專(zhuān)利名稱(chēng)：腫瘤壞死因子受體－免疫球蛋白的融合蛋白用于急性肺損傷藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，更具體地涉及腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)為“TNFR-Ig融合蛋白”)在治療急性肺損傷方面的用途。
背景技術(shù)：
自從嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)發(fā)生以后，曾波及全球30多個(gè)國(guó)家，總發(fā)病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)7500人，死亡超過(guò)600人。SARS具有強(qiáng)烈的傳染性，可迅速向周邊地區(qū)播散和暴發(fā)流行，死亡率可高達(dá)到14％-15％，影響了世界各國(guó)的政治和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。
SARS是一種新的病原物，致死率高，傳染性強(qiáng)。對(duì)其流行病學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)等方面的了解還非常有限，臨床治療還沒(méi)有確切有效的藥物，疫苗的開(kāi)發(fā)還剛剛起步。因此，WHO和各國(guó)科學(xué)家均認(rèn)為，這種狀況顯然還要持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，并且不排除再次爆發(fā)的可能性。因此，研制SARS防治藥物，特別是能夠有效降低死亡率的藥物，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。
大部分SARS感染者病情惡化后會(huì)表現(xiàn)出急性呼吸困難綜合癥(ARDS，Acute Respiratory Distress Syndrome)和急性肺損傷(ALI，Acute Lung Injury)，一些重癥的患者還會(huì)出現(xiàn)休克或多器官功能障礙綜合征(MODS)。正是這些肺部的急性病變和嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致了SARS患者的最終死亡。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的有效治療急性肺損傷的藥物。
腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)是機(jī)體內(nèi)的一種多功能免疫調(diào)節(jié)分子，它可以和細(xì)胞膜上的受體結(jié)合發(fā)揮作用，往往引起靶細(xì)胞的死亡或招引免疫效應(yīng)細(xì)胞在局部的聚集，參與多種生理、病理與免疫過(guò)程。
對(duì)TNF受體(TNF receptor，TNFR)的研究表明，有I型、II型兩種腫瘤壞死因子受體，均為I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更為廣泛，與腫瘤壞死因子的親和力更強(qiáng)。兩種受體雖然需位于細(xì)胞膜上才可以發(fā)揮向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的功能，但仍有部分從細(xì)胞表面脫落至體液內(nèi)，稱(chēng)為可溶性受體。進(jìn)一步的研究表明，這種可溶性的受體可以中和TNF，在體內(nèi)對(duì)TNF的活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
TNFR-Ig融合蛋白是將基因工程和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，利用受體-免疫球蛋白融合技術(shù)(又稱(chēng)“免疫粘附”技術(shù)(Immunoadhesion Technology))，生產(chǎn)出重組人II型TNFR-Ig融合蛋白。其原理是利用基因工程技術(shù)，將受體的細(xì)胞外區(qū)與免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的Fc段基因融合，在體外表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白。
然而，迄今為止尚沒(méi)有將TNFR-Ig融合蛋白用于治療急性肺損傷的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是一種有效治療急性肺損傷的藥物，所述藥物的活性成分是TNFR-Ig融合蛋白。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，用于制備治療急性肺損傷的藥物。
在一優(yōu)選例中，所述的急性肺損傷是由SARS冠狀病毒感染引起的。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量為1-99％。
在另一優(yōu)選例中，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235個(gè)氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細(xì)胞外段的序列，其C-末端的232個(gè)氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結(jié)晶片段序列。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥途徑是靜脈注射或靜脈滴注。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥劑量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。更佳地，所述藥物的給藥劑量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，TNFR-Ig融合蛋白可以非常有效地治療急性肺損傷，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“TNFR-Ig融合蛋白”指由腫瘤壞死因子受體的細(xì)胞外段與免疫球蛋白的Fc片段所形成的融合蛋白。優(yōu)選的TNFR是II型腫瘤壞死因子受體。此外，在TNFR和Ig部分之間宜具有長(zhǎng)度為10-30個(gè)氨基酸的肽接頭。
TNFR-Ig融合蛋白的制法和結(jié)構(gòu)是已知，例如美國(guó)Immunex公司產(chǎn)品EnbrelTM就是一種人II型TNFR-Ig融合蛋白，其N(xiāo)-末端的235個(gè)氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細(xì)胞外段的序列；其C-末端的232個(gè)氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結(jié)晶片段序列(IgG1 Fc)，對(duì)于TNFR-Ig融合蛋白的制備方法，可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)01132074.5(2001年10月31日申請(qǐng)，申請(qǐng)人上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司)。
將TNFR-Ig融合蛋白配制成藥物的技術(shù)、方法、某些適應(yīng)癥都是本領(lǐng)域中已知的。例如，在本領(lǐng)域中，TNFR-Ig融合蛋白已用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的藥物組合物”指用于治療急性肺損傷的，含有TNFR-Ig融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
在使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的TNFR-Ig融合蛋白施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)靜脈滴注、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
TNFR-Ig融合蛋白可有效治療急性肺損傷的機(jī)理可能如下所述。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明的范圍并不受該治療機(jī)理的限制。
通過(guò)對(duì)TNF-α與胸肺良惡性疾病關(guān)系研究證明，TNF與胸肺良惡性疾病的發(fā)生、發(fā)展均有一定關(guān)系。研究已表明，肺泡巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生TNF，TNF與胸肺疾病的發(fā)生、發(fā)展有著較為密切的關(guān)系。在另一方面，TNF對(duì)其他繼發(fā)性細(xì)胞因子的釋放有重要作用。當(dāng)各種TNF作用過(guò)重過(guò)久，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺間質(zhì)和肺泡上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害，最終產(chǎn)生ARDS。調(diào)控體內(nèi)TNF的水平對(duì)肺損傷的防治有重要作用。SARS最終將導(dǎo)致患者肺部急性損傷，而正是TNF-α在人體內(nèi)水平的異常升高直接引發(fā)了肺部的炎癥。因此，如果能減低SARS患者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)和降低對(duì)肺部造成的損傷，降低SARS患者體內(nèi)的TNF-α水平到正常的幅度，將能正確處理以及有效治療和緩解ARDS和ALI的肺部損傷癥狀程度，同時(shí)又能最大程度地減少治療藥物可能對(duì)患者產(chǎn)生的副作用，這將對(duì)SARS的治療大有裨益，有助于提高治療效果，降低SARS患者死亡率。
TNFR-Ig融合蛋白作為一種半衰期長(zhǎng)的能夠結(jié)合TNF的物質(zhì)，在體內(nèi)可以與細(xì)胞表面上的TNFR競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合周?chē)腡NF，從而減少結(jié)合于細(xì)胞上TNFR的TNF的數(shù)目，從而減少或消除由TNF所引發(fā)的炎癥反應(yīng)，從而有效抑制由SARS等因素導(dǎo)致的急性肺損傷。
本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果已表明，TNFR-Ig融合蛋白可非常有效地治療急性肺損傷。此外，通過(guò)有效中和體內(nèi)過(guò)高的TNF，可大大緩解SARS的臨床病癥，因此，應(yīng)用重組人II型TNFR-Ig融合蛋白來(lái)治療SARS，對(duì)SARS的治療大有裨益，有助于提高治療效果，降低SARS患者死亡率。因此本發(fā)明的藥物組合物是一種有效降低SARS死亡率的藥物。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
實(shí)施例1臨床前藥效學(xué)研究本實(shí)施例中使用的TNFR-Ig融合蛋白(也稱(chēng)為“rh-TNFRFc”)，其N(xiāo)-末端的235個(gè)氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細(xì)胞外段的序列；其C-末端的232個(gè)氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結(jié)晶片段序列(IgG1 Fc)。本制品是采用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)無(wú)血清連續(xù)灌注發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)，經(jīng)超濾濃縮、多步層析法純化后獲得純化的蛋白，最終凍干為臨床研究用制劑(參見(jiàn)CN01132074.5)。本品與美國(guó)Immunex公司產(chǎn)品EnbrelTM具有相同的分子結(jié)構(gòu)和體外活性、免疫反應(yīng)性。
本制品為凍干粉針劑，每支含12.5mg TNFR-Ig融合蛋白。應(yīng)避光保存于2～8℃，避免潮濕。使用前用1毫升含無(wú)菌注射用水溶解，用法為靜脈滴注。
(a)急性肺損傷試驗(yàn)對(duì)rh-TNFRFc進(jìn)行臨床前藥效學(xué)研究。使用內(nèi)毒素來(lái)誘導(dǎo)大鼠，使之產(chǎn)生急性肺損傷癥狀，然后用rh-TNFRFc融合蛋白靜脈注射大鼠。
結(jié)果表明，在本試驗(yàn)中，該藥物最低在1mg/kg體重時(shí)可產(chǎn)生明顯的藥效作用。
(b)小鼠注射致死劑量TNF-α和TNFR-Ig融合蛋白的試驗(yàn)在本試驗(yàn)中，通過(guò)小鼠注射致死劑量TNF-α模型，研究了皮下注射TNFRFc的體內(nèi)中和TNFα的情況。
結(jié)果顯示，給予小鼠腹腔注射重組人TNF-α(R&D systems)1μg/只，小鼠均在24h內(nèi)死亡(20/20)。而24h前皮下注射rhTNFRFc融合蛋白(50μg/只)組小鼠則無(wú)動(dòng)物死亡(0/20)。該結(jié)果證明，rhTNFRFc融合蛋白確實(shí)可在體內(nèi)起到中和TNF-α的作用，且該藥物經(jīng)皮下注射后，至少24h后仍有藥理作用。另外兩組動(dòng)物TNF-α給藥劑量提高至2μg，結(jié)果rhTNFRFc組動(dòng)物死亡8只(存活率60％)，EnbrelTM組動(dòng)物死亡7只(存活率65％)；經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組動(dòng)物存活率無(wú)顯著差異。
綜上所述，靜脈注射TNFR-Ig融合蛋白可對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷起到防治作用，其作用與劑量呈正相關(guān)。
實(shí)施例2安全性檢測(cè)利用貓對(duì)中試產(chǎn)品進(jìn)行的一般藥理學(xué)研究表明，皮下注射4mg/kg或12mg/kg的TNFR-Ig融合蛋白，動(dòng)物在接下來(lái)的6小時(shí)內(nèi)呼吸、血壓、心律、心率、心電圖方面無(wú)明顯改變。應(yīng)用Irwin行為分級(jí)法、爬桿法、開(kāi)闊法、傾斜法等四種方法，觀察皮下注射rh-TNFRFc20mg/kg及40mg/kg對(duì)小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)的影響。
結(jié)果TNFR-Ig融合蛋白與賦形劑陰性對(duì)照組無(wú)顯著差別。說(shuō)明使用本發(fā)明的方法進(jìn)行急性肺損傷治療是安全的。
實(shí)施例3藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)委托國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，利用大鼠進(jìn)行了TNFR-Ig融合蛋白(包括CN01132074.5中的TNFR-Ig融合蛋白和EnbrelTM)的藥物動(dòng)力學(xué)比較研究。皮下給予大鼠3mg/kg本藥或EnbrelTM，于給藥后不同時(shí)間采血，然后利用夾心ELISA檢測(cè)了大鼠血清中的藥物濃度進(jìn)行分析。
結(jié)果提示，CN01132074.5中TNFR-Ig融合蛋白與EnbrelTM在藥時(shí)曲線(xiàn)下面積、半衰期、峰值濃度等指標(biāo)上均無(wú)顯著差異，兩者藥時(shí)曲線(xiàn)接近重合。該結(jié)果說(shuō)明，本品在藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)上與Enbrel十分接近。
給予小鼠一次性靜脈注射160mg/kg(推薦臨床應(yīng)用劑量的400倍)的研究藥物，在14天的觀察期內(nèi)，全部動(dòng)物存活且體重增加，無(wú)異常毒性反應(yīng)現(xiàn)象。
實(shí)施例4長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)此外，用恒河猴進(jìn)行了本品的4周長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，以觀察恒河猴皮下注射rh-TNFRFc 4周后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，提供毒性反應(yīng)的靶器官及其損害的可逆性，確定無(wú)毒性反應(yīng)的劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。
結(jié)果顯示，在給予劑量分別為0、1、5和15mg/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周，動(dòng)物的一般征狀、血液學(xué)和血清生化指標(biāo)、尿液分析、心電圖和病理檢查等均未發(fā)現(xiàn)有明顯異常，僅見(jiàn)給藥2周后部分動(dòng)物血清中抗體產(chǎn)生。上述結(jié)果與美國(guó)FDA公布的關(guān)于ENBRELTM的猴4周長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的結(jié)果非常接近。因此在本試驗(yàn)條件下，猴給藥4周是較安全的，安全劑量為15mg/kg。
實(shí)施例5給藥劑量和方式鑒于rh-TNFRFc用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎采用的是皮下給藥，為了使其更快地起效，優(yōu)選采用靜脈滴注用于SARS、創(chuàng)傷等引起的急性肺損傷，推薦劑量為皮下注射的一半。
藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度試驗(yàn)方法如下在健康志愿者中sc給予10mg和iv給予10mg(N＝6；兩組各3人)。對(duì)于70kg的個(gè)體10mg相當(dāng)于5.7mg/m2。此研究被認(rèn)為是給藥途徑的交叉研究，因?yàn)槭茉囌呦冉o予sc隨后是iv。注射間隔28天。用非房室模型法測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)終點(diǎn)。用梯形法則計(jì)算AUC；半衰期是-log(2)/β。對(duì)于iv給藥用72h以后的時(shí)間，而sc用144h以后的時(shí)間估算回歸系數(shù)(β)。通過(guò)不同途徑AUC的比值(sc/iv)計(jì)算生物利用度。
結(jié)果表明，皮下注射的達(dá)峰時(shí)間為66h，半衰期為92h，而靜脈注射達(dá)峰時(shí)間為0.8h，半衰期為72h；皮下注射的生物利用度為58％?？梢?jiàn)，采用靜注12.5mg/次，每周兩次的劑量是可行的，也是安全的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療急性肺損傷的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的急性肺損傷是由SARS冠狀病毒感染引起的。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量為1-99％。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235個(gè)氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細(xì)胞外段的序列，其C-末端的232個(gè)氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結(jié)晶片段序列。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥途徑是靜脈注射或靜脈滴注。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，更具體地涉及腫瘤壞死因子受體－免疫球蛋白的融合蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)為“TNFR－Ig融合蛋白”)在治療急性肺損傷方面的用途。含有TNFR－Ig融合蛋白的藥物組合物可非常有效地治療由SARS等因素引起的急性肺損傷。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1565631SQ03129569
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者劉慶法, 王皓, 李晶, 李春澍, 李銳 申請(qǐng)人:上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司