專利名稱：一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法及其在抗血管生成及抗氧化藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域；涉及到重組的核糖核酸酶抑制因子在原核及真核細胞中的高表達；高效表達核糖核酸酶抑制因子在抗血管生成及抗氧化藥物中的應用。
背景技術(shù)：
核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是一種蛋白質(zhì)，它能與血管形成因子(angiogenin)緊密結(jié)合，抑制其活性。惡性實體瘤的生長過程中，新血管的形成有著重要的意義，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移必須依賴持續(xù)廣泛的血管生成，它不僅可以為瘤組織提供營養(yǎng)、氧氣和必要的生長因子，排出代謝產(chǎn)物。一旦有了新生血管，腫瘤便迅速增大，并發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是腫瘤病人的最大威脅。從轉(zhuǎn)移的發(fā)生到最終形成轉(zhuǎn)移瘤的全過程與血管生成的關(guān)系極為密切[1]。如果沒有新生血管，原發(fā)瘤將停頓于血管前期，不具備侵潤生長的能力。腫瘤細胞沒有機會接近和接觸血管，不能進入循環(huán)，也就沒有轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，抑制血管生成便可能成為抗實體瘤的一種有效的治療方法，尋找有效的血管生成抑制因子就成為抗癌治療的一個新方向。若腫瘤結(jié)節(jié)直徑超過1-2cm，還缺乏新生血管，腫瘤細胞便因“饑餓”而萎縮和退化，最終死亡。
目前已有多種阻斷腫瘤新生血管的抑制因子進入臨床試驗。但由于新生血管的抑制因子半壽期較短，需要每天給藥，同時通常需要的劑量也較大，如內(nèi)皮抑素(endostatin)及血管生成素(angiostatin)治療劑量10-20mg/kg/天。核糖核酸酶抑制因子與血管形成因子結(jié)合非常緊密，Ki值為10-16M，為此，能在很小的劑量(微克水平)抑制腫瘤血管的生成。
核糖核酸酶抑制因子分子中有32個半胱氨酸殘基，其中至少30個半胱氨酸的巰基以還原型巰基的形式存在，還原型巰基是保持RI活性的必要因素。眾所周知，生物體內(nèi)還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)通過其巰基可清除過氧化氫(H2O2)，防護脂質(zhì)過氧化物造成的損害，在機體抗氧化損傷方面發(fā)揮了重要的作用。根據(jù)RI分子組成亦富含巰基的特點，我們通過一系列實驗證明了RI也具有抗氧化的功能。
無論是衰老及癌癥的發(fā)生，自由基的作用均是一個重要因素。RI的抗氧化作用在保持機體對抗自由基引起的損傷中起重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的形成、生長及轉(zhuǎn)移，抑制異常組織血管的形成，抗氧化、抗衰老的高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法及其在抗血管生成及抗氧化藥物中的應用。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，是將人的核糖核酸酶抑制因子基因分別與原核及真核表達載體構(gòu)建，并在原核及真核細胞中表達。
人的核糖核酸酶抑制因子基因在原核生物中的克隆及表達，此基因的克隆為pET23b-ri，pBV220-ri，pGEX-6P-1-ri，和pGEX-6P-2T-ri。構(gòu)建人的核糖核酸酶抑制因子基因RNH在原核細胞表達體系，利用RT-PCR方法擴增人的RI基因cDNA，將此cDNA構(gòu)建到原核表達載體pET23b，pBV220，pGEX-6P，和pGEX-6P-2T上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，經(jīng)篩選得到陽性克隆，分別為pET23b-ri，pBV220-ri，pGEX-6P-1-ri，和pGEX-6P-2T-ri。
人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆及表達，此基因的克隆為pLNCX-ri，pLNCX-S-ri，和pPIC9K-M-ri。構(gòu)建人的核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系及建立了RI的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系，將RI基因從原核表達載體上切下，編碼人核糖核酸酶抑制因子的cDNA與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX重組，重組質(zhì)粒pLNCX-ri用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，經(jīng)抗生素G418篩選，獲得穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細胞克隆。將各細胞克隆分別擴大培養(yǎng)并收集病毒上清，感染NIH3T3細胞檢測病毒滴度，克隆滴度達2.5×105CFU/ml。
人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆pPIC9K-M-ri，此基因為人工定點突變，突變點為cys328/cys329；目的基因在畢赤酵母GS115菌中高效表達；定點突變的RI為分泌型RI。構(gòu)建定點突變的核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系，RI基因經(jīng)PCR定點突變，用丙氨酸同時取代cys328/cys329。定點突變的RI cDNA與酵母表達載體pPIC9K相連接，經(jīng)電轉(zhuǎn)染到畢赤酵母GS115菌中，經(jīng)篩選得到陽性克隆株。定點突變的RI產(chǎn)物在4℃條件下，穩(wěn)定性增加2.3倍。定點突變的RI產(chǎn)物生物活性沒有改變。
人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆pLNCX-S-ri，此基因連接有IgG信號肽，表達分泌型RI。構(gòu)建分泌型核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系，將克隆的pLNCX-ri，與小鼠的IgG基因片段相連，重組病毒攜帶有為分泌型RI，稱pLNCX-S-ri。重組質(zhì)粒pLNCX-S-ri用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，經(jīng)抗生素G418篩選穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細胞克隆。將細胞克隆擴大培養(yǎng)并收集病毒上清，感染NIH3T3細胞，檢測病毒滴度。建立了SRI的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系。
制備的核糖核酸酶抑制因子在制備抗腫瘤血管生成藥物中的應用，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物(大腸桿菌)和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程是將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用超聲破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNase A的活力；經(jīng)冷凍干燥，分裝，保存，制成RI制劑。
制備的人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗新生血管藥物中的應用，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物(大腸桿菌)和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNaseA的活力；經(jīng)冷凍干燥，壓片，包裝，保存。
制備的人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗氧化藥物中的應用，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物(大腸桿菌)和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)離子交換層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNaseA的活力；分裝，保存。
本發(fā)明的有益效果是，重組的人的核糖核酸酶抑制因子抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的形成、生長及轉(zhuǎn)移。抑制異常組織血管的形成，如青光眼，白內(nèi)障等。核糖核酸酶抑制因子還能夠抗氧化、抗衰老。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。
1.構(gòu)建人的核糖核酸酶抑制因子基因(RNH)在原核細胞表達體系。
利用RT-PCR方法擴增人的RI基因cDNA，經(jīng)測序與文獻報道的相一致。將此cDNA構(gòu)建到原核表達載體pET23b，pBV220，pGEX-6P，和pGEX-6P-2T上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，經(jīng)篩選得到陽性克隆，分別為pET23b-ri，pBV220-ri，pGEX-6P-1-ri，和pGEX-6P-2T-ri。經(jīng)SDS PAGE及Western blot檢測，證實在大腸桿菌中有RI基因的高效表達。
2.構(gòu)建人的核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系及建立了RI的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系。
將RI基因從原核表達載體上切下，編碼人核糖核酸酶抑制因子的cDNA與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX重組，重組質(zhì)粒pLNCX-ri用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，經(jīng)抗生素G418篩選，獲得穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細胞克隆。將各細胞克隆分別擴大培養(yǎng)并收集病毒上清，感染NIH3T3細胞檢測病毒滴度，克隆滴度達2.5×105CFU/ml。提取陽性克隆細胞總RNA進行RT-PCR分析，獲得的cDNA片段長度與預計結(jié)果一致。說明建立了RI的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系。經(jīng)PCR及Westernblot等方法鑒定，證實在真核細胞中有RI基因的高效表達。
3.構(gòu)建定點突變的人的核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系。
RI基因經(jīng)PCR定點突變，用丙氨酸同時取代cys328/cys329。定點突變的RI cDNA與酵母表達載體pPIC9K相連接，經(jīng)電轉(zhuǎn)染到畢赤酵母GS115菌中，經(jīng)篩選得到陽性克隆株。經(jīng)PCR及Western blot等方法鑒定，證實在酵母細胞中有分泌型RI的高效表達。定點突變的RI產(chǎn)物在4℃條件下，穩(wěn)定性增加2.3倍。定點突變的RI產(chǎn)物生物活性沒有改變。
4.構(gòu)建分泌型人的核糖核酸酶抑制因子基因真核表達體系將克隆的pLNCX-ri，與小鼠的IgG基因片段相連，重組病毒攜帶有為分泌型RI，稱pLNCX-S-ri。重組質(zhì)粒pLNCX-S-ri用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，經(jīng)抗生素G418篩選穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細胞克隆。將細胞克隆擴大培養(yǎng)并收集病毒上清，感染NIH3T3細胞，檢測病毒滴度。建立了SRI的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系。提取克隆細胞總RNA進行RT-PCR分析，獲得的cDNA片段長度與預計結(jié)果一致。
實施例1人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗腫瘤血管生成藥物中的應用。
從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物(大腸桿菌)和真核生物細胞中提取RI制劑。其工藝流程是將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用超聲破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI。測定RI的含量及其活性(抑制RNase A的活力)。經(jīng)冷凍干燥，分裝，保存，制成RI制劑。
人的核糖核酸酶抑制因子抗腫瘤血管生成藥物方面的使用實驗研究。核糖核酸酶抑制因子對小鼠S-180肉瘤生長的抑制作用經(jīng)親和層析純化的RI，皮下注射給純系L-615荷瘤小鼠(10000U/kg)。每天給藥一次，連續(xù)5天，對照組注射生理鹽水，一定時間后處死小鼠，取出實體瘤稱重，計算抑瘤率。結(jié)果表明，抑瘤率達到46％。
實施例2人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗新生血管藥物中的應用。
從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物大腸桿菌和真核生物細胞中提取RI制劑。其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI。測定RI的含量及其活性(抑制RNase A的活力)。經(jīng)冷凍干燥，壓片，包裝，保存。
在正常情況下，哺乳動物眼睛血管是停止生長的，部分原因是存在著血管抑制因子，它可以防止血管侵蝕到角膜及晶體(玻璃體)。在大多數(shù)健康的組織新血管的生長受到嚴密的調(diào)節(jié)，當這種抑制失調(diào)時，則會引起許多疾病，從關(guān)節(jié)到腫瘤。當視網(wǎng)膜缺血性疾病時，如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變，以及老年性相關(guān)的斑點性退行性病變時，血管過度增加，最終導致失明。角膜新生血管(comeal neovascularization，CNV)是角膜排斥反應的最危險因素，角膜移植術(shù)、角膜燒傷常伴有大量CNV，目前還沒有治療和預防CNV的理想方法。本藥物可用于治療及預防此類眼科疾病。
人的核糖核酸酶抑制因子抑制堿燒傷后的角膜血管的新生，實驗結(jié)果如下純種大耳白兔16只，隨機分為四組，雙眼表麻后，球后注射2％多卡因1ml，自身雙眼對照。用mol/L NaOH制成堿燒傷模型，實驗眼結(jié)膜下注射300-500U不同劑量的RI，，隔天給藥一次，共兩周。對照眼結(jié)膜下注射同體積的生理鹽水。觀察CMV生長情況并攝片，用PhotoShop5.5軟件計算CNV面積，用SPSS10.0軟件分析數(shù)據(jù)。
實驗結(jié)果顯示，RI注射組CNV被抑制，且與RI劑量有相關(guān)性，抑制率由35.26％--48.32％(p＜0.001)。結(jié)論RI能在相當程度上抑制堿燒傷后的CNV。
實施例3人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗氧化藥物中的應用。
從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物(大腸桿菌)和真核生物細胞中提取RI制劑。其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)離子交換層析純化RI。測定RI的含量及其活性(抑制RNase A的活力)。分裝，保存。
RI是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，在RI分子中含有30個游離的巰基，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特點，經(jīng)我們研究證實，RI分子具有抗氧化作用。
實驗結(jié)果如下a.利用基因轉(zhuǎn)染方法，將RI基因轉(zhuǎn)到神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞系中(C′6)。用不同濃度的H2O2造成C6細胞損傷。用未轉(zhuǎn)染RI基因的C6細胞作對照。結(jié)果在相同濃度H2O2作用下，轉(zhuǎn)染的C6細胞形態(tài)改變及存活率均明顯好于未轉(zhuǎn)染的C6細胞。
b.轉(zhuǎn)C6細胞的LDH(乳酸脫氫酶)漏出量，MDA(丙二醛)含量顯著低于C6細胞(p＜0.01)，而GSH(谷胱甘肽)明顯高于C6細胞(p＞0.05)。
轉(zhuǎn)C6細胞CAT(過氧化氫酶)及GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶)活性顯著高于C6細胞。以上結(jié)果表明，RI能夠減輕H2O2所致的細胞過氧化損傷，RI具有抗氧化的功能。
實施例4RI對CCl4肝中毒的保護作用實驗研究。
由于RI具有抗氧化作用，RI對CCl4肝中毒造成的肝損傷也具有保護作用，實驗結(jié)果是
a.從動物組織中提取RI，經(jīng)活性測定及電泳分子量測定，證實為RI。
b.小鼠急性肝損傷模型的建立昆明種小鼠25±2.0g，雌雄各半，隨機分四組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射2％CCl4造成急性肝損傷。
c.RI對CCl4所致小鼠血清ALT和AST水平的影響(見表1)表1GroupnRI(U/20g) ALT(U/100ml)AST(U/100ml)Control 10 48±5 124±7CCl41001104+121*769±73*RI low 10200 660±33+，*436±29+，*RI high 10400 628±30#，+，*408±25#，+，*表中可見，損傷組小鼠ALT和AST明顯高于對照組，說明CCl4破壞肝細胞，使轉(zhuǎn)氨酶逸入血液。RI治療組與未治療組相比，ALT和AST的水平明顯下降(p＜0.01)，并且與RI劑量有關(guān)。
d.RI對CCl4所致小鼠肝臟SOD、GSH和MDA水平的影響(見表2)表2Group n RI SOD GSH XOD MDA×102U/20gwU/mg pro μg/mg proU/g pro nmol/g proControl 100 7.5±1.1 34±7.1 7.4±2.03.9±0.2CCl4100 5.6±0.9*27±7.5*7.5±1.515.6±1.5**RI10200 8.2±1.0#27±6.3 7.4±2.19.7±0.56##RI10400 8.5±1.0+27±5.7 7.0±1.68.9±0.5++損傷后小鼠SOD(過氧化物歧化酶)的活性和GSH(谷胱甘肽)含量明顯下降(p＜0.01)，MDA(丙二醛)含量明顯增高(p＜0.01)RI治療組與未治療組相比，SOD及GSH明顯升高，MDA明顯下降(p＜0.01)。此結(jié)果表明，RI具有保護肝臟過氧化損傷的作用。
病理組織學檢查結(jié)果表明，小鼠經(jīng)CCl4損傷后，肝小葉索狀排列紊亂，肝細胞廣泛水樣變性，出現(xiàn)大量細胞壞死，炎性樣侵潤。給予RI后，肝細胞損傷明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，無明顯炎性細胞侵潤。此結(jié)果表明，RI能減輕CCl4對肝組織的損傷。從上述結(jié)果可見，RI可作為一種預防及治療肝損傷性藥物。
實施例5人的核糖核酸酶抑制因子抗腫瘤基因治療的作用a.根據(jù)RI能與血管生成因子(Ang)緊密結(jié)合的特性，RI的過表達可抑制腫瘤血管的生長，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。
b.本發(fā)明將人的RI基因(RNH)構(gòu)建到真核表達載體pLNCX-ri上，并轉(zhuǎn)染到人的干細胞中，將轉(zhuǎn)染RI的干細胞回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)進行抗腫瘤治療。
實驗結(jié)果如下將RI基因構(gòu)建到真核表達載體pLNCX-ri上，并轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(C6)，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，將轉(zhuǎn)染RI的C6細胞接種于大鼠皮下，以未轉(zhuǎn)染的C6細胞作對照。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組的成瘤潛伏期(23±5.7天)明顯延長于對照組(4±3.5天)；轉(zhuǎn)染組瘤組織重量(1.35±0.43g)明顯低于對照組(2.40±0.61g)(p＜0.01)；轉(zhuǎn)染組瘤組織的血管密度(27.2±4.31)明顯少于對照組(47±6.54)(p＜0.01)。此結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染RI的細胞有明顯的抗腫瘤生長作用，其作用機制可能是RI抑制腫瘤血管生成或與RI抗氧化有關(guān)。
c.將pLNCX-ri重組載體轉(zhuǎn)入包裝細胞PA317，通過G418篩選出滴度為2.5×105CFU/ml的產(chǎn)毒細胞克隆。用收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染經(jīng)150mg/ml 5-氟尿嘧啶處理小鼠骨髓造血細胞，體外分析病毒的轉(zhuǎn)染效率；同時將陽性細胞移植給致死劑量鈷60照射的小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，體外逆轉(zhuǎn)錄病毒對小鼠骨髓造血細胞的轉(zhuǎn)染效率為35％，經(jīng)G418篩選后的轉(zhuǎn)染效率為100％；鈷60照射的小鼠經(jīng)骨髓移植后，轉(zhuǎn)RI基因組與轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組和不轉(zhuǎn)染組比較，小鼠黑色素瘤的成瘤潛伏期延長，瘤重明顯減輕，抑瘤率為47％±9.6％。用PCR、RT-PCR及Westernblot分析外源基因在骨髓、血液、脾臟和胸腺中均有表達。本研究證實了，RI基因可以作為抗血管生成基因治療。
權(quán)利要求
1.一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，其特征在于，將人的核糖核酸酶抑制因子基因分別與原核及真核表達載體構(gòu)建，并在原核及真核細胞中表達。
2.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，其特征在于，人的核糖核酸酶抑制因子基因在原核生物中的克隆及表達，此基因的克隆為pET23b-ri，pBV220-ri，pGEX-6P-1-ri，和pGEX-6P-2T-ri。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，其特征在于，人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆及表達，此基因的克隆為pLNCX-ri，pLNCX-S-ri，和pPIC9K-M-ri。
4.根據(jù)權(quán)利1或3要求所述的一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，其特征在于，人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆pPIC9K-M-ri，此基因為人工定點突變，突變點為cys328/cys329；目的基因在畢赤酵母GS115菌中高效表達；定點突變的RI為分泌型RI；定點突變的RI產(chǎn)物在4℃條件下，穩(wěn)定性增加2.3倍。
5.根據(jù)權(quán)利1或3要求所述的一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，其特征在于，人的核糖核酸酶抑制因子基因在真核生物中的克隆pLNCX-S-ri，此基因連接有IgG信號肽，表達分泌型RI。
6.使用權(quán)利1要求所述的一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法，制備的人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗腫瘤血管生成藥物中的應用，其特征在于，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物大腸桿菌和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程是將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌、酵母收集后，利用超聲破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNasea A的活力；經(jīng)冷凍干燥，分裝，保存，制成RI制劑。
7.使用權(quán)利1要求所述的一種高效表達核糖核酸酶抑制因子的制備方法，制備的人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗新生血管藥物中的應用，其特征在于，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物大腸桿菌和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNase A的活力；經(jīng)冷凍干燥，壓片，包裝，保存。
8.使用權(quán)利1要求所述的一種高效表達核糖核酸酶抑制因子的制備方法，制備的人的核糖核酸酶抑制因子在制備抗氧化藥物中的應用，其特征在于，從轉(zhuǎn)化RI基因的原核生物大腸桿菌和真核生物細胞中提取RI制劑，其工藝流程如下將擴增培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母收集后，利用生物化學技術(shù)破碎細胞，分離蛋白質(zhì)，經(jīng)離子交換層析純化RI；測定RI的含量及其活性，抑制RNase A的活力；分裝，保存。
全文摘要
一種高效表達人的核糖核酸酶抑制因子的制備方法及其在抗血管生成及抗氧化藥物中的應用屬于生物技術(shù)領域。涉及到重組的核糖核酸酶抑制因子在原核及真核細胞中的高表達；高效表達核糖核酸酶抑制因子在抗血管生成及抗氧化藥物中的應用。重組的核糖核酸酶抑制因子抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的形成、生成及轉(zhuǎn)移。抑制異常組織血管的形成，如青光眼，白內(nèi)障等。核糖核酸酶抑制因子還能夠抗氧化、抗衰老。
文檔編號A61P39/00GK1584031SQ200410020700
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者崔秀云, 趙寶昌 申請人:崔秀云, 趙寶昌