專(zhuān)利名稱(chēng)：：含有針對(duì)約四種引起痤瘡的抗原的混合IgY的雞蛋及其蛋黃粉和混合IgY的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：該發(fā)明是關(guān)于針對(duì)痤瘡發(fā)病菌的復(fù)合型特殊免疫蛋白生產(chǎn)方法及復(fù)合型特殊免疫蛋白的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：在該發(fā)明中，醫(yī)學(xué)上稱(chēng)之為尋常性痤瘡的粉刺(acnevulgaris)是步入青春期的象征，每10名進(jìn)入青春期的男女中，7～8人有過(guò)長(zhǎng)青春痘的經(jīng)驗(yàn)。隨著女性進(jìn)入社會(huì)的比例上升，隨之而來(lái)的精神壓力日益加劇，故在20多歲或30多歲時(shí)第一次長(zhǎng)痤瘡的女性也在逐漸增加。觀察誘發(fā)痤瘡的原因如下首先、是因?yàn)槠ぶ置谶^(guò)分旺盛。在內(nèi)分泌腺的調(diào)節(jié)下，從皮膚皮脂腺分泌出的皮脂分泌過(guò)多直接導(dǎo)致皮脂腺繼續(xù)生成，并從皮脂腺排管通過(guò)漏斗部，在皮膚表面分泌出皮脂，導(dǎo)致皮脂分泌過(guò)多。此外，睪丸激素也會(huì)促進(jìn)皮脂分泌，并激活脂質(zhì)的生物合成分泌，所以在第二次成長(zhǎng)期——青少年期，皮脂腺非常發(fā)達(dá)。一般來(lái)講，成年男性從睪丸分泌出的睪丸激素促使皮脂分泌保持穩(wěn)定，而女性在排卵后的一定期間內(nèi)，抗體荷爾蒙的增加會(huì)刺激皮脂腺，導(dǎo)致皮脂分泌增加，并在月經(jīng)后會(huì)出現(xiàn)痤瘡惡化的現(xiàn)象。其次、是因?yàn)槊组]塞。在上述第一個(gè)原因中，皮脂的過(guò)多分泌會(huì)導(dǎo)致漏斗部閉塞，致使毛囊孔和皮脂腺開(kāi)口部閉塞或變窄，以至無(wú)法正常排泄皮脂，使皮脂留在毛漏斗部，變成黑頭粉刺，增加痤瘡桿菌，而桿菌的生成物又會(huì)刺激漏斗部的上皮細(xì)胞，角質(zhì)化現(xiàn)象得到亢進(jìn)，致使皮脂堵塞皮脂腺和毛囊，最終引發(fā)出疹癥狀。第三、隨著皮脂成分變成含有黑色素的黑色凝塊，厭氧性細(xì)菌——痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)也會(huì)逐漸增加。上述痤瘡丙酸桿菌屬于厭氧性細(xì)菌，它主要分布在毛孔周?chē)蚵┒凡?，能將皮脂增殖為營(yíng)養(yǎng)成分，并分泌出脂肪酶，分離出皮脂的主要成分——甘油三酸酯(triglyceride)，生成游離脂肪酸。上述游離脂肪酸會(huì)對(duì)皮膚上皮起作用，生成各種酵素，破壞毛囊壁，在毛囊周?chē)慕Y(jié)合組織誘發(fā)炎癥。皮脂腺的肥大增殖、毛囊孔的角質(zhì)化亢進(jìn)以及細(xì)菌的影響起到復(fù)合性作用，惡化痤瘡癥狀，有時(shí)這些原因還會(huì)單獨(dú)誘發(fā)痤瘡癥狀。此外，容易長(zhǎng)痤瘡的體質(zhì)的遺傳性因素、飲食影響以及疲勞和精神壓力也是誘發(fā)痤瘡癥狀的主要原因之一。在誘發(fā)痤瘡的主要原因中，痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)是其原因菌，這是滋生于皮膚里的常在菌，也是引發(fā)原發(fā)性皮膚疾病、痤瘡引起的皮膚疾病和迅速惡化癥狀的原因菌，此外還有粘液誘發(fā)病癥的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。(Francismartineauetal.，1996、ChristianC.etal.、1990)在引發(fā)皮膚及軟組織感染、肺炎、菌血癥等癥狀的G(+)球菌中，最常見(jiàn)的病原菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。(GordonL.Archer.、1996)此外，還有繁殖在不潔皮膚中的大腸菌。目前，治療痤瘡的方法有殺滅痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)的抗生劑或遏制皮脂過(guò)多分泌的方法。除了抗生劑以外，目前正在開(kāi)發(fā)約有40種痤瘡治療劑的后選物質(zhì)。其中，主要有類(lèi)維生素A(retinoid)和雄激素拮抗劑等16種痤瘡治療劑得到集中研究和開(kāi)發(fā)。睪丸激素通過(guò)5-α-還原酶(5-α-reductase)轉(zhuǎn)換成有兩個(gè)氫原子的睪丸激素，而它成為在皮脂腺的細(xì)胞內(nèi)生成皮脂的主要物質(zhì)，促進(jìn)皮脂生成，目前已有人發(fā)表了關(guān)于5-α-還原酶抑制劑(5-α-reductaseinhibitor)的研究報(bào)告。(CationsInhibitSpecificallyTypel5α-reductaseFoundinHumanSkin、J.Invest.Dermatol、104、775-778、1995)就5-α-還原酶抑制劑(5-α-reductaseinhibitor)系統(tǒng)，目前正由摩克制藥公司(Merck&Co)開(kāi)發(fā)研究?jī)煞N后選物質(zhì)，而在抗生劑方面，杜鵑花酸(Skinorenazelaicacid)和局部用喹諾酮(Acuatim、那氟沙星nadifloxacin)分別由德國(guó)先靈藥廠(ScheringAG)和日本大冢公司(Otsuka)開(kāi)發(fā)研究。在相關(guān)技術(shù)研究方面，作為天然物質(zhì)，在鹿腳部位發(fā)現(xiàn)的(E)-3-十三碳烯醇-2-one((E)-3-tridecen-2-one)，能有效遏制以皮膚油作為培養(yǎng)基增殖的細(xì)菌，這一技術(shù)已得到有關(guān)部門(mén)驗(yàn)證并已注冊(cè)專(zhuān)利。(PharmaprojectsMagazine、July1997)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液生成能力對(duì)細(xì)菌的病原性起到重要作用。粘液性物質(zhì)將覆蓋菌體，并通過(guò)外部多糖體形成生體膜。通過(guò)粘液性物質(zhì)形成的粘液層能從抗生劑保護(hù)菌體，并阻止宿主的免疫反應(yīng)——蝕菌作用。據(jù)有關(guān)資料顯示，它還能遏制血球凝集素，并損壞宿主的免疫系統(tǒng)。對(duì)痤瘡誘發(fā)菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的感染，曾使用過(guò)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase)較穩(wěn)定的青霉素(penicillin)，但在20世紀(jì)90年代，發(fā)現(xiàn)有35～66％的金黃色葡萄球菌是甲氧苯青霉素-抵抗性金黃色葡萄球菌(methilline-resistantStaphylococcusaureusMRSA)，從此普遍使用了糖肽(glycopeptide)——萬(wàn)古霉素(vancomycin)。(GordonL.Archer.、1996、RichardS.schwalbeetal.、1987)1996年以后，在日本、美國(guó)和法國(guó)發(fā)現(xiàn)了萬(wàn)古霉素(vancomycin)中呈現(xiàn)出中性耐性的萬(wàn)古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(vancomycinintermediateresistantStaphylococcusaureus、VISA)，故在這一領(lǐng)域引起了更大反響。萬(wàn)古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(VISA)在多種抗生劑中呈現(xiàn)出了耐性，這表明它能替代目前正在使用的抗生劑，同時(shí)還有望成為萬(wàn)古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(VISA)感染患者的新的福音。(RichardS.schwalbeetal.、1987、Keiichihiramatsu.、1998)盡管目前已開(kāi)發(fā)出了上述藥劑等痤瘡治療劑，但痤瘡癥狀仍不斷出現(xiàn)和惡化，其原因很多，且根據(jù)不同人的特點(diǎn)，也有很多差別，但因毛孔在人體中起到免疫作用，故認(rèn)為痤瘡與人體免疫功能有著最直接的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的含有四種混合菌的抗-復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產(chǎn)方法旨在解決上述問(wèn)題，用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進(jìn)行一次免疫接種，然后再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以?xún)蓚€(gè)星期為周期，給小雞進(jìn)行第二次免疫接種，使雞生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋。此外，該發(fā)明還旨在在含有蔗糖(Sucrose)0.5％和乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)中制作痤瘡原因菌里的表皮葡萄球菌，增加病原性的主要原因——表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液量，提供特殊免疫蛋白。圖1是單獨(dú)或復(fù)合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌時(shí)的每種特殊免疫蛋白的效價(jià)變化所示圖。圖2是單獨(dú)或復(fù)合接種大腸菌時(shí)的抗-大腸菌特殊免疫蛋白的效價(jià)變化所示圖。圖3是單獨(dú)或復(fù)合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌時(shí)的每種特殊免疫蛋白的平均效價(jià)所示圖。圖4是單獨(dú)或復(fù)合接種大腸菌時(shí)的抗-大腸菌特殊免疫蛋白的平均效價(jià)所示圖。具體實(shí)施方法根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的含有四種混合菌的抗-復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產(chǎn)方法具有如下特點(diǎn)為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)課題，該發(fā)明對(duì)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacne)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)進(jìn)行抗原化處理，并同時(shí)給小雞接種，以使每個(gè)雞蛋均含有能夠預(yù)防痤瘡的復(fù)合型特殊免疫蛋白。該發(fā)明中的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)含有0.5％能增加表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液量的蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)。在該發(fā)明中，從根據(jù)上述方法生下的含有復(fù)合型特殊免疫蛋白的雞蛋中分離出蛋黃，并制成含有復(fù)合型特殊免疫蛋白的蛋黃粉末。在該發(fā)明中，生產(chǎn)出針對(duì)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)的特殊免疫蛋白的階段如下利用氫氧化鋁乳化而制的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)，制成混合菌乳化液，并用該混合菌乳液給小雞(約為12周齡)接種一次，然后用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種同一抗原，制成混合菌乳液，并用該混合菌乳化液給小雞第二次接種，如此共給小雞接種三次，使其生下含有復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋。進(jìn)一步說(shuō)明抗原的混合比例和乳化液的比例如下給小雞接種的菌體數(shù)比例為痤瘡丙酸桿菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌抗原∶大腸菌抗原∶乳化助劑＝3∶1∶1∶1∶4。為此，應(yīng)將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小雞的一條腿上接種一次。將上述四種抗原以同樣的比例混合，并用0.2ml的乳化助劑(ISA25)乳化，制成混合菌乳液，然后以?xún)蓚€(gè)星期為周期，在小雞的一條腿上進(jìn)行第二次接種0.5ml的混合菌乳液，如此共接種三次。通過(guò)給小雞接種上述四種混合抗原，使已被免疫的產(chǎn)蛋雞生下同時(shí)擁有抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白等復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋，并使雞蛋蛋黃含有上述四種混合抗原。在該發(fā)明中，為了增加對(duì)抗表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白，在復(fù)合型特殊免疫蛋白的生產(chǎn)階段，對(duì)粘液量增加的表皮葡萄球菌進(jìn)行抗原化處理，共給小雞接種三次。詳細(xì)說(shuō)明上述過(guò)程如下在添加了0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉湯(TrypticSoyBrothTSB)中進(jìn)行增菌處理，增加表皮葡萄球菌的粘液量。利用含有0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-di-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)，生成病原性的主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，并增加影響病原性的原因——粘液的特殊免疫蛋白。該發(fā)明還在禽蛋加工廠，對(duì)通過(guò)上述方法生下的同時(shí)含有抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白的雞蛋進(jìn)行分離蛋黃和噴霧干燥處理，制作蛋黃粉末。通過(guò)該發(fā)明實(shí)例及圖表詳細(xì)說(shuō)明該發(fā)明結(jié)構(gòu)如下(該發(fā)明的權(quán)利范圍和請(qǐng)求范圍并不局限于如下實(shí)例及圖表。)實(shí)例1(1)制作痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)抗原痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)是從韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購(gòu)買(mǎi)并使用的，該菌的正規(guī)名稱(chēng)是Propionibacteriumacnes(KCTC3314)。上述抗原是革蘭氏細(xì)菌(Gram)培養(yǎng)桿菌，其大小為0.3～1.3μm×1～10μm。該抗原的部分菌體膨大，菌端為尖而多形性，并排列成“V”形。(甲)革蘭氏細(xì)菌(Gram)的染色性狀利用棉棒將已增菌的菌體涂抹在載片上面，并在空氣中晾干涂抹的菌體標(biāo)本，然后又將干燥的標(biāo)本在火花中通過(guò)2～三次予以固定。利用結(jié)晶紫試液(alkalinecrystalviolet)染色劑進(jìn)行兩分鐘處理，并在Kopeloffiodine媒染劑反應(yīng)兩分鐘，制成丙酮(acetone)和酒精(alcohol)的比例為3∶7的混合試劑。利用鹽基性紅色染料(safranin)進(jìn)行20秒的對(duì)照染色處理，并通過(guò)檢鏡，確定是革蘭氏細(xì)菌(Gram)培養(yǎng)的桿菌。(乙)固體培養(yǎng)基中的性狀將其涂抹在GAM半固體培養(yǎng)基(GAMsemisolid)上，并在含有二氧化碳(CO2)10％的恒溫器的厭氧性條件下培養(yǎng)4～5天，使其增殖為圓形隆起并具有非透明光澤的菌落。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，菌落的顏色逐漸變成了橙紅色(Salmonpink)。(丙)制作痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)抗原在5ml的放線(xiàn)菌培養(yǎng)基(Actinomycesbroth)中，對(duì)痤瘡丙酸桿菌進(jìn)行為時(shí)3個(gè)小時(shí)的第一次增菌處理。將第一次增菌液接種到大量放線(xiàn)菌培養(yǎng)基(Actinomycesbroth)中，并在含有10％的二氧化碳(CO2)，溫度為37℃的恒溫器中進(jìn)行增菌處理。在恒溫器中培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)的菌液中添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的濃度變成0.2％，并在室內(nèi)溫度下進(jìn)行24個(gè)小時(shí)的不活化處理。在4,000rpm的條件下，對(duì)進(jìn)行不活化處理的菌液進(jìn)行20分鐘的離心處理，以獲得細(xì)菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進(jìn)行了三次稀釋。將進(jìn)行不活化處理的菌液涂抹在固體培養(yǎng)基上，確定其為不能增菌的菌體。用滅菌生理鹽水對(duì)上述進(jìn)行不活化處理的菌體進(jìn)行三次稀釋?zhuān)⒃?20℃的溫度下冷藏，用作抗原。(2)制作表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)抗原表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是從韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購(gòu)買(mǎi)并使用的，該菌的正規(guī)名稱(chēng)是Staphylococcusepidermidis(KCTC1917)。該抗原是直徑為0.8～1.0μm的球菌，在染色標(biāo)本屬于革蘭氏細(xì)菌(Gram)培養(yǎng)球菌，一般排列成葡萄串形狀，在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的染色標(biāo)本呈雙球菌、連鎖狀、四分染色體等不規(guī)則的葡萄串排列狀。(甲)革蘭氏細(xì)菌(Gram)的染色性狀采用與痤瘡丙酸桿菌相同的方法，這也是葡萄串形狀的革蘭氏細(xì)菌(Gram)培養(yǎng)球菌。培養(yǎng)初期，其革蘭氏細(xì)菌(Gram)培養(yǎng)的性質(zhì)非常強(qiáng)烈，但在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，逐漸呈革蘭氏細(xì)菌(Gram)陰性。(乙)固體培養(yǎng)基中的性狀在寒天培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)后，菌落的圓形平滑，變成有光澤的半球狀菌落，其直徑為1～2mm。菌落的色素呈白色，在食鹽培養(yǎng)基中顯示出耐鹽性。(丙)在表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)特殊培養(yǎng)基制作抗原在含有5ml的0.5％蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)的TSB(Trypticsoybroth)特殊培養(yǎng)基中，對(duì)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)進(jìn)行了3個(gè)小時(shí)的第一次增菌處理，并將增菌的第一次增菌液接種到大量特殊培養(yǎng)基中，然后在37℃恒溫器里進(jìn)行了搖晃增菌處理。在恒溫器中培養(yǎng)36個(gè)小時(shí)的菌液中，添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的濃度變成0.2％，并在室內(nèi)溫度下進(jìn)行了24個(gè)小時(shí)不活化處理。在4,000rpm的條件下，對(duì)進(jìn)行不活化處理的菌液進(jìn)行20分鐘的離心處理，獲得細(xì)菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進(jìn)行了三次稀釋。將進(jìn)行不活化處理的菌液涂抹在固體培養(yǎng)基上，確定其為不能增菌的菌體。用滅菌生理鹽水對(duì)上述進(jìn)行不活化處理的菌體進(jìn)行三次稀釋?zhuān)⒃?20℃的溫度下冷藏，用作抗原。(丁)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液染色用阿新藍(lán)(alcianblue)對(duì)利用特殊培養(yǎng)基增殖的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液進(jìn)行染色處理并確認(rèn)。(3)制作金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是從韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購(gòu)買(mǎi)并使用的，該菌的正規(guī)名稱(chēng)是金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusKCTC1621)。該抗原為典型的圓形菌，是形成不規(guī)則的葡萄串排列狀的非孢子形成革蘭氏細(xì)菌培養(yǎng)(0.5～1.5μm)菌，有時(shí)其外表帶有膠囊狀粘液層，作為人體病原性菌，是一種非運(yùn)動(dòng)性需氧或通性厭氧性菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原制作過(guò)程如下將金黃色葡萄球菌接種到胰酶大豆肉湯(Difco)上，并在37℃溫度下培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。將菌體涂抹在固體培養(yǎng)基上，然后在4℃溫度下保管，并在每7天繼代培養(yǎng)和使用一次。在60℃恒溫水槽中，對(duì)培養(yǎng)的菌體進(jìn)行30分鐘的熱處理，殺滅活的抗原，然后在10,000xg條件下進(jìn)行15分鐘的離心處理，獲得菌體，并在該菌體中添加生理鹽水，進(jìn)行三次離心處理，去除菌體內(nèi)的培養(yǎng)基成分。利用血球計(jì)算儀，測(cè)定滅活菌體原液的細(xì)菌數(shù)量。(4)大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)的分離同定和抗原制作(甲)從人體分離并同定大腸菌(EnterotoxigenicEscherichiacoliETEC)用于該實(shí)驗(yàn)的大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)是從患有腹瀉癥狀的小兒糞便中分離出來(lái)的。人體中的大腸菌具有標(biāo)準(zhǔn)微生物特性，只要是該
技術(shù)領(lǐng)域：
的研究人員，均可輕松分離出大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)。抗原分離方法如下在漢城大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提取小兒的腹瀉糞便，并將部分樣本涂抹在半固體培養(yǎng)基上，然后在37℃恒溫器中培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)，并選定一個(gè)呈現(xiàn)出α-溶血性的大腸菌菌落。該菌落在麥康凱瓊脂(MacConkeyagar)中培養(yǎng)成粉紅色，將其涂抹在EMB培養(yǎng)基(EMBagar)上，通過(guò)呈綠色(metalicgreen)的大腸菌特殊菌落性狀進(jìn)行確認(rèn)。將如此分離的大腸菌命名為EB-E01。(乙)確認(rèn)毒素(Toxin)生產(chǎn)能力通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction以下簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)法，確認(rèn)了大腸菌(E.coli)腸毒素(enterotoxigenicity)的主要原因——腸毒素(Entrotoxin)的生產(chǎn)能力。通過(guò)采用對(duì)熱穩(wěn)定毒素(以下簡(jiǎn)稱(chēng)STheatstabletoxin)STa1基因和熱不穩(wěn)定毒素(以下簡(jiǎn)稱(chēng)LTheatlabletoxin)LTh基因的特殊引物(Primer)的多重(multiplex)PCR方法，進(jìn)行了擴(kuò)增。ST毒素確認(rèn)用引物為有義引物CCCCTCTTTTAGTCAGTC反義引物CCAGCACAGGCAGGATTACA采用了能夠擴(kuò)增到165bps最終產(chǎn)物的引物。LT毒素確認(rèn)用引物為有義引物CAGACTATCAGTCAGAGGTTG反義引物TTCATACTGATTGCCGCA采用了能夠擴(kuò)增到417bps最終產(chǎn)物的引物。在PCR條件中，在預(yù)變性溫度(Pre-denaturationtemperature)95℃下進(jìn)行5分鐘、在變性溫度(Denaturationtemperature)94℃下進(jìn)行1分鐘、在退火溫度(Annealingtemperature)56℃下進(jìn)行1分鐘、延伸溫度(Elongationtemperature)72℃下進(jìn)行1分鐘、在后-延伸溫度(Post-elongationtemperature)72℃下進(jìn)行了10分鐘擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物，以利用瓊脂糖膠(agarosegel)2％的電泳方式進(jìn)行了確認(rèn)。經(jīng)確認(rèn)，用于該發(fā)明的分離菌株能夠生成ST毒素。(丙)制作大腸菌ETEC(EnterotoxigenicE.coli)抗原將大腸菌ETEC菌株接種到胰酪蛋白胨大豆瓊脂(Trypticasesoyagr)上，并在37℃恒溫器中培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)，然后將一個(gè)菌落(colony)接種到5ml的胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基(Trypticasesoybroth)中。經(jīng)2個(gè)小時(shí)后，又接種到大量胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基上，并在37℃恒溫器中放置培養(yǎng)了48個(gè)小時(shí)。在培養(yǎng)的菌液中添加菌液的0.2％的甲醛(formaldehyde)，并在室內(nèi)溫度下進(jìn)行了24個(gè)小時(shí)的不活化處理。在4,000rpm的條件下，再對(duì)進(jìn)行不活化處理的菌液進(jìn)行20分鐘的離心處理，獲得細(xì)菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進(jìn)行了三次稀釋。將菌體浮游在生理鹽水上，使其從410nm變成1.2～1.3的O.D.(OculusDexter)后使用。(5)給小雞接種四種復(fù)合抗原(甲)在給12周齡的小雞接種的抗原中，痤瘡丙酸桿菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌∶大腸菌抗原∶乳化助劑的比例為3∶1∶1∶1∶4，并將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小雞的一條腿上接種一次，并從第二次開(kāi)始，用于增壓的助劑采用乳化助劑(ISA25)，將上述四種抗原乳化成混合菌乳液，然后以?xún)蓚€(gè)星期為周期，在小雞的一條腿上第二次接種0.5ml的混合菌乳液，如此共接種三次。本發(fā)明人通過(guò)圖1、圖2、圖3、圖4說(shuō)明了接種上述四種混合菌乳液的產(chǎn)蛋雞生下的雞蛋，具有富含抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白等復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)的特點(diǎn)。通過(guò)實(shí)例2和實(shí)例3對(duì)此詳細(xì)說(shuō)明如下實(shí)例2.蛋黃分離及經(jīng)過(guò)噴霧干燥處理的蛋黃粉末(1)蛋黃分離在禽蛋加工廠，以業(yè)內(nèi)人士廣知的技術(shù)，分離了通過(guò)上述方法生下的雞蛋的蛋清和蛋黃。(2)蛋黃粉末利用噴霧干燥器，對(duì)分離的新鮮蛋黃進(jìn)行噴霧干燥處理，生產(chǎn)蛋黃粉末。實(shí)例3.特殊免疫蛋白的分離及效價(jià)測(cè)定(1)特殊免疫蛋白的分離(甲)分離磷脂和水溶性特殊免疫蛋白(IgY)在禽蛋加工廠，分離通過(guò)上述方法生下的雞蛋的蛋清和蛋黃，并為在含有抗-復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)的蛋黃中分離出脂肪和脂蛋白(lipoprotein)，以1∶1的比例混合蛋黃和蒸餾水。即，準(zhǔn)備稀釋成兩倍的10個(gè)蛋黃樣本，并在每個(gè)樣本里添加1～10％的硫酸銨，使其完全熔化，然后將完全熔化的10個(gè)樣本置于溫度為5℃的室內(nèi)24個(gè)小時(shí)，那么根據(jù)每個(gè)樣本的濃度，將分離為上層和下層。這時(shí)，上層浮有脂質(zhì)和部分蛋白質(zhì)，而下層出現(xiàn)微量沉淀。使用硫酸銨的常規(guī)蛋白質(zhì)分離方法(Mathews1990)是在蛋白質(zhì)沉淀法中最常見(jiàn)的方法，它是通過(guò)添加大量硫酸銨來(lái)提高樣本濃度，使蛋白質(zhì)沉淀量增多，并通過(guò)對(duì)此進(jìn)行離心處理制作蛋黃粉末。為將精制度提高到10～20％，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行離心處理排除沉淀的方法來(lái)去除沒(méi)用的粗蛋白質(zhì)，然后添加20％以上的硫酸銨，并采用沉淀的蛋白質(zhì)。但在該發(fā)明中，為了分離出蛋黃中的脂質(zhì)，并未采用各種溶媒或溶劑(沉淀劑)，而是利用脂質(zhì)的浮游性和硫酸銨的凝聚性，解決了分離蛋黃內(nèi)的脂蛋白或免疫蛋白的難題。(乙)去除脂質(zhì)、水溶性蛋白質(zhì)和色素(蛋黃)為了去除留在已分離出脂質(zhì)的液體中的部分脂質(zhì)、水溶性蛋白質(zhì)和色素(蛋黃)，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)制作6個(gè)樣本，并分別向每個(gè)樣本添加6倍、12倍、18倍、30倍、42倍、48倍、60倍的蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮⑺鼈冎糜跍囟葹?℃的室內(nèi)一天。這時(shí)應(yīng)注意，不能讓已被分離的上清液與沉淀物混淆。稀釋為6倍的樣本出現(xiàn)了沉淀，但上清液中仍殘留著蛋黃特有的黃色，而其沉淀物迅速與上清液混淆；稀釋為12倍、18倍、30倍的樣本也出現(xiàn)了沉淀，而且沉淀物也未與上清液混淆；稀釋為42倍、48倍、60倍的樣本雖然出現(xiàn)了沉淀，但出現(xiàn)了沉淀物與上清液混淆的現(xiàn)象。最合適的沉淀稀釋率為12倍和18倍，其粘度極高，需要用熱水清洗，就像粘有油漆渣一樣，以至于用流淌的自來(lái)水也洗不凈。如表1所示，對(duì)去除沉淀物的上清液進(jìn)行特殊免疫蛋白(IgY)效價(jià)測(cè)定的結(jié)果顯示，僅用效價(jià)標(biāo)示的稀釋率中，60倍和6倍的產(chǎn)率(yield)分別為109％和10％，高于標(biāo)準(zhǔn)值。估計(jì)這是因?yàn)槭艿剿苄缘鞍踪|(zhì)等影響，導(dǎo)致稀釋后的效價(jià)高于原液中的效價(jià)。除了稀釋為12倍和18倍的樣本以外，其余樣本也均超過(guò)了100％。最終選定了未出現(xiàn)沉淀物，色素也被完全去除的稀釋率18倍的樣本。表1表2(丙)實(shí)驗(yàn)結(jié)果此前，秋田(Akita，1993年)曾采用過(guò)利用蒸餾水的稀釋法，在稀釋后，利用右旋糖苷(dextran)、黃原膠(xanthangum)、聚氧乙烯(PEG)、乙醇(ethanol)、硫酸鈉(sodiumsulfate)等沉淀劑進(jìn)行沉淀，并用離心處理器分離，但該發(fā)明先用少量硫酸銨去除蛋黃中的脂質(zhì)，將脂質(zhì)和蛋白質(zhì)部分凝集到上層，通過(guò)其他發(fā)明人經(jīng)常使用的硫酸銨沉淀法，顛倒順序分離出了蛋白質(zhì)。即，此前是通過(guò)利用硫酸銨的沉淀法進(jìn)行了分離處理，而該發(fā)明則采用浮游、凝集的方式進(jìn)行了分離處理。在該發(fā)明中，僅用5％的硫酸銨、蛋黃和蒸餾水(1∶1)，通過(guò)脂質(zhì)和部分蛋白質(zhì)的重力差別，將它們凝集并去除，然后再用蒸餾水稀釋?zhuān)沟包S的色素和水溶性蛋白質(zhì)凝集并沉淀。(2)特殊免疫蛋白的效價(jià)測(cè)定在通過(guò)上述過(guò)濾方式收集的水溶性蛋白質(zhì)中，利用如下方式測(cè)定出了特殊免疫蛋白(IgY)的含量特殊免疫蛋白(IgY)含量的測(cè)定方式采用了酶免法(ELISA)，用緩沖溶液對(duì)每個(gè)抗原(痤瘡丙酸桿菌、粘液量增加的表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌)進(jìn)行稀釋處理，以使吸光度(O.D.)值從660nm變成0.05。將稀釋的菌體涂抹在微量滴定盤(pán)上放置16個(gè)小時(shí)，然后稀釋該微量滴定盤(pán)，并添加過(guò)濾的水溶性特殊免疫蛋白，進(jìn)行反應(yīng)和稀釋?zhuān)⑻砑恿艘?∶10,000稀釋的IgGAb-HRP。這時(shí)，將TMB用作HRP的培養(yǎng)基，并將2Normal-硫磺酸(2N-H2SO4)用作反應(yīng)終止液，在450nm條件下測(cè)定了吸光度。如圖1、圖2、圖3、圖4所示，特殊免疫蛋白(IgY)的含量測(cè)定結(jié)果如下如圖1和圖3所示，復(fù)合接種表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和大腸菌時(shí)，痤瘡丙酸桿菌的特殊免疫蛋白效價(jià)要比單獨(dú)接種痤瘡丙酸桿菌時(shí)多，而復(fù)合接種痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸菌時(shí)，表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白效價(jià)也比單獨(dú)接種表皮葡萄球菌多。此外，復(fù)合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和大腸菌時(shí)，金黃色葡萄球菌的特殊免疫蛋白效價(jià)要比單獨(dú)接種金黃色葡萄球菌多。如圖2和圖4所示，復(fù)合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌時(shí)，大腸菌特殊免疫蛋白的平均效價(jià)要比單獨(dú)接種時(shí)高。發(fā)明效果綜上所述，該發(fā)明同時(shí)對(duì)痤瘡誘發(fā)菌——痤瘡丙酸桿菌、皮膚疾病誘發(fā)菌——表皮葡萄球菌、誘發(fā)化膿性炎癥的金黃色葡萄球菌和大腸菌進(jìn)行抗原處理，并制成同時(shí)含有上述四種抗原的特殊免疫蛋白的復(fù)合型特殊免疫蛋白，因而添加了復(fù)合型特殊免疫蛋白的防痤瘡化妝品能有效治療皮膚疾病。詳細(xì)說(shuō)明該發(fā)明效果如下首先、在給小雞(約為12周齡)陸續(xù)接種(三次接種×四種菌＝共一二次接種)上述四種痤瘡誘發(fā)菌時(shí)，通過(guò)一二次痤瘡誘發(fā)菌接種，最大限度地減少壓力，并能增加產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量。據(jù)相關(guān)報(bào)告內(nèi)容顯示，如給產(chǎn)蛋雞直接接種上述誘發(fā)菌，就會(huì)降低50～60％的產(chǎn)蛋量。如該發(fā)明實(shí)例所示，如果雞蛋產(chǎn)量增加，雞蛋內(nèi)的復(fù)合型特殊免疫蛋白也能達(dá)到最高值。其次、給小雞接種根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的病原性主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，為其進(jìn)行免疫，能有效增加抗-表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白。序列表<110>雞蛋高新技術(shù)有限公司(EggBiotechIncorporation)<120>含有針對(duì)約四種引起痤瘡的抗原的混合IgY的雞蛋及其蛋黃粉和混合IgY的生產(chǎn)方法(THEPRODUCTIONMETHODOFEGGCONTAININGMIXIGYABOUTFOURANTIGENCAUSINGACNESANDTHEREOFEGGYOLKPOWDERANDMIXIGY)<130>SPI033238-47<140><141><160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1cccctcttttagtcagtc18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccagcacaggcaggattaca20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cagactatcagtcagaggttg21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ttcatactgattgccgca18權(quán)利要求1.含有四種混合菌的抗-復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產(chǎn)方法應(yīng)具有如下特點(diǎn)用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進(jìn)行一次免疫接種；再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以?xún)蓚€(gè)星期為周期，給小雞進(jìn)行第二次免疫接種，使得生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋，是一種含有四種混合菌的抗-復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產(chǎn)方法。2.在第1項(xiàng)中，給小雞接種的菌體數(shù)比例應(yīng)為痤瘡丙酸桿菌抗原∶表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌抗原∶大腸菌抗原∶乳化助劑＝3∶1∶1∶1∶4。為此，應(yīng)將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并給小雞進(jìn)行一次免疫接種的階段；再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種同一比例的同一抗原，制成混合菌乳液，并以?xún)蓚€(gè)星期為周期，給小雞進(jìn)行第二次免疫接種，使得生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋。3.在第1項(xiàng)或第2項(xiàng)中，表皮葡萄球菌利用含有蔗糖0.5％和乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉湯(TrypticSoyBrothTSB)增菌培養(yǎng)，使其粘液量增加。4.將從利用第3項(xiàng)方法生下的雞蛋提取蛋黃，進(jìn)行分離和噴霧干燥處理，制成蛋黃粉末。5.將從利用第3項(xiàng)方法生下的雞蛋提取的蛋黃，用蒸餾水稀釋的階段在上述稀釋溶液中，添加含有特殊免疫蛋白(IgY)的水溶性蛋白質(zhì)和足以分離磷脂的3～10％的硫酸銨，以分離磷脂和水溶性蛋白質(zhì)的階段；然后用蒸餾水稀釋上述分離的溶液，然后置于4～10℃的溫度中進(jìn)行沉淀。全文摘要該發(fā)明是關(guān)于針對(duì)痤瘡發(fā)病菌的復(fù)合型特殊免疫蛋白生產(chǎn)方法及復(fù)合型特殊免疫蛋白的技術(shù)。進(jìn)一步說(shuō)明如下用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進(jìn)行一次免疫接種，然后再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以?xún)蓚€(gè)星期為周期，給小雞進(jìn)行第二次免疫接種，使雞生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋，是一種含有四種混合菌的抗－復(fù)合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋生產(chǎn)方法。此外，在添加蔗糖和乙二胺－D－O－間苯二酚乙酸的培養(yǎng)基中增加表皮葡萄球菌的粘液量，然后給小雞進(jìn)行抗原、免疫處理，增加抗體能力。根據(jù)上述方法生下的雞蛋蛋黃粉末或復(fù)合型特殊免疫蛋白能有效預(yù)防痤瘡。文檔編號(hào)A61P17/00GK1611514SQ20031010455公開(kāi)日2005年5月4日申請(qǐng)日期2003年10月31日優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日發(fā)明者李南珩,鄭順姬,金美鉉,金相兌,李吉成申請(qǐng)人:雞蛋高新技術(shù)有限公司