專(zhuān)利名稱(chēng)：葉酸-聚二醇類(lèi)化合物及其藥物復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化學(xué)藥物領(lǐng)域，涉及葉酸-聚二醇類(lèi)化合物及以該化合物與影像學(xué)核素或藥物結(jié)合的復(fù)合物，特別涉及葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物及其與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物結(jié)合的復(fù)合物。本發(fā)明還涉及分別以葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物、葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物和腫瘤診斷藥物中的應(yīng)用，以及以上述物質(zhì)為活性成分的藥物組合物，及其它們?cè)谀[瘤靶向診斷和治療中的應(yīng)用，特別是在淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的靶向診斷和治療中的應(yīng)用。
隨著多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面FR表達(dá)數(shù)目或活性顯著高于正常細(xì)胞的事實(shí)逐漸被揭示[Campbell et alCancer Res 1991，515329；Coney et alCancer Res 1991，516125；Weitman et alCancerRes 1992，523396]，以葉酸介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的研究已有了迅速發(fā)展。
葉酸作為FR配體與放射性核素直接通過(guò)小分子間接連接而成的復(fù)合物，在腫瘤影像診斷方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤部位靶向效果顯著[Low et alWO96/36367 Nov.21，1996和USA5688488Nov.18，1997；Wang S et alBioconjugate Chem 1996，7(1)56；Mathias CJ et alNucl Med Biol 1999，26(1)23；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8673；Mathias CJ et alJ Nucl Med1998，39(9)1579；Mathias CJ et alNucl Med Biol1998，25(6)585；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8(5)673；Iigan S et alCancer Biother Radiopharmaceuticals1998，13(6)427；Guo W et alJ Nucl Med 1999，40(9)1563]。
葉酸間接與脂質(zhì)體表面結(jié)合生成的葉酸-聚乙二醇-脂質(zhì)體細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其靶向腫瘤細(xì)胞效果明顯好于PEG-脂質(zhì)體或普通脂質(zhì)體[Lee et alJ Biol Chem 1994，269(5)3198；Wanget alProc Natl Acad Sci USA 1995，923318；Lee et alBiochimBiophys Acta 1995，1233134；Vogel et alJ Am Chem Soc1996，118(7)1581；Thompson et alWO97/31624 Sep.4，1997.RuiY et alJ A Chem Soc 1998，120(44)11213；Gabizon A et alBioconjugate Chem 1999，10(2)289；Shinoda T et alJ PharmSci 1998，87(12)1521；陸偉躍等上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2000，27(1)4]。
葉酸與高分子復(fù)合物也可通過(guò)FR將高分子完整地傳釋至細(xì)胞內(nèi)的非溶酶體漿質(zhì)中[Ying juan Lu et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54675]。與葉酸復(fù)合的牛血清白蛋白、牛免疫球膽白、辣根過(guò)氧化酶、核糖核酸酶、豆絲氨酸酶抑制劑和抗DNA寡核苷酸均能明顯導(dǎo)入KB細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和XC細(xì)胞發(fā)揮其相應(yīng)效果[Leamon et alProc NatlAcad Sci USA 1991，885572；Low et alWO90/12096Oct.18，1990]。結(jié)合葉酸的抗T細(xì)胞受體單克隆抗體或抗Fc受體單克隆抗體能將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞緊密地撮合在一起，達(dá)到有效溶解腫瘤細(xì)胞目的[David et alWO96/34630 Nov.7，1996]。而具有抑制蛋白合成功能的毒素[木鱉子皂甙(Momordin)—一種只有透過(guò)核糖體到達(dá)細(xì)胞漿才表現(xiàn)出細(xì)胞毒性的蛋白毒素；假單胞菌外毒素片段(LysPE38和CysPE35)]與葉酸復(fù)合后，其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力極大增強(qiáng)[Leamon et alJBiol Chem 1992，26724966；1993，26824847]。一種本無(wú)抗腫瘤活性的用于血容量擴(kuò)充劑的右旋糖苷與葉酸復(fù)合后，具有明顯的抑制腫瘤組織生長(zhǎng)作用(中國(guó)專(zhuān)利ZL00115752.3)。
一般認(rèn)為，藥物載體的粒徑或等效直徑介于9-100nm之間時(shí)，組織間隙注射后，具有良好的淋巴系統(tǒng)靶向性。至今為止，作為淋巴靶向藥物載體研究的物質(zhì)主要包括脂質(zhì)體、納米粒、膠束、多聚糖分子等，[Oussoren C et alAdv Drug deliv Rev 2001，50143；IllumL et alPharm Res 2001，18(5)640；Supersaxo A et alPharmRes 1991，8(10)1286；Vera DRJ Nucl Med 2001，42(6)951；陸偉躍等上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)1996，23(suppl)3]，有報(bào)道，作為抗腫瘤藥物載體靶向淋巴系統(tǒng)，[嚴(yán)忠勤等中國(guó)藥物化學(xué)雜志1999，9(4)240]。
聚二醇化合物是一類(lèi)具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重復(fù)結(jié)構(gòu)的線性聚二醇類(lèi)高分子化合物，其中n≥2或n’≥1。聚二醇化合物中最常見(jiàn)的是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，其分子組成為HOCH2CH2(OCH2CH2O)nCH2CH2OH或HOCH2(CH2OCH2)nCH2OHPEG既可溶解于水，又可溶解于絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑，具有良好生物相容性和血液相容性，免疫原性低[Richter A W et alInt ArchAllergy Appl Immunol 1984，7436]，能被機(jī)體迅速排除而不產(chǎn)生任何毒副作用[Yamaoka T et alJ Pharm Sci 1994，83601]。
在制藥工業(yè)中，PEG可用作藥物輔料以提高藥物的各種性能，如分散性、成膜性、潤(rùn)滑性、緩釋性等[Zalipsky S et alAdv Drugdelivery Rev 1995，16157]。在新型生物材料的合成和改性中，PEG作為材料的一部分，能賦予材料新的特性和功能，如親水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬細(xì)胞吞噬性等[Green wald R B et alJ Org Chem1995，60333；Iphigenia L K et alInt J Pharm 2000，157103]。
在PEG的實(shí)際應(yīng)用中，端基起著決定性的作用。PEG鏈末端不只限于羥基，其它反應(yīng)活性更強(qiáng)的功能基團(tuán)，如對(duì)甲苯磺酸酯[SuzakiT et alJ Polym Sci Polym Lett Ed 1979，17241]、氨基[GlassJD et alJ biopolym 1979，18383]、羧基[Fradet A et alPolymBull 1981，4205]、醛基[Ciuffarin E et alJ Org Chem1981，463064]等基團(tuán)也可引入PEG鏈的兩末端。這些功能基團(tuán)的引入，擴(kuò)大了PEG的應(yīng)用范圍。
PEG修飾包括，PEG與生物大分子類(lèi)藥物的物理結(jié)合和化學(xué)修飾，其可改變生物大分子的一些性質(zhì)，如①增加藥物的溶解度和穩(wěn)定性；②減弱或消除免疫原性、抗原性和毒性；③改善藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期；④提高藥物的治療指數(shù)、擴(kuò)大臨床使用等。目前大部分研究主要集中在PEG與蛋白質(zhì)的化學(xué)復(fù)合方面，如干擾素、超氧化物歧化酶、粒細(xì)胞集落刺激因子、牛血紅蛋白、水蛭素、腫瘤壞死因子、胰島素、白介素-2、尿酸酶腺苷脫胺酶、天冬酰胺酶等[Wang YS et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54547；Bullick J et alAnal Biochem 1997，254(2)254；Malic F et alExp Hematol 1992，20(8)1028；Conover CD et alArtif CellsBlood Substit Immobil Biotechnol 1999，27(2)93；Fareed J etalThrombosis & Haemostasis 1991，65(6)1286；Tsutsumi Y etalBr J Cancer 1995，71(5)963；Hinds K et alBionconjug Chem2000，11(2)195；Schiavon O et alfarmaco 2000，55(4)264；Goodson RJ et alBiochem Biophysic Res Commun 1993，197(1)287；Inada Y et alTIBTECH 1995，1386；Jean-Francois J et alPiotechnol Appl Biochem 1996，23(Pt3)221]。
綜上所述，腫瘤細(xì)胞膜表面FR是一條可通過(guò)葉酸將包括放射性核素、脂質(zhì)體和高分子化合物等物質(zhì)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有效途徑；PEG是一類(lèi)具有廣闊應(yīng)用前景的高分子化合物，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要用作蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖等生物大分子的首選化學(xué)修飾劑。因此，葉酸的主動(dòng)靶向性與PEG作為藥物載體的優(yōu)良性能結(jié)合，可能成為新的具有靶向作用的腫瘤診斷或治療的藥物載體。
本發(fā)明的另一目的是提供以上述化合物作為靶向載體與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物結(jié)合的藥物復(fù)合物。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供分別以葉酸-PEG類(lèi)化合物、葉酸-PEG類(lèi)化合物與影像學(xué)核素的復(fù)合物或與抗腫瘤藥物的復(fù)合物為活性成分的藥物組合物。
本發(fā)明還提供上述物質(zhì)在制備腫瘤診斷藥物和抗腫瘤藥物中的用途和為臨床提供腫瘤靶向診斷和治療，特別是淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤靶向診斷與治療的物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平均分子量?jī)H為3,000的葉酸-PEG類(lèi)化合物能夠在組織間隙不透過(guò)毛細(xì)血管而導(dǎo)入淋巴系統(tǒng)，同時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)葉酸受體的特征和腫瘤組織靶向性，其在進(jìn)入淋巴系統(tǒng)后，與過(guò)度表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，其所攜帶藥物主動(dòng)靶向腫瘤組織。
本發(fā)明特別涉及的葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物包括，聚乙二醇末端一個(gè)羥基被氨基取代后再被葉酸衍生化，另一端羥基被甲氧基、氨基、醛基、羧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被葉酸、多羧基分子衍生化而生成的化合物；涉及的葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物結(jié)合的復(fù)合物包括，一端被多羧基衍生化的葉酸-聚乙二醇化合物與放射性核素99mTc和111In或Gd磁共振核素螯合而生成的復(fù)合物，或一端取代有氨基、醛基、羧基和巰基，或衍生有多羧基或磺酸基的葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物與甲氨蝶呤、阿霉素等蒽環(huán)類(lèi)抗生素、絲裂霉素C、6-巰基嘌呤等抗腫瘤藥物共價(jià)結(jié)合而成的復(fù)合物。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明和達(dá)到上述發(fā)明目的。1.制備葉酸-聚二醇類(lèi)化合物將葉酸或葉酸衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)與不同分子量、不同種類(lèi)的聚二醇類(lèi)化合物，特別是PEG類(lèi)化合物，縮合生成下式的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，X-Y其中X代表葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y代表聚二醇及其衍生物。
上述葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)，其對(duì)動(dòng)物或人體細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，它們包括葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫喋呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸、8-去氮葉酸等。其中，某位“去氮”是指葉酸中該位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特別是PEG末端一個(gè)羥基被氨基、羧基、甲氧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被葉酸、二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
(1)分子兩端羥基被氨基取代的聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)與葉酸(F)在碳二亞胺脫水劑和堿性催化劑作用下，一端氨基或兩端與F中的羧基縮合生成F-PEG-NH2或F-PEG-F。
(2)F-PEG-NH2與DTPA酸酐縮合反應(yīng)生成F-PEG-DTPA。
(3)F-PEG-NH2與羧甲基右旋糖酐(CMDx)在碳二亞胺脫水劑和堿性催化劑作用下，另一端氨基與CMDx縮合生成F-PEG-CMDx。
(4)分子一端羥基被氨基取代的單甲氧基聚乙二醇(NH2-PEG-OCH3)與F在碳二亞胺脫水劑和堿性催化劑作用下，氨基與F縮合生成F-PEG-OCH3。2.制備葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，特別是葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物與不同影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物，在一定條件下反應(yīng)生成相應(yīng)葉酸-聚乙二醇衍生物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其通式如下X-Y-Z其中X代表葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y代表聚二醇及其衍生物；Z為影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物。
上述葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)，其對(duì)動(dòng)物或人體細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，它們包括葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫蝶呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸、8-去氮葉酸等。其中，某位“去氮”是指葉酸中該位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特別是PEG末端一個(gè)羥基被氨基、羧基、醛基和巰基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
上述影像學(xué)核素是指可被葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，特別是可被葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
上述抗腫瘤藥物是指具有可與葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，特別是具有可與葉酸-聚乙二醇類(lèi)化合物一端氨基、巰基、醛基、羧基和磺酸基共價(jià)結(jié)合的帶有羧基、氨基或巰基的抗腫瘤藥物。
(1)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx先與還原劑氯化亞錫在酸性條件下制備成水針劑或凍干粉針劑，再與新鮮的Na99mTcO4生理鹽水淋洗液混合，室溫條件下反應(yīng)生成F-PEG-DTPA-99mTc或F-PEG-CMDx-99mTc復(fù)合物。
(2)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx與GdCl3在酸性和室溫條件下反應(yīng)，生成F-PEG-DTPA-Gd或F-PEG-CMDx-Gd復(fù)合物。
(3)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx與絲裂霉素C(MMC)在水溶性碳二亞胺、pH5.0-5.5條件下，室溫反應(yīng)生成F-PEG-DTPA-MMC或F-PEG-CMDx-MMC復(fù)合物。
(4)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx與阿霉素(Dox)在碳二亞胺和堿性條件下，40℃反應(yīng)生成F-PEG-DTPA-Dox或F-PEG-CMDx-Dox復(fù)合物。
(5)F-PEG-NH2與甲氨喋呤(MTX)在碳二亞胺和堿性條件下，40℃反應(yīng)生成F-PEG-MTX復(fù)合物。3.葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)一定濃度葉酸-PEG類(lèi)化合物作用后的腫瘤細(xì)胞周期中各期DNA數(shù)量變化和凋亡百分率和葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。4.葉酸-PEG類(lèi)化合物循葉酸受體途徑導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)采用放射性配體結(jié)合分析法，測(cè)定葉酸-PEG類(lèi)化合物競(jìng)爭(zhēng)抑制125I-葉酸與腫瘤細(xì)胞膜表面葉酸受體結(jié)合程度，了解葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞膜表面葉酸受體的特異性親和能力。
采用放射性同位素示蹤法，檢測(cè)不同時(shí)相腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞葉酸-PEG類(lèi)化合物量的變化，證實(shí)葉酸-PEG類(lèi)化合物循葉酸受體途徑導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。5.葉酸-PEG類(lèi)化合物在正常和模型動(dòng)物體內(nèi)的行為采用放射性同位素示蹤法，檢測(cè)不同時(shí)相內(nèi)葉酸-PEG類(lèi)化合物在正常小鼠、大鼠及荷瘤裸鼠的正常組織和腫瘤組織中的分布，了解其被動(dòng)物正常組織攝取情況、藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)和對(duì)腫瘤組織的靶向性。6.葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)動(dòng)物淋巴系統(tǒng)靶向性的檢測(cè)采用放射性同位素示蹤法，檢測(cè)不同時(shí)相葉酸-PEG類(lèi)化合物在正常大鼠的組織和淋巴結(jié)中的分布，結(jié)合SPECT儀對(duì)家兔全身動(dòng)態(tài)顯像觀測(cè)，了解其對(duì)淋巴系統(tǒng)的靶向性及其排泄情況。
本發(fā)明葉酸-PEG類(lèi)化合物及其與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物可采用藥劑學(xué)上允許的賦形劑、粘合性、助懸劑、崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、腸溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等輔料配伍，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)或用特定的生產(chǎn)方法制備成相應(yīng)藥物組合物制劑?？刹捎萌~酸-PEG類(lèi)化合物與相關(guān)還原劑或pH調(diào)節(jié)劑以及相應(yīng)的放射性核素或磁共振核素配伍，按藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)或用特定生產(chǎn)方法制備成相應(yīng)藥物組合物制劑。
所述藥物組合物制劑包括腫瘤內(nèi)、腫瘤旁、靜脈或組織間隙注射用的葉酸-PEG類(lèi)化合物及其影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物復(fù)合物的凍干粉針劑、水針劑、脂質(zhì)體、納米粒、膠束；口服用的葉酸-PEG類(lèi)化合物及其抗腫瘤藥物復(fù)合物的微球劑、腸溶膠囊等。
本發(fā)明所述的聚二醇類(lèi)化合物，特別是聚乙二醇類(lèi)化合物，其中PEG平均分子量范圍為800-20,000。聚乙二醇類(lèi)化合物與葉酸共價(jià)結(jié)合生成葉酸-PEG類(lèi)化合物，選擇PEG平均分子量為2000的葉酸-PEG類(lèi)化合物作為模型藥物進(jìn)行如下試驗(yàn)。1.葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響及凋亡的誘導(dǎo)作用流式細(xì)胞儀檢測(cè)葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa229和人鼻咽癌細(xì)胞KB生長(zhǎng)的影響程度，結(jié)果表明F-PEG-OCH3、F-PEG-DTPA、F-PEG-NH2、F-PEG-F誘導(dǎo)HeLa229細(xì)胞凋亡程度依次為43.14％、36.48％、14.37％和10.95％，誘導(dǎo)KB細(xì)胞凋亡程度依次為52.09％、32.76％、15.14％和3.81％。兩株腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似的凋亡誘導(dǎo)效果，即F-PEG-OCH3最高，F(xiàn)-PEG-DTPA次之。2.葉酸-PEG-DTPA對(duì)腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體競(jìng)爭(zhēng)能力和內(nèi)化程度F-PEG-DTPA與125I-F競(jìng)爭(zhēng)HeLa229細(xì)胞表面葉酸受體的結(jié)果表明，F(xiàn)-LY2-DTPA具有與游離葉酸類(lèi)似的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合葉酸受體的特性。放射性同位素示蹤的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KB細(xì)胞內(nèi)化F-PEG-DTPA量隨接觸時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，6h后KB細(xì)胞攝入量基本達(dá)到飽和。3.葉酸-PEG類(lèi)化合物在正常和模型動(dòng)物體內(nèi)的行為特點(diǎn)正常動(dòng)物體內(nèi)組織分布和藥動(dòng)學(xué)的放射性同位素示蹤結(jié)果表明大鼠體內(nèi)2h時(shí)，F(xiàn)-PEG-DTPA主要分布于腎臟，總血漿清除半衰期為7.5min，其中t1/2(α)＝1.85min、t(1/2)β＝17.84min，血漿清除速度快；大鼠體內(nèi)6h時(shí)，F(xiàn)-PEG-CMDx主要集中在腎臟和肺部，總血漿清除半衰期為37.44，其中t(1/2)α＝10.69、t(1/2)β＝107.8，血漿清除速度相對(duì)較慢。
荷瘤(SKOV3)裸鼠的腫瘤組織靶向性試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG-DTPA和F-PEG-CMDx均表現(xiàn)出一定的腫瘤組織靶向性，且4h時(shí)均比游離葉酸靶向性好。荷瘤裸鼠尾靜脈注射F-PEG-DTPA-99mTc后1、4和24h時(shí)，腫瘤與肌肉比分別為2.97、3.68和3.59倍；注射F-PEG-CMDx-99mTc后4和24h時(shí)，腫瘤與肌肉比分別為2.09和5.64倍；注射99mTc-F后4和24h時(shí)，腫瘤與肌肉比分別為1.45和3.62倍。4.葉酸-PEG-DTPA對(duì)動(dòng)物淋巴系統(tǒng)靶向程度放射性同位素示蹤的淋巴系統(tǒng)靶向試驗(yàn)結(jié)果表明大鼠和家兔趾間間隙注射F-PEG-DTPA-99mTc后，2h時(shí)大鼠淋巴結(jié)與血、肝、腎和肌肉比值分別為25.86、31.78、1.13和33.10，給藥后家兔淋巴系統(tǒng)靶向顯著而又迅速，進(jìn)入血循環(huán)后，肝中攝取量少，腎臟為主要分布器官，并經(jīng)其通過(guò)膀胱快速排泄，淋巴結(jié)影像逐漸淡化。提示F-PEG-DTPA具有良好的淋巴系統(tǒng)靶向性，且正常淋巴結(jié)無(wú)明顯蓄積現(xiàn)象。
經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明有如下特點(diǎn)葉酸-PEG類(lèi)化合物可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑選擇性地蓄積于過(guò)度表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；葉酸-PEG-DTPA血漿清除速度快，但在組織間隙給藥后，淋巴系統(tǒng)靶向性好，結(jié)合其腫瘤靶向性，可作為靶向載體分別與影像學(xué)核素和抗腫瘤藥物結(jié)合成藥物復(fù)合物，應(yīng)用于淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤靶向診斷和治療。
在波長(zhǎng)為366nm處測(cè)定0.5mmol/l的F-PEG-NH2氫氧化鈉溶液的吸收度，A值為4.4630，由葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，0.5mmol/l F-PEG-NH2中葉酸的摩爾濃度為0.4980mmol/l。
即F-PEG-NH2中氨基與葉酸摩爾比(0.4975/0.4980)近似為1。6.葉酸-PEG類(lèi)化合物的檢測(cè)將上述方法制備得到的葉酸-PEG類(lèi)化合物，用HPLC法對(duì)其純度進(jìn)行定量分析，用紫外、紅外、核磁共振對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別，其結(jié)果分別如下HPLC法檢測(cè)純度結(jié)果將純化后的F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HPLC檢測(cè)圖譜，采用面積歸一法測(cè)得純度分別為100％、99.18％、98.97％、97.67％和100％。紫外掃描圖譜由紫外可見(jiàn)光譜掃描圖譜顯示，F(xiàn)-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3在283和365nm波長(zhǎng)處均有與葉酸相同的吸收峰。紅外圖譜將F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3紅外圖譜與葉酸比較，上述葉酸-PEG類(lèi)化合物圖譜中均有葉酸所含基團(tuán)特征峰，如1693cm-1處的酰胺基特征峰，1600cm-1附近的羰基特征峰；同時(shí)也具有PEG所含基團(tuán)的特征峰，如1100cm-1附近的脂肪醚特征峰。核磁共振圖譜將F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HNMR圖譜與葉酸、NH2-PEG-NH2、CH3O-PEG-NH2、DTPA、CMDx比較，均有與葉酸相似的位移峰δ8.67(s，1H，C7-H)、7.66(d，2H，Ar)、6.63(d，2H，Ar)、4.34(dd，C19-H)、2.0-2.4(m，2H，C21-H2)，還有與PEG相似的位移峰δ3.1-4.0(m，-OCH2CH2)；F-PEG-OCH3有與CH3O-PEG-NH2相似的位移峰δ3.36(s，-OCH3)；F-PEG-DTPA有與DTPA相似的位移峰δ3.29(t，C5，C7-2H)、3.42(t，C4，C8-2H)；F-PEG-CMDx有與CMDx在δ3.4-4.5處相似的位移多峰。實(shí)施例2 制備葉酸-PEG類(lèi)化合物與99mTc的復(fù)合物1.制備葉酸-PEG-DTPA-99mTc取10mg F-PEG-DTPA加1ml pH 7.4的PBS(0.01mol/l)溶解后，加入10μl濃度為10μg/μl氯化亞錫的0.15N鹽酸溶液后，再加入1-2ml新鮮Na99mTcO4溶液(1-5mCi)，混勻，室溫下放置10min，即得F-PEG-DTPA-99mTc注射液。用Sephadex G-15柱，以pH 7.4的0.01MPBS為流動(dòng)相洗脫，對(duì)其進(jìn)行純化，收集黃色區(qū)帶洗脫液，以紙層析法檢測(cè)其放射化學(xué)純度(固定相為新華濾紙，展開(kāi)劑為85％乙醇水溶液，展開(kāi)后在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定各區(qū)段放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算F-PEG-DTPA-99mTc放射性計(jì)數(shù)占總放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù))。F-PEG-DTPA-99mTc放射化學(xué)純度＞95％。2.制備葉酸-PEG-CMDx-99mTc取10mg F-PEG-CMDx同上方法反應(yīng)和純化，得F-PEG-CMDx-99mTc注射液，其放射化學(xué)純度＞95％。實(shí)施例3 制備葉酸-PEG類(lèi)化合物與Gd的復(fù)合物取F-PEG-DTPA 100mg溶解于6ml注射用水，加1.5ml 50mmol/lGdCl3的0.1N HCl溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，反應(yīng)液用Sephadex G-15柱結(jié)合AKTA explorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，收集具有葉酸特征吸收波長(zhǎng)段的流分，冷凍干燥，得黃色的F-PEG-DTPA-Gd固體184mg，再加注射用水4.2ml，按每瓶1ml分裝后凍干。實(shí)施例4 制備葉酸-PEG類(lèi)化合物與抗腫瘤藥物的復(fù)合物1.制備葉酸-PEG-DTPA-絲裂霉素C取F-PEG-DTPA 83mg溶解于10ml注射用水，加絲裂霉素C(MMC)15mg溶解后，在攪拌下加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)83mg，維持pH 5.0-5.5之間室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。在4℃條件下，反應(yīng)液對(duì)注射用水透析24h后，依次用DEAE Sepharose FF離子交換柱和Sephadex G-15柱結(jié)合AKTA explorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，收集同時(shí)具有MMC和葉酸特征吸收波長(zhǎng)段的流分，冷凍干燥，得黃中略帶紫色的F-PEG-DTPA-MMC固體61mg。2.制備葉酸-PEG-DTPA-阿霉素取F-PEG-DTPA 83mg溶解于5ml DMSO，在攪拌下加DCC 18mg，在40℃條件下活化30min，加阿霉素(Dox)20mg和三乙胺10μl，攪拌反應(yīng)24h，加20ml蒸餾水終止反應(yīng)，室溫下4000r/min離心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF離子交換柱和Sephadex G-15柱結(jié)合AKTA explorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，收集同時(shí)具有Dox和葉酸特征吸收波長(zhǎng)段的流分，冷凍干燥，得橙紅色F-PEG-DTPA-Dox固體67mg。3.制備葉酸-PEG-DTPA-甲氨喋呤取甲氨喋呤(MTX)22mg溶解于5ml DMSO，在攪拌下加DCC20mg，在40℃條件下活化30min，F(xiàn)-PEG-NH260mg和吡啶10μl，攪拌反應(yīng)24h，加20ml蒸餾水終止反應(yīng)，室溫下4000r/min離心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF離子交換柱和Sephadex G-15柱結(jié)合AKTA explorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，收集同時(shí)具有MTX和葉酸特征吸收波長(zhǎng)段的流分，冷凍干燥，得黃色F-PEG-MTX固體46mg。實(shí)施例5 葉酸-PEG類(lèi)化合物對(duì)體外人癌細(xì)胞周期DNA和凋亡的影響用含10％小牛血清(BCS)的無(wú)葉酸RPMI1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5％CO2、飽和濕度)連續(xù)HeLa229、KB細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至足夠量。將一定數(shù)量細(xì)胞分裝后繼續(xù)培養(yǎng)一天使之貼壁，分別加入F-PEG類(lèi)化合物，使最終濃度為10μg/ml，連續(xù)培養(yǎng)72h兩次。用0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化并分散HeLa229、KB細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心，棄去上清液，重新懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至106cell/ml。將等體積的細(xì)胞懸液和碘化丙啶染色液混合，4℃放置20-30min，300目尼龍膜過(guò)濾后，用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)波長(zhǎng)處檢測(cè)，考察F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-OCH3對(duì)HeLa229、KB細(xì)胞周期各期DNA量變化及其凋亡的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG類(lèi)化合物有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡程度依次為F-LY2-OMe＞F-LY2-DTPA＞F-LY2-NH2＞LY2-F2(HeLa229細(xì)胞)；F-LY2-Ome＞F-LY2-DTPA＞LY2-F2＞F-LY2-NH2(KB細(xì)胞)。表1是葉酸(F)-PEG類(lèi)葉酸化合物對(duì)Hela229及KB細(xì)胞的凋亡影響。表1DNA含量 凋亡率細(xì)胞類(lèi)型 實(shí)驗(yàn)組G0-G1 G2-M S (％)KB 對(duì)照 91.82 6.41 1.77 1.02PEG-F2 64.77 6.12 29.10 15.14F-PEG-OCH370.20 28.13 1.67 52.09F-PEG-NH264.72 1.61 33.67 3.81F-PEG-DTPA 82.03 4.60 13.37 32.76對(duì)照 96.81 0.00 5.96 5.96HeLa229PEG-F2 59.42 0.41 40.16 10.95F-PEG-OCH388.99 0.06 10.95 43.14F-PEG-NH265.42 0.35 34.23 14.37F-PEG-DTPA 94.63 4.99 0.38 36.48實(shí)施例6 葉酸-PEG-DTPA與葉酸受體結(jié)合特性的評(píng)價(jià)1.葉酸-PEG-DTPA-99mTc對(duì)HeLa 229葉酸受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)HeLa229細(xì)胞用含10％小牛血清(BCS)的無(wú)葉酸RPMI1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5％CO2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)至足夠量后，制備成約含2.2×105cells/ml的細(xì)胞懸液。將此細(xì)胞懸液中加入50μl125I-F與不同濃度F-PEG-DTPA或不同濃度葉酸，在pH 7.4的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液中，4℃反應(yīng)20h后，4000r/min離心10min，棄去上清液，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量沉淀物(細(xì)胞結(jié)合物)放射性計(jì)數(shù)(CPM)。分別以細(xì)胞結(jié)合的放射性計(jì)數(shù)對(duì)葉酸、F-PEG-DTPA濃度作圖，得HeLa229細(xì)胞結(jié)合125I-F的抑制曲線。結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG-DTPA和F競(jìng)爭(zhēng)抑制125I-F與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體結(jié)合的特征相似，但F-PEG-DTPA與125I-F競(jìng)爭(zhēng)葉酸受體能力弱于F，兩者抑制腫瘤細(xì)胞結(jié)合125I-F 50％時(shí)的濃度分別為11.2和1.58fmol2.KB細(xì)胞內(nèi)化攝取葉酸-PEG-DTPA試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KB細(xì)胞，通過(guò)常規(guī)方法消化，制成單細(xì)胞懸液，將其接種于四塊12孔板中，每孔2ml(每孔細(xì)胞數(shù)為6.25×104cells)。四天后將板中培養(yǎng)液更換成不含血清的無(wú)葉酸1640培養(yǎng)液，每孔2ml(洗滌，1ml×2次)。次日換培養(yǎng)液，每孔1ml不含血清的無(wú)葉酸1640培養(yǎng)液，后續(xù)處理按以下步驟操作。
非特異結(jié)合管(NBS)中先加F-PEG-DTPA溶液混勻，然后分別在非特異結(jié)合管、特異結(jié)合管和內(nèi)化管中各加入100μlF-PEG-DTPA-99mTc，吸取不同時(shí)相孔內(nèi)上清液。非特異結(jié)合管和特異結(jié)合管分別用pH 7.4的0.01M PBS洗滌(1ml×2次)后，0.25％胰蛋白酶消化5min，用力吹打貼壁細(xì)胞，吸出加入至測(cè)量管；內(nèi)化管加pH 3的醋酸溶液，使結(jié)合在細(xì)胞表面葉酸受體的配體解離后，再按特異結(jié)合管處理方法操作。用γ計(jì)數(shù)器分別測(cè)定處理后的非特異結(jié)合管、特異結(jié)合管和內(nèi)化管中放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果提示，KB細(xì)胞內(nèi)吞攝取F-PEG-DTPA量隨接觸時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，6h后KB細(xì)胞攝入量基本達(dá)到飽和。實(shí)施例7 葉酸-PEG類(lèi)化合物的動(dòng)物體內(nèi)行為試驗(yàn)1.葉酸-PEG-DTPA在正常大鼠體內(nèi)血液動(dòng)力學(xué)及其分布大鼠股靜脈注射0.1ml濃度約為10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分別于注射后不同時(shí)相尾靜脈取血50μl，在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。應(yīng)用MicroMath PKAnalyst Statistics Software按二室模型處理，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為t1/2(E)＝7.5min，t1/2(α)＝1.85min，t1/2(β)＝17.84min。結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG-DTPA血液清除速度較快。
大鼠尾靜脈注射0.1ml濃度約為10mg/ml的F-DTPA-PEG-99mTc，于2h后斷頭處死，取血、心、肝、脾、腎、肺、大腸、小腸、胃、肌肉，稱(chēng)量，在γ計(jì)數(shù)器上分別測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。計(jì)算每克組織的放射性計(jì)數(shù)占總注射量放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。結(jié)果提示，F(xiàn)-DTPA-PEG-99mTc在2h時(shí)主要分布在大鼠腎臟，而在肝臟等其它臟器中的量遠(yuǎn)小于腎。2.葉酸-PEG-CMDx在正常大鼠體內(nèi)血液動(dòng)力學(xué)及其分布大鼠6只，分為兩組，每只股靜脈分別注射0.1ml濃度約為5mg/ml的F-PEG-CMDx-99mTc或99mTc-CMDx，于注射后不同時(shí)相尾靜脈各取血50μl，在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。應(yīng)用MicroMath PKAnalystStatistics Software按二室模型處理，F(xiàn)-PEG-CMDx和CMDx的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為t1/2(E)＝37.44min，t1/2(α)＝10.69min，t1/2(β)＝107.8min和t1/2(E)＝53.57min，t1/2(α)＝22.71min，t1/2(β)＝202.3min。結(jié)果提示，F(xiàn)-PEG化縮短了CMDx在血液中滯留時(shí)間，而F-PEG被CMDx衍生化則延長(zhǎng)了F-PEG類(lèi)化合物的血循環(huán)時(shí)間。注射6h后斷頭處死，取心、肺、肝、脾、腎，稱(chēng)量，在γ計(jì)數(shù)器上分別測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。計(jì)算每克組織的放射性計(jì)數(shù)占總注射量放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。結(jié)果表明，給藥6h后，F(xiàn)-PEG-CMDx和CMDx均在肝中的分布較少，主要集中在腎和肺，但前者在組織中攝取量明顯低于后者。表2是大鼠股靜脈注射6h后F-PEG-CMDx-99m和99mTc-CMDx的組織分布。
表2％ID/g組 織F-PEG-CMDx-99mTc99mTc-CMDx心0.31±0.040.30±0.06肝0.46±0.040.75±0.05肺2.55±0.184.22±0.78脾0.58±0.282.16±0.19腎9.88±6.2412.49±5.723.葉酸-PEG-DTPA在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)組織分布荷瘤(SKOV3)裸鼠10只，用低葉酸飼料喂養(yǎng)三天后，分成三組，除F-PEG-DTPA-99mTc組設(shè)1個(gè)時(shí)相外，F(xiàn)-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F均為2個(gè)時(shí)相。尾靜脈分別注射0.1ml濃度10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc、F-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F后，F(xiàn)-PEG-DTPA-99mTc組于4h、后二組分別于4和24h處死，取血、心、肝、脾、腎、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、腫瘤，稱(chēng)量，在γ計(jì)數(shù)器上分別測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。計(jì)算每克組織放射性計(jì)數(shù)占總注射量放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。
另取(SKOV3)荷瘤裸鼠14只，用低葉酸飼料喂養(yǎng)三天后，分成3個(gè)時(shí)相組(4、5、5只)，尾靜脈分別注射0.1ml濃度為7mg/ml的葉酸-PEG-DTPA-99mTc99mTc-DTPA-LY2-F后，于1、4、24h分別斷頭處死，后續(xù)操作同上。計(jì)算每克組織放射性計(jì)數(shù)占總注射量放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。
結(jié)果表明，靜脈注射1、4和24h后，F(xiàn)-PEG-DTPA在腫瘤組織中分布量比肌肉分別高2.97、3.68和3.59倍；靜脈注射4和24h后，F(xiàn)-PEG-CMDx在腫瘤組織中分布量比肌肉分別高2.09和5.64倍；靜脈注射4和24h后，葉酸在腫瘤組織中分布量比肌肉分別高1.45和3.62。提示F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx具有一定的腫瘤組織靶向性，且在給藥后的4h內(nèi)均比游離葉酸靶向性好。實(shí)施例8 F-PEG-DTPA淋巴系統(tǒng)靶向性試驗(yàn)1.F-PEG-DTPA對(duì)大鼠淋巴結(jié)靶向試驗(yàn)大鼠兩后肢趾間間隙各注射一點(diǎn)，每點(diǎn)60μl濃度約為10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，于注射后2h斷頭處死，取血、心、肝、脾、腎、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、國(guó)淋巴結(jié)，稱(chēng)量，在γ計(jì)數(shù)器上分別測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM)。計(jì)算每克組織放射性計(jì)數(shù)占總注射量放射性計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG-DTPA在淋巴結(jié)中的量遠(yuǎn)高于血、心、脾、肺、肝、大腸、小腸、胃，與腎臟中的量相當(dāng)，提示F-PEG-DTPA具有較好的淋巴靶向性。2.F-PEG-DTPA對(duì)家兔淋巴系統(tǒng)靶向試驗(yàn)家兔兩后肢趾間間隙各注射一點(diǎn)，每點(diǎn)0.1ml濃度為10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分別于注射后5、15和120min在SPECT儀下進(jìn)行全身顯像觀察并攝片記錄。動(dòng)態(tài)圖象結(jié)果表明，F(xiàn)-PEG-DTPA在組織間隙靶向淋巴系統(tǒng)迅速而顯著，整個(gè)下肢淋巴系統(tǒng)導(dǎo)入在5min內(nèi)完成，除腎臟和膀胱外，2h內(nèi)其它臟器或組織均未見(jiàn)明顯蓄積，但包括淋巴結(jié)在內(nèi)的淋巴系統(tǒng)攝取F-PEG-DTPA量隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著遞減。此外，家兔膀胱中蓄積量隨時(shí)間增加，腎臟中蓄積量隨時(shí)間減少，提示腎臟可能僅是F-PEG-DTPA排泄途徑。
權(quán)利要求
1.一種葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于其具有以下通式，X-Y其中X為葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y為具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重復(fù)結(jié)構(gòu)的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1。
2.按權(quán)利要求1所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)是葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫蝶呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸和8-去氮葉酸。
3.按權(quán)利要求1所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物的聚二醇類(lèi)化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量為800-20,000。
4.按權(quán)利要求3所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一個(gè)羥基被氨基取代后再被葉酸衍生化，另一端羥基被甲氧基、氨基、羧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被葉酸、二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
5.按權(quán)利要求4所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一個(gè)羥基被氨基取代后再被葉酸衍生化，另一端羥基被甲氧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被葉酸、二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
6.按權(quán)利要求5所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇平均分子量為2,000-20,000。
7.按權(quán)利要求6所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其特征在于所述的葉酸-聚乙二醇衍生物中的聚乙二醇平均分子量為2,000。
8.葉酸-聚二醇類(lèi)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.一種用于抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于由權(quán)利要求5的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與藥用輔料混合制成，其制劑為小針劑、凍干粉針劑、微球劑、納米粒和腸溶膠囊劑。
10.按權(quán)利要求9所述的用于抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述藥物輔料是藥劑學(xué)上允許的賦形劑、粘合劑、助懸劑、崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、腸溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
11.一種葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于具有以下通式X-Y-Z其中X為葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y為具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重復(fù)結(jié)構(gòu)的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1；Z為影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物。
12.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)與權(quán)利要求2相同。
13.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物中聚二醇類(lèi)化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量為800-20,000。
14.按權(quán)利要求13所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物是聚乙二醇末端一個(gè)羥基被氨基取代后再被葉酸衍生化，另一端羥基被氨基、醛基、羧基和巰基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
15.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素的復(fù)合物，其特征在于所述影像學(xué)核素是可被葉酸-聚二醇類(lèi)化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
16.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述抗腫瘤藥物是具有可與葉酸-聚二醇類(lèi)化合物一端氨基、巰基、醛基、羧基和磺酸基共價(jià)結(jié)合的帶有羧基、氨基、巰基的抗腫瘤藥物。
17.按權(quán)利要求13所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量為2,000-10,000。
18.按權(quán)利要求17所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量為2,000。
19.按權(quán)利要求14所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物，其中聚乙二醇末端一個(gè)羥基被氨基取代后再被葉酸衍生化，另一端羥基被氨基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
20.按權(quán)利要求15所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素的復(fù)合物，其特征在于所述放射性核素是99mTc和111In，所述磁共振核素是Gd。
21.按權(quán)利要求16所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與抗腫瘤藥物的復(fù)合物，其特征在于所述抗腫瘤藥物是甲氨喋呤、阿霉素等蒽環(huán)類(lèi)抗生素和絲裂霉素。
22.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素的復(fù)合物在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
23.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與影像學(xué)核素的復(fù)合物在制備淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤診斷藥物中的用途。
24.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與抗腫瘤藥物的復(fù)合物在制備腫瘤靶向治療藥物中的用途。
25.按權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與抗腫瘤藥物的復(fù)合物在制備淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤治療藥物中的用途。
26.一種用于腫瘤靶向治療的藥物組合物，其特征在于由權(quán)利要求11所述的葉酸-聚二醇類(lèi)化合物與抗腫瘤藥物的復(fù)合物和藥用輔料混合制成，其制劑為小針劑、凍干粉針劑、微球劑、納米粒和腸溶膠囊劑。
27.按權(quán)利要求26所述的用于腫瘤靶向治療的藥物組合物，其特征在于所述藥物輔料是藥劑學(xué)上允許的賦形劑、粘合劑、助懸劑、崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、腸溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
全文摘要
本發(fā)明屬化學(xué)藥物領(lǐng)域，涉及葉酸－聚二醇類(lèi)特別是葉酸－聚乙二醇類(lèi)化合物及以該化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物結(jié)合的復(fù)合物，及其在腫瘤靶向診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小分子量的葉酸－PEG類(lèi)化合物能在組織間隙不透過(guò)毛細(xì)血管而導(dǎo)入淋巴系統(tǒng)，并具有競(jìng)爭(zhēng)葉酸受體的特征和腫瘤組織靶向性。本發(fā)明葉酸－聚二醇類(lèi)化合物及以該化合物與影像學(xué)核素或抗腫瘤藥物結(jié)合的復(fù)合物可制備腫瘤診斷藥物和抗腫瘤藥物，為臨床提供腫瘤靶向診斷和治療，特別是淋巴系統(tǒng)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤靶向診斷與治療的物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1472235SQ0312956
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者陸偉躍, 徐雯, 韓慧蘭, 劉敏, 謝操, 潘俊, 鐘高仁, 陳紹亮, 姚明 申請(qǐng)人:上海復(fù)康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司, 復(fù)旦大學(xué)