專利名稱：含有人參皂苷Rg的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有谷氨酸(glutamate)介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制效果的組合物。具體地，本發(fā)明提供下述抑制谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的組合物該組合物包含選自20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2混合物的人參皂苷。
人參(Panax ginseng C.A.Meyer(Araliaceae))的根——人參不僅是亞洲，也是世界使用最多的生藥之一。人參中具有生物學(xué)效果的成分中，作為人參皂苷或人參皂角甙為已知化合物，已經(jīng)有30種以上的人參皂苷從人參中分離并已知其結(jié)構(gòu)(參照Liu，C.X.等，J.Ethnopharmacol.36，27-38，1996和Baek，N.I.等，Planta Med.1996，62，86-87，1996)。其代表例有人參皂苷-Ra、-Rb1、-Rb2、-Rc、-Rd、-Re、Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2等。
生物體內(nèi)的人參皂甙的各種功能中，最近的研究開始報(bào)告了人參對中樞神經(jīng)的有益效果。已知人參對動物模型的學(xué)習(xí)和記憶力顯示出效果。特別是已知人參能減緩海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷導(dǎo)致的記憶力衰退，已知該細(xì)胞是東莨菪堿(scopolamine)損傷的動物模型或隨著年齡增長而衰退的記憶力、記憶形成的最重要部位(參照Hsieh，M.T.等，Phytother.Res.14，375-377，2000，Wesnes，K.A.，Ward等，Psychopharmacology(Berl)152，353-361，2000和Zhong，Y.M.等，Physiol.Behab.69，511-525，2000)。
除了對學(xué)習(xí)和記憶力的效果外，還報(bào)告了人參對腦出血、腦中風(fēng)和腦缺血等腦疾病的重要有益效果。外部腦損傷或腦血管堵塞誘發(fā)腦損傷時(shí)，腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)——谷氨酸的穩(wěn)定性被破壞，作為谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)毒性而使神經(jīng)細(xì)胞死亡。有報(bào)告(參照Wen，T.C.等，Acta.Neuropathol.(Berl)91，15-22，1996和Maffei Facino，R.等，Planta Med.65，614-619，1999)指出，用人參處理心肌或全腦血管閉塞誘發(fā)腦缺血的動物模型的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以防止神經(jīng)細(xì)胞死亡。
上述人參神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果通過下述事實(shí)進(jìn)一步證明(參照Lim，J.H.等，Neurosci Res.28，191-200，1997和Kim，Y.C.等，J.Neurosci.Res.53，426-432，1998)人參成分之一的人參皂苷Rb1對腦缺血中最容易受損傷的海馬細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞死亡抑制效果，以及人參皂苷Rb1和Rg3對被培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中的谷氨酸引起的神經(jīng)毒性的抑制。
但是，雖然人參對中樞神經(jīng)的上述有益效果已經(jīng)發(fā)表，但目前還不清楚其詳細(xì)機(jī)理，各成分的不同作用也尚處于不明狀態(tài)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是明確人參皂苷對谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，提供含有下述人參皂苷的抑制谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性的組合物直接篩選人參皂苷中對神經(jīng)細(xì)胞中的谷氨酸誘發(fā)神經(jīng)毒性中最重要的NMDA受體具有優(yōu)良抑制效果的人參皂苷，所述組合物含有該皂苷。
為了篩選具有谷氨酸毒性抑制效果的人參皂苷，本發(fā)明人進(jìn)行反復(fù)研究，結(jié)果確定下述事實(shí)20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rg3的代謝產(chǎn)物-20(S)-人參皂苷Rh2，以及它們的混合物對谷氨酸受體亞型-NMDA受體具有優(yōu)良的抑制效果，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供具有抑制谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性效果的組合物，具體地，本發(fā)明提供下述抑制谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性的組合物該組合物包含選自20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2的混合物的人參皂苷。
通過NMDA受體的谷氨酸神經(jīng)毒性是神經(jīng)外傷、腦中風(fēng)、腦溢血時(shí)誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡從而導(dǎo)致腦神經(jīng)非可逆性損傷的最主要的**(Skaper S.D.等，Ann N Y Acad Sci.939，11-22，2001和Massieu L&Garcia O.Neurobiology(Bp)6，99-108，1998)，具有谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制效果的本發(fā)明組合物可以用于治療包括外傷、腦中風(fēng)、腦缺血、中風(fēng)的神經(jīng)疾病和谷氨酸受體過度活化誘發(fā)的癲癇或亨廷頓舞蹈病(ハンチントン病)等腦疾病。
本發(fā)明已經(jīng)明確如下事實(shí)20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2的混合物對谷氨酸、特別是NMDA受體的特異性抑制劑具有優(yōu)良的效果。因此，作為與本發(fā)明最接近的在先研究，被培養(yǎng)的皮質(zhì)細(xì)胞中人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg3抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡的結(jié)果是唯一的(參照Kim，Y.C.等，J.Neurosci.Res.53，426-432，1998)，但在該在先研究中，只對20(S)-人參皂苷Rg3和20(R)-人參皂苷Rg3的混合物的效果進(jìn)行了試驗(yàn)，并沒有提示如本發(fā)明所述的不是混合物的20(S)-人參皂苷Rg3具有優(yōu)良的谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制效果。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明就與外部刺激導(dǎo)致的腦損傷或腦血管閉塞誘發(fā)的腦梗塞、腦出血、中風(fēng)等相關(guān)的谷氨酸誘發(fā)神經(jīng)毒性的初期機(jī)理，對10種主要的人參皂苷進(jìn)行了研究。將海馬神經(jīng)從白鼠懷孕18天到產(chǎn)后1天的狀態(tài)分離后，照射系統(tǒng)在該神經(jīng)細(xì)胞的病理現(xiàn)象中最先觀察到神經(jīng)細(xì)胞死亡，并且所述海馬神經(jīng)作為學(xué)習(xí)和記憶力中最重要的部位而已知。然后，使用在試管條件中培養(yǎng)一周的細(xì)胞。
另外，神經(jīng)細(xì)胞中最主要的神經(jīng)遞質(zhì)——谷氨酸通過NMDA受體、非NMDA受體和代謝性谷氨酸受體3種受體起作用。谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)毒性中，誘導(dǎo)過量鈣進(jìn)入細(xì)胞中的NMDA受體是最重要的，因此，NMDA受體活化時(shí)伴隨的鈣流入，通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+-影像化技術(shù)，NMDA受體介導(dǎo)的離子流入，通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究其初期機(jī)理后，通過現(xiàn)有的神經(jīng)毒性分析方法——酶分析法(MTT分析)確證了人參皂苷成分的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明確認(rèn)的結(jié)果，20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及它們的混合物可有效抑制NMDA受體介導(dǎo)的鈣流入，這點(diǎn)已經(jīng)明確。
因此，含有20(S)-人參皂苷Rg3和/或20(S)-人參皂苷Rh2的谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制組合物可以用于有效治療包括外傷、腦中風(fēng)、腦缺血和中風(fēng)的神經(jīng)疾病和谷氨酸受體過度活化誘發(fā)的癲癇或亨廷頓舞蹈病等腦疾病。
本發(fā)明組合物優(yōu)選按照藥劑學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制成適合于口服的單位給藥型的制劑、注射劑、糖漿劑等形式后服用。
適合于口服用藥的劑型包括硬膠囊、軟膠囊、片劑和散劑等。這些口服制劑中，除了藥物學(xué)活性成分外，還可以包含一種或一種以上沒有藥物學(xué)活性的普通載體，例如含有下列添加劑成分淀粉、乳糖和高嶺土等賦形劑，水、明膠、阿拉伯膠和黃蓍膠等粘合劑，淀粉、藻酸鈉等崩解劑，滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂和液體石蠟等潤滑劑。
另外，本發(fā)明的藥物組合物還可以用作吸入劑、舌下片、局部注入劑、局部涂敷劑、肌肉注射劑、皮下注射劑和皮內(nèi)注射劑。
本發(fā)明組合物的靜脈給藥組合物可以按照常規(guī)方法配制。例如，本發(fā)明組合物可以通過將凍干結(jié)晶溶于生理鹽水、蒸餾水、磷酸緩沖液等制成靜脈給藥制劑，也可以使用脂肪乳劑、脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明組合物一天的給藥量隨給藥對象的年齡、健康狀態(tài)和并發(fā)癥等多種因素而變化，以成人為基準(zhǔn)時(shí)，一般將5～1000mg，優(yōu)選10～500mg，更優(yōu)選50～500mg活性成分在一天分1～2次給藥。但是，可以根據(jù)腦神經(jīng)疾病領(lǐng)域主治醫(yī)生的判斷施用上述用量以外的給藥量。
本發(fā)明組合物中包含的人參皂苷是從生藥人參中提取的成分，對人體使用具有安全性，這是本領(lǐng)域人員公知的。
附圖簡述

圖1a是利用Ca2+-成像技術(shù)測定的NMDA受體活性測定圖，圖1b是用相同方法利用人參皂苷總成分(GTS)和現(xiàn)有已知的NMDA受體拮抗劑D-APV(D(-)-2-氨基-5-膦?；焖?測定的NMDA受體活性測定圖。
圖2表示用圖1的方法檢查人參的10種主要人參皂苷成分(C-20位異構(gòu)體未分離的狀態(tài))后，將最好的成分用全細(xì)胞膜片鉗(whole-cellpatch-clamp)方法，通過NMDA受體介導(dǎo)流入電流確認(rèn)的結(jié)果圖。
圖3表示在利用酶的神經(jīng)毒性分析法(MTT分析)中，人參皂苷Rg3的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果圖。
圖4是生物體中存在的微生物代謝的20(S)-人參皂苷的分解圖。
圖5表示圖4所示的共9種20(S)-人參皂苷的NMDA受體介導(dǎo)鈣流入的減少效果。
圖6表示20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷-Rh2的混合物具有比各人參皂苷單一成分更優(yōu)良的NMDA受體抑制效果圖。
實(shí)施例1海馬神經(jīng)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法將懷孕18天到產(chǎn)后1天白鼠的海馬神經(jīng)組織在解剖顯微鏡下分離，往Leibovitz L-15培養(yǎng)基中加入0.05％的木瓜蛋白酶，在37℃處理20分鐘。然后，將酶溶液洗滌數(shù)次后，調(diào)整巴斯德吸移管的空隙大小，用聚-L-賴氨酸(0.5mg/ml)處理機(jī)械分離的海馬單一神經(jīng)細(xì)胞，在條狀蓋片上用1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml進(jìn)行培養(yǎng)。
將細(xì)胞在添加了下列成分的Neurobasla/B27培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5mM L-谷氨酰胺、25μM-谷氨酸、25μM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。每周兩次用未添加谷氨酸的培養(yǎng)基替代其1/2進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7～15天后用于實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的測定用乙酰氧基甲基酯形態(tài)的フラ一2(フラ一2/AM；分子探針，美國俄勒岡州Eugene公司產(chǎn)品)作為熒光性Ca2+標(biāo)記物。用HEPES緩沖溶液(單位mM150 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、2CaCl2、10HEPES、10葡萄糖，pH＝7.4)，將海馬神經(jīng)細(xì)胞與5μMフラ一2/AM和0.001％Pluronic F-127一起在室溫進(jìn)行40～60分鐘一次培養(yǎng)和標(biāo)記后，用HEPES緩沖溶液洗滌數(shù)次。穩(wěn)定10分鐘后用倒像顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
具體地，用氙孤燈進(jìn)行照射，通過電腦控制過濾輪(computer-controlledfilter wheel)(美國加利福尼亞州Sutter Instruments公司產(chǎn)品)將激發(fā)波長(340nm和380nm)選擇性地在細(xì)胞上暴露。以每2秒的間隔獲得數(shù)據(jù)，在曝光部位設(shè)置按鈕，防止給細(xì)胞帶來光毒性。通過515nm高頻區(qū)域通過濾波器(long-passfilter)進(jìn)入的發(fā)射熒光(emitter fluorescence light)，經(jīng)由CCD照相機(jī)，通過數(shù)字熒光分析器轉(zhuǎn)變成比率值和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)值。所有影像數(shù)據(jù)和分析，利用Universal Imaging軟件(美國賓夕法尼亞州West Chester公司)而得到。
實(shí)施例3利用電生理學(xué)方法測定NMDA受體介導(dǎo)膜電流利用穿孔膜片鉗(perforated patch-clamp)法進(jìn)行所有細(xì)胞的電壓鉗記錄。室溫下在海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞膜和電極間形成千兆歐姆密封，使電流不往外流，然后固定膜電位等待約10分鐘后測定細(xì)胞膜電流。膜片(パツチ)電極的電阻保持在3～4MΩ，用120葡萄糖酸鉀、20 NaCl、2MgCl2、10HEPES、pH＝7.4(單位mM)將內(nèi)部溶液充滿。
作為僅使一價(jià)離子通過細(xì)胞膜而通電的溶液，將真菌素(Nystatin)原液(25mg/ml)稀釋至濃度為250μg/ml，加入內(nèi)部溶液中。根據(jù)需要，往細(xì)胞膜電流測定溶液(單位mM150 NaCl、5KCl、2CaCl2、10HEPES、10葡萄糖，pH＝7.4)中，加入用于活化NMDA受體的0.001mM甘氨酸，除去Mg2+后使用。細(xì)胞膜電壓記錄利用EPC-9放大器和Pulse/Pulsefit軟件(HEKA，德國)測定。
實(shí)施例4利用NMDA受體介導(dǎo)的鈣流入檢查NMDA受體抑制劑海馬神經(jīng)細(xì)胞中，通過NMDA受體活化的NMDA受體抑制劑篩選方法如實(shí)施例2中所說明，使用稱為fura-2/AM的鈣依賴性染料的Ca2+-成像技術(shù)。
每次短期施用NMDA時(shí)，NMDA受體活化引起鈣流入細(xì)胞內(nèi)。因此，每4～5分鐘給實(shí)施例1中準(zhǔn)備的海馬神經(jīng)細(xì)胞施用NMDA 12次或更多次，觀察細(xì)胞內(nèi)的鈣流入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ca2+保持恒定值且沒有出現(xiàn)靈敏度下降。用公知的NMDA受體拮抗劑-D-APV和人參總皂苷成分(GTS)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，Ca2+濃度明顯受抑制(圖1)，因此用作人參成分的NMDA受體抑制劑的篩選系統(tǒng)。
人參的主要皂苷成分中，將10種人參皂苷(人參皂苷-Rb1、-Rb2、Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2)進(jìn)行一次檢索，在沒有分離C-20位的異構(gòu)體的狀態(tài)下進(jìn)行檢索的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3的NMDA受體抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它的人參皂苷成分(圖2a和2b)。
人參皂苷Rg3的NMDA受體抑制效果不僅直接測定鈣的流入，還能直接測定NMDA受體介導(dǎo)的電流流入。采用實(shí)施例3記載的電生理學(xué)全細(xì)胞膜片鉗方法可以確認(rèn)(圖2d)，IC50濃度為3.8μM并且表現(xiàn)出依賴性(圖2c)。
如上所述，圖2a～2c的實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)海馬細(xì)胞施用NMDA時(shí)(5～10秒)，NMDA活化導(dǎo)致的鈣流入可通過Ca2+-成像技術(shù)進(jìn)行測定，除上述Ca2+離子流入以外，NMDA受體活化使NA+離子等流入細(xì)胞內(nèi)，從而形成流入電流，圖2d表示人參皂苷Rg3對該流入電流的抑制。圖2的結(jié)果是人參皂苷Rg3阻斷NMDA受體活化時(shí)流入的離子等流入，由此表現(xiàn)出抑制作用。除濃度依賴性實(shí)驗(yàn)外，其它實(shí)驗(yàn)所用的人參皂苷給藥量均為10μM。
為了測定神經(jīng)細(xì)胞中由NMDA導(dǎo)致的細(xì)胞興奮毒性所決定的細(xì)胞生存率，進(jìn)行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)分析。將進(jìn)行過一次培養(yǎng)的白鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞在24孔平板中培養(yǎng)6～14天，然后，將GTS(100μg/ml)和Rg3(10μM)用含有1μM甘氨酸的未添加Mg2+的緩沖液進(jìn)行1分鐘預(yù)處理后，將NMDA同時(shí)處理10分鐘并作為正常培養(yǎng)液進(jìn)行交換。處理24小時(shí)后，將PBS溶解的MTT(1mg/ml)50μl用于進(jìn)行直接培養(yǎng)的細(xì)胞處理，MTT處理4小時(shí)后，除去上清液，將被代謝的甲朁溶于100μl二甲亞砜(DMSO)。用自動分光光度計(jì)平板讀數(shù)器(Automatedspectrophotometric plate reader)測定560nm處的吸光度。
通過上述MTT分析法的分析結(jié)果證明，NMDA受體拮抗劑——D-APV、人參總皂苷成分(GTS)、人參皂苷Rg3能有效提高對NMDA誘發(fā)的神經(jīng)毒性的細(xì)胞存活能力(圖3)。
人參中本身存在30多種人參皂苷，但其中的各種成分可在機(jī)體內(nèi)的代謝過程中由其前體物質(zhì)追加生成(圖4)，以上述1次結(jié)果為基礎(chǔ)，對人胃腸中存在的微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，特別是以紅參中特異性存在的成分為中心，補(bǔ)充研究了C-20位(S)構(gòu)型的純水合物(純水化合物)對海馬神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體的效果。
人參皂苷成分的C-20位(S)構(gòu)型純水合物的檢查中，利用20(S)-人參皂苷-Rb1、-Rd、-Rg1、-Rg3、-Rh1、-Rh2，20(S)-原人參萜二醇(protopanaxadiol)、20(S)-原人參萜三醇(protopanaxatriol)和化合物K共9種化合物，按照圖2a～2c同樣的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，其中對NMDA受體活性表現(xiàn)出最好效果的化合物為20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2(圖5)。
為了研究20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2的混合物的效果，分別將1μM的人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2按1∶1的比例混合后，按照圖2a～2c同樣的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示，上述混合物表現(xiàn)出比各人參皂苷單一成分更好的NMDA受體抑制效果(圖6a是從單一細(xì)胞獲得的結(jié)果，圖6b表示從各細(xì)胞所得的結(jié)果和統(tǒng)計(jì)類似性(n＞9))。
下述表1比較了人參總皂苷成分(GTS)、C-20位異構(gòu)體未分離的人參皂苷Rg3和人參皂苷Rh2、20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2對NMDA受體介導(dǎo)的鈣流入的抑制作用，表示人參皂苷Rg3的C-20位異構(gòu)體不論是S構(gòu)型還是R構(gòu)型，或其混合物，其生物體效能相同，相反，人參皂苷Rh2中，20(S)-構(gòu)型呈現(xiàn)比混合物更好的效果。
表1


發(fā)明的效果本發(fā)明詳細(xì)研究了20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及兩者混合物對神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理及其效能，本發(fā)明的組合物具有優(yōu)良的神經(jīng)毒性抑制或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果，因此，可以用于治療腦外傷、腦中風(fēng)、腦缺血、中風(fēng)、癲癇、阿耳茨海默病和亨廷頓舞蹈病等。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制組合物，該組合物含有選自20(S)-人參皂苷Rg3、20(S)-人參皂苷Rh2以及20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2的混合物的人參皂苷。
2.按照權(quán)利要求1中所述的組合物，其中含有20(S)-人參皂苷Rh2。
3.按照權(quán)利要求1中所述的組合物，其中含有20(S)-人參皂苷Rg3和20(S)-人參皂苷Rh2的混合物。
4.按照權(quán)利要求1中所述的組合物，其可用于治療腦外傷、腦中風(fēng)、腦缺血、中風(fēng)、癲癇、阿耳茨海默病或亨廷頓舞蹈病。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性抑制效果的組合物。具體地說，本發(fā)明提供一種抑制谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性組合物，該組合物是包含20(S)－人參皂苷Rg
文檔編號A61P9/10GK1498622SQ20031010430
公開日2004年5月26日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月26日
發(fā)明者林惠媛, 金善晤 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院