專利名稱：一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽及其篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)具有多種生物學(xué)活性的一種重要的多肽生長(zhǎng)因子，也是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族目前已知的19個(gè)成員中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的因子。它通過自分泌或/和外分泌形式與其受體結(jié)合，對(duì)多種細(xì)胞有不同程度的促有絲分裂作用，在促進(jìn)血管形成、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、矽肺形成以及在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)bFGF在惡性腫瘤組織中有強(qiáng)烈表達(dá)，并與腫瘤病理分級(jí)、分期呈正相關(guān)，同時(shí)血清中bFGF水平亦明顯增高，這提示bFGF表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤惡性程度增高、侵襲力增強(qiáng)有密切關(guān)系，可作為惡性腫瘤的早期診斷與愈后指標(biāo)。bFGF在血管新生腫瘤形成過程中的作用尤其引起研究者們的重視。
噬菌體展示技術(shù)(Phage Display Technology)在20世紀(jì)80年代中期產(chǎn)生，Smith Georgep第一次描述了在絲狀噬菌體表面展示外源多肽片段的原理。該辦法主要是用DNA重組技術(shù)將大量的多肽編碼順序?qū)耸删w的衣殼蛋白基因中，從而使表達(dá)出的各種多肽以與PIII或PVIII蛋白融合的形式出現(xiàn)在噬菌體的表面，即首先構(gòu)建噬菌體多肽展示文庫(kù)。近年來，在識(shí)別蛋白或受體的小肽順序的鑒定上、在結(jié)構(gòu)和功能上模擬已知蛋白的多肽模擬物的研究上、在篩選鑒定能與人類病毒、細(xì)胞、組織及腫瘤等生物靶系統(tǒng)結(jié)合的多肽研究日益增加。噬菌體多肽展示庫(kù)提供了這樣的可能勝可從多肽展示庫(kù)中分離出一個(gè)能與重要蛋白如與炎癥有關(guān)的抗體、與介導(dǎo)細(xì)胞粘著的整合蛋白等特異性結(jié)合已具有相應(yīng)生物活性的多肽。特別是有可能發(fā)現(xiàn)一些多助配基而導(dǎo)致多肽模擬藥物的產(chǎn)生。
噬菌體肽庫(kù)是噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)非常重要的分支。肽庫(kù)是由大量帶有不同肽段的單個(gè)噬菌體組成的重組噬菌體庫(kù)。噬菌體肽庫(kù)的基本原理是將隨機(jī)肽段插入到噬菌體衣殼蛋白上形成融合蛋白而展示出來，并利用噬菌體能大量復(fù)制的特點(diǎn)，得到不同重組噬菌體的多拷貝，為不同的研究提供有利的工具。通過目標(biāo)受體來篩選與其相互作用的噬菌體肽，經(jīng)過洗脫、擴(kuò)增，從而富集到特異性的重組噬菌體，并分析所篩選到的肽的結(jié)構(gòu)和序列，為蛋白質(zhì)分子之間(如抗原與抗體、受體與配體、酶與底物)的相互作用機(jī)理提供理論依據(jù)。噬菌體肽庫(kù)技術(shù)應(yīng)用范圍很廣，可用于表位的確定、描述蛋白之間的作用、確定非蛋白配體的蛋白模擬表位、受體的活性作用分子篩選、酶底物的確立、分析DNA結(jié)合蛋白等，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣，其技術(shù)也得到了充分發(fā)展。
Baird等1988年發(fā)現(xiàn)含有bFGF的25-69和24-12l位氨基酸殘基的兩個(gè)肽序列可競(jìng)爭(zhēng)bFGF與受體結(jié)合。更小的肽定位于bFGF的35-51和107-116位氨基酸殘基的兩段區(qū)域，也可競(jìng)爭(zhēng)bFGF與受體結(jié)合。Kurokawa等1989年研究證明，bFGF親受體位點(diǎn)在105-115位氨基酸序列上。Ray等1997年認(rèn)為，bFGF的68-77位氨基酸序列為bFGF在神經(jīng)祖細(xì)胞上與受體結(jié)合的表位。因此，如果能用噬菌體展示技術(shù)，研究模擬小肽競(jìng)爭(zhēng)與bFGF受體結(jié)合或小分子抗原肽作為疫苗，針對(duì)bFGF而產(chǎn)生抑制作用，將具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽，是一種利用噬菌體展示技術(shù)和抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體結(jié)合篩選的7肽。
本發(fā)明所述的一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽，其多肽序列為L(zhǎng)eu Pro Leu Gly His Ile Lys，即LPLGHIK。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法。該篩選方法是為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選而特別設(shè)計(jì)的，選擇噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)在ELISA板上進(jìn)行精確的篩選。
本發(fā)明所述的一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法，包括以下步驟A.將稀釋的抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體包被ELISA板，4℃過夜，加入BSA封閉緩沖液4℃封閉2-3小時(shí)，用TBS-Tween(Tris緩沖液-吐溫)洗滌，吸干液體；B.每孔加入用TBS-吐溫溶液稀釋的噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，使加入噬菌體數(shù)量為2×1011pfu/100μl，室溫下?lián)u晃7小時(shí)，吸去液體，用TBS-吐溫溶液洗去非特異性結(jié)合的噬菌體；C.用TBS-吐溫溶液稀釋使含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子800ng/ml，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫，收集洗脫液；D.收集的噬菌體洗脫液經(jīng)計(jì)數(shù)、擴(kuò)增后，重復(fù)進(jìn)行A至C步驟的篩選，在第二輪和第三輪篩選中，改變TBS-吐溫溶液中的吐溫濃度，其余同第一輪篩選；E.第三輪篩選的噬菌體擴(kuò)增后隨機(jī)挑選多個(gè)克隆進(jìn)行點(diǎn)雜交檢驗(yàn)和DNA測(cè)序，得到與抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的抗原表位多肽，鑒定多肽序列為L(zhǎng)eu Pro Leu Gly His Ile Lys，即LPLGHIK。
本發(fā)明所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法，通過改變每輪篩選時(shí)的TBS-吐溫溶液中吐溫的濃度，使噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中的與靶分子即抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體結(jié)合的陽性噬菌體遞增，最終得到保守性高的抗原表位多肽序列，其優(yōu)選方式是第一輪篩選時(shí)的TBS-吐溫溶液中吐溫的濃度為0.1％，第二輪和第三輪篩選時(shí)的用于洗滌的TBS-吐溫溶液中吐溫的濃度為0.5％。
本發(fā)明所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法，另一特點(diǎn)是選用了噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，這樣篩選得到的噬菌體多肽為7個(gè)氨基酸的序列，經(jīng)檢驗(yàn)和分析，該肽可模擬155個(gè)氨基酸組成的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的性質(zhì)，鑒定為特異性強(qiáng)、親和力高的抗原表位多肽。之所以選用了噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，一者避免長(zhǎng)肽鏈可能導(dǎo)致的空間折疊構(gòu)象的影響，二者肽鏈過短也使特異性和親和力降低。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選得到的7肽，已具備與抗bFGF單克隆抗體結(jié)合的較強(qiáng)的特異性和較高的親和力。
點(diǎn)雜交把每輪篩選洗脫的噬菌體作單個(gè)克隆擴(kuò)增，用點(diǎn)雜交的方法檢驗(yàn)陽性率。用野生型噬菌體vesm13作陰性對(duì)照。與陰性對(duì)照顏色一致的克隆可視為陰性。點(diǎn)雜交結(jié)果顯示，除第一輪篩選第一次洗脫3個(gè)克隆與陰性結(jié)果顏色相近外，其余的都比陰性對(duì)照顏色深，表明噬菌體上的隨機(jī)態(tài)能與抗bFGF單抗GF22結(jié)合。
測(cè)序經(jīng)三輪篩選后，取最后一次洗脫的10個(gè)噬菌體克隆擴(kuò)增后，提取單鏈DNA，用引物5’HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)各七肽噬菌體克隆有相同的氨基酸序列Leu Pro Leu Gly His Ile Lys(LPLGHIK)，表明該抗原表位有很保守的氨基酸序列，該抗原表位模擬肽序列與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)上22-27位氨基酸(PPGHFK)有57％同源性。這表明抗bFGF單抗GF22可結(jié)合此抗原表位。
競(jìng)爭(zhēng)ELISA取含有抗原表位模擬肽LPLGHIK的噬菌體克隆作競(jìng)爭(zhēng)ELISA，確定此肽與抗bFGF單抗GF22的結(jié)合為抗體-抗原的方式。用野生型噬菌體vesm13作陰性對(duì)照，由于在其gIII蛋白N-端沒有GF22的抗原表位，vesm13與bFGF沒有競(jìng)爭(zhēng)與GF22結(jié)合。結(jié)果表明，含有序列LPLGHIK的噬菌體克隆表現(xiàn)出明顯的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線。
噬菌體陽性克隆序列的免疫原性分析用帶有序列LPLGHIK的噬菌體克隆進(jìn)行免疫。陽性對(duì)照小鼠用bFGF免疫。噬菌體的免疫量為10ng bFGF(1012個(gè)分子)。由于噬菌體和bFGF的免疫量大致都在同一個(gè)摩爾數(shù)量級(jí)，所以免疫效果可作比較。結(jié)果表明，以免疫bFGF小鼠的血清抗bFGF的平均活性作為100％，則免疫含有LPLGHIK肽的小鼠血清相當(dāng)于原bFGF的33％，免疫vesm13小鼠血清抗bFGF的平均活性為0。在免疫bFGF的小鼠中90％抗bFGF活性超過對(duì)照，免疫帶有LPLGHIK序列陽性噬菌體的小鼠抗bFGF活性有80％。
細(xì)胞免疫組化及免疫熒光分析用細(xì)胞免疫組化及免疫熒光技術(shù)，對(duì)篩選所得的能模擬bFGF抗原表位(決定簇)的噬菌體肽LPLGHIK與NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體進(jìn)行間接的親和性分析。結(jié)果表明，含有LPLGHIK七肽的噬菌體克隆能結(jié)合到NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體，此噬菌體能作為檢測(cè)FGF受體的特異標(biāo)記。免疫熒光與細(xì)胞免疫組化的結(jié)果一致，表明所檢測(cè)的噬菌體陽性克隆序列免疫原能結(jié)合NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體。
以上鑒定實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽，可以作為一個(gè)較佳的抗原以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗bFGF活性。
抗原表位并不總是對(duì)應(yīng)于一個(gè)蛋白中的線性氨基酸順序，抗體能識(shí)別一個(gè)間斷的決定簇所折疊的蛋白的特殊的構(gòu)型。用某種抗體去篩選一個(gè)噬菌體文庫(kù)，產(chǎn)生的多肽將模擬折疊蛋白的結(jié)構(gòu)。這些配基被稱為模擬肽。一個(gè)能展示出適當(dāng)構(gòu)型的小肽，可以替代天然蛋白的功能。隨機(jī)噬菌體展示多肽文庫(kù)，結(jié)合一些其他方法可以提供非常好的程序去研究蛋白的有效的模擬物以及有活性的最小的肽段順序，如多肽激素EPO和TPO的模擬多肽對(duì)人類疾病有很好的治療作用，14個(gè)氨基酸的環(huán)形的TPO模擬多肽的二聚體有著332個(gè)氨基酸TPO的活性，而13個(gè)氨基酸構(gòu)成的模擬配基可模擬162個(gè)氨基酸組成的EPO的性質(zhì)。
本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，通過與bFGF單克隆抗體篩選陽性克隆，采用梯度洗脫，最終在隨機(jī)7肽庫(kù)中得到了一種能與中和bFGF活性的單克隆抗體GF22結(jié)合的保守序列，即僅7個(gè)氨基酸構(gòu)成的bFGF抗原表位模擬肽，經(jīng)檢驗(yàn)和分析，該肽可模擬155個(gè)氨基酸組成的bFGF的性質(zhì)。通過此肽，可以在bFGF分子上找出該抗原決定簇的位點(diǎn)，分析其序列，以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；同時(shí)檢驗(yàn)這種抗原決定簇能否作為一種免疫抗原誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生能與bFGF結(jié)合的抗體，以及該抗原決定簇是否直接結(jié)合到bFGF受體上，尋找比天然bFGF分子有更強(qiáng)抗原性的多肽序列，為進(jìn)行多肽疫苗的設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
將序列LPLGHIK與人源bFGF分子作比較，在天然bFGF分子上所對(duì)應(yīng)的序列是21-27位氨基酸FPPGHFK，該定位序列高度保守。兩序列非常相似，有57％同源性，并且以一個(gè)亮氨酸代替了天然分子上的苯丙氨酸，而亮氨酸與苯丙氨酸的性質(zhì)類似，都是一個(gè)大的疏水氨基酸，所以可以認(rèn)為近似序列LPLGHIK所引起的免疫反應(yīng)能反映由bFGF分子上相應(yīng)序列所引起的免疫反應(yīng)。
bFGF的生物學(xué)效應(yīng)，包括在病理?xiàng)l件下參與多種腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤血管的新生，加速腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，所以抑制bFGF的生物活性有可能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。然而，重組抗體用于治療的缺點(diǎn)是抗體的異源性和用量太大，而噬菌體展示技術(shù)篩選到具有抑制bFGF生物學(xué)活性的單克隆抗體個(gè)體型抗原表位，并具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制bFGF受體結(jié)合或具有疫苗特點(diǎn)的模擬肽誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗bFGF抗體，是抑制bFGF生物學(xué)活性的合理途徑。
bFGF發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵是與其受體結(jié)合，阻礙bFGF與其受體結(jié)合就能完全抑制bFGF的活性。能中和bFGF生物活性的單克隆抗體很大程度上可能是結(jié)合在bFGF受體結(jié)合區(qū)域。所以，用該抗體作為目標(biāo)篩選到的肽就很有可能可以直接結(jié)合到bFGF受體上。本發(fā)明所述的能模擬bFGF抗原決定簇的噬菌體肽，與bFGF受體進(jìn)行親和性分析，對(duì)于以bFGF受體為目標(biāo)，診斷、預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、探討小分子肽作為腫瘤血管生長(zhǎng)抑制劑和腫瘤導(dǎo)向藥物等研究都有十分重要的參考價(jià)值。


圖1是競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖。其中1LPLGHIK(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽)；2野生型噬菌體vesm13。Y軸為OD值(吸光度)，X軸為噬菌體加入量(pfu)。
圖2是噬菌體陽性克隆序列的免疫原性分析的結(jié)果圖。Y軸為OD值(吸光度)，X軸為抗血清稀釋度(Antiserum diIution)。其中1LPLGHIK(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽)；2堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)；3野生型噬菌體vesm13。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一(一)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽(LPLGHIK)的篩選1、材料與試劑(1)抗bFGF單克隆抗體GF22，購(gòu)自Calbiochem公司，能抑制bFGF的生物學(xué)活性；(2)偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)-抗噬菌體抗體，購(gòu)自Pharmacia公司；(3)偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自華美公司；(4)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，購(gòu)自New England Biolabs公司，復(fù)雜度為2.8×109。測(cè)序引物購(gòu)自基因公司；(5)昆明小鼠，購(gòu)自廣州第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心；
(6)PEG8000，購(gòu)目華美公司；(7)硝酸纖維膜、IPTG/X-gal，購(gòu)自天象人公司；(8)96孔酶標(biāo)板，購(gòu)自Greiner公司；(9)重組人bFGF(155氨基酸)，暨南大學(xué)生物工程研究所提供。
2、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)抗原表位模擬肽的篩選A.將稀釋的抗bFGF單克隆抗體包被ELISA板，10μg/ml，100μl，4℃過夜，加入BSA封閉緩沖液200μl，4℃封閉2-3小時(shí)，用滅菌的TBS-0.1％吐溫溶液洗3次，每次3分鐘，吸干液體；B.每孔加90μl TBS-0.1％吐溫溶液和10μl噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，使加入噬菌體數(shù)量為2×1011pfu/100μl，室溫下?lián)u晃7小時(shí)，吸去液體，用TBS-0.1％吐溫溶液洗滌10次，每次2分鐘，以洗去非特異性結(jié)合的噬菌體；C.用TBS-0.1％吐溫溶液(pH7.4)稀釋使含bFGF 800ng/ml，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫2次，每次1小時(shí)，收集洗脫液；D.收集的噬菌體洗脫液經(jīng)計(jì)數(shù)、培養(yǎng)液擴(kuò)增后，重復(fù)進(jìn)行A至C步驟的篩選，在第二輪和第三輪篩選中，除洗滌時(shí)用TBS-0.5％吐溫溶液，其余同第一輪篩選；E.第三輪篩選的噬菌體擴(kuò)增后隨機(jī)挑選多個(gè)克隆進(jìn)行點(diǎn)雜交檢驗(yàn)和DNA測(cè)序，得到與抗bFGF單克隆抗體結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的的抗原表位多肽。
(二)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽(LPLGHIK)的鑒定1、點(diǎn)雜交用點(diǎn)雜交的方法檢驗(yàn)陽性率，把每輪篩選洗脫的噬菌體作單個(gè)克隆擴(kuò)增3ml的LB培養(yǎng)液中加入30μl的培養(yǎng)過夜的TG1培養(yǎng)液，挑選單個(gè)噬菌體克隆到培養(yǎng)液中，37℃振搖5小時(shí)，1000rpm離心10分鐘。上清液移入另一離心管中，用20％PEG8000/NaCl沉淀噬菌體，把噬菌體溶于50μlTBS。把1μl噬菌體溶液點(diǎn)在硝酸纖維膜上的小格，室溫干燥。用BSA封閉液封閉1小時(shí)，加入1∶5000的抗bFGF單抗GF22，4℃放置3小時(shí)。用11000HRP-羊抗鼠IgG抗體檢測(cè)，DAB顯色。用野生型噬菌體vesm13作陰性對(duì)照。與陰性對(duì)照顏色一致的克隆可視為陰性。
第一輪和第二輪篩選共6次洗脫，每次洗脫擴(kuò)增20個(gè)克隆，最后一輪篩選每次洗脫擴(kuò)增30個(gè)克隆，共擴(kuò)增210個(gè)克隆。點(diǎn)雜交結(jié)果顯示，除第一輪篩選第一次洗脫3個(gè)克隆與陰性結(jié)果顏色相近外，其余的都比陰性對(duì)照顏色深，表明噬菌體上的隨機(jī)態(tài)能與GF22結(jié)合。
2、測(cè)序經(jīng)三輪篩選后，取最后一次洗脫的10個(gè)噬菌體克隆擴(kuò)增后，提取單鏈DNA，用引物5’HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)各七肽噬菌體克隆有相同的氨基酸序列Leu Pro Leu Gly HisIle Lys(LPLGHIK)，表明該抗原表位有很保守的氨基酸序列，該抗原表位模擬肽序列與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)上22-27位氨基酸(PPGHFK)有57％同源性。這表明抗bFGF單抗GF22可結(jié)合此抗原表位。
3、競(jìng)爭(zhēng)ELISA取含有抗原表位模擬肽LPLGHIK的噬菌體克隆作競(jìng)爭(zhēng)ELISA，確定此肽與抗bFGF單抗GF22的結(jié)合為抗體-抗原的方式。結(jié)果如圖1所示，其中1LPLGHIK(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽)；2野生型噬菌體vesm13。Y軸為OD值(吸光度)，X軸為噬菌體加入量(pfu)。用野生型噬菌體vesm13作陰性對(duì)照，由于在其gIII蛋白N-端沒有GF22的抗原表位，vesm13與bFGF沒有競(jìng)爭(zhēng)與GF22結(jié)合。相反，含有序列LPLGHIK的噬菌體克隆表現(xiàn)出明顯的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線。
4、噬菌體陽性克隆序列的免疫原性分析用帶有序列LPLGHIK的噬菌體克隆進(jìn)行免疫。陽性對(duì)照小鼠用bFGF免疫。噬菌體的免疫量為10ng bFGF(1012個(gè)分子)。由于噬菌體和bFGF的免疫量大致都在同一個(gè)摩爾數(shù)量級(jí)，所以免疫效果可作比較。
結(jié)果如圖2所示，Y軸為OD值(吸光度)，X軸為抗血清稀釋度(AntiserumdiIution)。其中1LPLGHIK(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽)；2堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)；3野生型噬菌體vesm13。以免疫bFGF小鼠的血清抗bFGF的平均活性作為100％，則免疫含有LPLGHIK肽的小鼠血清相當(dāng)于原bFGF的33％，免疫vesm13小鼠血清抗bFGF的平均活性為0。在免疫bFGF的小鼠中90％抗bFGF活性超過對(duì)照，免疫帶有LPLGHIK序列陽性噬菌體的小鼠抗bFGF活性有80％。
5、細(xì)胞免疫組化及免疫熒光分析采用細(xì)胞免疫組化及免疫熒光技術(shù)，對(duì)篩選所得的能模擬bFGF抗原表位(決定簇)的噬菌體肽LPLGHIK與NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體進(jìn)行間接的親和性分析。
結(jié)果表明，含有LPLGHIK七肽的噬菌體克隆能結(jié)合到NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體，此噬菌體能作為檢測(cè)FGF受體的特異標(biāo)記。免疫熒光與細(xì)胞免疫組化的結(jié)果一致，表明所檢測(cè)的噬菌體陽性克隆序列免疫原能結(jié)合NIH3T3細(xì)胞表面的bFGF受體。
實(shí)施例二篩選與鑒定方法與實(shí)施例一同，得到另一保守性強(qiáng)的多肽序列LPPGHFK。本發(fā)明所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的氨基酸序列表(用PatentIn Version 3.1軟件生成，文件為“bFGF抗原表位模擬肽.ST25”)序列表<110>暨南大學(xué)<120>一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽及其篩選<130>
<141>2003-12-01<160>1<170>PatentIn version 3.1
<210>1<211>7<212>PRT<213>噬菌體(M13 Phage)<400>1Leu Pro Leu Gly His Ile Lys1 權(quán)利要求
1.一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽，其特征在于多肽序列為L(zhǎng)eu Pro Leu Gly His Ile Lys，即LPLGHIK。
2.一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟A.將稀釋的抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體包被ELISA板，4℃過夜，加入BSA封閉緩沖液4℃封閉2-3小時(shí)，用TBS-吐溫溶液洗滌，吸干液體；B.每孔加入用TBS-吐溫溶液稀釋的噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，使加入噬菌體數(shù)量為2×1011pfu/100μl，20℃搖晃7小時(shí)，吸去液體，用TBS-吐溫溶液洗去非特異性結(jié)合的噬菌體；C.用TBS-吐溫溶液稀釋使含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子800ng/ml，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫，收集洗脫液；D.收集的噬菌體洗脫液經(jīng)計(jì)數(shù)、培養(yǎng)液擴(kuò)增后，重復(fù)進(jìn)行A至C步驟的篩選，在第二輪和第三輪篩選中，洗滌時(shí)改變TBS-吐溫溶液中的吐溫濃度，其余同第一輪篩選；E.第三輪篩選的噬菌體擴(kuò)增后隨機(jī)挑選多個(gè)克隆進(jìn)行點(diǎn)雜交檢驗(yàn)和DNA測(cè)序，得到與抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的抗原表位模擬肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽的篩選方法，其特征在于第一輪篩選時(shí)的TBS-吐溫溶液中吐溫的濃度為0.1％，第二輪和第三輪篩選時(shí)的用于洗滌的TBS-吐溫溶液中吐溫的濃度為0.5％。
4.如權(quán)利要求1所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬肽用于制備多肽疫苗或者腫瘤血管生長(zhǎng)抑制劑或者腫瘤導(dǎo)向藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于多肽生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于提供一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬短肽及其篩選方法。本發(fā)明所述的一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗原表位模擬短肽，其多肽序列為L(zhǎng)eu Pro Leu Gly His Ile Lys，即LPLGHIK。本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，通過與bFGF單克隆抗體篩選陽性克隆，采用梯度洗脫，最終在隨機(jī)7肽庫(kù)中得到7個(gè)氨基酸構(gòu)成的bFGF抗原表位模擬短肽。本發(fā)明可用于制備多肽疫苗、腫瘤血管生長(zhǎng)抑制劑、腫瘤導(dǎo)向藥物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1546522SQ20031011250
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者向軍儉, 楊紅宇 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)