專利名稱：大黃有效成分在制備增強(qiáng)As的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及大黃有效成分在制備增強(qiáng)三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)在人類早幼粒細(xì)胞白血病的有效應(yīng)用引起了研究者和臨床醫(yī)生的廣泛關(guān)注(Wang Z.Y.，2001，Arsenic compounds as anticancer agents.Cancer chemother.Pharmacol.，48 suppl 1S72-76)，但是不同腫瘤細(xì)胞對As2O3的易感性差別很大。體外研究表明來源于人早幼粒細(xì)胞白血病的細(xì)胞株NB4對As2O3十分敏感，而同樣來源于人類白血病的U937、HL60細(xì)胞對相同劑量的As2O3就不夠敏感，實(shí)體瘤細(xì)胞株則大多較不敏感(Bode A.M.& Z.GDong，2002，The paradox of arsenicmolecular mechanisms of celltransformation and chemotherapeutic effects.Crit.Rev.Oncol.Hematol.，42(1)5-24)。另外，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外敏感性差異很大，許多腫瘤細(xì)胞在體外能夠被As2O3有效誘導(dǎo)凋亡，而在臨床應(yīng)用中卻反應(yīng)不敏感。這些問題無疑都限制了該藥的進(jìn)一步應(yīng)用。
很多工作提示As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡涉及細(xì)胞活性氧(reactiveoxygen species，ROS)水平的升高(Jing Y.，J.Dai，R.M.Chalmers-Redman，W.G. Tatton & S.Waxman，1999，Arsenic trioxideselectively induces acute promyelocytic leukemia cell apoptosis via ahydrogen peroxide-dependent pathway.Blood，94(6)2102-2111)，(ChenY.C.，S.Y. Lin-Shiau & J.K.Lin，1998，Involvement of reactive oxygenspecies and caspase 3 activation in arsenite-induced apoptosis. J. CellPhysiol.，177324-333)。本發(fā)明人前期研究則表明，腫瘤細(xì)胞對As2O3As2O3敏感性的差異與細(xì)胞固有活性氧水平差異有關(guān)，而且提高活性氧能增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)的凋亡(Yi J.，F(xiàn).Gao，G. Shi，H.Li，Z.Wang，X.Shi& X.Tang，2002，The inherent cellular level of reactive oxygen speciesone of the mechanisms determining apoptotic susceptibility of leukemiacells to arsenic trioxide.Apoptosis，7(3)209-215)，(Gao F.，J.Yi，G.Y.Shi，H.Li，X.G. Shi & X.M.Tang，2002，The sensitivity of digestive tracttumor cells to As2O3is associated with the inherent cellular level ofreactive oxygen species. World J. Gastroenterol.，836-39)。ROS是細(xì)胞中一類氧的單電子還原產(chǎn)物，以往人們只注意到其氧化損傷作用，新近越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)它可能介導(dǎo)了細(xì)胞對外界刺激或自身病理狀態(tài)下的生死調(diào)控(Martindale J.L. & N.J.Holbrook，2002，Cellularresponse to oxidative stresssignaling for suicide and survival.J.cellPhysiol.，192(1)1-15)，(Liu Y.W.，T.Sakaeda，K.Takara，T.Nakamura，N.Ohmoto，C.Komoto & H.Kobayashi，2003，Effects of reactiveoxygen species on cell proliferation and death in Hela cells and itsMDRl-overexpressing derivative cell line.Biol.Pharm.Bull.，26(2)278-281；Karin M. & E.Shaulian，2001，AP-1Linking hydrogenperoxide and oxidative stress to the control of cell proliferation and death.IUBMB Life，5217-42)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用二甲萘醌(2，3-dimethoxy-1，4-naphthoquinone，D MNQ)提高ROS后使原本對As2O3不敏感的U937變得敏感(Yi J.，F(xiàn).Gao，G.Shi，H.Li，Z.Wang，X.Shi &X.Tang，2002，The inherent cellular level of reactive oxygen speciesoneof the mechanisms determining apoptotic susceptibility of leukemia cellsto arsenic trioxide.Apoptosis，7(3)209-215)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，在現(xiàn)有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇與DMNQ結(jié)構(gòu)類似的天然蒽醌類物質(zhì)——大黃有效成分進(jìn)行研究，提供該類化合物在制備增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明公開的可用于制備增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物的大黃有效成分是指從天然植物中分離純化獲得的具有下述式I母體結(jié)構(gòu)的蒽醌類化合物，或采用化學(xué)溶劑法從大黃生藥材中提取獲得的含大黃有效成分的提取物。
本發(fā)明所述具有蒽醌類母體結(jié)構(gòu)的化合物包括(1)大黃素(emodin，簡稱emo)、(2)蘆薈大黃素(aloe-emodin，簡稱al)、(3)大黃酚(chrysophanol，簡稱ch)和(4)大黃酸(rhein，簡稱rh)等。
本發(fā)明所述從生藥材大黃中提取獲得的含大黃有效成分的提取物是指用化學(xué)溶劑法提取并用梯度萃取法分離制備獲得的粗提物大黃素和粗提物大黃酚。具體方法是將大黃生藥浸泡于60％甲醇，過濾蒸干制成甲醇浸膏，然后用乙醚和5％碳酸鈉萃取獲得大黃素，用乙醚和1％氫氧化鈉萃取獲得大黃酚。
蒽醌和各大黃有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)為 R1R2大黃素 CH3OH蘆薈大黃素 CH2OH H大黃酚 CH3H大黃酸 COOH H本發(fā)明采用大黃提取物和主要成分純化物對三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用影響進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示純化物大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、粗提物大黃素、粗提物大黃酚在所選定的劑量范圍(見表1)內(nèi)單獨(dú)作用，對3種腫瘤細(xì)胞(NB4、HeLa、EC/CUHK)和非腫瘤細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)活力均無影響。純化物大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、粗提物大黃素、粗提物大黃酚在上述選定劑量范圍的最大劑量下與As2O3合用，在3種腫瘤細(xì)胞都增強(qiáng)As2O3的細(xì)胞毒作用(細(xì)胞活力抑制作用)，不同物質(zhì)在各種細(xì)胞分別有效，其中純化物大黃素、蘆薈大黃素普遍明顯有效，純化物大黃酸、粗提物大黃素、粗提物大黃酚對不同細(xì)胞分別有效。但純化物大黃酚對增強(qiáng)As2O3的細(xì)胞毒作用基本無效。各種物質(zhì)與As2O3合用對非腫瘤細(xì)胞活力無影響。純化物大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、粗提物大黃素、粗提物大黃酚在上述選定的劑量下與As2O3合用的細(xì)胞毒作用是通過增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的?？寡趸颪一乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-Cystein，NAC)能抵消這種增強(qiáng)作用。
表1 大黃有效成份體外實(shí)驗(yàn)劑量 本發(fā)明對純化大黃素對三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用影響進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明As2O3單獨(dú)給予未能使瘤塊縮小，合用純化大黃素，明顯使瘤塊縮小，說明As2O3合用大黃素在體內(nèi)增強(qiáng)As2O3療效。且As2O3合用大黃素對機(jī)體無明顯毒、副作用。
本發(fā)明對大黃有效成份增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行相關(guān)機(jī)理研究，結(jié)果顯示大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸純化物及大黃素、大黃酚粗提物在NB4、HeLa、EC/CUHK 3種腫瘤細(xì)胞均提高細(xì)胞活性氧水平，與As2O3合用使活性氧水平比單用As2O3進(jìn)一步提高。在非腫瘤細(xì)胞，大黃有效成分與As2O3合用對活性氧水平有輕微升高作用。純化大黃素在HeLa細(xì)胞增強(qiáng)了As2O3降低線粒體膜電位的作用?？寡趸颪AC能抵銷這種增強(qiáng)作用，說明該增強(qiáng)作用依賴活性氧水平的提高。純化大黃素在HeLa和EC/CUHK細(xì)胞增強(qiáng)了As2O3引起的Caspase3活化。純化大黃素與As2O3合用在HeLa細(xì)胞造成NF-кB和AP-1兩個抗凋亡的轉(zhuǎn)錄因子活化的抑制?？寡趸颪AC能抵消這種抑制作用，說明該抑制作用依賴活性氧水平的提高。
上述試驗(yàn)結(jié)果顯示1.大黃多種成分與三氧化二砷合用，在三種體外培養(yǎng)的白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞能增強(qiáng)三氧化二砷促凋亡作用。在接種食管癌細(xì)胞致瘤的裸鼠，三氧化二砷對瘤塊大小無明顯影響，而大黃素與三氧化二砷合用能顯著縮小瘤塊體積。這表明，大黃有效成分在體內(nèi)和體外都能增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
2.大黃有效成分增強(qiáng)三氧化二砷促凋亡作用是通過提高細(xì)胞活性氧水平實(shí)現(xiàn)的，并且涉及到活性氧升高介導(dǎo)的線粒體膜電位崩潰、凋亡實(shí)施酶類Caspase3活性增高和抗凋亡力量受抑制等信號事件，從而提高了細(xì)胞對三氧化二砷促凋亡作用的易感性。
3.大黃多種成分單獨(dú)使用和與三氧化二砷合用，對非腫瘤細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用，對動物機(jī)體不引起明顯的毒、副作用。
本發(fā)明可將大黃有效成份單獨(dú)制成各種制劑或與三氧化二砷制成復(fù)方制劑用于增強(qiáng)三氧化二砷抗腫瘤的作用。
將大黃及其有效成分與三氧化二砷合用，可以提高三氧化二砷療效，控制三氧化二砷劑量和相應(yīng)的毒、副作用，拓展三氧化二砷治療譜。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。


圖1 大黃主要成分對NB4細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.大黃素10μM，4.蘆薈大黃素25μM，5.大黃酚25μM，6.大黃酸15μM，7.粗提物大黃素2.5μg/ml，8.粗提物大黃酚10μg/ml，24小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％。
圖2大黃主要成分對HeLa細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.大黃素10μM，4.蘆薈大黃素10μM，5.大黃酚10μM，6.大黃酸20μM，7.粗提物大黃素10μg/ml，8.粗提物大黃酚50μg/ml，48小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％。
圖3大黃主要成分對EC/CUHK細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.大黃素10μM，4.蘆薈大黃素25μM，5.大黃酚50μM，6.大黃酸20μM，7.粗提物大黃素2.5μg/ml，8.粗提物大黃酚50μg/ml，72小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％。
圖4大黃主要成分對成纖維細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.大黃素10μM，4.蘆薈大黃素10μM，5.蘆薈大黃素25μM，6.大黃酚50μM，7.大黃酸20μM，8.粗提物大黃素2.5μg/ml，9.粗提物大黃酚50μg/ml，72小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％圖5三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對NB4細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，4.As2O32μM+蘆薈大黃素25μM，5.As2O32μM+大黃酚25μM，6.As2O32μM+大黃酸15μM，7.As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml，8.As2O32μM+粗提物大黃酚10μg/ml，24小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％。
圖6三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對HeLa細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，4 As2O32μM+蘆薈大黃素10μM，5.As2O32μM+大黃酚10μM，6.As2O32μM+大黃酸20μM，7.As2O32μM+粗提物大黃素10μg/ml，8.As2O32μM+粗提物大黃酚50μg/ml，48小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％
圖7三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對EC/CUHK細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，4.As2O32μM+蘆薈大黃素25μM，5.As2O32μM+大黃酚50μM，6.As2O32μM+大黃酸20μM，7.As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml，8.As2O32μM+粗提物大黃酚50μg/ml，72小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％圖8三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對成纖維細(xì)胞活力的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，4.As2O32μM+蘆薈大黃素10μM，5.As2O32μM+蘆薈大黃素25μM，6.As2O32μM+大黃酚50μM，7.As2O32μM+大黃酸20μM，8.As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml，9.As2O32μM+粗提物大黃酚50μg/ml，72小時后用MTT法檢測細(xì)胞活力。相對細(xì)胞活力＝測試組OD490/對照組OD490×100％圖9大黃素增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，4.As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml，加藥24小時后檢測凋亡率。
圖10大黃主要成分增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM和As2O32μM+大黃素10μM+NAC 1.5mM，4.As2O32μM+蘆薈大黃素10μM和As2O32μM+蘆薈大黃素10μM+NAC1.5mM，5.As2O32μM+大黃酸20μM和As2O32μM+大黃酸20μM+NAC 1.5mM，6.As2O32μM+粗提物大黃酚50μg/ml和As2O32μM+粗提物大黃酚50μg/ml+NAC1.5mM，加藥48小時后檢測凋亡率。
圖11大黃主要成分增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)的EC/CUHK細(xì)胞凋亡圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM和As2O32μM+大黃素10μM+NAC 5.0mM，4.As2O32μM+蘆薈大黃素25μM和As2O32μM+蘆薈大黃素25μM+NAC 5.0mM，6.As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml和As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml+NAC 5.0mM，加藥72小時后檢測凋亡率。
圖12裸鼠移植瘤化療18天后的瘤體重量圖中分組如下1.陰性對照組，2.大黃素30mg/kg體重/天，3.As2O35mg/kg體重/天，4.As2O3+大黃素，5.陽性對照組5-FU25mg/kg體重/次，3次/周，18天后稱取瘤體重量。結(jié)果用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行ANOVA分析處理。*表示該組與無*組有顯著性差異(p＜0.05)，**表示該組與*組及***組均有顯著性差異(p＜0.05)。
圖13移植瘤裸鼠化療12天后的體重變化圖中分組如下1.陰性對照組，2.大黃素30mg/kg體重/天，3.As2O35mg/kg體重/天，4.As2O3+大黃素，5.陽性對照組5-FU25mg/kg體重/次，3次/周，12天時稱取體重。體重增長率＝(化療后體重-化療前體重)/化療前體重×100％圖14三氧化二砷單用及合用大黃主要成分15分鐘對NB4細(xì)胞活性氧水平的影響圖中系列如下未加藥組，As2O32μM，As2O32μM+大黃主要成分，As2O32μM+大黃主要成分+NAC。三組中大黃主要成分及劑量分別為1.大黃素10μM，2.蘆薈大黃素25μM，3.粗提物大黃素2.5μg/ml。樣品加藥15分鐘后檢測細(xì)胞ROS水平。NAC 2.5mM提前24小時加入。
圖15三氧化二砷單用及合用大黃主要成分1小時對HeLa細(xì)胞活性氧水平的影響圖中系列如下未加藥組，As2O32μM，As2O32μM+大黃主要成分，As2O32μM+大黃主要成分+NAC。4組中大黃主要成分及劑量分別為1.大黃素10μM，2.蘆薈大黃素10μM，3.大黃酸20μM，4.粗提物大黃酚50μg/ml。樣品加藥1小時后檢測細(xì)胞ROS水平。NAC1.5mM提前24小時加入。
圖16三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對EC/CUHK細(xì)胞活性氧水平的影響(3個時間點(diǎn))圖中系列如下未加藥組，As2O32μM，As2O32μM+大黃素10μM，As2O32μM+蘆薈大黃素25μM，As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml。3個檢測時間點(diǎn)分別為1.加藥15分鐘，2.加藥45分鐘，3.加藥1.5小時。
圖17三氧化二砷單用及合用大黃主要成分對成纖維細(xì)胞活性氧水平的影響(2個時間點(diǎn))圖中系列如下未加藥組，As2O32μM，As2O32μM+大黃素10μM，As2O32μM+粗提物大黃素2.5μg/ml。2個檢測時間點(diǎn)分別為1.加藥15分鐘，2.加藥1小時。
圖18三氧化二砷單用及合用大黃素對HeLa細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.大黃素2μM，4.大黃素10μM，5.As2O32μM+大黃素2μM，6.As2O32μM+大黃素10μM，7.As2O32μM+大黃素10μM+NAC 1.5mM。圖中所示系列為48小時和72小時。As2O3誘導(dǎo)凋亡過程中出現(xiàn)線粒體跨膜電位的崩潰，結(jié)果顯示合用大黃素后使發(fā)生該事件的細(xì)胞比例增多，提示合用組通過提高ROS加劇線粒體跨膜電位崩潰是增強(qiáng)凋亡敏感性的一個機(jī)制。
圖19三氧化二砷單用及合用大黃素對HeLa細(xì)胞Caspase3活性的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，加藥24小時后檢測細(xì)胞Caspase3活性。
圖20三氧化二砷單用及合用大黃素對EC/CUHK細(xì)胞Caspase3活性的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.As2O32μM，3.As2O32μM+大黃素10μM，加藥48小時后檢測細(xì)胞Caspase3活性。
圖21三氧化二砷合用大黃素對HeLa細(xì)胞NF-kB激活的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.PMA 0.5μM，3.PMA 0.5μM+As2O32μM，4.PMA 0.5μM+大黃素10μM，5.PMA0.5μM+As2O32μM+大黃素10μM，6.PMA0.5μM+As2O32μM+大黃素10μM+NAC1.5mM.
圖中上幅為細(xì)胞加藥45分鐘后用EMSA法檢測NF-kB的激活。圖中指示的條帶為NF-kB激活后與特異識別的寡核苷酸探針結(jié)合的凝膠電泳條帶，它的位置滯后于未結(jié)合NF-kB的游離探針。該條帶強(qiáng)弱反映NF-kB激活的程度。
圖中下幅為NF-kB特異的熒光素酶報告基因表達(dá)強(qiáng)度，反映NF-kB的激活并促進(jìn)基因表達(dá)的功能。細(xì)胞轉(zhuǎn)染NF-kB特異識別的啟動子及熒光素酶基因，24小時后加藥，4小時后檢測熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，該值反映熒光素酶的活性。因熒光素酶報告基因的表達(dá)程度與轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的激活水平正相關(guān)，所以相對熒光強(qiáng)度間接反映了NF-kB激活的程度。
圖22三氧化二砷合用大黃素對HeLa細(xì)胞AP-1激活的影響圖中分組如下1.未加藥組，2.PMA 0.5μM，3.PMA 0.5μM+As2O32μM，4.PMA 0.5μM+大黃素10μM，5.PMA0.5μM+As2O32μM+大黃素10μM，6.PMA0.5μM+As2O32μM+大黃素10μM+NAC 1.5mM.
圖中上幅為細(xì)胞加藥45分鐘后用EMSA法檢測AP-1的激活。圖中指示的條帶為AP-1激活后與特異識別的寡核苷酸探針結(jié)合的凝膠電泳條帶，它的位置滯后于未結(jié)合AP-1的游離探針。該條帶強(qiáng)弱反映AP-1激活的程度。
下幅為AP-1特異的熒光素酶報告基因表達(dá)強(qiáng)度，反映AP-1激活并促進(jìn)基因表達(dá)的功能。細(xì)胞轉(zhuǎn)染AP-1特異識別的啟動子及熒光素酶基因，24小時后加藥，4小時后檢測熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，該值反映熒光素酶的活性。因熒光素酶報告基因的表達(dá)程度與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的激活水平正相關(guān)，所以相對熒光強(qiáng)度間接反映了AP-1激活的程度。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1大黃提取物和主要成分純化物對三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用影響的體外實(shí)驗(yàn)1.材料與方法被試物質(zhì)純化物大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸及粗提物大黃素、大黃酚。對NB4、HeLa、CU/CUHK細(xì)胞，劑量為大黃素均為10μM，蘆薈大黃素分別為25、10、25μM，大黃酚分別為25、10、50μM，大黃酸分別為15、20、20μM，大黃素粗提物分別為2.5、10、2.5μg/ml，大黃酚粗提物分別為10、50、50μg/ml。
被試細(xì)胞1)白血病細(xì)胞人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株NB4，已知對As2O3高度敏感。
2)實(shí)體瘤細(xì)胞人宮頸癌上皮細(xì)胞株HeLa，已知對As2O3中度敏感。
3)實(shí)體瘤細(xì)胞人食管癌復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞株EC/CUHK，已知對As2O3輕度敏感。
4)非腫瘤細(xì)胞人皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblast)方法1)MTT檢測細(xì)胞活力2)AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡3)對NB4、Hela、EC/CUHK細(xì)胞，三氧化二砷劑量均為2μM，加藥處理的時間分別為24、48、72小時。
2.結(jié)果
1)2種提取物和4種純化物在所選定的劑量下單獨(dú)作用，對各種腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞活力均無影響(圖1、圖2、圖3、圖4)。
2)數(shù)種提取物和純化物在上述選定的劑量下與As2O3合用，在3種腫瘤細(xì)胞都增強(qiáng)As2O3的細(xì)胞毒作用(細(xì)胞活力抑制作用)，不同物質(zhì)在各種細(xì)胞分別有效，其中純化物大黃素、蘆薈大黃素普遍明顯有效，純化物大黃酸、大黃素粗提物、大黃酚粗提物對不同細(xì)胞分別有效，純化物大黃酚基本無效。各種物質(zhì)與As2O3合用對非腫瘤細(xì)胞活力無影響(圖5、圖6、圖7、圖8)。
3)數(shù)種提取物和純化物在上述選定的劑量下與As2O3合用的細(xì)胞毒作用是通過增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的?？寡趸颪AC能抵消這種增強(qiáng)作用(圖9、圖10、圖11)。
實(shí)施例2純化大黃素對三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.材料與方法6周齡裸鼠(BALB/c-nu/nu)接種EC/CUHK細(xì)胞1.25×106/只于腋部皮下，1天后開始給藥，純化大黃素30mg/kg體重，合用或不合用As2O35mg/kg體重，每日1次腹腔注射；陽性對照組給常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)25mg/kg體重/次，3次/周?；熅S持18天。每實(shí)驗(yàn)組含裸鼠5～8個。
2.結(jié)果1)As2O3單獨(dú)給予未能使瘤塊縮小，合用純化大黃素，明顯使瘤塊縮小(圖12)。說明As2O3合用大黃素在體內(nèi)增強(qiáng)As2O3療效。
2)動物體重在未給藥組、As2O3組、合用組間無差別，陽性對照組(5-FU組)顯著降低(p＜0.05)(圖13)；死亡率在陽性對照組為62.5％，其他組均為0。說明As2O3合用大黃素對機(jī)體無明顯毒、副作用。
實(shí)施例3大黃有效成分增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用相關(guān)機(jī)理研究
1.材料與方法1)流式細(xì)胞儀檢測活性氧水平DCF熒光強(qiáng)度(2種提取物和4種純化物作用于3種細(xì)胞，定義同實(shí)施例1)2)流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位TMRE熒光強(qiáng)度(純化大黃素作用于HeLa)3)Caspase3活性(純化大黃素作用于HeLa和EC/CUHK)4)EMSA和Luciferase Assay檢測NF-кB和AP-1激活(純化大黃素作用于HeLa)2.結(jié)果1)2種提取物和4種純化物在3種腫瘤細(xì)胞均提高細(xì)胞活性氧水平，與As2O3合用使活性氧水平比單用As2O3進(jìn)一步提高，大黃成分與As2O3合用對非腫瘤細(xì)胞活性氧水平有輕微升高作用，(圖14、圖15、圖16、圖17)。
2)純化大黃素在HeLa細(xì)胞增強(qiáng)了As2O3降低線粒體膜電位的作用?？寡趸颪AC能抵銷這種增強(qiáng)作用，說明該增強(qiáng)作用依賴活性氧水平的提高(圖18)。
3)純化大黃素在HeLa和EC/CUHK細(xì)胞增強(qiáng)了As2O3引起的Caspase3活化(圖19、圖20)。
4)純化大黃素與As2O3合用在HeLa細(xì)胞造成NF-кB和AP-1兩個抗凋亡的轉(zhuǎn)錄因子活化的抑制。抗氧化物NAC能抵消這種抑制作用，說明該抑制作用依賴活性氧水平的提高(圖21、圖22)。
權(quán)利要求
1.大黃有效成分在制備增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的大黃有效成分是指從天然植物中分離純化獲得的具有下述式I母體結(jié)構(gòu)的蒽醌類化合物，或采用化學(xué)溶劑法從大黃生藥材中提取獲得的含大黃有效成分的提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的式I母體結(jié)構(gòu)中R1、R2的定義包括R1R2大黃素 CH3OH蘆薈大黃素 CH2OH H大黃酚 CH3H大黃酸 COOH H
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的含大黃有效成分的提取物是指用化學(xué)溶劑法提取并用梯度萃取法分離制備獲得的粗提物大黃素和粗提物大黃酚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物為含大黃有效成份或同時含有大黃有效成份與三氧化二砷的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及大黃有效成分在制備增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述大黃有效成分是指從天然植物中分離純化獲得的具有上述式I母體結(jié)構(gòu)的蒽醌類化合物，或采用化學(xué)溶劑法從大黃生藥材中提取獲得的含大黃有效成分的提取物。本發(fā)明通過大黃有效成分在體內(nèi)和體外試驗(yàn)均證明其能增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且該作用是通過提高細(xì)胞活性氧水平實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明可將大黃有效成分單獨(dú)制成各種制劑或與三氧化二砷制成復(fù)方制劑用于增強(qiáng)三氧化二砷抗腫瘤的作用，控制三氧化二砷劑量和相應(yīng)的毒、副作用，拓展三氧化二砷治療譜。
文檔編號A61P35/00GK1526378SQ200310104509
公開日2004年9月8日 申請日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者易靜, 高飛, 楊潔, 陸陽, 湯雪明, 易 靜 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)