專利名稱：一種治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體是涉及以中草藥為原料而制備的一種治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是乙型肝炎病毒引起的傳染病，嚴(yán)重危害人類健康及影響勞動(dòng)能力，近年來本病發(fā)生率全世界均有增長(zhǎng)趨勢(shì)，我國(guó)系乙肝病毒感染高發(fā)區(qū)，成人乙肝病毒感染率為42.4-80.77％，而慢性乙型肝炎是最主要、最常見的肝臟病，罹患率每100-200/10萬人口以上。占疾病死亡率的第六位，國(guó)內(nèi)報(bào)導(dǎo)有24-50％急性乙型肝炎發(fā)展成為慢性肝炎。而肝硬化、肝癌的發(fā)生率與慢性乙型肝炎的發(fā)生率呈平行關(guān)系，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)80％肝癌由慢性乙型肝炎演變而來。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乙型病毒肝炎尚無特異治療，療效也不夠理想。而臨床實(shí)踐證明，肝得康具有高效、穩(wěn)效的優(yōu)勢(shì)，因此研究肝得康顆粒具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乙型肝炎尚無特異治療，西醫(yī)綜合療法適量維生素、解毒藥物、肝泰樂、肌苷、肝樂等；去脂藥物肌醇等；免疫調(diào)節(jié)劑白細(xì)胞介素、胸腺肽、聚肌胞；抗病毒藥物干擾素、拉米夫定等；降酶藥物甘利欣、五靈脂、聯(lián)苯雙酯等。中醫(yī)藥治療分兩大類1、辨證施治，有清熱解毒、涼血化解毒、疏肝理氣化瘀、調(diào)補(bǔ)氣血、健脾養(yǎng)肝補(bǔ)腎等法。2、中成藥云芝肝泰、滅澳靈、肝必復(fù)、豬苓多糖等，但療效尚不夠理想，如湖南地區(qū)用疏肝理脾片治療慢性乙型肝炎，其中慢活肝(CNN)治療組總有效率76.9％，基本治愈率為41.3％，慢遷肝(CPH)治療組總有效率為81.4％，基本治愈率為54.39％。中藥芪苓柴虎湯(QLCHS)治療慢性乙型肝炎的臨床研究顯示QLCHS組HbeAg轉(zhuǎn)陰率為56.5％，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率為33.3％，均顯著高于常規(guī)護(hù)肝組(分別為9.3％和11.1％)，P＜0.01。QLCHS組的HbeAg和HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率與干擾素組無顯著差異(P＞0.05)。治療組、干擾素組、常規(guī)護(hù)肝組ALT依次有76.8％、82.5％和61.1％恢復(fù)正常水平，無顯著差異(P＞0.05)，(摘自中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志2002年第12卷第5期268-269)。據(jù)此，國(guó)內(nèi)外對(duì)慢性乙型病毒性肝炎尚無特異治療，療效不夠理想，因此急需研制療效高，無明顯毒性反應(yīng)的中藥新制劑。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的(1)本發(fā)明采用調(diào)養(yǎng)肝脾、清化濕熱瘀毒法，應(yīng)用相應(yīng)的中藥配伍、制劑，提供一種治療慢性乙型病毒性肝炎療效高、無明顯毒性的中藥新制劑。
(2)本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供復(fù)方制劑的制備方法。
2.技術(shù)方案(1)一種冶療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑，其特征在于它是由下列重量配比的原料制成的藥劑太子參5-30克 枸杞子5-30克 白術(shù)5-30克 茯苓5-30克 虎杖5-40克 半枝蓮10-40克 垂盆草10-70克 赤芍8-20克 蒼術(shù)5-20克蛇舌草10-40克 苦參5-15克 甘草2-15克若患者虛象不明情況，可去太子參、枸杞子，加土茯苓10-40克、田基黃8-40克、敗醬草10-50克(2)方解藥用太子參益氣健脾為君，實(shí)脾以治肝，杞子、白術(shù)、茯苓為臣，補(bǔ)益肝脾，助君藥以健脾養(yǎng)肝，扶正祛邪，佐以虎杖、半枝蓮、垂盆草、赤芍、蛇舌草、苦參清熱利濕、涼血解毒，蒼術(shù)燥濕健脾，取甘草為使，調(diào)和諸藥以解毒。
(3)一種治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其制備步驟為①取苦參，加60％-95％的乙醇，用量為8-10倍處方量，浸泡24-48小時(shí)后，加熱回流提取2-3次，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，并濃縮相對(duì)密度1.00-2.00(40-60℃)，得濃縮液I備用；②取炒白術(shù)、炒蒼術(shù)，加水浸泡1-3小時(shí)后，水蒸汽蒸餾得蒸餾液，冷至(4℃-6℃)24-48小時(shí)，分離，得揮發(fā)油，備用；③將藥渣與太子參等9味藥，加水浸泡1-2小時(shí)后，煎煮二次，合并煎液，高速離心，取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.00-2.00(40-60℃)，備用(II)；④合并上述濃縮液I、II，混勻，真空干燥，得干浸膏，粉碎成細(xì)粉(IV)，備用；⑤取炒白術(shù)等的揮發(fā)油，加入適量的輔料I后包合，低溫干燥得(III)；⑥將上述III、IV合并混勻，加適量的輔料II后，干法制粒，整粒，檢驗(yàn)，分裝，即得(1000g)。
上述輔料I為β-環(huán)糊精，輔料II為硬脂酸鎂。
上述所說的復(fù)方制劑，其特征是藥劑學(xué)上所說的任何一種劑型。
3.有益效果本發(fā)明首次提出濕熱瘀毒交結(jié)，久必肝脾兩傷是慢性乙型肝炎的病理特點(diǎn)，據(jù)此確立調(diào)養(yǎng)肝脾，清化濕熱瘀毒法，并按此組方研制成的復(fù)方制劑--肝得康顆粒。它與現(xiàn)有中藥相比，具有明顯調(diào)養(yǎng)肝脾、清化濕熱瘀毒作用，臨床應(yīng)用肝得康顆粒治療慢性乙型病毒性肝炎肝脾兩傷、濕熱瘀郁證103例，總有效率為93.66％，基本治愈率為68.29％，與同類藥物比較，療效顯著，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。肝得康顆粒亦可用于慢性丙型病毒性肝炎肝脾兩傷、濕熱瘀郁證。
四、具體實(shí)施方案實(shí)施例1.冶療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑，由下列重量配比的原料藥所制成的藥劑第一組重量配比的藥劑太子參10克 枸杞子10克 白術(shù)10克 茯苓12克 虎杖16克 半枝蓮20克 垂盆草40克 赤芍12克 蒼術(shù)10克 蛇舌草20克 苦參10克 甘草5克第二組重量配比的藥劑太子參20克 枸杞子20克 白術(shù)20克 茯苓20克 虎杖25克 半枝蓮30克 垂盆草60克 赤芍20克 蒼術(shù)20克 蛇舌草30克 苦參15克 甘草10克實(shí)施例2.冶療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其制備步驟為①按實(shí)施例1的重量稱取太子參、枸杞子、虎杖等12味原料，取苦參，加60％乙醇浸泡24小時(shí)后，加熱回流提取三次，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，并濃縮相對(duì)密度1.20(50℃)，備用(I)；②取炒白術(shù)、炒蒼術(shù)，加水浸泡1小時(shí)后，水蒸汽蒸餾得蒸餾液，冷至(4℃)24小時(shí)，分離，得揮發(fā)油，備用；③將藥渣與太子參等9味藥，加水浸泡1小時(shí)后，煎煮二次，合并煎液，高速離心，取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.20(50℃)，備用(II)；④合并上述I、II，混勻，真空干燥，得干浸膏，粉碎或細(xì)粉(IV)，備用；⑤取炒白術(shù)等揮發(fā)油，加入適量β-環(huán)糊精包合，低溫干燥(III)；⑥將上述III、IV混勻，加適量硬脂酸鎂，干法制粒，整粒，檢驗(yàn)，分裝，即得(1000g)。
實(shí)施例3.肝得康顆粒對(duì)鴨乙型肝炎病毒的作用1.實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品與試劑肝得康顆粒干浸膏(批號(hào)2000802)每g含生藥5.5g，口服，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供。
半宙乙肝寧顆粒(批號(hào)000321)廣西半宙制藥有限公司鄰苯二胺(CPD)(批號(hào)99108)南京化學(xué)試劑廠
Tween-2D(批號(hào)000503)上?；瘜W(xué)試劑廠ALT、AST、ALP(批號(hào)20001011)南京建成生物工程研究所鴨乙型肝炎病毒 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)系病理教研室提供鴨乙型肝炎病毒抗原單雙夾心ELISA診斷試劑盒 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)系病理教研室提供1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一日齡櫻桃谷鴨 南京灣山農(nóng)場(chǎng)2.實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)前小鴨全部心臟取血，分離血清，用單抗雙夾心ELISA檢測(cè)血清中的DHBsAg；用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中的ALT、AST、ALP、T-Bili水平，然后給每只小鴨注射鴨乙型肝炎病毒0.1ml，7日后采血，分離血清，再檢測(cè)血清中DHBsAg，陽(yáng)性及肝功能水平升高者即為感染成功的模型。將已感染的小鴨隨機(jī)分為五組，每組10只。即肝得康顆粒1組、肝得康顆粒2組、肝得康顆粒3組、乙肝寧組、模型組。各組隔離喂養(yǎng)。除正常組、模型組不給任何藥物外，其余各組均每日給藥一次，連續(xù)35天，觀察藥物的作用。
2.2體外抗病毒作用以100ID50DHBV分別與10-2g 5ml肝得康顆粒，10-2g半宙乙肝寧顆粒5ml混合，充分混勻，于37℃恒溫60min后，將三組混合液分別接種1日齡小鴨，腹腔注射，0.2ml/只。7天后各組小鴨采血，分離血清，檢測(cè)其中的DHBsAg，陽(yáng)性即為感染。
2.3用藥方式(1)肝得康顆粒高、中、低劑量組56.0、28.0、14.0g/kg，均灌胃給藥，每日一次，連續(xù)35天。
(2)乙肝寧組4.5g/kg，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)35天。
模型組、正常組不作任何處理。
各組均每周采血一次，分離血清，-20℃保存。
單抗雙夾心ELISA測(cè)DHBsAg按陳以平等方法進(jìn)行，步驟如下以0.05M PH值9.6碳酸鹽緩沖液稀釋DHBsAg單抗腹水1∶10000，包被ELISA板100ul/孔，37℃溫浴1小時(shí)，PBS洗三次，每次5min，10％CFS封閉，37℃溫浴2小時(shí)，PBST洗三次，每次5min。每孔加入1∶6400稀釋的酶標(biāo)單抗，37℃溫浴1.5小時(shí)，PBS洗三次，每次5min，每加100ulOPD底物，37℃避光反應(yīng)15min，以2MH2SO4終點(diǎn)反應(yīng)，測(cè)定OD490值。以P-N≥2.1(X±3SD)為陽(yáng)性。
2.4肝功能檢測(cè)每周采血一次，分離血清，用全自動(dòng)生化分析佼檢測(cè)各組給藥前后，不同時(shí)期鴨血清中的ALT、AST、ALP、T-Bili水平。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果各組接種混合液7天后采血，用單抗雙夾心ELISA檢測(cè)鴨血清中DHBsAg陽(yáng)性發(fā)生率。肝得康顆粒高、中、低三個(gè)劑量組、乙肝寧組、空白組DHBsAg發(fā)生率分別為75％(6/8)、62.5％(5/8)、62.5％(5/8)、62.5％(5/8)、100％(10/10)，說明肝得康顆粒具有抗體外病毒作用。
3.2肝得康顆粒對(duì)小鴨病毒攜帶者影響，見表1表1肝得康顆粒對(duì)小鴨血病毒攜帶DHBsAg的影響組別 動(dòng)物數(shù)劑量不同日齡小鴨血清中DHBsAg陽(yáng)性率(％)(只) (g/kg) 17 14 28 42正常 10-0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10)組模型 10-0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 100 100組 (10/10) (10/10)▲肝得 1056.0 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 70(8/10) 50(5/10)康1 *組肝得 1028.0 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 90(9/10) 70(7/10)康2組肝得 1014.0 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 90(9/10) 90(9/10)康3組乙肝 109.0 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 90(9/10) 70(7/10)寧組注▲與正常組相比P＜0.05*與模型組相比，P＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鴨感染后，用肝得康顆粒三個(gè)劑量組在第28天以后，血清中DHBsAg陽(yáng)性動(dòng)物數(shù)開始減少，42天后DHBsAg陽(yáng)性率明顯下降，說明肝得康顆粒在給藥一定時(shí)期以后，對(duì)鴨DHBsAg有一定的清除作用。
3.3肝功能檢測(cè)結(jié)果各組用藥前后不同時(shí)期鴨血清中ALT、AST、ALP、T-Bili水平見表2、3、4、5。
表2肝得康顆粒對(duì)鴨血清ALT值(u/L)的影響(X±S)組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)小鴨日齡(天)(只) 17 42正常組 20ml/kg 1046.3±25.4 57.8±29.649.5±19.9模型組 1047.4±22.2 115.6±41.1▲109.8±32.9▲肝得康156.01050.2±28.2 109.7±36.7* 75.7±27.6組肝得康228.01048.6±25.6 98.4±29.2* 71.6±32.4組肝得康314.01044.4±29.5 106.2±39.5* 69.1±31.5組乙肝寧組 9.0 1049.7±30.5 99.1±25.7* 73.4±41.6注▲與正常組相比P＜0.05與感染前相比，*P＜0.05
表3肝得康顆粒對(duì)鴨血清AST值(u/L)的影響(X±S)組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù) 小鴨日齡(天)(只) 17 42正常組 20ml/kg 1086.5±29.3 89.4±31.477.4±25.9模型組 - 1079.5±28.5 216.5±66.4▲229.5±72.6▲肝得康156.01074.5±31.4 180.4±154.9±48.4*組53.6*肝得康228.01082.4±24.3 174.9±151.2±53.7*組62.8*肝得康314.01079.0±26.1 190.1±169.0±62.3*組72.2*乙肝寧組 9.0 1077.1±29.4 184.6±155.6±52.1*65.8*注▲與正常組相比P＜0.05 與感染前相比，*P＜0.05表4肝得康對(duì)鴨血清ALP值(u/L)的影響(X±S)組別 劑量 動(dòng)物數(shù)小鴨日齡(g/kg)(只)1 7 42空白組 - 10 338.6±326.1 ±352.7±238.9132.5 256.1模型組 - 10 355.5±705.4 ±717.4±254.6▲211.9 249.3▲肝得康1 56.0 10 461.3±695.5 ±542.8±251.8組 208.7 238.0*肝得康2 28.0 10 343.8±679.6 ±608.3±223.1*組 227.4 225.2*肝得康3 14.0 10 392.3±691.52±612.2±245.1*組 223.9 46.7*乙肝寧組 9.0 10 375.6±684.3 ±611.6±221.0*234.5 227.6*注▲與正常組相比P＜0.05與感染前相比，*P＜0.05
表5肝得康顆粒對(duì)鴨血清T-Bili值(u/L)的影響(X±S)組別劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù) 小鴨日齡(只) 1 7 42空白組 - 10 2.42±1.12 2.38±1.03 3.01±1.53模型組 - 10 2.60±3.31 9.20±3.91▲▲8.95±3.11▲▲肝得康1 56.0 10 2.84±1.45 10.4± 6.09±3.05*組3.11**肝得康2 28.0 10 3.06±2.24 8.8±3.18** 5.98±3.51組肝得康3 14.0 10 2.79±1.98 7.94± 6.82±3.17*組3.18**乙肝寧組9.0 10 2.81±2.03 7.69± 6.73±3.26*2.58**注▲▲與正常組相比P＜0.01與模型組相比，**P＜0.01*P＜0.05表2、3、4、5提示，肝得康顆粒給藥42天后，病毒感染鴨子血清AST、ALT、T-Bili水平均有不同程度的下降，表明肝得康顆粒具有一定的降酶和降膽紅素作用。
4.小結(jié)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明，肝得康顆粒有一定的抗乙型肝炎病毒作用。鴨乙型肝炎病毒感染實(shí)驗(yàn)表明肝得康顆粒具有一定的降血清AST、ALT、ALP和T-Bili作用。
實(shí)施例4.肝得康顆粒對(duì)四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用1.材料1.1動(dòng)物SD大鼠，體重140-180克，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證蘇動(dòng)(質(zhì))970031.2藥品與試劑肝得康顆粒干浸膏(批號(hào)2000802)，每g含生藥5.5g，口服，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供。
乙肝寧顆粒(批號(hào)000321)廣西半宙制藥股份有限公司丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、
天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒白蛋白試劑盒、總蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所四氯化碳(CCl4)上海長(zhǎng)江化學(xué)試劑廠1.3儀器Vital-200全自動(dòng)生化分析儀器，荷蘭威圖科學(xué)儀器公司奧林巴斯顯微鏡，日本2.方法2.1分組給藥取健康SD大鼠96只，雌雄各半，隨機(jī)分為六組，每組16只。六組分別為(1)正常組；(2)模型組10ml/kg空白；(3)肝得康顆粒低劑量組給予肝得康顆粒14.0g生藥/kg體重；(4)肝得康顆粒中劑量組給予肝得康顆粒28.0g生藥/kg體重；(5)肝得康顆粒高劑量組給予肝得康顆粒42.0g生藥/kg體重；(6)半宙乙肝寧組給予半宙乙肝寧顆粒4.5g/kg體重。除(1)組外，其余各組每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥2個(gè)月。
2.2大鼠造模及觀察指標(biāo)大鼠皮下注射10％四氯化碳橄欖油溶液5ml/kg體重，每周2次，連續(xù)6周。觀察大鼠死亡情況。各組存活大鼠在最后一次給藥1小時(shí)后眼眶取血，測(cè)定血清ALT、AST、ALP、T-Bili、總蛋白、白蛋白。取血后，大鼠頸椎脫臼處死，立即取出肝臟，用10％甲醛溶液固定，用作光鏡檢查。
2.3肝臟病理組織學(xué)檢查取大鼠肝臟10％福爾馬林固定，取材，脫水，石蠟包埋。切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察(1)有無肝細(xì)胞變性。變性有兩種類型，如胞漿疏松、淡染則為肝細(xì)胞水腫，如胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的張力空泡則為肝細(xì)胞脂肪變性；(2)有無肝細(xì)胞壞死。壞死的肝細(xì)胞表現(xiàn)為核固縮、核碎裂、核溶解或細(xì)胞體積變小、胞漿紅染、核消失既嗜酸性小體；(3)肝竇瘀血；(4)有無炎細(xì)胞浸潤(rùn)；(5)門管區(qū)有無擴(kuò)大及組織增生。損傷由輕到重的程度分為輕度、中度、重度、極重度，分別標(biāo)記“+、++、+++、++++”，無損傷為“-”。
3.結(jié)果3.1肝得康顆粒對(duì)造模大鼠存活率的影響大鼠經(jīng)四氯化碳造成肝損傷后6周內(nèi)，各造模組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的死亡。肝得康顆粒三個(gè)劑量組大鼠存活率高于模型組，提示其有一定的提高造模大鼠存活率作用。見表6。
表6肝得康顆粒對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠存活率的影響組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg) 死亡數(shù)(只)存活率(％)正常組 12 -0 100模型組 16 -7 56.25▲▲肝得康1組 16 14.0 4 75.00肝得康2組 16 28.0 3 81.25肝得康3組 16 42.0 2 87.50乙肝寧組 16 4.5 1 68.75注▲▲與正常組相比P＜0.013.2肝得康顆粒對(duì)大鼠血清ALT、AST、ALP的影響大鼠經(jīng)四氯化碳造成慢性肝損傷后，肝功能出現(xiàn)明顯的異常。肝得康顆粒三個(gè)劑量均能明顯降低造模大鼠的異常升高的血清AST、ALT、ALP和T-Bili水平，表明肝得康顆粒具有一定的保肝降酶作用。見表7。
表7肝得康顆粒對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP的影響(X±S)組別 動(dòng)物數(shù) 劑量AST(u/L)ALT(u/L) ALP(u/L)T-Bili(只)(g/kg) (umol/L)正常組12 - 26.8±6.4 18.5±4.2184.3±46.7 9.4±3.2模型組9- 247.4±86.1▲▲621.0±167.2▲▲569.2±103.2▲▲19.2±5.3▲▲肝得康1 12 14.0231.5±73.5 408.3±329.6 ±9.8±6.2**組 110.4* 84.1**肝得康2 13 28.0125.6±46.9*369.4±86.6* 387.9 ±10.4±7.7*組 101.9**肝得康3 14 42.0118.4±33.2*357.2±294.5 ±8.4±4.9**組 79.4** 121.4*乙肝寧組 11 4.5 135.6±44.7*394.5±325.7 ±10.2±6.6*105.8* 133.0*注▲▲與正常組相比P＜0.01與模型組相比，**P＜0.01*P＜0.05
3.3肝得康顆粒對(duì)四氯化碳所致慢肝損傷大鼠血清總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比例的影響。
大鼠經(jīng)四氯化碳造成慢性有損傷后，血清總蛋的和白蛋折含量明顯下降，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的白蛋白/球蛋白比例失調(diào)。肝得康顆粒三個(gè)劑量均能阻止造模大鼠血清總蛋白和白蛋白含量的下降以及白蛋白/球蛋白比例失調(diào)。見表8表8肝得康顆粒對(duì)四氯化碳所致慢肝損傷大鼠血清總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比例的影響(X±S)組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 總蛋白(g/L)白蛋白 白蛋白/球蛋(只) (g/kg)(g/L) 白正常組 12 - 81.4±15.3 58.3±14.9 2.5±0.81模型組 9 - 53.9±11.6▲▲33.5±6.2▲1.6±0.64▲肝得康1組12 14.0 67.2±13.5*46.1±7.3*2.1±0.72肝得康2組13 28.0 69.5±12.7*47.0±9.4*2.0±0.69肝得康3組14 42.0 72.3±9.8* 52.5±8.7*2.4±0.93*乙肝寧組 11 4.569.3±12.1*49.5±9.1*2.3±0.86**注▲與正常組相比P＜0.01與模型組相比，*P＜0.05實(shí)施例5.肝得康顆粒對(duì)D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝損傷的護(hù)肝作用1.材料1.1動(dòng)物SD大鼠，體重140-180克，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供1.2藥品與試劑肝得康顆粒干浸膏(批號(hào)2000802)，每g含生藥5.5g，口服，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供。
乙肝寧顆粒(批號(hào)000321)廣西半宙制藥股份有限公司丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒 南京建成生物工程研究所D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，HCL)(批號(hào)990108)南京美好生物工程研究所1.3儀器Vital-200全自動(dòng)生化分析儀器，荷蘭威圖科學(xué)儀器公司奧林巴斯顯微鏡，日本2.方法2.1分組給藥取健康SD大鼠96只，雌雄各半，隨機(jī)分為六組。六組分別為(1)正常組；(2)模型組10ml/kg空白；(3)肝得康顆粒1組給予肝得康顆粒14.0g生藥/kg體重；(4)肝得康顆粒2組給予肝得康顆粒28.0g生藥/kg體重；(5)肝得康顆粒3組給予肝得康顆粒42.0g生藥/kg體重；(6)半宙乙肝寧組給予半宙乙肝寧顆粒4.5g/kg體重。
2.2大鼠造模及觀察指標(biāo)除(1)組外，其余各組每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥十天，在給藥的第九天，每鼠腹腔注射D-氨基半乳糖900mg/kg。觀察大鼠死亡情況。各組存活大鼠在48小時(shí)后眼眶取血，測(cè)定血清ALT、AST、ALP、T-Bili。取血后，大鼠頸椎脫臼處死，立即取出肝臟，用10％甲醛溶液固定，用作光鏡檢查。
2.3肝臟病理組織學(xué)檢測(cè)取大鼠肝臟10％福爾馬林固定，取材，脫水，石蠟包埋。切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察(1)有無肝細(xì)胞變性。變性有兩種類型，如胞漿疏松、淡染則為肝細(xì)胞水腫，如胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的張力空泡則為肝細(xì)胞脂肪變性；(2)有無肝細(xì)胞壞死。壞死的肝細(xì)胞表現(xiàn)為核固縮、核碎裂、核溶解或細(xì)胞體積變小、胞漿紅染、核消失既嗜酸性小體；(3)肝竇瘀血；(4)有無炎細(xì)胞浸潤(rùn)；(5)門管區(qū)有無擴(kuò)大及組織增生。損傷由輕到重的程度分為輕度、中度、重度、極重度，分別標(biāo)記“+、++、+++、++++”，無損傷為“-”。
3.結(jié)果3.1肝得康顆粒對(duì)造模大鼠存活率的影響大鼠經(jīng)D-氨基半乳糖造成急性肝損傷后，各造模組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的死亡，肝得康顆粒高、中劑量組存活率高于模型組，表明肝得康顆粒有提高造模大鼠存活率作用。見表9。
表9肝得康顆粒對(duì)D-氨基半乳糖所致急性肝損傷大鼠存活率的影響組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg)死亡數(shù)(只)存活率(％)正常組 12 - 0 100.0模型組 16 - 4 75.0▲肝得康1組16 14.0 4 75.0肝得康2組16 28.0 3 81.3肝得康3組16 42.0 0 100.0*乙肝寧組 16 4.5 3 81.3注▲與正常組相比P＜0.01與模型組相比，**P＜0.05
3.2肝得康顆粒對(duì)大鼠血清ALT、AST、ALP的影響大鼠經(jīng)D-氨基半乳糖造成急性肝損傷后，肝功能明顯異常，肝得康顆粒三個(gè)劑量均能明顯降低造模大鼠血清AST、ALT、ALP水平，表明肝得康有一定的保肝降酶作用。見表10。
表10肝得康顆粒對(duì)D-氨基半乳糖所致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP的影響組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 ASTALT ALP(只) (g/kg)(u/L) (u/L) (u/L)正常組 12 - 136.7±69.242.6±7.2 184.6±41.6模型組 12 - 637.2±210.1▲▲754.6±406.1±200.7▲▲295.2▲▲肝得康1 12 14.0 421.6±146.4 567.1±335.4±195.6組 267.1肝得康2 13 28.0 321.5±127.5* 334.2±249.1±94.5**組 169.4*肝得康3 16 42.0 248.9±115.9* 219.5±307.4±154.1組 174.6**乙肝寧組 13 4.5 332.4±157.3 372.4±315.2±167.8202.4*注▲▲與正常組相比P＜0.01與模型組相比，**P＜0.01*P＜0.05實(shí)施例6.肝得康顆粒對(duì)小鼠免疫功能的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠 體重18-22g，雌雄各半，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證蘇(動(dòng))質(zhì)970031.2藥品與試劑肝得康顆粒干浸膏(批號(hào)2000802)，每g含生藥5.5g，口服，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供。
乙肝寧沖劑(批號(hào)000312) 廣西半宙制藥有限公司甲醛(批號(hào)971289) 南京化學(xué)試劑廠小牛血清 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司綿羊紅細(xì)胞 南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
L-谷氨酰胺(2000405) 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司2.方法與結(jié)果2.1肝得康顆粒對(duì)小腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響取小鼠80只，體重18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組。各組按表2劑量分別按20ml/kg灌胃給藥，每天一次，連續(xù)15天。最后一次給藥后1小時(shí)，每只小鼠腹腔注射10％蛋白胨0.2ml，32小時(shí)后腹腔注射2％的新鮮雞紅細(xì)胞0.2ml，30分鐘后，脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，洗出腹腔液，置試管中，37℃水浴中溫存15min，隔5min搖動(dòng)一次，離心，棄上清液。取紅細(xì)胞懸液涂片，自然干燥后，用甲醛固定10min，再用姬姆薩染色7min，油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞。以巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)為指標(biāo)來表示藥物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果見表11。
表11肝得康顆粒對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(X±S)組別 劑量(g/kg) 吞噬百分率(％) 吞噬指數(shù)空白組 34.42±2.09 0.53±0.04肝得康1組56 54.29±5.99** 1.10±0.10**肝得康2組28 50.13±6.40** 0.96±0.11**肝得康3組14 40.83±7.89*0.85±0.15**乙肝寧組 10 48.17±6.78** 0.97±0.10**注與空白組相比*P＜0.05**P＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝得康顆粒三個(gè)劑量組均能明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)，與空白組相比，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01＝，提示肝得康顆粒能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
2.2肝得康顆粒對(duì)小鼠空斑形成細(xì)胞(PFC)數(shù)的影響取小鼠80只，體重18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組。各組按表3劑量分別按20ml/kg灌胃給藥，每天一次，連續(xù)10天。于給藥第6天，每鼠腹腔注射5綿羊紅細(xì)胞0.2ml，4天后放血處死，用PBS制成5×106脾細(xì)胞懸液。取0.5ml此懸液，加入0.2％綿羊紅細(xì)胞和1∶10豚鼠血清各0.5ml，混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白對(duì)照組，置37℃水浴中溫育1小時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心5min。取上清液在波長(zhǎng)413nm處測(cè)定其上清液中紅細(xì)胞裂解釋放的血紅蛋白(以O(shè)D值表示)，結(jié)果見表12。
表12肝得康顆粒對(duì)小鼠空斑形成細(xì)胞的影響(X±S)組別 劑量(g/kg) PFC溶血值(OD值)空白組 20ml/kg 0.41±0.03肝得康1組56 0.53±0.07**肝得康2組28 0.52±0.04**肝得康3組14 0.50±0.02**乙肝寧組 10 0.51±0.30**注與空白組相比*P＜0.05**P＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝得康顆粒三個(gè)劑量組均能使小鼠PFC數(shù)增加。
2.3肝得康對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響取小鼠80只，體重18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組。各組按表4劑量分別按20ml/kg灌胃給藥，每天一次，連續(xù)15天。最后一次給藥后1小時(shí)，小鼠眼球采血，用肝素抗凝。取0.1ml加入1.8ml滅菌的RPM11640(含20％小牛血清30.0g/L L-谷氨酰胺1.0ml)再加入PHA0.1ml，置37℃水浴中溫育三天，每天搖動(dòng)一次，取出后吸出大部分血清，加入8.5g/LNH4CL4ml，混勻后置37℃水浴中10min，2500×g離心10min，棄上清液。沉淀物輕輕搖勻后滴加于玻片上，使其均勻鋪開，自然干燥后用Giemsa染色，油鏡下觀察200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算其母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果見表13。
表13肝得康顆粒對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響(X±S)組別 劑量(g/kg) 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(％)空白組 20ml/kg25.8±10.31肝得康1組56 37.5±9.99**肝得康2組28 29.8±8.22**肝得康3組14 22.6±5.94乙肝寧組 10 23.7±6.94注與空白組相比*P＜0.05**P＜0.01
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝得康顆粒高劑量能提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，與空白組比較，有顯著性差異。
2.4肝得康顆粒對(duì)小鼠免疫器官重量的影響取小鼠80只，隨機(jī)分成五組。各組按表1劑量分別按20ml/kg灌胃給藥，每天一次，連續(xù)15天。最后一次給藥后1小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，摘取胸腺、脾臟，即刻稱重。計(jì)算每20g體重的器官重量。結(jié)果見表14。
表14肝得康顆粒對(duì)小鼠免疫器官重量的影響(X±S)組別劑量(g/kg)器官重量(mg/20g)脾臟 胸腺空白組72.44±2.98 26.61±1.30肝得康1組56 77.29±3.81**32.91±3.43**肝得康2組28 75.66±3.43* 32.24±3.41**肝得康3組14 74.39±2.91 30.39±3.27**乙肝寧組 10 75.46±3.50* 32.44±3.38**注與空白組相比*P＜0.05**P＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝得康顆粒高、中低劑量組可使小鼠胸腺和脾臟增重，與空白組相比，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01，提示肝得康顆?？稍黾有∈竺庖咂鞴僦亓?，有一定的免疫增強(qiáng)作用。
3.小結(jié)肝得康顆粒能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增加正常小鼠免疫器官重量，提示具有一定的免疫增強(qiáng)作用。
實(shí)施例7.用肝得康治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床試驗(yàn)治療方法1、治療組用肝得康，每次1包(15g/包)，1日3次，口服。
2、對(duì)照組(1)戊環(huán)鳥苷1次0.3克，1日3次，口服，或每日75-100毫克，靜脈注射，1日1次。
(2)云芝多糖1次1包，1日3次，口服。
3、療程兩組均以3個(gè)月為1療程。
療效結(jié)果1、總療效比較肝得康組基本治愈率68.29％，總有效率93.66％；對(duì)照組基本治愈率6％，總有效率79％。P均＜0.01。
2、藥后肝得康組、對(duì)照組兩對(duì)半變化比較肝得康組HbsAg轉(zhuǎn)陰率34.95％，HbeAg轉(zhuǎn)陰率62.12％，抗-HBc轉(zhuǎn)陰率47.05％；對(duì)照組分別為4％、6％、1.45％，P均＜0.01。
3、藥后肝得康組、對(duì)照組血肝功能復(fù)常率肝得康組ALT 96.78％r-GT 86.71％TBIL 100％；對(duì)照組分別為78％、75％、86％。P均＜0.01。
4、藥后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率肝得康組50％；對(duì)照組3.45％。P＜0.01。
權(quán)利要求
1.一種冶療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑，其特征在于它是由下列重量配比的原料所制成的藥劑太子參5-30克 枸杞子5-30克 白術(shù)5-30克 茯苓5-30克 虎杖5-40克 半枝蓮10-40克 垂盆草10-70克 赤芍8-20克 蒼術(shù)5-20克 蛇舌草10-40克 苦參5-15克 甘草2-15克
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑，其特征在于所說的制劑是藥劑學(xué)上所說的任何一種劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑，其特征在于所說的制劑是顆粒劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的冶療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其步驟如下①取苦參，加乙醇浸泡后，加熱回流提取，提取液濾過，濾液減壓回收乙醇，并濃縮得濃縮液I，備用；②取炒白術(shù)、炒蒼術(shù)，加水浸泡后，用水蒸汽蒸餾得蒸餾液，冷卻，分離，得揮發(fā)油，備用；③將藥渣與太子參、枸杞子、虎仗等9味藥，加水浸泡，煎煮，把煎液高速離心，取上清液，濃縮得濃縮液(II)，備用；④合并上述濃縮液I、II，混勻，真空干燥，得干浸膏，粉碎成細(xì)粉(IV)，備用；⑤取上述炒白術(shù)等的揮發(fā)油，加入適量的輔料I后包合，低溫干燥得(III)；⑥將上述III、IV合并混勻，加入適量的輔料II后，干法制粒，整粒，檢驗(yàn)，分裝，即得(1000克)顆粒劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其特征是步驟(1)中乙醇的濃度為60-95％，用量為8-10倍處方量，浸泡24-48小時(shí)，加熱提取2-3次，濃縮液相對(duì)密度1.00-2.00(40-60℃)；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療慢性乙型肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其特征是步驟(2)中加水浸泡1-4小時(shí)，冷卻至4℃-6℃，24-48小時(shí)后分離；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其特征是步驟(3)中加水浸泡1-2小時(shí)后，煎煮2次，濃縮至相對(duì)密度1.00-2.00(40-60℃)；
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方制劑的制備方法，其特征是所述的輔料I為β-環(huán)糊精，輔料II為硬脂酸鎂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冶療慢性乙型肝炎的復(fù)方制劑，它是以太子參、枸杞子、白術(shù)、茯苓、虎仗、半枝蓮、垂盆草、赤芍、蒼術(shù)、蛇舌草、苦參、甘草為原料，按重量比例配制，并根據(jù)每味藥的不同特性，分別用乙醇或水浸泡后，回收提取，或煎煮離心，濃縮、干燥、粉碎加輔料后，干法制粒，得到肝得康顆粒劑，該制劑經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)和臨床應(yīng)用，具有明顯調(diào)養(yǎng)肝脾，清化濕熱瘀毒作用，總有效率為93.66％，基本治愈率為68.29％，與同類藥物比較，療效十分顯著。
文檔編號(hào)A61K9/16GK1555819SQ20031011280
公開日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者周仲瑛, 金妙文 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)