
本發(fā)明還提供了一種制備穩(wěn)定的重建制劑的方法，包括在稀釋劑中重建蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的混合物，使得重建制劑中蛋白質(zhì)濃度至少約為50mg/mL，其中重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中的蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍。
本發(fā)明還提供了一種制備一種制劑的方法，包括步驟(a)對蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的混合物進(jìn)行冷凍干燥；和(b)在稀釋劑中重建步驟(a)的凍干混合物，使得重建制劑是等滲性的，穩(wěn)定的，且濃度至少約為50mg/mL。優(yōu)選該方法中重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度為約80mg/mL至約300mg/mL，優(yōu)選重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比凍干前混合物中的蛋白質(zhì)濃度高約2-40倍，并優(yōu)選在整個冷凍干燥過程中冷凍干燥是在擱架溫度保持在15-30℃下進(jìn)行的。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品，包括(a)一個裝有蛋白質(zhì)和溶解保護(hù)劑的凍干混合物的容器；和(b)關(guān)于凍干混合物在稀釋劑中重建成重建制劑中蛋白質(zhì)濃度至少約為50mg/mL的說明。
優(yōu)選所述產(chǎn)品還包含另一個裝有稀釋劑的容器，優(yōu)選所述產(chǎn)品中稀釋劑是包含芳香醇的注射用抑菌劑BWFI。
本發(fā)明還提供了一種包含溶解保護(hù)劑和單克隆抗體的凍干混合物的制劑，其中溶解保護(hù)劑和單克隆抗體的摩爾比為100至1500摩爾溶解保護(hù)劑比1摩爾抗體。
本發(fā)明還提供了一種制劑，包含含量約為5-40mg/mL的抗HER2抗體，含量為10-100mM的蔗糖或海藻糖，緩沖液和表面活化劑，優(yōu)選還包含一種填充劑。優(yōu)選所述制劑中制劑是凍干的并在30℃下至少穩(wěn)定6個月，還優(yōu)選所述制劑，制劑用稀釋劑重建，使得重建制劑中的抗體濃度約為10-30mg/mL，其中重建制劑在2-8℃下至少穩(wěn)定30天。
本發(fā)明還提供了一種制劑，包含含量約為5-40mg/mL的抗IgG抗體，含量為80-300mM的蔗糖或海藻糖，緩沖液和表面活化劑，優(yōu)選所述制劑中制劑是凍干的并在30℃下至少穩(wěn)定1年。
附圖簡述

圖1表示重建體積對凍干的rhuMAb HER2的穩(wěn)定性的影響。凍干制劑是從包含25mg/mL蛋白質(zhì)、60mM海藻糖、5mM琥珀酸鈉pH5.0和0.01％吐溫20TM的未凍干制劑制得的。將凍干餅放在40℃下培育，然后用4.0mL(○)或20.0mL(●)的BWFI重建。用非變性大小排阻色譜測定重建制劑中的完整蛋白質(zhì)的組份，并根據(jù)相對于包括凝聚物在內(nèi)的總峰面積的非變性蛋白質(zhì)的峰面積來確定。
圖2描述了海藻糖濃度對凍干rhuMAb HER2的穩(wěn)定性的影響。25mg/mL蛋白質(zhì)在5mM琥珀酸鈉，pH5.0(圓圈)或5mM組氨酸，pH6.0(方塊)和濃度為60mM(360摩爾比)至200mM(1200摩爾比)的海藻糖中凍干。凍干的蛋白質(zhì)放在40℃下培育30天(實心)或91天(空心)。在用20mL BWFI重建凍干蛋白質(zhì)后測定完整的蛋白質(zhì)的量。
圖3描述了海藻糖濃度對于保藏在40℃下的凍干rhuMAb HER2的長期穩(wěn)定性的影響。25mg/mL蛋白質(zhì)在5mM琥珀酸鈉，pH5.0，0.01％吐溫20TM和60mM海藻糖中(■)或5mM組氨酸，pH6.0，0.01％吐溫20TM和60mM海藻糖中(□)凍干或21mg/mL蛋白質(zhì)在10mM琥珀酸鈉，pH5.0，0.2％吐溫20TM和250mM海藻糖中(●)凍干。凍干的蛋白質(zhì)放在40℃下培育，然后用20mL BWFI重建。重建后測定完整的蛋白質(zhì)的量。
圖4表示在38.4mM甘露糖醇(7mg/mL)、20.4mM蔗糖(7mg/mL)、5mM組氨酸、pH6.0、0.01％吐溫20TM中凍干的rhuMAb HER2穩(wěn)定性。凍干蛋白質(zhì)在40℃下培育，然后用4.0mL(○)或20.0mL(●)的BWFI重建。重建后測定完整的蛋白質(zhì)的量。
圖5表示rhuMAb HER2在5mM琥珀酸鈉、pH5.0、60mM海藻糖、0.01％吐溫20TM中凍干后重建的穩(wěn)定性。樣品用4.0mL(方塊)或20.0(圓圈)的BWFI(20mL0.9％苯甲醇；4mL1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(實心)或25℃(空心)下。非變性蛋白質(zhì)％通過相對于總峰面積的非變性(未降解)蛋白質(zhì)的峰面積來確定，峰面積用陽離子交換色譜測定。
圖6表示rhuMAb HER2在5mM組氨酸、pH6.0、60mM海藻糖、0.01％吐溫20中凍干后重建的穩(wěn)定性。樣品用4.0mL(方塊)或20.0(圓圈)的BWFI(20mL0.9％苯甲醇；4mL1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(實心)或25℃(空心)下。非變性蛋白質(zhì)％通過相對于總峰面積的非變性(未降解)蛋白質(zhì)的峰面積來確定，峰面積用陽離子交換色譜測定。
圖7表示rhuMAb HER2在5mM組氨酸、pH6.0、38.4mM甘露糖醇、20.4mM蔗糖、0.01％吐溫20中凍干后重建的穩(wěn)定性。樣品用4.0mL(方塊)或20.0(圓圈)的BWFI(20mL0.9％苯甲醇；4mL1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(實心)或25℃(空心)下。非變性蛋白質(zhì)％通過相對于總峰面積的非變性(未降解)蛋白質(zhì)的峰面積來確定，峰面積用陽離子交換色譜測定。
圖8表示rhuMAb HER2在10mM琥珀酸鈉、pH5.0、250mM海藻糖、0.2％吐溫20中凍干后重建的穩(wěn)定性。樣品用20.0mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(●)或25℃(○)下。非變性蛋白質(zhì)％通過相對于總峰面積的非變性(未降解)蛋白質(zhì)的峰面積來確定，峰面積用陽離子交換色譜測定。
圖9表示rhuMAb E25加入pH5至pH7、緩沖液濃度為10mM、抗體濃度為5mg/mL的緩沖液中的凝聚情況。凍干樣品并測定保藏在2-8℃時0、4星期、8星期和52星期后的凝聚。緩沖液是磷酸鉀pH7.0(○)；磷酸鈉pH7.0(□)；組氨酸pH7.0(◇)；琥珀酸鈉pH6.5(●)；琥珀酸鈉pH6.0(■)；琥珀酸鈉pH5.5(◆)和琥珀酸鈉pH5.0(▲)。
圖10表示在5mM組氨酸緩沖液中凍干的rhuMAb E25在pH6和pH7時在下列保藏時測定的凝聚情況。緩沖液是為pH6.0，保藏在2-8℃下(○)；pH6，保藏在25℃下(□)；pH6，保藏在40℃下(◇)；pH7，保藏在2-8℃下(●)；pH7，保藏在25℃下(■)；和pH7，保藏在40℃下(◆)。
圖11表示在pH5的10mM琥珀酸鈉及加入的溶解保護(hù)劑濃度為275mM(等滲的)中配制的5mg/mL rhuMAb E25的凝聚情況。溶解保護(hù)劑是對照，不含溶解保護(hù)劑(○)；甘露糖醇(□)；乳糖(◇)；麥芽糖(●)；海藻糖(■)；和蔗糖(◆)。凍干樣品并測定在2-8℃下保藏0、4星期、8星期和52星期后的凝聚情況。
圖12表示在pH5的10mM琥珀酸鈉及加入的溶解保護(hù)劑濃度為275mM(等滲的)中配制的5mg/mL rhuMAb E25的凝聚情況。溶解保護(hù)劑是對照，不含溶解保護(hù)劑(○)；甘露糖醇(□)；乳糖(◇)；麥芽糖(●)；海藻糖(■)；和蔗糖(◆)。凍干樣品并測定在40℃下保藏0、4星期、8星期和52星期后的凝聚情況。
圖13表示20mg/mL的rhuMAb E25在乳糖等滲濃度(即275mM)、pH6的組氨酸緩沖液中凍干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24個星期后重建至20mg/mL的疏水作用色譜結(jié)果。
圖14表示20mg/mL的rhuMAb E25在pH6的組氨酸緩沖液中凍干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24個星期后重建至20mg/mL的疏水作用色譜結(jié)果。
圖15表示20mg/mL的rhuMAb E25在蔗糖等滲濃度(即275mM)、pH6的組氨酸緩沖液中凍干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24個星期后重建至20mg/mL的疏水作用色譜結(jié)果。
圖16表示糖濃度對于在5mM組氨酸(pH6.0)中配制的20mg/mL rhuMAbE25的影響。蔗糖(●)和海藻糖(□)以0至2010(等滲)的摩爾比加入制劑中(見下表1)。凍干樣品，測定在50℃下保藏12星期后的凝聚情況。
表1
圖17揭示在5mM組氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(℃)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情況。凍干樣品并保藏在2-8℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗體濃度為100mg/mL、組氨酸為20mM、pH6的等滲(340mM)和高滲(644mM)糖濃度制劑。
圖18揭示在5mM組氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(℃)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情況。凍干樣品并保藏在30℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗體濃度為100mg/mL、組氨酸為20mM、pH6的等滲(340mM)和高滲(644mM)糖濃度制劑。
圖19揭示在5mM組氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(℃)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情況。凍干樣品并保藏在50℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗體濃度為100mg/mL、組氨酸為20mM、pH6的等滲(340mM)和高滲(644mM)糖濃度的制劑。
優(yōu)選實施方案詳述I.定義“蛋白質(zhì)”是指氨基酸序列，鏈長度足以產(chǎn)生高水平的三級結(jié)構(gòu)和/或四級結(jié)構(gòu)。這是與“多肽”或其它沒有這種結(jié)構(gòu)的小分子量藥物的區(qū)別。通常，這里的蛋白質(zhì)的分子量至少約為15-20kD，最好至少約為20kD。
這里定義所包括的蛋白質(zhì)的例子有哺乳動物蛋白質(zhì)，例如，生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；促黃體素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織型因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白質(zhì)C；心鈉素；肺表面活性劑；纖維蛋白溶解酶原激酶，如尿激酶或組織型纖溶酶原激酶(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；趨化因子RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的通常由T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；鼠促性腺素伴隨肽；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白質(zhì)A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子如骨衍神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長因子如NGN-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)；CD蛋白質(zhì)，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生長素(EPO)；血小板生長素(TPO)；成骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；膜表面蛋白質(zhì)；衰變加速因子(DAF)；病毒性抗原，例如AIDS的部分包被；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；免疫粘附素；抗體；和任何上述多肽的生物活性片段或變異體。
制劑的蛋白質(zhì)最好是基本上純凈，最好基本上是均相的(即沒有雜蛋白等)?！盎旧霞儍簟钡牡鞍踪|(zhì)指的是組分包含至少約90％(重量)(以組分的總重量計)的蛋白質(zhì)，較佳的為至少約95％(重量)。“基本上均相”的蛋白質(zhì)指的是以組分的總重量計，組分包含至少99％(重量)的蛋白質(zhì)。
在一些例子中，蛋白質(zhì)是抗體。例如抗體可與上述的任一分子結(jié)合。本發(fā)明中抗體典型的靶分子包括CD蛋白質(zhì)，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受體家族的成員，例如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子，如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括它的α或β亞單元(如，抗-CD11a、抗-CD18或抗CD11b抗體)；生長因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；多脂性(OB)受體；蛋白質(zhì)C等。
術(shù)語“抗體”的含義非常廣，它特別包含單克隆抗體(包括有免疫球蛋白Fc區(qū)域的全長抗體)、有多個表位特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、二體(diabodies)和單鏈分子，以及抗體片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)。
這里所用的術(shù)語“單克隆抗體”指的是從基本上均一的抗體種群中獲得的抗體，即單個抗體包括的種群是相同的，除了少量可能發(fā)生天然的突變。單克隆抗體對單一的抗原位點有高度的特異性。而且，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備物，即通常有不同抗體針對不同的決定簇(表位)相反，每個單克隆抗體只針對抗原單一的決定簇。除了特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點是它們是用雜交瘤培育來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”指從基本上均一的抗體種群中獲得的抗體的特征，不應(yīng)被理解為需要任何特殊的方法來生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可用Kohler等人描述的雜交瘤方法(Nature，256495(1975))來制備，或用重組DNA技術(shù)來制備(見美國專利No.4,816,567)?！皢慰寺】贵w”也可用如Clackson等人(Nature，352624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.222581-597(1997))描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離獲得。
這里的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，它的部分重鏈和/或輕鏈與從特定種類中衍生獲得的或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體對應(yīng)順序是相同或同源，而剩余的鏈與從另一種類中衍生獲得的或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體以及這種抗體的片段的對應(yīng)順序是相同或同源，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(美國專利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
非人體來源(如鼠源型)的“人源化”抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或包含從非人源型免疫球蛋白中獲得的最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它與抗原結(jié)合的抗體序列)。人源化抗體的大部分是人源型免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被非人源型的有所需特異性、親和性和容量的抗體如鼠、大鼠或兔子抗體(供體抗體)的CDR殘基替代。在一些例子中，人源型免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人源型殘基取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體和輸入的CDR或構(gòu)架序列中均沒有的殘基。這些修飾可進(jìn)一步精修并優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體基本上都包含至少一個，典型的包括兩個可變區(qū)域，其中所有或基本上所有的與非人源型免疫球蛋白對應(yīng)的CDR區(qū)和所有或基本上所有的FR區(qū)有人源型免疫球蛋白的序列。人源化抗體還可以任選地包含至少部分免疫球蛋白，通常是人源型免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)。更詳細(xì)的描述見Jones等人在Nature(321522-525(1986))、Reichmann等人在Nature(332323-329(1988))和Presta在Curr.Op.Struct.Biol.(2593-596(1992))中所作的描述。人源化抗體包括PrimatizedTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)通過對獼猴屬(macaque)猴子免疫接種入感興趣的抗原來產(chǎn)生出的抗體中獲得。
“穩(wěn)定”的制劑是指其中的蛋白質(zhì)在保藏時可基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性。該領(lǐng)域中已有多種測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術(shù)，它們在“肽和蛋白質(zhì)藥物傳遞”(Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，VincentLee編輯，Marcel Dekker Inc.，紐約，紐約出版社(1991))和Jones在A.Adv.Drug Delivery Rev.(1029-90(1993))中有所總結(jié)。穩(wěn)定性可在選定的溫度下和時間內(nèi)測定。為進(jìn)行快速篩選，制劑可在40℃下保藏2星期至1個月并同時測定穩(wěn)定性。當(dāng)制劑要保藏在2-8℃時，通常制劑應(yīng)該在30℃或40℃下穩(wěn)定至少1個月和/或在2-8℃下穩(wěn)定至少2年。當(dāng)制劑要保藏在30℃下時，通常制劑應(yīng)在30℃下穩(wěn)定至少2年和/或在在40℃穩(wěn)定至少6個月。例如在凍干和保藏后的凝聚長度可作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的一個標(biāo)志(見這里的例子)。例如，“穩(wěn)定”的制劑是制劑中小于約10％，最好是小于約5％的蛋白質(zhì)是凝聚物的形式。在另一例子中，在凍干制劑的凍干和保藏后測定了制劑凝聚物的增量。例如，“穩(wěn)定”的凍干制劑是指當(dāng)凍干制劑在2-8℃下保藏至少1年時，凍干制劑中凝聚物增量應(yīng)小于約5％，最好小于約3％。在另一例子中，蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性可用生物活性測定法來測定(見下面實施例2)。
“重建”制劑是指通過將凍干蛋白質(zhì)制劑溶解在稀釋劑中使蛋白質(zhì)分散在重建制劑中。在本發(fā)明的一些例子中，適用于對需要用所需的蛋白質(zhì)來治療的患者給藥(如非腸胃給藥)的重建制劑可適用于皮下給藥。
“等滲”指感興趣的制劑基本上與人血液的滲透壓相等。等滲制劑的滲透壓通常為約250至350mOsm。等滲性可用如氣壓式或冷凍式滲透壓計來測定。
“溶解保護(hù)劑”指一種分子，當(dāng)它與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合時，能阻止或減少蛋白質(zhì)在凍干和后續(xù)保藏時的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性。典型的溶解保護(hù)劑包括糖類如蔗糖或海藻糖；氨基酸如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺類如甜菜堿；易溶的鹽類如硫酸鎂；多元醇如三元醇或高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronic及其組合。較佳的溶解保護(hù)劑是非還原性糖，如海藻糖或蔗糖。
溶解保護(hù)劑加入未凍干制劑中的量“溶解保護(hù)量”指蛋白質(zhì)在溶解保護(hù)量的溶解保護(hù)劑存在時，在凍干和保藏時基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性及完整性。
這里感興趣的“稀釋劑”是藥學(xué)上可接受的(對于人體給藥是安全無毒的)，能用于制備重建制劑。典型的稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌劑(BWFI)、pH緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)、無菌鹽溶液、林格溶液或葡萄糖液。
“防腐劑”是一種加入稀釋劑中以基本上減少重建制劑中的細(xì)菌作用的化合物，從而能獲得多次性使用重建制劑。有效的防腐劑的例子包括氯化十八烷基二甲基苯基銨、氯化己烷甲銨、氯化苯烷鎓(氯化烷基苯基二甲基銨的混合物，其中烷基是長鏈化合物)和氯化苯乙銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇如酚、丁醇和苯甲醇、烷基paraben如甲基或丙基paraben、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己烷、3-戊醇和間甲酚。這里最佳的防腐劑是苯甲醇。
“填充劑”是一種加入凍干混合物中形成凍干餅物理結(jié)構(gòu)(如使基本上均一的維持開孔結(jié)構(gòu)的凍干餅生產(chǎn)更容易)的化合物。典型的填充劑包括甘露糖醇、甘油。聚乙二醇和山梨糖醇。
“治療”指醫(yī)療治療和預(yù)防措施。那些需要治療的受用者包括已經(jīng)患有疾病和預(yù)防疾病受用者。
需要治療的“哺乳動物”指任何歸類為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農(nóng)場動物和動物園、運動場動物或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、牛等。較佳的哺乳動物是人。
“疾病”是能得益于蛋白質(zhì)治療的疾病。它包括慢性和急性疾病或處于病態(tài)的使哺乳動物易于得病的疾病。這里待治療的非限制性的疾病例子包括癌和過敏反應(yīng)。
II.發(fā)明的實施方案A.蛋白質(zhì)制備待配制的蛋白質(zhì)用該領(lǐng)域已建立的技術(shù)來制備，它們包括合成技術(shù)(如重組技術(shù)和肽合成或這些技術(shù)的組合)或從內(nèi)源性蛋白質(zhì)中分離出來。在本發(fā)明的一些例子中，所選的蛋白質(zhì)是抗體。產(chǎn)生抗體的技術(shù)如下。
(i)多克隆抗體多克隆抗體通常是通過在動物體內(nèi)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)注射相關(guān)的抗原和佐劑獲得的。用雙功能或衍生試劑(如，磺基琥珀酰亞氨馬來酰亞氨基苯甲酰酯(通過半胱氨酸殘基共軛反應(yīng))、N-羥基琥珀酰亞氨(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基))使相關(guān)抗原與待免疫種類中的免疫原性蛋白質(zhì)(如，匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進(jìn)行共軛是有利的。
對動物免疫接種以抗原、免疫原性共軛物或通過1mg或1ug的肽或共軛物(分別針對兔型或鼠源型)與3倍體積的Freund完全佐劑結(jié)合獲得的衍生物。1個月后對動物多處皮下注射入Freund完全佐劑中原先肽或共軛物量的1/5至1/10加強(qiáng)免疫。7至14天后對動物抽血，滴定血清中的抗體。對動物加強(qiáng)免疫直至滴度平頂。較佳地，動物可用相同抗原，但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同的交聯(lián)劑共軛的共軛物來加強(qiáng)免疫。共軛物可在重組細(xì)胞培育中用蛋白質(zhì)融合來獲得。同樣，凝聚劑如明礬也適用于提高免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體可從基本上均一的抗體種群獲得，即包括種群的單個抗體除少量可能發(fā)生的自然突變外是相同的。因此，修飾詞“單克隆”指的是抗體特性不是具體抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等人(Nature，256495(1975))首先提出的雜交瘤方法制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。
在雜交瘤方法中，鼠或其它合適的宿主動物，如倉鼠，可用上述的方法免疫接種以引起淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與用于免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。或者，淋巴細(xì)胞可在體外免疫。然后用合適的融合劑(如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合生成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAnibodiesPrinciple and Practice，pp.59-103(Academic Press))。
這樣獲得的雜交瘤細(xì)胞接種入合適的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基最好含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么通常雜交瘤所用的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這樣可抑制HGPRT缺陷性細(xì)胞的生長。
較佳的骨髓瘤細(xì)胞是那些充分融合、在選擇性抗體產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)可高度穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體的、并且對如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。在它們中，較佳的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠源型骨髓瘤細(xì)胞系，如從MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤(從美國加利福尼亞圣地亞哥Salk Institute Cell Distribution Center獲得)和從SP-2細(xì)胞(從美國馬里蘭州Rochville的American Type Culture Colletion獲得)衍生獲得的細(xì)胞。人源型骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也在人單克隆抗體的產(chǎn)生中有所描述(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
測定用于雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基來產(chǎn)生針對抗原的單克隆抗體。較佳地，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性用免疫沉淀法或體外結(jié)合測定法，如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來測定。
單克隆抗體的結(jié)合親和性可用如Scatchard分析法(Munson等人，Anal.Biochem.，107220(1980))來測定。
在鑒定產(chǎn)生所需特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可通過有限稀釋步驟來亞克隆無性系并用標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciplse and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于這個目的的合適的培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。雜交瘤細(xì)胞可在動物體內(nèi)作為腹水腫瘤生長。
該亞克隆系分泌的單克隆抗體可從培養(yǎng)基、腹水液體或血清中用常規(guī)免疫球蛋白純化步驟，如蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和層析來適當(dāng)分離獲得。
編碼單克隆抗體的DNA用常規(guī)方法很容易分離獲得并測序(如用可與編碼鼠源型抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的一個較佳的來源。一旦分離后，可將DNA放在表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞系、猴COS細(xì)胞系、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、或不另產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞中，以使單克隆抗體在重組宿主細(xì)胞中合成。關(guān)于在細(xì)菌中編碼抗體的DNA的重組表達(dá)的文獻(xiàn)有Skerra等人在Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun在Immunol.Revs.，130151-188(1992)中的總結(jié)。
在另一個例子中，抗體可用McCafferty等人(Nature，348552-554(1990))描述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫中分離獲得。Clackson等人(Nature，352624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.，222581-597(1991))分別描述了用噬菌體文庫分離鼠源型和人源型抗體的方法。此后，文獻(xiàn)公開了用鏈改組(Marks等人，Bio/Technology，10779-783(1992))產(chǎn)生高親和性(nM范圍內(nèi))的人源型抗體，以及用組合感染和體內(nèi)重組來構(gòu)建很大的噬菌體文庫(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)是與常規(guī)的分離單克隆抗體的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)不同的有前途的方法。
DNA還可以通過用同源鼠源型序列替代人源型重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列(美國專利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984))或通過所有或部分編碼非免疫球蛋白多肽的序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。
通常，這種非免疫球蛋白多肽用來替代抗體的恒定區(qū)，或替代抗體上與抗原結(jié)合的位點的可變區(qū)以形成有一個與抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點和另一個與不同的抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點的嵌合二價抗體。
嵌合的或雜合的抗體也可用蛋白質(zhì)合成化學(xué)中已知的方法(包括那些用交聯(lián)劑的方法)在體外制備。例如，通過二硫化合物交換反應(yīng)或形成硫醚鍵可構(gòu)建免疫毒素。用于該目的合適的試劑例子包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞氨酯。
(iii)人源化的和人源型抗體非人源型抗體的人源化是該領(lǐng)域熟知的。通常，人源化的抗體中引入了非人來源的一個或多個氨基酸殘基。這些非人源型氨基酸殘基通常稱作“輸入”殘基，它們通常是從“輸入”可變區(qū)中取出的。人源化可基本上根據(jù)Winter及其同事的方法(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichman等人，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988))進(jìn)行，用鼠CDR或CDR序列代替人抗體的相應(yīng)序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816567)，其中基本上小于完整的人源型可變區(qū)被非人源型對應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是人源型抗體，其中，一些CDR殘基和FR殘基被鼠抗體的相同位點的殘基替代。
用于產(chǎn)生人源化抗體的重鏈和輕鏈人源型可變區(qū)對于減少抗原性非常重要。在所謂的“最合適的”方法中，鼠抗體的可變區(qū)序列是針對所有已知的人源型可變區(qū)序列來篩選的。然后將與鼠型最相近的人源型序列作為人源化抗體中的人源化構(gòu)架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等人.J.Mol.Biol.，196901(1992))。另一種方法采用了從所有人源型抗體的輕鏈或重鏈的特定亞類的共有序列中獲得的特定構(gòu)架。相同的構(gòu)架可用于幾個不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，1512623(1993))。
抗體人源化后仍有對抗原的高度親和性和其它有利的生物性質(zhì)也是很重要的。為實現(xiàn)該目的，根據(jù)較佳的方法，人源化抗體是通過分析親代序列和用親代和人源化序列的三維模型產(chǎn)生的各種人源化產(chǎn)物的方法來制備的。免疫球蛋白的三維模型通常是可以獲得的，且是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。計算機(jī)程序可用來描述和顯示所選的免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。通過觀察這些顯示可以分析殘基在所選的免疫球蛋白序列中可能起的作用，即分析殘基對于待選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的影響。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基，以獲得所需的抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和性的提高。通常CDR殘基對與抗原結(jié)合有直接的、很大的影響。
或者，現(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(如鼠)，它能在免疫接種時在內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生缺失的條件下產(chǎn)生人源型抗體的所有組成。例如，有描述說嵌合和種系突變鼠的抗體重鏈結(jié)合區(qū)(JH)基因?qū)⑼耆种苾?nèi)源性抗體的產(chǎn)生。將人的種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移排列在這種種系突變鼠中將導(dǎo)致它在有抗原攻擊時產(chǎn)生人源的抗體。見如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，733(1993)。人源抗體也可從噬菌體展示文庫中獲得(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，277381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991))。
(iv)雙特異性抗體抗體雙特異性抗體(BsAbs)是可特異性結(jié)合至少兩種不同抗原表位的抗體。這種抗體可從全長抗體或抗體片段中獲得(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是該領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的常規(guī)產(chǎn)生方法是根據(jù)兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表達(dá)，而兩條鏈的特異性互不相同(Millstein等人，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生了有10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對于正確分子的純化(通常用親和色譜步驟)是相當(dāng)麻煩的，而且產(chǎn)物量很低。同樣的步驟在WO93/08829和Traunecker等人在EMBO J.，103655-3659(1991)中有所公開。
根據(jù)另一種方法，使有所需特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。最好與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，恒定區(qū)包括至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。最好在至少一個融合物中，重鏈恒定區(qū)(CH1)含有輕鏈結(jié)合所需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈(如果需要可以是免疫球蛋白的輕鏈)融合物的DNA，插入單獨的表達(dá)載體中，然后共轉(zhuǎn)染入合適的宿主有機(jī)體中。在例子中當(dāng)用三種不同比例的多肽鏈來構(gòu)建提供最優(yōu)得率時，這種方法能靈活地調(diào)節(jié)三種多肽片段間的比例。然而，當(dāng)至少兩種多肽以相同比例表達(dá)能導(dǎo)致高得率時，或當(dāng)比例沒有特別影響時，可以將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體中。
在該方法的一個較佳例中，雙特異性抗體是由雜交的免疫球蛋白重鏈(其一個臂中有第一結(jié)合特異性)和雜交的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(在另一個臂上提供第二結(jié)合特異性)組成。也發(fā)現(xiàn)該該不對稱結(jié)構(gòu)使得所需的雙特異性化合物更容易從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出來，因為僅存在于一半雙特異性分子中的免疫球蛋白輕鏈為分離提供了容易的方法。該方法在1994年3月3日公布的WO94/04690中公開。產(chǎn)生雙特異性抗體的更詳細(xì)的細(xì)節(jié)見例如，Suresh等人在Methods in Enzymology，121210(1986)中的描述。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源共軛”的抗體。例如，異源共軛物中的一個抗體可與親和素偶連，而另一個與生物素偶連。這種抗體例如被設(shè)計成可使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)和治療HIV傳染(WO91/00360，WO92/200373)。異源共軛物抗體可用任何便利的交聯(lián)方法制得。合適的交聯(lián)劑是該領(lǐng)域熟知的，并在美國專利No.4,676,980中公開許多交聯(lián)技術(shù)。
從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也在文獻(xiàn)中有所描述。下列技術(shù)也可用于產(chǎn)生二價的但不必為雙特異性的抗體片段。例如，從大腸桿菌中得到的Fab′片段可在體外化學(xué)結(jié)合形成二價抗體。見，Shalaby等人，J.Exp.Med.，175217-225(1992)。
直接從重組細(xì)胞培育中制備和分離二價抗體片段的多種技術(shù)已有描述。例如，亮氨酸拉鏈可產(chǎn)生二價異源二聚體(Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992))。從Fos至Jun的亮氨酸拉鏈的肽段蛋白質(zhì)通過基因融合與兩個不同抗體的Fab′部分連接。在鉸鏈區(qū)的抗體同源二聚體還原成單體然后重新氧化成抗體異源二聚體。Hollinger等人描述的“二體”技術(shù)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(19993))提供了另一種制備雙特異性/二價抗體片段的思路。片段中有一個重鏈可變區(qū)(VH)，它通過很短的接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)連接從而使同一鏈上的兩個區(qū)域間配對。因此一個片段上的VH和VL區(qū)被迫與另一個片段上的互補(bǔ)VL和VH區(qū)片段配對，因此形成了兩個抗原結(jié)合位點。另外也報道了用單鏈Fv制備雙特異性/二價抗體片段的思路(見Gruber等人，J.Immunol.，1525368(1994))。
B.凍干制劑的制備在如上述制備了感興趣的蛋白質(zhì)后，可制得“未凍干制劑”。未凍干制劑中的蛋白質(zhì)含量可根據(jù)所需劑量體積、給藥方式等來確定。當(dāng)所選的蛋白質(zhì)是完整的抗體(如抗IgE或抗HER2抗體)時，典型的起始蛋白質(zhì)濃度應(yīng)約為2mg/mL至50mg/mL，較佳的約為5mg/mL至40mg/mL，最佳約為20-30mg/mL。蛋白質(zhì)通常存在于溶液中。例如，蛋白質(zhì)可在pH約為4-8的pH緩沖液中，pH最佳約為5-7。典型的緩沖液包括組氨酸、磷酸鹽、Tris、檸檬酸、琥珀酸及其它有機(jī)酸。緩沖液濃度約為1mM至20mM，或約3mM至約15mM，這是根據(jù)如緩沖液和所需的制劑(如重建制劑)等滲性來確定的。較佳的緩沖液是組氨酸，下面證明它有溶解保護(hù)性質(zhì)。另外琥珀酸也是一種有用的緩沖液。
將溶解保護(hù)劑加入未凍干制劑中，在較佳實施例中，溶解保護(hù)劑是非還原性糖類如蔗糖或海藻糖。未凍干制劑中的溶解保護(hù)劑的量應(yīng)使在重建時獲得的制劑有等滲性。然而，也可用高滲重建制劑。此外，溶解保護(hù)劑的量也不宜過低致使在凍干時發(fā)生不令人滿意量的蛋白質(zhì)降解/凝聚。當(dāng)溶解保護(hù)劑是糖類(如蔗糖或海藻糖)而蛋白質(zhì)是抗體時，未凍干制劑中典型的溶解保護(hù)劑的濃度為約10mM至約400mM，較佳的為約30mM至約300mM，最好是約50mM至100mM。
每個蛋白質(zhì)與溶解保護(hù)劑的組合均要選擇蛋白質(zhì)與溶解保護(hù)劑的比例。當(dāng)所選的蛋白質(zhì)是抗體而溶解保護(hù)劑是用來生成高濃度蛋白質(zhì)的等滲性重建制劑的糖類(如蔗糖或海藻糖)時，溶解保護(hù)劑與抗體的比例為約100至1500摩爾溶解保護(hù)劑比1摩爾抗體，較佳為約200至約1000摩爾溶解保護(hù)劑比1摩爾抗體，例如約100至600摩爾(更佳為200至約600摩爾的溶解保護(hù)劑比1摩爾抗體。
在本發(fā)明較佳實施例中，發(fā)現(xiàn)需要在未凍干制劑中加入一種表面活性劑。或者，在凍干制劑和/或重建制劑中也需要加入表面活性劑。典型的表面活性劑包括非離子型表面活性劑如多乙氧基醚(如多乙氧基醚20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基、十四烷基、亞油基或十八烷?；腔鸩藟A；月桂基、十四烷基、亞油基或十八烷?；“彼幔粊営突?、十四烷基或十六烷基甜菜堿；月桂酰氨丙基、柯卡酰氨丙基、亞油酰氨丙基、十四烷酰氨丙基、十六烷酰氨丙基或異十八烷基酰氨丙基甜菜堿(如月桂酰氨丙基)；十四烷酰氨丙基、十六烷酰氨丙基或異十八烷基酰氨丙基二甲胺；甲基椰子基牛磺酸鈉或甲基油酰?；撬岫c；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，New Jersey)、聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronics，PF68等)。表面活性劑的加入量應(yīng)使得重建時蛋白質(zhì)凝聚減少并使重建后制劑的顆?；厔葑钚?。例如，未凍干制劑中的表面活性劑的量為約0.001-0.5％，較佳的為約0.005-0.05％。
在本發(fā)明的一些實施例中，溶解保護(hù)劑(如蔗糖或海藻糖)與填充劑(如甘露糖醇或甘氨酸)的混合物可用于未凍干制劑的制備。填充劑可生成均一的凍干餅而沒有其中過多的開孔。
未凍干制劑(和/或凍干制劑和/或重建制劑)中可包括其它藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(16th edition，Osol，A.Ed.(1980))中描述的，只要它們對制劑所需性質(zhì)沒有負(fù)效應(yīng)即可。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑采用的劑量和濃度對受體應(yīng)是無毒的，它們包括其它緩沖液、防腐劑、共溶劑、抗氧化劑如抗壞血酸和甲硫氨酸、螯合劑如EDTA、金屬配位化合物如Zn-蛋白質(zhì)配位化合物、可生物降解的聚合物如聚酯和/或成鹽抗衡離子如鈉。
這里的制劑也可含有多種蛋白質(zhì)以用于特別的治療場合，最好這些有互補(bǔ)活性的蛋白質(zhì)對其它蛋白質(zhì)沒有負(fù)效應(yīng)。例如，在一個制劑中可提供兩種或多種與HER2受體或IgE結(jié)合的抗體。而且，抗HER2和抗VEGF的抗體可在同一制劑中組合使用。這些蛋白質(zhì)可以利于目的的量存在于組合中。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須無菌。這可通過在凍干和重建前或之后流過無菌過濾膜的過濾來實現(xiàn)。或者，整個混合物可通過例如對除蛋白質(zhì)外的組分在約120℃高壓滅菌30分鐘來實現(xiàn)無菌。
在蛋白質(zhì)、溶解保護(hù)劑和其它任意的組分混合后，可凍干制劑。實現(xiàn)該目的可采用不同的冷凍干燥機(jī)，如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-Heraeus，Germany)型冷凍干燥機(jī)。冷凍干燥是先將制劑冷凍，然后在適于初級干燥的溫度下使冷凍的冰升華。在該條件下，產(chǎn)物溫度低于制劑的低共熔點或崩潰點。通常初級干燥的擱架溫度為約-30℃至25℃(在初級干燥期間產(chǎn)物應(yīng)保持冷凍態(tài))，合適的壓力為50至250mTorr。干燥所需的時間主要由制劑、放置樣品的容器(如玻璃瓶)的大小和類型以及液體的體積來確定，時間可在幾小時至幾天內(nèi)(如40-60小時)。二級干燥步驟可在0-40℃下進(jìn)行，這主要是根據(jù)所用的容器的類型和大小以及蛋白質(zhì)的種類。然而，這里發(fā)現(xiàn)二級干燥步驟是非必要的。例如，凍干物整個水相除去的擱板溫度為約15-30℃(如約20℃)。二級干燥所需的時間和壓力應(yīng)能生成合適的凍干餅，它們與例如溫度和其它參數(shù)有關(guān)。二級干燥時間由產(chǎn)物中所需殘余水分水平來確定，通常需要至少5小時(如10-15小時)。壓力可與初級干燥步驟中所用的壓力相同。冷凍干燥條件可根據(jù)制劑和瓶的大小而不同。
在一些例子中，希望在容器中凍干蛋白質(zhì)制劑，而可在其中進(jìn)行蛋白質(zhì)的重建以避免輸送步驟。該例子中的容器例如可以是3、5、10、20、50或100cc的瓶。
通常，凍干應(yīng)使凍干制劑中的水分含量小于約5％，較佳的用小于約3％。
C.凍干制劑的重建通常當(dāng)需要對患者給藥時，所需步驟是用稀釋劑來重建凍干制劑，使得重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度至少為50mg/mL，例如為約50mg/mL至約400mg/mL，更佳為約80mg/mL至約300mg/mL，最佳為約90mg/mL至約150mg/mL。當(dāng)需要皮下輸遞重建制劑時，重建制劑中如此高的蛋白質(zhì)濃度被認(rèn)為是特別有用的。然而，對于其它給藥途徑，如靜脈內(nèi)給藥，則需要重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度稍低(例如重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度為約5-50mg/mL，或約為10-40mg/mL)。在一些例子中，重建制劑中的蛋白質(zhì)濃度比未凍干制劑中的濃度高的多。例如，重建制劑中蛋白質(zhì)濃度是未凍干制劑的2-40倍，較佳為3-10倍，最佳為3-6倍(如至少3倍或至少4倍)。
重建通常是在約25℃下進(jìn)行，以保證完全水合，但也可按需采用其它溫度。重建的時間與例如稀釋劑的種類、賦形劑和蛋白質(zhì)的量有關(guān)。典型的稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌劑(BWFI)、一種pH緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)、無菌鹽溶液、林格溶液或葡萄糖液。稀釋劑還可以含有防腐劑，典型的防腐劑如上所述，較佳的是芳香醇如苯基或酚類醇。防腐劑的用量通過測定不同的防腐劑濃度下與蛋白質(zhì)的相容性和防腐劑效應(yīng)來決定。例如，如果防腐劑是芳香醇(如苯甲醇)，其含量可為約0.1-2.0％，較佳為0.5-1.5％，但最佳為1.0-1.2％。
較佳地，每一瓶重建制劑中粒徑大于等于10μm的顆粒應(yīng)小于6000個。
D.重建制劑的給藥重建制劑可用已知的方法來對需要用蛋白質(zhì)來治療的哺乳動物，最好是人給藥，方法如靜脈內(nèi)藥給藥或通過肌肉間、會陰內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)、皮膚表面或吸入途徑持續(xù)一定時間灌輸。
在較佳實施例中，重建制劑通過皮下(即皮膚下面)來對哺乳動物給藥。為了這個目的，制劑應(yīng)用注射器來注射。然而，也可用其它用于給藥的設(shè)備，如注射裝置(如Inject-easeTM和GenjectTM裝置)；注射筆(如GenPenTM)；無針裝置(如MediJectorTM和BioJectorTM)和皮下輸藥系統(tǒng)。
蛋白質(zhì)的合適的劑量(“治療有效量”)與例如待治療的疾病、疾病嚴(yán)重性和進(jìn)程、蛋白質(zhì)給藥用于預(yù)防還是治療、以前的治療、患者病史和對蛋白質(zhì)的反應(yīng)、所用的蛋白質(zhì)種類以及主治醫(yī)師的處理有關(guān)。蛋白質(zhì)可一次或在一系列療程內(nèi)對病人給藥，而且可根據(jù)前面的診斷在任何時刻給藥。蛋白質(zhì)可以單獨用于治療或與其它可用于治療疾病的藥物或療法組合使用。
當(dāng)所選的蛋白質(zhì)是抗體時，無論是如一種或多種單獨服法，對患者給藥的最初所選劑量為約0.1-20mg/kg。然而，也可用其它劑量方案。該治療法的進(jìn)展很容易用常規(guī)技術(shù)來控制。
在抗HER2抗體的例子中，抗體的治療有效量應(yīng)可以治療或預(yù)防以HER2載體過度表達(dá)為特征的癌。認(rèn)為抗HER2抗體的重建制劑可用于治療乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和/或膀胱癌。例如，抗HER2抗體可用于治療原位導(dǎo)管癌(DCLS)。一種或多種單獨服法中典型的抗HER2抗體劑量為1-10mg/kg。
抗IgE制劑可用于治療或預(yù)防IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病，例如寄生蟲傳染、間質(zhì)膀胱炎和哮喘。抗IgE抗體的治療有效量(如約1-15mg/kg)根據(jù)治療的疾病來對患者給藥。
E.生產(chǎn)的產(chǎn)品本發(fā)明的另一方面是提供一種含有本發(fā)明的凍干制劑的產(chǎn)品和它的重建和/或用法的說明。產(chǎn)品包括一個容器。合適的容器包括，例如玻璃瓶、小瓶(如雙室小瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。容器可用各種材料如玻璃或塑料制得。容器中有凍干制劑，容器上的或和容器配套的標(biāo)簽說明了重建和/或施用的方法。例如，標(biāo)簽可以指示將凍干制劑重建至上述蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)簽還可說明制劑適用于皮下注射。裝有制劑的容器可以是多次性使用小瓶，它可重復(fù)進(jìn)行重建制劑的給藥(如給藥2-6次)。產(chǎn)品還可包括另一個有合適稀釋劑(如BWFI)的容器。在混合稀釋劑和凍干制劑時，重建制劑中的蛋白質(zhì)最終濃度至少為50mg/mL。從商業(yè)和用戶角度出發(fā)，產(chǎn)品還可包括其它物品，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾膜、針、注射器以及裝有說明書的包裹。
參照下列例子可以充分理解本發(fā)明。然而，它們不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。所有的文獻(xiàn)均作引證參考。
實施例1抗HER2制劑HER2原癌基因產(chǎn)物(p185HER2)的過度表達(dá)與各種入侵性人惡性腫瘤有關(guān)。稱作muMAb4D5的鼠型單克隆抗體可直接作用于p185HER2的胞外區(qū)域(ECD)。muMAb4D5分子被人源化以試圖通過減少它的免疫原性并使它支持人體效應(yīng)器功能來提高臨床效果(見WO92/22653)。這個例子描述了開發(fā)包含WO92/22653中描述的全長人源化抗體huMAb4D5-8的凍干制劑。
在開發(fā)凍干制劑時，首先通過測定蛋白質(zhì)在凍干和重建后的穩(wěn)定性來篩選賦形劑和緩沖液。對每一個制劑中的凍干蛋白質(zhì)作進(jìn)一步穩(wěn)定性研究以測定蛋白質(zhì)在它保藏期限內(nèi)的穩(wěn)定性。這些進(jìn)一步的研究通常是在上述給出的保藏條件溫度下進(jìn)行的，然后根據(jù)阿侖尼烏斯動力學(xué)用數(shù)據(jù)估計降解反應(yīng)所需的活化能(Cleland等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier System 10(4)307-377(1993))。然后用活化能計算出在給出的保藏條件下預(yù)計的蛋白質(zhì)制劑的保藏期限。
在早期篩選研究中，在5℃(給出的保藏條件)和40℃(進(jìn)一步穩(wěn)定性研究的條件)下培育后來研究一些凍干的重組人源化抗HER2抗體(rhuMAbHER2)制劑的穩(wěn)定性。在液態(tài)時，發(fā)現(xiàn)rhuMAB HER2通過脫氨基(輕鏈的30位天冬酰胺)而降解和通過環(huán)狀亞胺中間物琥珀酰亞胺形成異天冬氨酸(重鏈的102位天冬氨酸)。在pH5.0脫氨基反應(yīng)最小，導(dǎo)致降解基本上為琥珀酰亞胺。在pH6.0時，在液體蛋白質(zhì)制劑中發(fā)現(xiàn)有較高量的脫氨基反應(yīng)。因此，在(a)5或10mM琥珀酸鹽緩沖液，pH5.0和(b)5或10mM組氨酸緩沖液，pH6.0下研究凍干制劑。緩沖液均含有表面活性劑多乙氧基醚20(吐溫20TM)，它可用于減少重建蛋白質(zhì)的凝聚趨勢并使重建后顆粒形成最少。這些緩沖液可與及不與各種糖類一起使用。將蛋白質(zhì)以5.0，21.0或25.0mg/mL的濃度配入緩沖液。然后凍干制劑，在5℃和40℃下保藏2星期后測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在冷凍干燥機(jī)內(nèi)，小瓶在約-55℃的擱架溫度下冷凍約5小時，然后在5℃擱架溫度，150mTorr壓力下初級干燥30小時，并用20℃的擱架溫度二級干燥10小時以干燥至1-2％的殘余水分。該蛋白質(zhì)在凍干時的主要降解途徑是凝聚，因此可用非變性大小排阻色譜測定完整非變性蛋白質(zhì)的得率來測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(完整蛋白質(zhì)的％見下表2)。
在10mM琥珀酸鈉，pH5.0(表2)中測定各種溶解保護(hù)劑糖類對于凍干蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的影響。在高糖濃度(250-275mM)和低蛋白質(zhì)濃度(5.0mg/mL)下，海藻糖和乳糖可使在40℃下保藏2星期的凍干蛋白質(zhì)穩(wěn)定并防止它凝聚。然而，乳糖是一種還原性糖，發(fā)現(xiàn)它在40℃下長期保藏時將與蛋白質(zhì)反應(yīng)。含有山梨糖醇或甘露糖醇的5.0mg/mL的制劑在40℃下保藏2星期后將產(chǎn)生蛋白質(zhì)凝聚。在高蛋白質(zhì)濃度下(21.0mg/mL)，由甘露糖醇或甘露糖醇與山梨糖醇或甘氨酸的組合的制劑在兩種條件下凍干保藏后含有凝聚的蛋白質(zhì)。相反，在兩種保藏條件下海藻糖和蔗糖可防止凝聚。
現(xiàn)在測定含有250mM海藻糖和250mM乳糖的制劑的長期穩(wěn)定性。在40℃下保藏9個月或在5℃下保藏12個月后，含海藻糖的制劑中完整蛋白質(zhì)的百分比沒有變化。而對于乳糖制劑，在40℃下保藏3個月后或在25℃下保藏6個月后完整蛋白質(zhì)的百分比保持恒定(和原來一樣)。含海藻糖的制劑可在控制的室溫下(15-30℃)下保藏2年而完整蛋白質(zhì)的百分比沒有顯著的變化。
在40℃下保藏2星期后，有pH6.0，10mM的組氨酸和甘露糖醇的制劑比有pH5.0，10mM的琥珀酸鹽和甘露糖醇的制劑含有更少的凝聚蛋白質(zhì)。這個結(jié)果可能是由于單組氨酸貢獻(xiàn)的穩(wěn)定效果。然而在40℃下保藏2星期后，單用組氨酸或用組氨酸/甘露糖醇的制劑中有顯著的凝聚。在組氨酸制劑中加入與甘露糖醇相等的量(10mg/mL)可在兩種保藏條件下防止凝聚使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。用甘氨酸和甘露糖醇沒有提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而蔗糖/甘氨酸制劑則提供了與蔗糖/甘露糖醇制劑相同的穩(wěn)定性。該結(jié)果進(jìn)一步表明蔗糖有助于在保藏時防止凍干蛋白質(zhì)的凝聚。
表2
a.完整蛋白質(zhì)的組分用非變性大小排阻HPLC和非變性蛋白質(zhì)的峰面積相對于包括凝聚物的總峰面積的值來測定(TSK3000 SW XL柱，TosoHaas，流速為1.0mL/min；用磷酸鹽緩沖液洗脫；在214和280nm下檢測)。蛋白質(zhì)制劑在凍干前(液體，5℃)、凍干后和在5℃或40℃下保藏2星期后分析。
b.含有5mg/mL蛋白質(zhì)的制劑用蒸餾水重建(20mL，5.0mg/mL蛋白質(zhì))，和含有21mg/mL蛋白質(zhì)的制劑用注射用抑菌劑(BWFI，0.9％苯甲醇；20mL，20mg/mL蛋白質(zhì))重建。
由于皮下給藥的體積限制(≤1.5mL)和劑量需求(≥100mg)，因此通常需要高蛋白質(zhì)濃度的輸遞。然而，由于在高濃度下蛋白質(zhì)在處理中有凝聚的趨勢，對它很難處理和無菌過濾，因此高蛋白質(zhì)濃度(≥50mg/mL)通常很難在生產(chǎn)過程中實現(xiàn)。另外凍干過程提供了一種允許蛋白質(zhì)濃縮的方法。例如，將蛋白質(zhì)以一定體積(Vf)裝入小瓶中，然后凍干。然后將凍干蛋白質(zhì)用較原來體積小的體積(Vr)(如Vr＝0.25Vf)的水或防腐劑(如BWFI)重建，使得重建溶液中有較高的蛋白質(zhì)濃度。該方法也使緩沖液和賦形劑濃縮。對于皮下給藥來說，希望溶液是等滲的。
減少凍干rhuMAB HER2中的海藻糖量以在重建成100mg/mL蛋白質(zhì)時形成等滲溶液。測定在pH5.0，5mM琥珀酸鈉和pH6.0，5mM組氨酸、25.0mg/mL蛋白質(zhì)下海藻糖隨濃度而變的穩(wěn)定效果(表3)。在海藻糖濃度從60至200mM間，凍干蛋白質(zhì)在40℃下培育4星期后沒有顯著的凝聚。這些制劑在20mL注射用抑菌劑(BWFI，USP，0.9％苯甲醇)中重建。50mM海藻糖制劑(5mM琥珀酸鈉)在40℃下培育4星期后，在4mL BWFI(100mg/mL蛋白質(zhì))中重建，生成的制劑有稍微增加量的凝聚。保藏的重建制劑提供了可從同一小瓶中多次取出而不染菌的優(yōu)點。當(dāng)使用接種針時，這一個小瓶內(nèi)的制劑就可分幾次取出。
表3
a.完整蛋白質(zhì)的組分用非變性大小排阻HPLC測定，并定義為非變性蛋白質(zhì)的峰面積相對于包括凝聚物的總峰面積的值(TSK3000 SW XL柱，TosoHaas，流速為1.0mL/min；用磷酸鹽緩沖液洗脫；在214和280nm下檢測)。蛋白質(zhì)制劑在凍干前(液體，5℃)、凍干后和在5℃或40℃下保藏4星期后分析。制劑用注射用抑菌劑(BWFI，USP，0.9％w/w苯甲醇；20mL，22mg/mL蛋白質(zhì))重建。
b.用4mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建成蛋白質(zhì)濃度為100mg/mL。
c.用4mL BWFI(1.1％苯甲醇)重建成蛋白質(zhì)濃度為100mg/mL。
d.樣品在5℃或40℃下培育2星期，然后用20mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建成蛋白質(zhì)濃度為22mg/mL。
現(xiàn)在，研究rhuMAb HER2作為治療乳房癌的藥物。給患者每周服用2mg/kg蛋白質(zhì)。由于這些患者的平均體重為65kg，因此，平均每周劑量為130mg rhuMAb HER2。對于皮下給藥來說，注射體積為或小于1.5ml是可以接收的，因此，每周一次皮下給藥的rhuMAb HER2蛋白質(zhì)濃度約為100mg/mL(130mg平均劑量/1.5mL)。如上所述，這種高蛋白質(zhì)濃度很難生成并保持穩(wěn)定。為達(dá)到高蛋白質(zhì)濃度，可將rhuMAb HER2以25mg/mL的蛋白質(zhì)濃度配制入(a)5mM琥珀酸鈉，pH5.0或(b)5mM組氨酸，pH6.0以及60mM海藻糖、0.01％吐溫20TM中并凍干。凍干時將18mL蛋白質(zhì)制劑分裝入50cc小瓶中。在冷凍干燥機(jī)中，小瓶在約-55℃的擱架溫度下冷凍約5小時，然后在5℃擱架溫度，150mTorr壓力下初級干燥30小時，并用20℃的擱架溫度二級干燥10小時以干燥至1-2％的殘余水分。置于含有無效對照劑(不含蛋白質(zhì)的制劑)中的熱電偶顯示小瓶中的產(chǎn)品在整個初級干燥中維持在-10℃以下。在凍干時的依序制止研究顯示在初級干燥后殘余水分通常小于10％。
然后凍干蛋白質(zhì)用4或20mL BWFI(0.9或1.1％的苯甲醇)重建生成濃縮的蛋白質(zhì)溶液(a)4mL102mg/mL rhuMAb HER2，245mM海藻糖，21mM琥珀酸鈉，pH5.0或21mM組氨酸，pH6.0，0.04％吐溫20TM；(b)20mL22mg/mL rhuMAb HER2，52mM海藻糖，4mM琥珀酸鈉，pH5.0或4mM組氨酸，pH6.0，0.009％吐溫20TM。
凍干制劑在40℃下保藏4星期后，重建成22mg/mL的蛋白質(zhì)濃度，隨著海藻糖濃度的減少蛋白質(zhì)的凝聚量顯示出略有上升。凍干蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性則不受重建體積的影響。如圖1所示，凍干蛋白質(zhì)(60mM海藻糖，5mM琥珀酸鈉，pH5.0，0.01％吐溫20TM)在40℃下培育后用4或20mL BWFI重建后完整蛋白質(zhì)的量是相同的。
表3的結(jié)果表明海藻糖濃度和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性間有一定關(guān)系。為進(jìn)一步確定這個關(guān)系，在40℃下對含有不同配制濃度的海藻糖的琥珀酸鈉或組氨酸制劑進(jìn)行培育。然后測定在每個海藻糖濃度下隨海藻糖與蛋白質(zhì)摩爾比變化的穩(wěn)定性。如圖2所示，隨著海藻糖濃度的下降，兩種制劑中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性均有明顯的下降。在這些制劑中采用兩種不同的緩沖液，即琥珀酸鹽和組氨酸，并沒有明顯的區(qū)別，這表明在這種條件下主要的穩(wěn)定劑是海藻糖。此外，兩種制劑中發(fā)現(xiàn)的完整蛋白質(zhì)的減少對于保藏在2-8℃下的低海藻糖濃度制劑在其保存期內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。然而，如果需要控制室溫穩(wěn)定(最大溫度為30℃)，根據(jù)產(chǎn)品穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)(保藏2年后剩余的完整蛋白質(zhì)的量的標(biāo)準(zhǔn))，可能需要更高的海藻糖濃度(海藻糖蛋白質(zhì)之比≥600∶1)。通常，控制室溫保藏條件在40℃下穩(wěn)定保藏6個月與在30℃下保藏2年等效。
如圖3所示，250mM海藻糖制劑在40℃下保藏6個月而無變化，而60mM的海藻糖制劑則較不穩(wěn)定。如果產(chǎn)品在保存期末的標(biāo)準(zhǔn)是，例如用非變性大小排阻色譜測定有大于98％的完整蛋白質(zhì)，那么60mM海藻糖濃度的制劑則需要冷凍保藏。
在先前的篩選研究中，也發(fā)現(xiàn)蔗糖可在凍干后及后續(xù)保藏時防止rhuMab HER2的凝聚。為在重建后獲得等滲溶液以用于皮下給藥(制劑組分和蛋白質(zhì)約濃縮4倍)，必須大大減少蔗糖濃度。在篩選研究中，相同質(zhì)量濃度的蔗糖和甘露糖醇(填充劑)的采用防止了蛋白質(zhì)的凝聚?，F(xiàn)在選擇較低濃度的蔗糖和甘露糖醇(相同的質(zhì)量濃度)用于有效的rhuMAb HER2皮下用制劑。凍干蛋白質(zhì)溶液(25mg/mL蛋白質(zhì)，5mM組氨酸，pH6.0，38.4mM(7mg/mL)甘露糖醇，20.4mM(7mg/mL)蔗糖，0.01％吐溫20TM)，所用方法和60mM海藻糖的制劑相同，只是初級干燥的周期延長至54小時。在40℃下保藏4星期后，用4.0或20.0mL BWFI重建后凝聚物量略有增加(表3)。蛋白質(zhì)凝聚量與對重建成22或100mg/mL蛋白質(zhì)濃度(圖4)的結(jié)果相同。與60mM海藻糖制劑相同，甘露糖醇/蔗糖制劑在40℃下保藏一定時間將形成較少的完整蛋白質(zhì)量。該制劑中蔗糖與蛋白質(zhì)的摩爾比為120比1，這表明在相同摩爾比的穩(wěn)定化糖條件下甘露糖醇/蔗糖的組合比單用海藻糖更有效(圖2和4)。
在先前的例子中，測定了凍干rhuMAb HER2制劑的穩(wěn)定性隨溫度的變化情況。這些研究證明海藻糖和甘露糖醇/蔗糖的制劑可在高溫(40℃)下防止凍干態(tài)的蛋白質(zhì)降解。然而這些試驗并沒有確定蛋白質(zhì)在重建和保藏后的穩(wěn)定性。當(dāng)用BWFI重建后，凍干的rhuMAb HER2制劑可用于幾種藥物給藥。特別是，小瓶容量(450mg rheMAb HER2)設(shè)計成可平均為三個患者提供藥劑(每次劑量為130mg rhuMAb HER2)。由于藥物每周服用一次，因此，小瓶必須在重建后保藏至少三星期，為確定rhuMAb HER2在重建后可維持穩(wěn)定，現(xiàn)在在5℃和25℃下對重建的rhuMAb HER2制劑進(jìn)行穩(wěn)定性研究。
對于皮下給藥，制劑可重建成蛋白質(zhì)濃度為100mg/mL(4mL BWFI)。在這個高蛋白質(zhì)濃度下，蛋白質(zhì)比重建成22mg/mL蛋白質(zhì)(20mL BWFI)的靜脈用制劑更容易凝聚。測定先前例子中四種rhuMAb HER2制劑的凝聚情況(完整蛋白質(zhì)的損失)。如表4至6所示，重建成22和100mg/mL蛋白質(zhì)濃度的制劑的穩(wěn)定性沒有區(qū)別。而且，這些制劑在5℃下可使蛋白質(zhì)保持全部完整90天以及在25℃下可保持蛋白質(zhì)全部完整30天，這表明重建制劑可冷凍保藏至少90天。與先前例子中的凍干蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不同，該制劑中海藻糖濃度對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性無影響(表7)。
表4蛋白質(zhì)濃度為25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM琥珀酸鈉，pH5.0，60mM海藻糖，0.01％吐溫20TM中凍干后重建制劑的穩(wěn)定性
樣品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白質(zhì)的百分比用非變性大小排阻色譜測定，定義為非變性峰面積的組分。ND為沒有測定。
表5蛋白質(zhì)濃度為25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM組氨酸，pH6.0，60mM海藻糖，0.01％吐溫20TM中凍干后重建制劑的穩(wěn)定性
樣品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白質(zhì)的百分比用非變性大小排阻色譜測定，定義為非變性峰面積的組分。ND為沒有測定。
表6蛋白質(zhì)濃度為25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM組氨酸，pH6.0，38.4mM甘露糖醇，20.4mM蔗糖，0.01％吐溫20TM中凍干后重建制劑的穩(wěn)定性
樣品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白質(zhì)的百分比用非變性大小排阻色譜測定，定義為非變性峰面積的組分。ND為沒有測定。
表7蛋白質(zhì)濃度為21mg/mL的rhuMAb HER2在10mM琥珀酸鈉，pH5.0，250mM海藻糖，0.2％吐溫20TM中凍干后重建制劑的穩(wěn)定性
樣品用20.0mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白質(zhì)的百分比用非變性大小排阻色譜測定，定義為非變性峰面積的組分。ND為沒有測定。
如上所述，rhuMAb HER2在水性溶液中主要的降解途徑脫氨基或形成琥珀酰亞胺。現(xiàn)在測定四種重建的rhuMAb HER2制劑中由于脫氨基或形成琥珀酰亞胺而損失的非變性蛋白質(zhì)。
rhuMAb HER2脫氨基和形成琥珀酰亞胺可用陽離子交換色譜來分析。Bakerbong Wide-Pore Carboxy Sulfon(CSX)柱(4.6×250mm)的流速為1mL/min。流動相緩沖液是(A)0.02M磷酸鈉，pH6.9和(B)0.02M磷酸鈉，pH6.9，0.2M NaCl。色譜在40℃下以如下方式進(jìn)行表8
洗脫峰在214nm下檢測，每次分析蛋白質(zhì)上樣量為75μg。
同樣，重建成22mg/mL和100mg/mL蛋白質(zhì)濃度的制劑的穩(wěn)定性也沒有差別(圖5至7)。每種制劑在25℃下的蛋白質(zhì)降解速度比5℃下快，而所有保藏在5℃下的制劑的降解速度是類似的。在25℃下含有組氨酸的制劑的降解速度比琥珀酸鹽制劑略快。在兩個溫度下制劑中的海藻糖濃度對降解速度均沒有影響(圖5至8)。這些結(jié)果證明這四種制劑在計劃使用期間(在用BWFI重建后的30天內(nèi))在冷藏條件下(5℃)的降解速度是可以接受的。
多次性使用制劑要在美國使用必須通過如美國藥典(USP)所描述的防腐性測試。將含有25mg/mL蛋白質(zhì)、5mM組氨酸，pH6.0、60mM海藻糖，0.01％吐溫20TM的rhuMAb HER2凍干制劑用20mL濃度w/w為0.9至1.5％的苯甲醇重建。當(dāng)濃度等于或大于1.3％w/w時，重建制劑在室溫(～25℃)下培育過夜后將變混濁。用標(biāo)準(zhǔn)的BWFI制劑(0.9％苯甲醇)重建將使溶液不能始終通過防腐性測試。然而，用1.0或1.1％的與制劑相容濃度的苯甲醇重建的制劑可通過防腐性測試。產(chǎn)品的規(guī)格要求溶液濃度在±10％范圍內(nèi)，因此凍干制劑用1.1％苯甲醇(1.1±0.1％)來重建。
現(xiàn)在研究了一種rhuMAb HER2制劑單步冷凍干燥過程。在單步冷凍干燥過程中，25mg/mL的rhuMAb HER2、60mM海藻糖、5mM組氨酸(pH6)和0.01％多乙氧基醚20在擱架溫度為20℃、壓力為150mTorr的條件下凍干。47小時后，凍干餅的殘余含水量小于5％。這種冷凍干燥方法被認(rèn)為是有利的，它除去二級干燥步驟，簡化了生產(chǎn)過程。
實施例2抗IgE制劑IgE抗體可與肥大細(xì)胞上的特異性高親和性受體結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫粒并釋放介體如產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)癥狀的組胺，因此，阻礙IgE與高親和性受體結(jié)合的抗IGE抗體對于治療變應(yīng)性疾病有很高的醫(yī)療價值。這些抗體也不能在IgE與受體結(jié)合后與IgE結(jié)合，因為這將引發(fā)組胺的解離。該例子描述了對含有如Presta等人描述的全長人源化抗IgE抗體MaE11(J.Immunology，1512623-2632(1993))的凍干制劑的開發(fā)。
材料:高度純化的rhuMAb E25(重組的人源化的抗IgE抗體MaE11)，在下述所用的制劑中不含有吐溫20TM。從Spectrum(Los Angeles，CA)購得Spectra/Por 7透析膜。該研究中其它所有的試劑可從商業(yè)上獲得并且是分析級的。制劑緩沖液和色譜流動相可通過在容量瓶中混合適當(dāng)量的緩沖液和鹽和Milli-Q級水來制得。
配制將E25S瓊脂糖集合體在特定的制劑緩沖液中透析。透析用4×2L的最小量交換緩沖液在2-8℃下交換48小時來實現(xiàn)。在透析后，將溶解保護(hù)劑按需加入一些制劑中形成等滲濃度。透析后的蛋白質(zhì)濃度用1.60摩爾吸光系數(shù)的紫外分光光度計來測定。將透析后的蛋白質(zhì)用合適的制劑緩沖液稀釋至預(yù)定的制劑濃度，用0.22μm Millex-GV過濾器(Millipore)進(jìn)行無菌過濾，然后分裝到預(yù)先清洗和高壓滅菌過的玻璃小瓶中。小瓶裝上硅烷化的特氟隆瓶塞，然后在下列條件下冷凍干燥E25制劑以80℃/小時的速度冷凍至-55℃，并保持小瓶內(nèi)物質(zhì)冷凍4小時。然后將溫度以10℃/小時的速度升至25℃進(jìn)行初級干燥。初級干燥在25℃、50μ容器室壓下進(jìn)行39小時，使得凍干餅中的殘余含水量為1-2％。在冷凍干燥后，將每種制劑的一個小瓶取出，在0℃分析，而其余的小瓶則在不同的溫度如-70℃、2-8℃、25℃、30℃(對照室溫)、40℃和50℃下進(jìn)行分析。
色譜在Bio-Rad Bio-SelectTMSEC 250-5柱(300×7.8mm)上進(jìn)行非變性大小排阻色譜。柱用PBS以0.5mL/min的流速平衡流洗，并使用裝有二極管排列檢測器的Hewlett Packard 1090L型HPLC儀。用由甲狀腺球蛋白(670kd)、γ球蛋白(158kd)、卵白蛋白(44kd)和維生素B12(1.35kd)組成的分子量標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-Rad，Inc.)來校正柱。樣品上樣量為25μg，蛋白質(zhì)通過用Turbochrom 3軟件(PE Nelson，Inc.)監(jiān)測214nm下的紫外吸光值來獲得。
疏水作用色譜用TosoHass Butyl-NPR柱(3.5×4.6mm)和裝有二極管排列檢測器的Hewlett Packard 1090L型HPLC儀色譜E25抗體的F(ab′)2。洗脫緩沖液A是20mM Tris、2M硫酸銨、20％(v/v)甘油，pH8.0，而洗脫緩沖液B是20mM Tris、20％(v/v)甘油，pH8.0。柱用10％洗脫緩沖液B以1.0mL/min的流速平衡至少20分鐘。樣品上樣量為5μg，蛋白質(zhì)通過用Turbochrom 3軟件(PE Nelson，Inc.)監(jiān)測214nm下的紫外吸光值來獲得。在注入樣品后，使柱在10％的緩沖液B中維持1分鐘，然后在20分鐘內(nèi)從10％線性梯度洗脫至62％的緩沖液B。用100％的緩沖液B洗柱5分鐘，然后在連續(xù)樣品注入間用10％緩沖液B重新平衡至少20分鐘。
抗體結(jié)合活性如上面Presta等人描述的方法對樣品進(jìn)行IgE受體結(jié)合抑制測定(IE252)，樣品用測定稀釋劑(磷酸鹽緩沖液，0.5％BSA，0.05％多乙氧基醚20，0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉)稀釋至20μg/mL和30μg/mL。然后重復(fù)測定每種稀釋液三次，結(jié)果再乘上適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)就可生成活性濃度。平均6次測定的結(jié)果。該測定法測定了rhuMAb E25競爭性結(jié)合IgE從而阻止IgE與固定在ELISA盤上的高親和性受體結(jié)合的能力。結(jié)果除以紫外吸光值分光法測得的抗體濃度，可得到比活值。先前的試驗顯示這個測定結(jié)果可表示穩(wěn)定性。
顆?；瘻y試合并凍干rhuMAb E25的重建制劑，獲得體積約為7mL。用Hiac/Royo型8000計數(shù)器測定1mL樣品中粒徑在2至80μm間的顆粒數(shù)。計數(shù)器首先用1mL樣品洗三次，然后重復(fù)測定1mL樣品三次。儀器測定每毫升中大于粒徑10μm的顆粒數(shù)和粒徑大于25μm的顆粒數(shù)。
制備抗IGE抗體的第一步是決定產(chǎn)品凍干和保藏時合適的緩沖液和pH值。將濃度為5.0mg/mL的抗體配制入pH5.0至6.5的10mM琥珀酸鹽緩沖液和pH7.0的磷酸鈉、磷酸鉀和組氨酸緩沖液中。圖9表示在凍干前和凍干后較高pH的制劑中抗體凝聚物量有增加。一個例外是pH7的組氨酸制劑，發(fā)現(xiàn)它在2-8℃下保藏時凝聚物量沒有增加。圖10表示rhuMAb E25在pH6和pH7的5mM組氨酸緩沖液凍干然后在2-8℃、25℃和40℃下保藏1年后的凝聚情況。在每個測定時間點和保藏溫度下pH6的制劑的凝聚物量均比pH為7的抗體制劑要少。這個結(jié)果表明pH6的組氨酸特別適于用作防止抗體凝聚的緩沖液系統(tǒng)。
為實現(xiàn)溶解保護(hù)劑的篩選，可在有或沒有溶解保護(hù)劑時將抗IgE抗體配制入pH為5的琥珀酸鈉中。加至等滲濃度的有效的溶解保護(hù)劑可分為3類(a)非還原性單糖(如甘露糖醇)；(b)還原性二糖(即乳糖和麥芽糖)；和(c)非還原性二糖(即海藻糖和蔗糖)。
制劑在2-8℃和40℃下保藏1年后的凝聚情況顯示在圖11和12中。在2-8℃下保藏時，單糖制劑(甘露糖醇)的凝聚速度與緩沖液對照中的相同，而含有二糖的制劑在控制凝聚方面均非常有效(圖11)。在40℃下保藏的結(jié)果是相同的，只是蔗糖制劑的凝聚很迅速(這與凍干餅發(fā)生棕黃反應(yīng)相關(guān)聯(lián)(圖12))。后面將顯示這是蔗糖在酸性pH和高溫下保藏時發(fā)生降解而引起的。
配制入pH6的組氨酸緩沖液和乳糖中的抗體的疏水作用色譜顯示抗體在40℃下保藏6個月后將發(fā)生改變(圖13)。色譜峰變寬而保留時間減少。而如圖14和15所示，緩沖液對照和蔗糖制劑在相似條件下保藏則沒有發(fā)現(xiàn)這些變化。而且等電聚焦顯示在25℃和40℃下保藏的配制入乳糖的抗體pI有酸性移動。這表明還原性糖不適用作抗體的溶解保護(hù)劑。
圖16表示了在pH6的組氨酸緩沖液以及各種濃度的蔗糖和海藻糖中濃度為20mg/mL的抗IgE的凍干制劑在50℃下保藏12周后的凝聚情況。當(dāng)每摩爾抗體的糖濃度大于500摩爾時，兩種糖的防止凝聚的效果是相似的。根據(jù)這些結(jié)果，對蔗糖和海藻糖的等滲和高滲制劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。制劑在凍干前被加入較低濃度的抗體，凍干的產(chǎn)品用比含0.9％苯甲醇的注射用抑菌劑(BWFI)的用量更少的量重建。這使得在皮下輸遞前抗體可以濃縮并包括一種防腐劑以用于多次性使用的制劑而避免了長時間保藏時蛋白質(zhì)和防腐劑間的作用。
等滲制劑在pH6的5mM組氨酸緩沖液中配制成抗IgE的濃度為25mg/mL，每摩爾抗體的糖摩爾數(shù)為500摩爾，即糖濃度等于85mM。這種制劑用比原來加量體積小4倍的BWFI(0.9％苯甲醇)重建。這使得在pH6的20mM組氨酸中抗體濃度為100mg/mL，等滲糖濃度為340mM。
高滲制劑在pH6的5mM組氨酸緩沖液中配制成抗IgE的濃度為25mg/mL，每摩爾抗體的糖摩爾數(shù)為1000摩爾，即糖濃度等于161mM。這種制劑用比原來加量體積小4倍的BWFI(0.9％苯甲醇)重建。這使得在pH6的20mM組氨酸中抗體濃度為100mg/mL，高滲糖濃度為644mM。
等滲和高滲制劑在保藏高達(dá)36星期后的抗體凝聚的比較顯示在圖17至19中。在保藏在2-8℃下的高滲或等滲制劑中均沒有發(fā)現(xiàn)凝聚變化(圖17)。而保藏在控制室溫(30℃)下時，高滲溶液中沒有發(fā)現(xiàn)有凝聚增量，而在等滲制劑中有約1至2％的凝聚物增量(圖18)。最后，在50℃下保藏時，在高滲制劑中發(fā)現(xiàn)有較小的凝聚物增量，等滲性海藻糖制劑中有4％的凝聚物增量，而在等滲性蔗糖制劑中有12％的凝聚物增量(圖19)。這些結(jié)果表明等滲性制劑應(yīng)含有使在高達(dá)30℃下保藏的抗體能保持穩(wěn)定所必需的最小量的糖。
用IgE受體抑制測定法可測定等滲和高滲制劑中抗IgE的結(jié)合活性。發(fā)現(xiàn)等滲和高滲蔗糖和海藻糖制劑在-70℃、2-8℃、30℃和50℃下保藏36星期后結(jié)合活性基本上沒有改變。
已知凍干制劑中含有不溶性凝聚物或顆粒(Cleland等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，10(4)307-377(1993))。因此，對加入85mM和161mM蔗糖和海藻糖的pH6，5mM的組氨酸中的濃度為25mg/mL凍干抗體進(jìn)行顆粒化測定。加入多乙氧基醚20至濃度為0.005％、0.01％和0.02％。凍干樣品并在重建成20mM組氨酸，pH6中抗體濃度為100mg/mL，糖濃度為340mM和644mM。下列制劑中的多乙氧基醚20的濃度分別為0.02％，0.04％和0.08％。
下表9表示等滲和高滲的蔗糖和海藻糖制劑中粒徑大于10μm的顆粒數(shù)和粒徑大于25μm的顆粒數(shù)。在凍干前將多乙氧基醚20加入制劑中至濃度為0.005％，0.01％和0.02％中。結(jié)果表明制劑中加入吐溫TM可大大減少每個測試粒徑范圍內(nèi)的顆粒數(shù)。美國藥典(USP)對于小注射劑量的標(biāo)準(zhǔn)是每個容器中粒徑大于或等于10μm的顆粒數(shù)不超過6000個，粒徑大于或等于25μm的顆粒數(shù)不超過600個(Cleland等人，同上)。加入多乙氧基醚20后，高滲和等滲制劑均通過了測試。
表9
下表10顯示了一種抗IgE抗體的制劑(即，143mg瓶裝rhuMAb E25等滲性制劑)，它被認(rèn)為適用于該抗體的皮下輸遞。在10cc小瓶中加入5.7mL濃度為25mg/mL的rhuMAb E25，rhuMAb E25配制在pH6的5mM組氨酸和0.01％多乙氧基醚20中。蔗糖作為溶解保護(hù)劑加入至濃度為85mM，相應(yīng)的糖與抗體的摩爾比為500比1。對小瓶進(jìn)行冷凍干燥，用0.9％苯甲醇重建成原來加量體積的1/4或1.2mL。制劑組分的最后濃度增加4倍，形成pH6的20mM組氨酸中rhuMAb E25濃度為100mg/mL，多乙氧基醚20為0.04％，蔗糖為340mM(等滲性)和0.9％的苯甲醇。制劑含有pH6的組氨酸緩沖液，因為已證明它能防止抗體凝聚。加入蔗糖作為溶解保護(hù)劑是由于以前在藥物行業(yè)中的使用。糖濃度的選擇應(yīng)使得重建時為等滲性制劑。最后，可加入多乙氧基醚20來防止不溶性凝聚物的形成。
表10
權(quán)利要求
1.一種制劑，包含含量約為5-40mg/mL的抗HER2抗體，含量為10-100mM的蔗糖或海藻糖，緩沖液和表面活化劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，還包含一種填充劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中制劑是凍干的并在30℃下至少穩(wěn)定6個月。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，制劑用稀釋劑重建，使得重建制劑中的抗體濃度約為10-30mg/mL，其中重建制劑在2-8℃下至少穩(wěn)定30天。
5.一種制劑，包含含量約為5-40mg/mL的抗IgG抗體，含量為80-300mM的蔗糖或海藻糖，緩沖液和表面活化劑。
6.權(quán)利要求5所述的制劑，其中制劑是凍干的并在30℃下至少穩(wěn)定1年。
7.與HER2受體結(jié)合的抗體在制備用于治療選自子宮內(nèi)膜癌、肺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌的癌癥的藥物中的應(yīng)用。
8.與HER2受體結(jié)合的抗體在制備用于治療以HER2受體過度表達(dá)為特征的癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中抗體為皮下給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中藥物包含的制劑含有含量為50mg/mL-400mg/mL的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中通過將凍干的抗體重建在稀釋劑中來制備制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中癌癥選自乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。
12.穩(wěn)定的重建制劑在制備用于治療以HER2受體過度表達(dá)為特征的癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中重建制劑包含含量為50mg/mL-400mg/mL的結(jié)合HER2受體的抗體，它是通過在稀釋劑中重建抗體和溶解保護(hù)劑的凍干混合物來制得的，其中重建制劑中抗體的濃度比凍干前混合物中抗體濃度高2-40倍。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中制劑為皮下給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的應(yīng)用，其中哺乳動物是人。
15.結(jié)合HER2受體的抗體在制備原位治療導(dǎo)管癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述一種穩(wěn)定的凍干蛋白質(zhì)制劑，它可用合適的稀釋劑重建成高蛋白質(zhì)濃度的重建制劑以適用于皮下給藥。例如，抗IgE和抗HER2抗體制劑可通過在溶解保護(hù)劑存在時對這些抗體冷凍干燥而制得。獲得的凍干混合物可重建成高蛋白質(zhì)濃度的制劑而蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性沒有明顯的喪失。
文檔編號A61K38/00GK1539505SQ20041003025
公開日2004年10月27日 申請日期1996年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月27日
發(fā)明者J·安德亞, J·L·克萊倫德, C·C·赫蘇, X·M·拉姆, D·E·奧維卡謝爾, S·J·夏爾, J·Y·楊, S·S·吳, J 安德亞, 克萊倫德, 吳, 夏爾, 奧維卡謝爾, 拉姆, 楊, 赫蘇 申請人:基因技術(shù)股份有限公司