專利名稱：生物可降解聚酯和生物活性多肽的離子型分子共軛物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種持續(xù)釋放的藥物組合物，尤其是該組合物包括與生物活性多肽離子共軛的游離COOH基團(tuán)的聚酯。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及持續(xù)釋放的生物活性多肽。
已經(jīng)對許多藥物傳送系統(tǒng)的藥物組合物的體內(nèi)控制釋放進(jìn)行了開發(fā)、試驗(yàn)和應(yīng)用。例如，已將諸如聚(DL-乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(ε-己內(nèi)酯)的聚酯和其它各種共聚物用于從生物學(xué)上釋放諸如孕酮的活性分子；這些已被用于微膠囊、薄膜或棒條的劑型(Pitt CG，Marks，TA，和Schindler，A.1980)中。在聚合物/治療劑組合物的植入中，例如皮下或肌內(nèi)，該治療劑釋放特定的時間。將這種生物相容性生物可降解聚合系統(tǒng)設(shè)計(jì)為允許所截留的治療劑從聚合物基質(zhì)擴(kuò)散。在治療劑的釋放時，該聚合物在體內(nèi)降解，以避免植入的外科去除。雖然影響聚合物降解的因素不是很明確，但人們認(rèn)為聚酯的降解可能是通過酯鏈達(dá)到聚合物成分的非酶自催化水解而進(jìn)行調(diào)節(jié)的。
一些EPO出版物和美國專利已論述了有關(guān)聚合物基質(zhì)設(shè)計(jì)和其在調(diào)節(jié)治療劑的體內(nèi)釋放速度和范圍的作用。
例如，Deluca(EPO出版物0 467 389 A2/Kentucky大學(xué))描述了疏水生物可降解聚合物和蛋白質(zhì)或多肽之間的物理作用。所形成的組合物是治療劑和疏水聚合物的混合物，它進(jìn)入受治療者體內(nèi)后可從基質(zhì)持續(xù)其擴(kuò)散釋放。
Hutchinson(美國專利4,767,628/ICI)通過在聚合物裝置中的均勻分散對治療劑的釋放進(jìn)行控制。證實(shí)了這種制劑是通過重復(fù)下列兩個階段來控制連續(xù)釋放的首先，藥物從制劑表面的擴(kuò)散依賴性滲出；其次，通過聚合物的降解所誘導(dǎo)的含水通道釋放。

發(fā)明內(nèi)容
一般而言，本發(fā)明的特征在于提供一種包括含有與生物活性多肽離子共軛的游離COOH基團(tuán)的聚酯的持續(xù)釋放藥物制劑，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中組合物中至少50％重量的多肽與聚酯進(jìn)行離子共軛。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對聚酯改性以增加大于1的羧基與羥基末端基團(tuán)的比例、并達(dá)到無限大，即所有羥基基團(tuán)可用羧基取代。適合的聚酯的例子為那些來源于下列化合物者，例如，L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯(TMC)、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、(β-羥丁酸酯)、和任何上述的旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物，其中取代的TMC是用(C1-C4)烷基取代，優(yōu)選甲基。也可使用與傳統(tǒng)的聚酯相關(guān)的其它雜鏈聚合物(例如，聚原酸酯、聚原碳酸酯和聚乙縮醛)。
優(yōu)選的是，通過多羧酸與蘋果酸、檸檬酸或酒石酸的反應(yīng)來制備該聚酯。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用戊二酸酐使聚酯部分酸封端。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，用戊二酸酐使聚酯完全酸封端。優(yōu)選該聚酯的平均聚合度為10-300，更優(yōu)選是20-50。
本發(fā)明的離子型分子共軛物優(yōu)選由多羧酸封端聚酯與含有至少一個有效的離子型胺基團(tuán)的一元和多元生物活性多肽制備而成?；蛘撸梢詫⑷魏尉埘ビ糜谛纬杀景l(fā)明的離子型分子共軛物，條件是用適當(dāng)?shù)膲A如NaOH對其進(jìn)行預(yù)處理。而且，可以使用任何酸穩(wěn)定性肽，例如生長激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRH)、抑生長素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、降鈣素、緩激肽、神經(jīng)節(jié)肽、促黑激素(MSH)、生長激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡肽、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)、高血糖素、神經(jīng)降壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)、胃動素、P物質(zhì)、Y神經(jīng)肽(NPY)、TSH及其類似物和片段。這種離子型分子共軛物可在體內(nèi)以預(yù)定速度釋放其生物活性成分，該預(yù)定速度由化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量和這些共軛物的兩種成分的pKa確定。藥物釋放的機(jī)制需要使不溶性共軛物形式轉(zhuǎn)化為水溶性成分，盡管部分是通過疏水聚酯的水解而實(shí)現(xiàn)的。因此，生物活性多肽的釋放不會隨以下而增加(a)生物活性多肽和聚酯之間的pKa差異，(b)羰基親核性所影響的聚酯鏈的化學(xué)反應(yīng)性，(c)聚酯密度的降低，因?yàn)樗婕安ＡЩD(zhuǎn)變溫度和最小的可結(jié)晶性，和(d)基質(zhì)親水性增強(qiáng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽包括總重量為1-50％的離子型分子共軛物，優(yōu)選大于85％，更優(yōu)選是95％，還更優(yōu)選是99％，其中該組合物中的多肽與聚酯離子共軛；離子型分子共軛物的聚酯成分在氯仿中的粘度約為0.05-0.7dl/g；聚酯的平均分子量約為1200-40,000。
可以很容易將本發(fā)明聚合離子型分子共軛物制成可注射的微球體或微粒，以及可植入的薄膜或棒條，而不需利用多相乳液或非水兩相系統(tǒng)處理。優(yōu)選通過以下方法制備微粒(a)將組合物溶解在非質(zhì)子傳遞的水混溶性有機(jī)溶劑中；(b)在水中混合有機(jī)溶劑；和(c)從水中分離微粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑選自丙酮、乙腈、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、和二甲氧基乙二醇。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚酯/多肽離子型分子共軛物可在體內(nèi)釋放治療上有效量的生物活性多肽達(dá)至少20天以上，更好的優(yōu)選是達(dá)95天但不少于7天。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，離子型分子治療共軛物的釋放本質(zhì)上是單相的。
本發(fā)明的持續(xù)釋放組合物優(yōu)選通過以下方法制成(a)提供含游離COOH基團(tuán)的聚酯和含至少一種有效的離子型胺的生物活性多肽，和(b)將聚酯與多肽離子共軛以形成離子型分子共軛物，其中組合物中至少85重量％的多肽與聚酯共軛。該聚酯可以具有足夠的起始游離COOH基團(tuán)，或者，如果最初得不到用于所需的承載肽水平的足夠的這些基團(tuán)，該聚酯可以(1)通過酯化作用或功能交換與例如蘋果酸、檸檬酸或酒石酸反應(yīng)，或(2)封端的酸與例如戊二酸酐或(3)可用堿例如NaOH處理該聚酯以暴露酸基團(tuán)。最后，可以將聚酯/多肽離子型分子共軛物轉(zhuǎn)化為可植入的薄膜或棒條、或者能在體內(nèi)釋放多肽的可注射的微球體或微粒。
優(yōu)選在預(yù)定濃度的多羧酸羥基酸例如蘋果酸、檸檬酸或酒石酸存在下，通過催化或自催化一種或多種羥基酸如乙醇酸和乳酸的直接縮合作用來合成聚酯。如此形成的聚酯具有酸封端的羥基端基，該端基優(yōu)選為部分或全部酸封端。
也可通過下列方法合成聚酯在諸如羥基多羧酸的鏈引發(fā)劑存在下，催化內(nèi)酯的開環(huán)聚合、或催化環(huán)狀單體的聚合，該單體例如ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮。
另一種合成方法包括將羥基酸與環(huán)狀二聚物反應(yīng)、然后在多羧酸存在下進(jìn)行開鏈系統(tǒng)的縮合作用。
還有另一種合成方法包括將有機(jī)多羧酸與預(yù)先形成的聚酯反應(yīng)。
在上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，酸封端的聚酯具有羧基與羥基端基的比例大于1且達(dá)到無限大(即排除所有羥基)，其平均聚合度為10-300，特別優(yōu)選的實(shí)施方案為20-50。
或者，通過用堿例如NaOH處理能使聚酯與生物活性多肽形成一種離子型分子共軛物。
優(yōu)選通過聚酯(如游離形式)與多肽(如游離形式)在適當(dāng)?shù)囊后w介質(zhì)中的直接相互作用來合成聚酯/多肽離子型分子共軛物。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，形成共軛物的適合的溶劑是一定比例的非質(zhì)子傳遞溶劑[例如，丙酮、四氫呋喃(THF)、乙二醇二甲醚]和適當(dāng)?shù)挠糜陔牡娜軇?如，水)的混合物，以便這兩種系統(tǒng)可以混溶。多肽優(yōu)選pKa大于或等于3.5的一元羧酸的鹽。優(yōu)選多肽具有至少一個有效的離子型胺基團(tuán)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽占聚酯/多肽離子型分子共軛物的1-50重量％，優(yōu)選10-20重量％。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用堿金屬離子或有機(jī)堿使聚酯的可使用羧基部分中和。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，堿處理可提供聚酯的鏈離解和低分子量接合點(diǎn)的形成。
另一方面，本發(fā)明涉及含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1的聚酯(稱作聚酯A)，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物，條件是檸檬酸、ε-己內(nèi)酯和乙交酯為聚酯的組成部分。前面所述聚酯的優(yōu)選方式(稱作聚酯B)為其中該聚酯包括檸檬酸、ε-己內(nèi)酯和乙交酯。剛才前面所述聚酯的優(yōu)選方式(稱作聚酯C)是其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與乙交酯的比例為90ε-己內(nèi)酯∶10乙交酯至99ε-己內(nèi)酯∶1乙交酯者。剛才前面所述聚酯的優(yōu)選聚酯(稱作聚酯D)是其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與乙交酯的比例為97ε-己內(nèi)酯∶3乙交酯者。
另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的聚酯A、聚酯B、聚酯C或聚酯D，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素、鈴蟾肽/GRP、降鈣素、緩激肽、神經(jīng)節(jié)肽、MSH、GRF、糊精、速激肽、胰泌素、PTH、CGRP、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、PTHrP、胰高血糖素、神經(jīng)降壓素、ACTH、GHRP、GLP、VIP、PACAP、腦啡肽、PYY、胃動素、P物質(zhì)、NPY、TSH和其類似物或片段。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素和其類似物或片段。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中LHRH類似物為式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且抑生長素為式H2N-β-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中抑生長素類似物的兩個Cys殘基相互結(jié)合。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中組合物為棒條形。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中棒條具有聚酯層。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中包覆棒條的聚酯是可吸收的聚酯。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中可吸收的聚酯包含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中包覆棒條的可吸收聚酯與組合物中所包含的聚酯相同。
還有一方面，本發(fā)明涉及一種包含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1的聚酯(稱作聚酯E)，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物，條件是酒石酸是該聚酯的組成部分。前面所述聚酯的優(yōu)選方式(稱作聚酯F)為其中聚酯包括L-乳酸或D-乳酸；或其中聚酯包括L-乳酸或D-乳酸和乙醇酸。聚酯E的另一個優(yōu)選方式(稱作G)是其中聚酯包括酒石酸、ε-己內(nèi)酯和碳酸亞丙基酯。剛才前面所述聚酯的優(yōu)選方式(稱作聚酯H)是其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與碳酸亞丙基酯的比例為90ε-己內(nèi)酯10碳酸亞丙基酯至99ε-己內(nèi)酯1碳酸亞丙基酯者。剛才前面所述聚酯的優(yōu)選方式(稱作I)是其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與碳酸亞丙基酯的比例為98ε-己內(nèi)酯2碳酸亞丙基酯者。
還有一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽離子共軛的聚酯E、聚酯F、聚酯G、聚酯H或聚酯I，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中組合物中至少50％重量的多肽與聚酯進(jìn)行離子共軛。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素、鈴蟾肽/GRP、降鈣素、緩激肽、神經(jīng)節(jié)肽、MSH、GRF、糊精、速激肽、胰泌素、PTH、CGRP、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、PTHrP、胰高血糖素、神經(jīng)降壓素、ACTH、GHRP、GLP、VIP、PACAP、腦啡肽、PYY、胃動素、P物質(zhì)、NPY、TSH和其類似物或片段。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素和其類似物或片段。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中LHRH類似物為式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且抑生長素為式H2N-β-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中抑生長素類似物的兩個Cys殘基相互結(jié)合。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中組合物為棒條形。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中該棒條具有聚酯層。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中可吸收的聚酯包含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物。
剛才前面所述組合物的優(yōu)選方式是，其中包覆棒條的可吸收聚酯與組合物中所包含的聚酯相同。
本文所用的“多肽”是指蛋白質(zhì)、肽、寡肽或合成寡肽。
本文所用的“多羧酸”是指具有一個以上羧基的化合物，例如蘋果酸、檸檬酸和酒石酸。
本文所用的“平均聚合度”是指重復(fù)單體序列數(shù)。
本文所用的“有效離子型胺”是指含有至少一個在通常條件下能形成離子的胺基團(tuán)的多肽。
本文所用的“酸封端”是指具有酸末端的化合物。
本文所用的“部分酸封端”是指具有1-99％酸封端的羥基末端基團(tuán)的化合物。
本文所用的“全部酸封端”是指具有99.9％以上酸封端的羥基的化合物。
本文所用的“羥基酸”是指任何含羥基和羧基的化合物。
本文所用的“一元羧酸羥基酸”是指具有一個羧基和一個或多個羥基的有機(jī)酸。
本文所用的“多羧酸羥基酸”是指具有一個以上羧基的羥基酸。
本文所用的“有機(jī)共沸劑”是指與水共蒸餾的有機(jī)液體。
本文所用的“生物活性的”是指引起或產(chǎn)生生物活動的分子。
本文所用的“無環(huán)化”是指由開環(huán)所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。
本文所用的“縮聚”是指通過兩個或多個分子的縮合形成聚酯。
本文所用的“可吸收的”聚酯是指在生物學(xué)環(huán)境中進(jìn)行鏈離解成為水溶性副產(chǎn)物的水不溶性聚酯。
本發(fā)明提供了一種新的藥物組合物，該組合物使生物相容性的生物可降解聚酯與作為均勻離子種類的寡肽、多肽、肽和/或蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)結(jié)合。通過不同分子量的聚酯與治療劑進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，可使該組合物的化學(xué)特性更為精確以適合體內(nèi)的生物學(xué)活性多肽分子的單相控制釋放的需要。而且，使本發(fā)明組合物易于達(dá)到最佳以具備承載較多治療上的活性多肽的功能特性。
從下面詳述的優(yōu)選實(shí)施方案和從權(quán)利要求書中可以很顯然地看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。


圖1表示多羧酸封端的丙交酯/乙交酯(蘋果酸型)共聚物的異構(gòu)體的圖；圖2表示描述丙交酯/乙交酯(蘋果酸型)共聚物與Somatuline(BIM-23014)之間的化學(xué)相互作用的離子型分子共軛物的圖；圖3是描述在37℃下28天內(nèi)從離子型分子共軛物釋放進(jìn)入PBS緩沖劑中的肽百分?jǐn)?shù)的圖。
具體實(shí)施例方式
通過適當(dāng)選擇組成的單體、共聚用單體或共用鏈節(jié)(comers)以形成具有預(yù)定組合物和分子量的鏈，制備具有所需的化學(xué)反應(yīng)性的本發(fā)明生物可降解的或可吸收的聚酯以提供控制的鏈水解性，并且它具有與在生理學(xué)pH下具有凈正電荷的寡肽、多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的最大能力。
在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，采用三部分合成設(shè)計(jì)制備本發(fā)明組合物。這些步驟包括(1)多羧酸封端聚酯的合成；(2)通過多羧酸封端聚酯(或用堿處理的聚酯)與生物學(xué)活性多肽的離子相互作用合成聚酯/多肽離子型共軛物；和(3)將離子型共軛物轉(zhuǎn)化為能在體內(nèi)釋放治療劑至少7天的植入物、棒條、微球體或微粒。
(1)多羧酸封端聚酯的合成通過下列方法合成本發(fā)明的多羧酸封端聚酯鏈，例如2-羥基酸與多羧酸有機(jī)酸的直接縮合，無環(huán)化產(chǎn)物的逐步生長聚合，丙交酯或丙交酯混合物的開環(huán)聚合，或多羧酸有機(jī)酸與預(yù)先形成的高分子量聚酯的功能交換(參見圖1)。通過上述所遵循的這些方法對多羧酸封端聚酯的合成進(jìn)行描述。
通常是通過在部分多羧酸羥基酸存在下、在裝備有連續(xù)干氮?dú)饬骱腿鏀嚢璧牟ＡХ磻?yīng)器中加熱一元羧酸羥基酸或者兩種或多種一元羧酸羥基酸的混合物來完成在有或沒有無機(jī)或有機(jī)金屬催化劑存在下、旋光活性形式和/或無活性形式的2-羥基酸與預(yù)定量的多羧酸有機(jī)酸的直接縮合，例如乙醇酸、DL-乳酸和DL-蘋果酸的縮合(稱作IA型聚酯，參見表I)。典型的是，縮聚反應(yīng)在150-170℃下進(jìn)行4-72小時。通過磁性攪拌器或使經(jīng)聚酯物質(zhì)的氮?dú)夤呐菘墒狗磻?yīng)混合物得到攪拌。連續(xù)聚合直至得到所需平均分子量(根據(jù)溶液粘度確定)和/或酸數(shù)目(由端基滴定而確定)。按照如下進(jìn)行通過端基滴定的聚酯分析。精確稱量聚酯樣品(300mg-500mg)并將其溶解在最小量(10-30ml)丙酮中。溶解后用苯甲醇(Mallinckrodt，分析試劑)將溶液稀釋至100ml，并使用苯甲醇溶液中的氫氧化鉀(對HCI標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化)滴定至淡桃紅色終點(diǎn)(酚酞)。將用于樣品的堿溶液的體積(ΔVs)與用于空白溶劑的堿體積(ΔVo)相比以測定聚酯的酸數(shù)目。
聚合結(jié)束時，從適合的有機(jī)溶液中分離聚酯并用水或稀釋的氫氧化鈉水溶液萃取，以去除水溶性或可溶解的低分子量鏈。
按如下進(jìn)行通過GPC的聚酯分析。使用Waters Model 6000溶劑傳送泵和Dynamax(Rainin)型UV-D檢測器、通過GPC測定聚酯的平均分子量(MW)。于25℃下在四氫呋喃(Burdick和Jackson UV級)中用Jordi GelDVB 1000A，50cm×10mm柱(Jordi Associates)以1.2ml/分鐘的流速進(jìn)行試驗(yàn)。在220nm和1.0AUFS下測定峰值。于Mw＝4000、9,200和25,000用窄譜帶聚苯乙烯參考標(biāo)準(zhǔn)(Polysciences Inc.)校準(zhǔn)該柱。
直接縮合方法的改進(jìn)需要使用有機(jī)共沸劑和離子交換樹脂作為縮合催化劑(稱作IB型聚酯，參見表I)。此方法需要過濾和蒸發(fā)步驟以分別去除催化劑和共沸劑。由這些方法所制備的聚酯的例子和相關(guān)的分析數(shù)據(jù)如表1所述。
表1通過直接縮合方法制備的聚酯IA型聚酯聚合物#加樣聚合條件 酸#ηinhTg，℃*1L-乳酸(88％) 35.7gm(0.349M) 100℃/0.7hr 5630.24 11乙醇酸 4.65gm(0.612M) 165℃/17.5hrs檸檬酸 1.75gm(0.0091M)2L-乳酸(88％) 25.6gm(0.25M) 165℃/22hrs 8200.14 27乙醇酸 19.2gm(0.25M)蘋果酸 1.5gm(0.011M)IB型聚酯3L-乳酸(88％) 25.6gm(0.25M) 132℃/53hrs 8420.11 15乙醇酸 19.2gm(0.25M)檸檬酸 2.13gm(0.011M) 用Dean-Stark阱，大孔樹脂傾析、在丙酮中過(Amberlyst) 濾、干燥、用水洗催化劑Beads#15 0.5gm 滌并真空干燥甲苯 150ml
4L-乳酸(88％)25.6gm(0.25M)132℃/68hrs1421 0.2028乙醇酸 19.2gm(0.25M)蘋果酸 1.5gm(0.011M)用Dean-Stark阱，大孔樹脂 傾析、過濾、干燥、甲苯100ml用水洗滌并真空干燥*在氮?dú)夥罩杏?-10mg樣品和10℃/分鐘的加熱速率根據(jù)差示掃描熱量計(jì)(TA 2100 DSC)測定。
除了使用一元羧酸羥基酸、二羥基酸的環(huán)二聚物和羥基聚羧酸的混合物，無環(huán)化產(chǎn)物的逐步生長聚合基本上與上述聚合方法相同，其中令羥基酸與環(huán)二聚物反應(yīng)，隨后在預(yù)定量的多羧酸存在下和在有或無適合的縮合催化劑如乙醇酸、L-乳酸和DL-蘋果酸存在下所得到的開鏈系統(tǒng)的縮合。通過這種方法制備的聚酯的例子和相關(guān)的分析數(shù)據(jù)如表II所述。當(dāng)用水預(yù)處理環(huán)二聚物時，按照簡單的逐步生長聚合處理該系統(tǒng)。
表II無環(huán)化產(chǎn)物的逐步生長聚合作用II型聚酯聚合物# 加樣聚合條件酸# ηinhTg，℃*1L-丙交酯單體10.0gm(0.07M) 160℃/29hrs 1200 0.21 20乙醇酸 10.7gm(0.14M)蘋果酸 0.79gm(0.0061M)2L-丙交酯單體20.0gm(0.139M) 25-155℃/1.5h1800 0.13 27乙醇酸 7.1gm(0.093M) 155℃/70hr蘋果酸 1.01gm(0.0075M)溶解在DCM中，用水洗滌并真空干燥
*在氮?dú)夥罩杏?-10mg樣品和10℃/分鐘的加熱速率根據(jù)差示掃描熱量計(jì)(TA 2100 DSC)測定。
在作為鏈引發(fā)劑的預(yù)定濃度的羥基多羧酸和催化量的有機(jī)金屬催化劑例如存在于辛酸亞錫中的L-乳酸、乙交酯和DL-蘋果酸的混合物存在下的內(nèi)酯或內(nèi)酯混合物的開環(huán)聚合采用了干燥的環(huán)狀單體或環(huán)狀單體、羥基多羧酸和微量辛酸亞錫(使用0.33M甲苯溶液)的混合物，在干燥的無氧氣氛中將它們轉(zhuǎn)移至裝有磁性或機(jī)械攪拌的玻璃反應(yīng)器中。適當(dāng)加熱系統(tǒng)后在氮?dú)夥罩欣^續(xù)聚合反應(yīng)直至得到所需的分子量(根據(jù)溶液粘度測定)。在聚合反應(yīng)結(jié)束時，降低溫度并在減壓下蒸餾未反應(yīng)的單體。然后將聚酯物質(zhì)冷卻并通過低溫萃取從適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶液中去除水溶性低分子量部分。然后干燥溶液并去除溶劑。再根據(jù)比濃對數(shù)粘度測定分子量并根據(jù)端基滴定測定酸數(shù)目。通過這種方法制備的聚酯的例子和相關(guān)的分析數(shù)據(jù)如表III所示。
表III通過開環(huán)聚合制備的聚酯III型聚酯聚合物# 加樣聚合條件 酸# ηinhTg，℃*1 乙交酯 3.22gm(0.028M) 120℃/0.5hr 2,150 0.79**38L-丙交酯 10.7gm(0.14M) 150℃/6hrs蘋果酸 0.79gm(0.0061M)120℃/11hrs2 乙交酯 2.84gm(0.0245M)120℃/0.5hrs 1,206 0.08 26DL-丙交酯20.0gm(0.139M) 180℃/2.5hrs蘋果酸 0.876gm(0.00541M) 130℃/15hrs3 乙交酯 2.84gm(0.0245M)155℃/1hr 937 0.10 27DL-丙交酯20.0gm(0.139M) 185℃/2.5hrs檸檬酸 1.256gm(0.00654M) 190℃/2.5hrs160℃/13hrs4 乙交酯 8.06gm(0.0694M)180℃/1hr 970 0.26 23
DL-丙交酯10.0gm(0.0694M) 185℃/2hrs蘋果酸 0.744gm(0.00555M) 195℃/7hrs120℃/9hrs5 乙交酯 8.06gm(0.0694M) 150℃/0.5hr 10,138 0.39 30DL-丙交酯10.0gm(0.0694M) 185℃/4hrs1，6-己二醇 0.656gm(0.00555M) 150℃/1.5hrs120℃/3hrs*在氮?dú)夥罩杏?-10mg樣品和10℃/分鐘的加熱速率根據(jù)差示掃描熱量計(jì)(TA 2100 DSC)測定。
**在六氟異丙醇中。
為了制備COOH/OH≥1的低分子量聚酯，具有COOH/OH比例為1至實(shí)際上0的預(yù)先形成的高分子量聚酯的多羧酸或羥基多元有機(jī)酸的功能交換，優(yōu)選在有機(jī)金屬催化劑存在下，例如存在于辛酸亞錫中的具有DL-萃果酸的分子量大于5,000且COOH/OH≤1的85/15丙交酯/乙交酯共聚物的熔化反應(yīng)，需要在微量的諸如辛酸亞錫的有機(jī)金屬催化劑存在下對含預(yù)定量多羧酸或羥基多羧酸的高分子量聚酯進(jìn)行加熱。在干燥氮?dú)庵杏?50℃以上充分?jǐn)嚢鑼⒎磻?yīng)物加熱、直至完成功能交換(通過除去殘余的未反應(yīng)多羧酸進(jìn)行測定)。實(shí)際上這是通過檢驗(yàn)所得到的較分子量聚酯的分子量(根據(jù)28℃下毛細(xì)管粘度測定的溶液粘度)和在未反應(yīng)的多羧酸存在下進(jìn)行測定的。通過聚酯樣品的水萃取和用高效液相色譜(HPLC)的萃取物的分析來達(dá)到這一目的。通過HPLC、用Waters Model 6000溶劑傳遞泵和Dynamax(Rainin)型UV-D檢測器(205 nm，1.0 AUFS)測定剩余的單體、二聚物和多羧酸水平。用0.025N Na2PO4緩沖液、pH＝3.5(同溶劑流速＝1.0ml/分鐘)、使用Nucleosil C18，5um，25cm×4.6mm柱進(jìn)行試驗(yàn)。
分離所需的聚酯并按上述開環(huán)聚合作用進(jìn)行純化。通過此方法制備的聚酯的例子和相關(guān)分析數(shù)據(jù)如表IV所示。
表IV通過功能交換制備的聚酯IV型聚酯聚合物# 加樣 聚合條件 酸# ηinhTg，℃*1 Boehringer 8gm(50/50 dl-丙交酯150℃/5hrs 670 0.26 25A001 /乙交酯)檸檬酸**0.8gm(0.00417M)*在氮?dú)夥罩杏?-10mg樣品和10℃/分鐘的加熱速率根據(jù)差示掃描熱量計(jì)(TA 2100 DSC)測定。
**催化量的辛酸亞錫(2滴0.33M溶液，約0.03nmole)。
適用于本發(fā)明聚酯的合成的其它單體有L-乳酸、DL-乳酸、ε-己內(nèi)酯、對-＝噁酮、ε-己酸、碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯和內(nèi)消旋-丙交酯。有用的多羧酸鏈引發(fā)劑和/或鏈改性劑的例子包括蘋果酸、檸檬酸和酒石酸。
(2)通過多羧酸封端聚酯和生物活性多肽的離子相互作用的聚酯/多肽離子型共軛物的合成將上述多羧酸封端的生物可降解聚酯用于制備具有一元或多元羧酸寡肽、多肽或蛋白質(zhì)以及可使用的有效離子型胺基團(tuán)的離子型分子共軛物(參見圖2)。并且，如果用堿例如0.1NaOH處理、任何聚酯都可形成含多肽的離子型分子共軛物。由于陽離子多肽的多部位離子相互作用，這種處理暴露了聚酯的酸基團(tuán)。
因此，在有或沒有用無機(jī)堿預(yù)處理聚酯以使其對堿性藥物的結(jié)合率最大的情況下，通過適當(dāng)溶劑中的組分的直接分子相互作用可形成這些共軛物。如上所述，它們的離子共軛物組分的離子相互作用在其不同的pKa值范圍內(nèi)增強(qiáng)了。
將聚酯以2％-20％W/V濃度范圍溶解在適合的非質(zhì)子傳遞溶劑中。這些溶劑應(yīng)該溶解該聚酯，但也可以是與水部分混溶的。用于此目的的適合溶劑包括四氫呋喃、丙酮和乙二醇二甲基醚。將諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銨或者其碳酸鹽之類的堿水溶液加入該溶液中以使聚酯的結(jié)合能力達(dá)到最大。一般而言，所加入的堿的量與由所使用的堿性肽的抗衡陰離子水平表示的酸的數(shù)量相當(dāng)。
簡單混合聚酯-堿混合物后，以2％-50％W/W(肽/聚酯)的肽/聚酯加樣水平加入肽或肽鹽的水溶液。攪拌該混合物一段時間(多達(dá)3小時)，然后去除溶劑并在真空下干燥產(chǎn)物。然后可將所得到的物質(zhì)進(jìn)一步處理以制劑。將所得到的藥物組合物設(shè)計(jì)為完全由離子型分子共軛物組成的化學(xué)均勻組合物，并且在生物可降解的基質(zhì)中基本上沒有通過顯微鏡可見或通過肉眼可見的化學(xué)藥物的分散區(qū)域。所制備的離子型分子共軛物的例子和相關(guān)的分析數(shù)據(jù)如表V所示。
表V離子型分子共軛物-肽結(jié)合物1所用聚合物 肽2加樣％ 殘留3％150/50 dl丙交酯/乙交酯 I 10 47(商業(yè)的) I 20 25酸#＝22,000II 20 73ηinh＝0.53III 20 48.52聚L-丙交酯 I 10 62(商業(yè)的) II 20 40Mw(平均)＝2,000酸#＝850
3聚L-丙交酯 I 10 54(商業(yè)的)Mw(平均)＝50,000酸#＝2100448/48/4聚d，l-丙交酯/I 20 43乙交酯/1，6-己二醇(方法III)酸#＝10,138ηinh＝0.39549/49/2聚L-丙交酯/ I 10 100乙醇酸/蘋果酸I 20 99(IB型) I 30 95.5酸#＝1400I 40 96.0ηinh＝0.20 I 50 99.8II 20 99.8III 20 77.5683.3/14.7/2聚L-乳酸/乙醇酸/檸檬酸I 20 96(IA型)酸#＝563ηinh＝0.24749/49/2聚d，1-丙交酯/乙交酯/蘋果酸 I 20 96(II型) III 20 73.9酸#＝1200ηinh＝0.21848/48/4聚d，l-丙交酯/乙交酯/檸檬酸 I 10 90(III型)酸#＝589ηinh＝0.221在所有情況中，用丙酮作溶劑和氫氧化鈉作為堿，按本文所述制成共軛物。所使用的所有肽均為醋酸鹽形式。
2肽I BIM-21003D-Trp6-LHRH(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly NH2)pka＝10.1II BIM-23014(H2N-β-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2)pka＝9.8III BIM-26226(H2N-D-F5Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-OCH3)pka＝8.03殘留％通過用去離子水漂洗干的聚酯/肽離子型共軛物和通過HPLC對漂洗中的可溶性肽進(jìn)行定量而測定。
(3)離子型共軛物轉(zhuǎn)化為植入物、棒條、微球體或微粒，它們能按單相圖在體內(nèi)釋放治療劑至少20天?？梢詫⒈景l(fā)明離子型共軛物鹽轉(zhuǎn)化為(A)含1-50重量％多肽的可注射的無菌微球體(含或不含0.1-10％作為操作助劑的固體多羥基醇)，它可根據(jù)實(shí)際上的單相圖被釋放、并持續(xù)1-12周藥理活性；(B)在有或沒有藥理學(xué)上無活性的操作助劑的情況下，通過澆鑄、沖壓或擠壓制成的可植入無菌薄膜，它能提供與(A)所述相似的釋放圖；和(C)通過擠壓或沖壓制備的可注射無菌棒條，它能提供與(A)所述相似的釋放圖。而且，可用聚酯包覆棒條以提供控制治療劑釋放速率的附加層。優(yōu)選，用可吸收的聚酯包覆棒條；更優(yōu)選可吸收的聚酯是如本文所定義者，最佳優(yōu)選是可吸收的包覆聚酯與棒條中所包含的聚酯相同。
體外釋放測定將每個稱重50mg的磨碎干共軛物置于直徑25mm閃爍管中。在每個管中加入5ml等分改性PBS緩沖液(PBS緩沖液2.87gm Na2HPO4，0.654gmNaH2PO4，5.9gm NaCI，0.5gm NaN3，用去離子水適量1.0L；pH＝7.27.)、并將管置于Lab-Line Orbit Environ-震動器中以120 R.P.M于37℃旋轉(zhuǎn)。定期移開管、傾析并用新鮮PBS溶液重新補(bǔ)足。通過HPLC從傾析的PBS溶液測定所釋放的肽的量。
來自離子型共軛物的肽萃取將50mg離子型分子共軛物樣品混入20ml二氯甲烷中?；旌衔镫S后用50ml、20ml和20ml乙酸分別萃取。合并乙酸萃取液并且用高壓液相色譜(HPLC)分析肽含量。用HPLC的肽分析結(jié)果如下。HPLC分析使用Watersmodel M-45溶劑傳遞泵和波長為220nm和1.0AUFS的EM Science MACS 700檢驗(yàn)器進(jìn)行。肽流動使用Lichrospher(EM Separations)C18，100A，5μm，25cm×4.6mm柱和使用30％乙腈/0.1％TFA作為無梯度洗脫緩沖液。
下面是證明經(jīng)28天49∶49∶2L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸\D-Trp6[LHRH](#8實(shí)施例)，49∶49∶2∶L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸\抑生長素-腫瘤抑制類似物(#9實(shí)施例)，和73.5∶24.5∶2聚-L-丙交酯/乙醇酸/蘋果酸D-Trp6[LHRH](#10實(shí)施例)離子型分子共軛物釋放肽數(shù)量的體外試驗(yàn)詳細(xì)數(shù)據(jù)(表VI)。
表V1體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)試驗(yàn)天數(shù) 釋放肽總量的百分?jǐn)?shù)#8實(shí)施例 #9實(shí)施例 #10實(shí)施例1 5.5％ 12.5％ 11％7 26.9％21.3％ 53％14 55.2％47.3％ 55％17 84.4％72.2％ 60％21 98.6％82.5％ 66％24 100％ 98.2％ 75％28 --- 99.6％ ---
離子型共軛物中的肽定量分析共軛物產(chǎn)物中的離子鍵合肽通過在5.7ml 9∶1的丙酮和0.1M三氟乙酸水溶液混合物中溶解10mg樣品來測定。將該溶液在約25℃轉(zhuǎn)動約15-24小時，然后通過0.5微米聚四氟乙烯過濾筒過濾。然后用高壓液相色譜(HPLC)分析濾液的肽含量。使用Millipore 717型Wisp自動取樣器，510型泵和486型UV檢測器在220nm進(jìn)行HPLC肽分析。肽流動在Lichrospher(EM Separations)25cm×4.6mm，C18，5μm，100A柱上，流速是每分鐘1.0ml，使用在0.14％高氯酸鈉緩沖液中的35％乙腈緩沖液作為無梯度洗脫系統(tǒng)。通過比較試驗(yàn)樣品的校正峰面積和注入的肽標(biāo)準(zhǔn)的面積定量計(jì)算出肽量。
用途本發(fā)明中描述的任何方位酸的聚酯/多肽離子型共軛物可以單獨(dú)或與可藥用介質(zhì)結(jié)合對受體給藥。雖然其可以方便地通過皮下、肌內(nèi)、非腸道、栓劑或鼻給藥，但是，治療制劑可以根據(jù)治療情況給藥。本發(fā)明制劑中的組合物濃度可以根據(jù)各種情況，包括給藥劑量和給藥途徑而變化。
不用進(jìn)一步說明，人們可以相信，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)前面的說明，可以完整地使用本發(fā)明。因此，下面的實(shí)施方案僅僅是用于說明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其它部分。
實(shí)施例1--直接縮合方法--通過Amberlyst 15催化的50/50聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)的合成在裝有磁性攪拌器、Dean-Stark收集器和水冷卻冷凝器的圓底燒瓶中將D，L-乳酸(85％含水混合物；13.7gm，0.13mole)與乙醇酸(10gm，0.13mole)混合。加入甲苯(100ml)和Amberlyst 15滴(100mg)，并在氮?dú)庵袑⒒旌衔锘亓?2小時，從混合物中去除水。令混合物冷卻，從固化物中傾析出甲苯、并將產(chǎn)物溶解在二氯甲烷(250ml)中。用活性炭(Darco，500mg)處理二氯甲烷溶液、過濾并在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中真空干燥。將聚酯在高真空(1mmHg)下于40℃進(jìn)一步干燥得到白色粉末。(CHCI3中的ηinh＝0.3，酸#＝2439，Tg＝12℃)實(shí)施例2--直接縮合方法--通過Amberlyst 15催化的49/49/2聚(L-乳酸-共-乙醇酸/檸檬酸)的合成使用與上述相似的系統(tǒng)，在圓底燒瓶中將L-乳酸(88％含水混合物；25.6gm，0.25mole)與乙醇酸(19.2gm，0.25mole)、檸檬酸-水合物(2.33gm，0.011mole)，Amberlyst 15滴(500mg)和甲苯(150ml)混合。將混合物加熱并同時攪拌回流51小時、通過Dean-Stark收集器去除水。從半固體產(chǎn)物中傾析出甲苯。將該聚酯溶解在丙酮(300ml)中，過濾并在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中干燥。然后將固體聚酯再溶解于二氯甲烷中、并用水(2×150ml)洗滌兩次，以去除可溶性低聚物。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中將有機(jī)溶液濃縮、并在真空下將產(chǎn)物充分干燥得到白色固體(參見表I，IB型聚酯，#4聚合物)。
(CHCI3中的ηinh＝0.11，酸#＝842，Tg＝15℃)實(shí)施例3--逐步生長聚合法通過蘋果酸催化的73.5/24.5/2聚(L-丙交酯-共-乙醇酸/蘋果酸)的合成使用裝有空氣碰撞取樣器、容量為150ml的圓柱形安瓿，將丙交酯(20gm，0.139mole)與乙醇酸(7.1gm，0.093mole)和(d，l)-蘋果酸(1.0gm，0.0075mole)混合。通過經(jīng)碰撞取樣器入口的鼓泡氮?dú)?100ml/分鐘)攪拌混合物，并從25℃加熱至155℃經(jīng)100分鐘。將反應(yīng)溫度在155℃保持70小時，在反應(yīng)器出口線上的冷阱中去除聚合中的水。70小時后，將反應(yīng)物冷卻至100℃，并注入用于固化的冷卻的不銹鋼接受器中。然后將固體聚酯溶于二氯甲烷中，并用水(2×150ml)洗滌兩次以去除可溶性低聚物。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中將有機(jī)溶液濃縮，并在真空下將產(chǎn)物充分干燥得到白色固體(參見表II，II型聚酯，#2聚合物)。
(CHCI3中的ηinh＝0.13，酸#＝1800，Tg＝27℃)實(shí)施例4-開環(huán)聚合方法—由蘋果酸引發(fā)的75/25聚(L-丙交酯-共-乙交酯)的合成在干燥氮?dú)鈼l件下，在裝有磁性攪拌器的玻璃安瓿中加入L-丙交酯(12.0g，0.0833mole)、乙交酯(3.21g，0.0277mole)、蘋果酸(0.3042g，0.00227mole)和催化劑辛酸亞錫(甲苯中0.33M，67μL，0.022mmole)。在密封安瓿之前用N2沖洗系統(tǒng)并抽真空數(shù)次。然后在140℃熔化反應(yīng)物，分別在180℃、190℃、180℃和150℃加熱熔化物1、4.5、12和2小時。冷卻至室溫后，在小于1mm Hg真空下將聚酯再加熱至110℃約1小時以去除單體，于室溫下再冷卻、在液氮中使之驟冷、分離并在真空下干燥。(CHCI3中的ηinh＝0.20，酸#＝2560，Tg＝39℃)實(shí)施例5--開環(huán)聚合方法—由檸檬酸引發(fā)的50/50聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的合成在干燥氮?dú)夥罩校谘b有磁性攪拌器的玻璃安瓿中將D，L-丙交酯(10.0g，0.0694mole)與乙交酯(8.06g，0.0694mole)、檸檬酸(1,07g，0.00555mole)和催化劑辛酸亞錫(甲苯中的0.33M，84μL，0.0278mmole)混合，并在真空下密封。熔化反應(yīng)物，分別在180℃、185℃、190℃和120℃加熱1、2、7和9小時。冷卻聚酯至室溫，在液氮中使之驟冷、分離并干燥。
(CHCI3中的ηinh＝0.26，酸#＝970，Tg＝23℃)實(shí)施例6--開環(huán)聚合方法—由1，6-己二醇引發(fā)的50/50聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的合成使用與上述相似的系統(tǒng)，在干燥氮?dú)鈼l件下，向玻璃安瓿中加入D，L-丙交酯(10.0g，0.0694mole)、乙交酯(8.06g，0.0694mole)、1，6-己二醇(0.656g，0.00555mole)和辛酸亞錫(甲苯中的0.33M，84μL，0.0278mmole)，隨后在真空下密封。分別在150℃、185℃、150℃和120℃將組分加熱0.5、4、1、5和3小時?；厥盏玫降木埘ゲ⒏稍?參見表III，III型聚酯，#5聚合物)。(CHCI3中的ηinh＝0.39，酸#＝10,138，Tg＝30℃)實(shí)施例7--功能交換方法-含羧酸的50/50聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的合成在干燥氮?dú)鈼l件下，向玻璃安瓿中加入50/50聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯(Boehringer A001，8g)檸檬酸(0.8g，4.16mmole)和辛酸亞錫(2滴)并密封。在150℃加熱混合物4小時、冷卻至室溫，在液氮中使之驟冷、分離并干燥(參見表IV，IV型聚酯，#1聚合物)。(CHCI3中的ηinh＝0.26，酸#＝670，Tg＝23℃)實(shí)施例8--49∶49∶2L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸(見表I，#4聚合物)和D-Trp6[LHRH]離子型分子共軛物的合成將500mg 49∶49∶2L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸(通過直接縮合合成；Mw＝9,500；酸#＝1420)溶解在10ml丙酮(Mallinckrodt分析試劑)中。加入一部分0.1N氫氧化鈉溶液(1.14ml)，并在室溫下攪拌該混合物15分鐘。加入100mg D-Trp6[LHRH](BIM-21003肽1；堿含量87％，醋酸鹽含量7％)的1.0ml水溶液，并在室溫下攪拌該混合物1小時。然后去除溶劑，首先在T＜40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、然后在1mm Hg真空下于室溫置于干燥器中1小時。研碎干燥的固體并在100ml去離子水中攪拌，并通過過濾進(jìn)行分離。通過HPLC對含水濾液進(jìn)行測試、測定含＜1mg可溶性肽。在真空下干燥固體物數(shù)天得到540mg白色粉末。將該粉末用于體外試驗(yàn)(參見表VI，#8實(shí)施例)。
實(shí)施例9--49∶49∶2L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸(見表I，#4聚合物)和抑生長素/腫瘤抑制類似物離子型分子共軛物的合成將100mg 49∶49∶2L-乳酸/乙醇酸/蘋果酸(通過直接縮合合成；Mw＝9,500；酸#＝1420)溶解在2ml丙酮(Mallinckrodt分析試劑)中。加入一部分0.1N氫氧化鈉溶液(0.32ml)，并在室溫下攪拌該混合物15分鐘。加入20mg抑生長素/腫瘤抑制類似物(BIM-23014肽lI；堿含量83％，醋酸鹽含量9.8％)的1.2ml水溶液，并在室溫下攪拌該混合物1小時。然后去除溶劑，首先在T＜40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后在1mm Hg真空下于室溫置于干燥器中1小時。研碎干燥的固體并在20ml去離子水中攪拌，并通過過濾進(jìn)行分離。通過HPLC對含水濾液進(jìn)行測試、測定含＜0.05mg可溶性肽。在真空下干燥固體物數(shù)天得到106mg白色粉末。研磨該粉末并將其用于體外釋放試驗(yàn)(參見表VI，#9實(shí)施例)。
實(shí)施例10-73.5∶24.5∶2聚L-丙交酯/乙醇酸/蘋果酸(見表II，#2聚合物)和D-Trp6[LHRH]離子型分子共軛物的合成將800mg 73.5∶24.5∶2聚L-丙交酯/乙醇酸/蘋果酸(通過無環(huán)化產(chǎn)物的逐步生長來合成；酸#＝1800)溶解在丙酮(16ml)中。加入一部分0.1N氫氧化鈉溶液(2.8ml)，并在室溫下攪拌該溶液20分鐘。加入200mgD-Trp6[LHRH](BIM-21003；堿含量87％，醋酸鹽含量7％)的2ml水溶液，并攪拌該混合物90分鐘。然后去除溶劑，按實(shí)施例8所述在去離子水中研碎所得到的固體、發(fā)現(xiàn)存在小于1％的可溶性肽。在真空下干燥分離的固體4天得到839mg白色粉末。研磨該粉末并用于體外釋放試驗(yàn)(參見表VI，#10實(shí)施例)。
實(shí)施例11--1.50L-丙交酯/乙交酯/蘋果酸聚酯(65∶33∶2)的肽-聚合物離子型共軛物微粒的形成按實(shí)施例4所述通過開環(huán)聚合來合成共軛物(MW＝4700多分散性＝1.3，在Jordi凝膠50×1cm混合線性床柱上根據(jù)GPC測定，THF洗脫液，Wyatt Mini Dawn光散射檢測器dn/dc＝0.05，通過滴定酸#1475，Tg＝42℃)，將其溶解在40ml丙酮中。用2.0ml 0.5M氫氧化鈉溶液中和酸基團(tuán)，并攪拌5分鐘。在聚合物溶液中緩慢加入0.5g BIM-23014(肽含量83.7％，醋酸鹽含量11.5％)的20ml Milli-Q水溶液并混合。在加入肽期間還要分批添加另外40ml丙酮以防止沉淀。攪拌此透明無色溶液1小時，然后在真空下蒸發(fā)至干。將所得到的白色固體再溶解于20ml丙酮和2ml Milli-Q水的混合物中形成透明溶液。于4℃通過0.2μ聚四氟乙烯過濾器將此溶液注入快速攪拌的500me Milli-Q水的蓄水池中。通過與水接觸，聚合物/肽復(fù)合相立即分離成小顆粒。于4℃混合該淤漿30分鐘后，在減壓下去除殘余的丙酮，通過離心分離固體、并用100mlMilli-Q水再懸浮并再離心。通過冷凍干燥干燥分離的固體得到1530mg白色自由流動的粉末。顆粒大小范圍＝2-100μm。顯示在53℃出現(xiàn)離子型共軛物的Tg。通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)在所有含水上清液中的總殘余(未結(jié)合)肽為63mg。通過氮的元素分析測得起始總肽含量為19.9重量％。采用丙酮/0.1M TFA萃取工藝測得共軛物中可萃取的肽的百分?jǐn)?shù)為16.9重量％。因此，所得到的共軛物保留了84.8％離子的(可萃取的)特性。
1型棒條傳送系統(tǒng)(CONC2和CGC1)實(shí)施例A-1檸檬酸引發(fā)的97/3己內(nèi)酯/乙交酯共聚物(CGC1)的制備將裝有機(jī)械攪拌的一圓底燒瓶進(jìn)行火焰干燥兩次并用干燥氬氣沖洗。在燒瓶中加入ε-己內(nèi)酯(1.455moles，166g)、乙交酯(0.08865moles，10.3g)、檸檬酸(0.075moles，14.4g)和辛酸亞錫(0.0003moles，甲苯中的375μl 0.8M溶液)。采用下列方法進(jìn)行聚合在氬氣沖洗下、將所加原料從室溫加熱至約150℃經(jīng)約1小時和約20分鐘、同時熔化后不斷攪拌(于70rpm)。將所加料保持在約150℃約11.5小時。在聚合結(jié)束時，在真空(約0.1mm Hg)下于約120℃蒸餾少量未反應(yīng)的單體約15分鐘。將此物質(zhì)注入廣口瓶中并使其冷卻。
通過GPC(Mn＝3543，Mw＝7708)，F(xiàn)TIR，DSC(Tm 52.0℃)和滴定分析該聚合物的羧酸含量(平均當(dāng)量＝623Da)。
將20g聚合物溶解在50.0mL丙酮中，使溶液在攪拌的冰水中沉淀。通過過濾分離固體產(chǎn)物。
通過GPC(Mn＝4214，Mw＝9688)，DSC(Tm 45.2℃)和滴定(平均當(dāng)量＝780)分析純化的聚合物。
實(shí)施例B-1離子型共軛物(CONC1)的制備在小玻璃瓶中將1.5g純化聚合物(CGC1)溶解在7.5mL乙腈中。在一單獨(dú)的小瓶中將250.0mg LHRH-醋酸鹽溶解在1.5ml蒸餾水中。通過0.45μm Acrodisc注射管過濾器將溶解的聚合物過濾到含83.8mg碳酸鈉的小瓶中(以中和LHRH醋酸鹽)。將LHRH溶液逐滴加入到過濾的聚合物溶液中。在室溫下用磁性攪拌棒混合該合并的溶液約1.5小時。通過將共軛物逐滴加入正攪拌的液氮冷卻的異丙醇(IPA)中而使其沉淀。通過離心收集該沉淀物并在真空下干燥過夜。共軛物產(chǎn)率為73.5％。通過DSC(Tm 50.9℃)和FTIR對共軛物進(jìn)行分析。物質(zhì)的元素分析得到1.81％氮。據(jù)此，測定LHRH含量為10.0％。
實(shí)施例C-1棒條形傳送系統(tǒng)的制備通過細(xì)心研磨使離子型共軛物(0.3987g CONC2)和聚合物(1.206gCGC1)混合，并在加熱區(qū)(block)于約58℃使其一同熔化?；旌先刍?，然后移至18G毛細(xì)管中并冷卻。擠壓該混合物，將棒條切割成含適當(dāng)劑量藥物的長度，并置于無菌的10-計(jì)量螺旋針(用于注射)中。實(shí)施例C-1的所有步驟均在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。棒條的LHRH含量為2.5％。
2型棒條傳送系統(tǒng)(CONC2和CGC1)實(shí)施例A-2檸檬酸引發(fā)的97/3己內(nèi)酯/乙交酯共聚物(CGC1)的制備在本實(shí)施例中使用實(shí)施例A-1所制備的相同的聚合物(CGC1)。
實(shí)施例B-2離子型共軛物(CONC2)的制備根據(jù)實(shí)施例B-1所述的方法制備CONC2。通過元素分析，氮的百分?jǐn)?shù)為2.31％。據(jù)此，LHRH含量為12.76％。
實(shí)施例C-2棒條形傳送系統(tǒng)的制備用機(jī)械方法混合CONC2(0.1854g)和0.5565g純化CGC1，然后加熱至約60℃。將混合和熔化的物質(zhì)取出注入18-計(jì)量毛細(xì)管中并用活塞擠壓。將棒條切割成含適當(dāng)劑量藥物的長度、并置于無菌的18-計(jì)量螺旋針(用于注射)中。實(shí)施例C-2的所有步驟均在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。棒條的LHRH含量為3.2％。
3型棒條傳送系統(tǒng)實(shí)施例A-3酒石酸引發(fā)的98/2己內(nèi)酯/碳酸亞丙基酯(TMC)共聚物(CTT1)的制備將裝有機(jī)械攪拌的一圓底燒瓶進(jìn)行火焰干燥三次并用干燥氬氣沖洗。在燒瓶中加入ε-己內(nèi)酯(1.47moles，168g)、TMC(0.03moles，3.06g)、酒石酸(0.0142moles，2.134g)和辛酸亞錫(0.0003moles，甲苯中的375μl 0.8M溶液)。采用下列方法進(jìn)行聚合在氬氣沖洗下，將所加原料從室溫加熱至約150℃經(jīng)約1小時，同時攪拌熔化的反應(yīng)混合物(于60rpm)。使溫度在約150℃保持約9小時。在減壓(0.1mm)下于約100℃蒸餾未反應(yīng)的單體約1小時。將聚合物注入廣口瓶中并使其冷卻。
通過GPC(Mn＝13221，Mw＝35602)對聚合物進(jìn)行分析。
實(shí)施例B-3離子型共軛物(CONCTT1)的制備在小玻璃瓶中將來自實(shí)施例A-3的1.5g純化聚合物溶解在7.5mL乙腈中。在一單獨(dú)的小瓶中將250mg LHRH-醋酸鹽溶解在1.5ml蒸餾水中。通過0.45μm Acrodisc注射管過濾器將溶解的聚合物過濾到含56.5mg碳酸鈉的小瓶中(以中和LHRH醋酸鹽)。將LHRH溶液逐滴加入到過濾的聚合物溶液中。在室溫下用磁性攪拌棒混合該合并的溶液約3小時。通過將共軛物逐滴加入正攪拌的液氮冷卻的IPA中而使其沉淀。通過離心收集該沉淀物并在真空下干燥過夜。
共軛物產(chǎn)率為81.1％。物質(zhì)的元素分析得到2.04％氮。據(jù)此，測定LHRH含量為11.3％。
實(shí)施例C-3棒條形傳送系統(tǒng)的制備在大約55℃熔化CTT1(0.8909g)。向其中加入0.2250g CONCTT1，并將整個系統(tǒng)加熱至約65℃。然后將熔化系統(tǒng)取出注入18G毛細(xì)管中并用活塞擠壓。將棒條切割成含適當(dāng)劑量藥物的長度，并置于無菌的18-計(jì)量螺旋針(用于注射)中。實(shí)施例C-3的所有步驟均在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。棒條的LHRH含量為2.3％。
4型棒條傳送系統(tǒng)實(shí)施例A-4酒石酸引發(fā)的94/6己內(nèi)酯/乙交酯共聚物(CGT6)的制備將裝有機(jī)械攪拌的一圓底燒瓶進(jìn)行火焰干燥三次并用干燥氬氣沖洗。在燒瓶中加入ε-己內(nèi)酯(1.41moles，161g)、乙交酯(0.09moles，10.4g)、酒石酸(0.005moles，0.73g)和辛酸亞錫(0.0003moles，甲苯中的375μl 0.8M溶液)。采用下列方法進(jìn)行聚合在氬氣沖洗下，將所加原料從室溫加熱至約150℃經(jīng)約1小時，同時攪拌熔化的反應(yīng)混合物(于60rpm)。使溫度在約150℃保持約1小時。然后升至約180℃保持約4小時。將物質(zhì)冷卻至107℃并于1.5mmHg真空下放置約1.5小時。將該物質(zhì)注入廣口瓶中并使其冷卻。
收集后，通過DSC(Tm＝54.5℃)和GPC(Mn＝26254，Mw＝68101)對聚合物進(jìn)行分析。
實(shí)施例B-4離子型共軛物(CONCTT2)的制備使用實(shí)施例A-4的LHRH-醋酸鹽和共聚物，按照實(shí)施例B-1所述方法制備CONCTT2。
實(shí)施例C-4棒條形傳送系統(tǒng)的制備將CGT6(1.4g)和CONCTT2(0.4779g)加熱至約57℃，冷卻、切割、然后再加熱至同樣溫度。然后將熔化系統(tǒng)取出注入18G毛細(xì)管中并用活塞擠壓。將棒條切割成含適當(dāng)劑量藥物的長度，并置于無菌的18-計(jì)量螺旋針(用于注射)中。實(shí)施例C-4的所有步驟均在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。棒條的LHRH含量為2.8％。
實(shí)施例D-4用惰性的共聚物前體包覆C-4棒條系統(tǒng)將CGT6(1.4g)溶解在1.5ml二氯甲烷中。在此聚合物溶液中浸入實(shí)施例C-4的棒條，立即移開，并在室溫條件下在層流通風(fēng)櫥中干燥。
根據(jù)前面所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定本發(fā)明的基本特征，在不背離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種變化和改進(jìn)以適應(yīng)各種用途和狀況。因此，其它實(shí)施方案也在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種聚酯，其含有一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯、和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物，條件是酒石酸為聚酯的組成部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚酯，其中該聚酯包括L-乳酸或D-乳酸，或者其中該聚酯包括L-乳酸或D-乳酸和乙醇酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚酯，其中該聚酯由酒石酸、ε-己內(nèi)酯和碳酸亞丙基酯組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚酯，其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與碳酸亞丙基酯的比例為90ε-己內(nèi)酯∶10碳酸亞丙基酯至99ε-己內(nèi)酯∶1碳酸亞丙基酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚酯，其中該聚酯中ε-己內(nèi)酯與碳酸亞丙基酯的比例為98ε-己內(nèi)酯∶2碳酸亞丙基酯。
6.一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的權(quán)利要求1所述的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中該組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
7.一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的權(quán)利要求3所述的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中該組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
8.一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的權(quán)利要求4所述的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中該組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
9.一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的權(quán)利要求5所述的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中該組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
10.一種組合物，它包括與一種或多種生物活性多肽進(jìn)行離子共軛的權(quán)利要求2所述的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中該組合物中至少50％重量的多肽與聚酯離子共軛。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素、鈴蟾肽/GRP、降鈣素、緩激肽、神經(jīng)節(jié)肽、MSH、GRF、糊精、速激肽、胰泌素、PTH、CGRP、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、PTHrP、胰高血糖素、神經(jīng)降壓素、ACTH、GHRP、GLP、VIP、PACAP、腦啡肽、PYY、促胃動素、P物質(zhì)、NPY、TSH和其類似物或片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中生物活性多肽選自LHRH、抑生長素、鈴蟾肽/GRP、降鈣素、緩激肽、神經(jīng)節(jié)肽、MSH、GRF、糊精、速激肽、胰泌素、PTH、CGRP、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、PTHrP、胰高血糖素、神經(jīng)降壓素、ACTH、GHRP、GLP、VIP、PACAP、腦啡肽、PYY、胃動素、P物質(zhì)、NPY、TSH和其類似物或片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中該生物活性多肽選自LHRH、抑生長素和其類似物或片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中該生物活性多肽選自LHRH、抑生長素和其類似物或片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中該LHRH類似物為式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且該抑生長素類似物為式H2N-β-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中抑生長素類似物的兩個Cys殘基相互結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中該LHRH類似物為式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且該抑生長素類似物為式H2N-β-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中抑生長素類似物的兩個Cys殘基相互結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的組合物為棒條形。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的組合物為棒條形。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述棒條具有聚酯層。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中包覆棒條的聚酯是可吸收的聚酯。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中可吸收的聚酯包含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中包覆棒條的可吸收聚酯與組合物中所包含的聚酯相同。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述棒條具有聚酯層。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中包覆棒條的聚酯是可吸收的聚酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中可吸收的聚酯包含一個或多個游離COOH基團(tuán)且羧基與羥基之比大于1，其中所述的聚酯含有選自以下的組成部分L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、ε-己內(nèi)酯、對-二噁酮、ε-己酸、草酸亞烴酯、草酸環(huán)亞烴酯、琥珀酸亞烴酯、β-羥丁酸酯、取代的或未取代的碳酸亞丙基酯、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮、乙交酯、乙醇酸、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋-丙交酯和任何旋光活性異構(gòu)體、外消旋物或其共聚物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中包覆棒條的可吸收聚酯與組合物中所包含的聚酯相同。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種持續(xù)釋放的藥物組合物。該組合物包括含與生物活性多肽離子共軛的游離COOH基團(tuán)的聚酯，該多肽含有至少一種有效的離子型胺，其中組合物中至少50重量％的多肽與聚酯進(jìn)行離子共軛。
文檔編號A61K9/52GK1500820SQ20031010434
公開日2004年6月2日 申請日期2000年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月26日
發(fā)明者薛勒比·沃赫拜·薛勒比, 薛勒比 沃赫拜 薛勒比, A 杰克遜, 史蒂文·A·杰克遜, P 摩里憂, 杰昆西·P·摩里憂 申請人:研究及應(yīng)用科學(xué)協(xié)會股份有限公司, 波利曼德有限公司