專利名稱：一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧獸醫(yī)學(xué)科中的口蹄疫疫苗研制應(yīng)用領(lǐng)域，特別是一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物。
背景技術(shù)：
口蹄疫病毒能引起多種動(dòng)物的口蹄疫，該病在世界各地廣泛流行，對(duì)于口蹄疫防制一直是世界各國(guó)政府關(guān)注的焦點(diǎn)，國(guó)際上防治口蹄疫的策略歸納起來主要有下列三種①捕殺政策；②捕殺結(jié)合免疫接種政策；③免疫接種政策。
我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，根據(jù)我國(guó)的國(guó)情，目前我國(guó)對(duì)口蹄疫的防疫主要以免疫接種為主，但是存在一些問題，近年來，隨著FMD疫苗用量的不斷加大，用戶在使用過程中的問題也不斷出現(xiàn)，單純靠檢測(cè)抗體很難區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物，因?yàn)槊庖叩膭?dòng)物和自然感染的動(dòng)物都產(chǎn)生抗體。另一方面，基層防疫不能確實(shí)，如何采用一種行之有效的方法以確定疫苗在實(shí)際應(yīng)用過程中的評(píng)價(jià)指標(biāo)，目前檢疫部門沒有一種有效的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無毒無害，性質(zhì)穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定存在于疫苗中，作為口蹄疫疫苗標(biāo)記物，在疫苗成品中能被檢測(cè)，免疫動(dòng)物后能夠有效的檢測(cè)其抗體，為防疫部門的監(jiān)測(cè)提供確實(shí)可行的檢測(cè)方法，同時(shí)為加強(qiáng)免疫動(dòng)物和保護(hù)品牌疫苗產(chǎn)品能夠提供有效手段的一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物，其特征在于主要為卵清蛋白的干粉(Crude DriedEgg White，Grande II，singma)，其組分配比為0.01mg～1mg/ml即每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克到1毫克；其制備方法為用滅菌生理鹽水配成100mg/ml的濃縮液，經(jīng)輻照滅菌后同口蹄疫疫苗抗原、佐劑按1∶10000～1∶100的比例一起乳化配制而成，即得到每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克到1毫克的標(biāo)記物。
本發(fā)明的疫苗標(biāo)記物添加到疫苗中，疫苗沒有生物學(xué)性質(zhì)上的改變，使用方法同疫苗一致，動(dòng)物免疫后同檢測(cè)口蹄疫的抗體一樣進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效的區(qū)分注苗動(dòng)物和自然感染的動(dòng)物，同時(shí)也可以區(qū)分疫苗的生產(chǎn)廠家，為防疫部門提供確實(shí)可行有效的檢測(cè)方法，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
對(duì)于該疫苗標(biāo)記物的免疫劑量進(jìn)行了如下試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1兔體模擬試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物為350～400g的健康兔子，兔子來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。將15只兔子隨機(jī)分為5組，每組3只，將疫苗標(biāo)記物經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化按不同含量進(jìn)行肌肉注射免疫，免疫劑量1ml/只，并于免疫前和免疫后不同時(shí)間采集血清，通過瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗體效價(jià)消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，其具體免疫劑量如下A組0.1mg/ml；B組10mg/ml；C組50mg/ml；D組100mg/ml；E組50mg/ml(不完全弗氏佐劑乳化)；F組空白對(duì)照(等量的生理鹽水)。
瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果A組1∶2～1∶4持續(xù)12周，B組1∶2～1∶4持續(xù)13周，C組1∶2～1∶4持續(xù)14周，在3～15周達(dá)到1∶8，D組第一周沉淀線較弱，從2～12周達(dá)到1∶16～1∶32，E組無沉淀線。
ELISA方法檢測(cè)兔抗標(biāo)記物的抗體，其結(jié)果為A組抗體水平達(dá)到1∶400～1∶12800；B組抗體水平達(dá)到1∶1600～1∶12800；C組抗體水平達(dá)到1∶1600～1∶25600；D組抗體水平達(dá)到1∶12800～1∶25600；E組無抗體。
說明本標(biāo)記物抗原性較好，免疫持續(xù)期較長(zhǎng)，并且與偶蹄獸的親緣性較遠(yuǎn)，所以這種物質(zhì)作為現(xiàn)有疫苗的標(biāo)記物有一定的實(shí)用性。
實(shí)驗(yàn)2豬體免疫檢測(cè)試驗(yàn)在蘭州市雁灘鄉(xiāng)選定一個(gè)符合條件的養(yǎng)豬場(chǎng)，采購(gòu)30頭無疫病、體重在10-15公斤的仔豬，分成6個(gè)組，每組5頭，按不同劑量進(jìn)行免疫，并于免疫前和免疫后不同時(shí)間采集血清，進(jìn)行豬抗標(biāo)記物抗體效價(jià)消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，免疫劑量1ml/只。免疫方法肌肉注射。
A組1mg/ml(每1毫升成品疫苗產(chǎn)品含F(xiàn)MD疫苗標(biāo)記物1mg)。
B組10mg/ml(每1毫升成品疫苗產(chǎn)品含F(xiàn)MD疫苗標(biāo)記物10mg)。
C組、50mg/ml(每1毫升成品疫苗產(chǎn)品含F(xiàn)MD疫苗標(biāo)記物50mg)。
D組、100mg/ml(每1毫升成品疫苗產(chǎn)品含F(xiàn)MD疫苗標(biāo)記物100mg)。
E組、50mg/ml(每1毫升不完全弗氏佐劑含F(xiàn)MD疫苗標(biāo)記物100mg)。
F組、空白對(duì)照(成品疫苗產(chǎn)品中不加FMD疫苗)。
以間接ELISA檢測(cè)血清中標(biāo)記物的抗體在NUNC 96孔酶標(biāo)板中加入50μl(10μg/ml)用碳酸鹽緩沖液配制的標(biāo)記物，過夜包被，用PH＝7.4 0.01％的PBST洗滌五次后加含3％的牛血清白蛋白100μl，37℃條件下30分鐘分閉，用PH＝7.4 0.01％的PBST洗滌五次后加用0.01％的牛血清白蛋白稀釋的被檢血清50μl，血清從第一排至第八排其稀釋濃度1∶20從開始倍比稀釋至1∶2560，其中第一排3-6孔加陰性血清，其稀釋濃度從1∶80開始倍比稀釋至1∶2560，37℃條件下1小時(shí)。用PH＝7.4 0.01％的PBST洗滌五次后加用0.01％的牛血清白蛋白稀釋的兔抗豬IgG酶結(jié)合物(1∶4000)50μl，37℃條件下1小時(shí)，加底物(10mlOPD+50μlH2O2)37℃條件下15min后加1.25％硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其OD值。
從檢測(cè)結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在初免后四周內(nèi)抗體水平不高，但都能達(dá)到一個(gè)小的峰值，而加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，其中C組和D組的抗體水平最高。具體結(jié)果如下A組初免后一周產(chǎn)生抗體，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，最高抗體水平達(dá)1∶320～1∶640，其抗體水平維持18周。
B組初免后一周產(chǎn)生抗體，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，最高抗體水平達(dá)1∶320～1∶1280，其抗體水平維持18周。
C組初免后一周產(chǎn)生抗體，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，最高抗體水平達(dá)1∶640～1∶2560，其抗體水平維持20周。
D組初免后一周產(chǎn)生抗體，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，最高抗體水平達(dá)1∶640～1∶2560，其抗體水平維持20周。
E組初免后一周產(chǎn)生抗體，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，最高抗體水平達(dá)1∶40～1∶80，其抗體水平維持14周。
F組沒有抗體的產(chǎn)出。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
從檢測(cè)結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在初免后四周內(nèi)抗體水平不高，而加強(qiáng)免疫后，第八周抗體水平達(dá)到最高值，其中C組和D組的抗體水平最高?？瞻讓?duì)照組沒有抗體的產(chǎn)生，且于A，B，C，D有顯著的差異。


圖1為抗體消長(zhǎng)情況示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例12003年2月28日，按1mg/ml配苗150000毫升。批號(hào)9002具體過程用滅菌生理鹽水配成100mg/ml的濃縮液，經(jīng)輻照滅菌后同口蹄疫疫苗抗原、佐劑按1∶100的比例一起乳化配制而成，即得到每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白1毫克的標(biāo)記物。
實(shí)施例2配制比例為0.1mg/ml即每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克的標(biāo)記物用滅菌生理鹽水配成100mg/ml的濃縮液，經(jīng)輻照滅菌后同口蹄疫疫苗抗原、佐劑按1∶10000的比例一起乳化配制而成，即得到每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克的標(biāo)記物。
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物，其特征在于它主要采用卵清蛋白的干粉，用滅菌生理鹽水配成100mg/ml的濃縮液，經(jīng)輻照滅菌后同口蹄疫疫苗抗原、佐劑按1∶10000～1∶100的比例一起乳化配制而成，即得到每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克到1毫克的標(biāo)記物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口蹄疫疫苗標(biāo)記物，主要采用卵清蛋白的干粉，用滅菌生理鹽水配成100mg/ml的濃縮液，經(jīng)輻照滅菌后同口蹄疫疫苗抗原、佐劑按1∶10000～1∶100的比例一起乳化配制而成，即得到每毫升濃縮疫苗中含卵清蛋白0.01毫克到1毫克的標(biāo)記物。本發(fā)明的疫苗標(biāo)記物添加到疫苗中，疫苗沒有生物學(xué)性質(zhì)上的改變，使用方法同疫苗一致，動(dòng)物免疫后同檢測(cè)口蹄疫的抗體一樣進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效的區(qū)分注苗動(dòng)物和自然感染的動(dòng)物，同時(shí)也可以區(qū)分疫苗的生產(chǎn)廠家，為防疫部門提供確實(shí)可行有效的檢測(cè)方法，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/125GK1611263SQ20031010425
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月27日
發(fā)明者郭建宏, 戈銀生, 劉湘濤, 馬軍武, 張玉德, 靳野, 黃銀君, 朱培德 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所