專利名稱：重組人干擾素用于預(yù)防嚴(yán)重性急性呼吸道綜合征的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組的細(xì)胞因子重組人干擾素用于預(yù)防嚴(yán)重性急性呼吸道綜合征(recombinant human interferon，rhIFN)的新治療適應(yīng)癥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rhIFN可以明顯地在體外抑制SARS病毒引起的細(xì)胞病變，這提示rhIFN可以作為用于預(yù)防SARS的新藥。
根據(jù)干擾素(interferons，IFNs)的定義，干擾素是一類至少在同種細(xì)胞上有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在不同途徑上影響細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和分化的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮需新合成RNA和蛋白質(zhì)。它是一類重要的細(xì)胞素。經(jīng)近30多年的臨床研究和應(yīng)用，說(shuō)明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
迄今所知，人干擾素存在多個(gè)型別干擾素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ，和ω等型別，它們的主要特點(diǎn)和可能的臨床應(yīng)用見表1.
表1 9種型別干擾素的主要特點(diǎn)和其臨床應(yīng)用或可能的臨床用途一覽表干擾素型別 主要特點(diǎn) 臨床應(yīng)用和可能的臨床用途干擾素-α 屬I型干擾素；約有23個(gè) 世界上批準(zhǔn)用于治療病毒病變種。較詳細(xì)研究的有約和惡性腫瘤的主要干擾素-α13種亞型。分子量為有干擾素-α1b，α2b，α2a.，約19-26kDa，由156-166個(gè) 有40種治療適應(yīng)癥。
氨基酸組成。115-151之間為保守序列?；蚣性?p22.受體位于21q22.1.
干擾素-β 屬I型干擾素；主要由成纖 美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療多發(fā)性維細(xì)胞所產(chǎn)生，為糖蛋白， 硬化。
166個(gè)氨基酸。Cys31/141之間的二硫鍵對(duì)其生物學(xué)活性的發(fā)揮是必需的。
在DNA水平上與干擾素α有30％的同源性。干擾素α和干擾素-β結(jié)合于同一干擾素受體。
干擾素-γ 屬II型干擾素；由T細(xì)胞 FDA批準(zhǔn)治療慢性淋巴肉芽和NK細(xì)胞刺激所產(chǎn)生。
腫；我國(guó)FDA批準(zhǔn)治療類風(fēng)二聚體蛋白質(zhì)。有2處糖 濕性關(guān)節(jié)炎。
基位點(diǎn)。143個(gè)氨基酸，無(wú)二硫鍵。對(duì)酸不穩(wěn)定。與干擾素α和β無(wú)明顯的同源性?；蛟?2q24.1.受體為于6和21對(duì)染色體。
干擾素-ω 屬I型干擾素；是人白細(xì) 1型丙型肝炎？胞干擾素的自然成分。又稱為干擾素-αII1。與干擾素-α的其它成員高度同源，與之相關(guān)的是牛滋養(yǎng)層蛋白質(zhì)TP-1。
干擾素ω結(jié)合于與干擾素-α和β同樣的細(xì)胞受體。
干擾素-τ TP-1屬1型干擾素，172 可能成為潛在的抗腫瘤藥個(gè)氨基酸與IFN-ω相關(guān)。 物，而無(wú)一般干擾素的毒性反芻動(dòng)物滋養(yǎng)層在植床 作用。
以前幾天分泌多種形式 可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性的IFN-τ。在識(shí)別母體和 腦脊髓炎；還能預(yù)防實(shí)驗(yàn)性建立孕體上起有重要作 腦脊髓炎超級(jí)抗原的重新激用。在周圍血淋巴細(xì)胞 活。
中，抗HIV的能力比干擾素-α強(qiáng)35倍，在導(dǎo)源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中比干擾素-α強(qiáng)100倍。
干擾素-δ 屬I型干擾素，豬孕體的滋？養(yǎng)外胚葉與干擾素-γ共同表達(dá)，149個(gè)氨基酸。
干擾素-λ(1-3) 包括干擾素-λ-1，2和？3，也各稱為IL-29，IL-28A和IL-28B。
基因位于第19對(duì)染色體。
其受體由2個(gè)亞單位組成CRF2-12(干擾素-λR1)和CRF2-4(IL-10R2)。干擾素-λ-1，2和3均通過(guò)同一組受體系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)傳遞。
干擾素-κ 屬I型干擾素；207個(gè)氨基 皮膚是機(jī)體最外圍的防御器酸，N端27個(gè)氨基酸是信 官，干擾素-κ的基因可在上號(hào)肽，與1型干擾素的其 皮角化細(xì)胞組成性表達(dá)，可它成員有約30％的同源 能與其功能密切相關(guān)。
性。與肝素可密切結(jié)合。
在靜止期的樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞可表達(dá)干擾素-κmRNA。與干擾素-α和干擾素-β一樣使用同一受體。
人干擾素-ε屬I型干擾素。189個(gè)氨動(dòng)脈硬化癥？基酸，N端21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。3個(gè)Cys，位于53，163和175。其中有一個(gè)Cys是不參與形成二硫鍵的?；蛟?p21.2-21.3有2個(gè)N糖基化位點(diǎn)，74和83位。在許多成人組織中組成性地表達(dá)目前，研究較多并用于臨床治療的有α，β，γ；其它型別干擾素是否有臨床應(yīng)用價(jià)值尚在研究之中。
迄今所知，人、小鼠、牛、馬等哺乳動(dòng)物的干擾素至少有α、β、γ等三個(gè)型別。IFN-α和IFN-β稱為I型干擾素；IFN-ω和IFN-τ等也屬于I型；IFN-γ為II型干擾素。曾有一種IFN-β2已定名為IL-6，不屬于干擾素。在歷史上曾有白細(xì)胞干擾素，成纖維細(xì)胞干擾素，免疫干擾素等名稱，現(xiàn)已不采用。
1986年美國(guó)FDA首先同時(shí)批準(zhǔn)基因工程干擾素-α2a(Roche公司)和干擾素-α2b(Schering公司)投放市場(chǎng)；基因工程干擾素-β、γ也相繼于1990年、1993年獲準(zhǔn)投放市場(chǎng)。目前有60多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)干擾素治療約40多種疾病。
國(guó)內(nèi)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所、衛(wèi)生部上海生物制品研究所、衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所和中國(guó)藥品生物制品檢定所等單位共同研制并開發(fā)的人α1b型、α2a型，α2b型，γ型基因工程干擾素已經(jīng)我國(guó)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)投放市場(chǎng)，它是我國(guó)經(jīng)國(guó)家正式批準(zhǔn)的第一批基因工程高技術(shù)藥物，其中人基因工程干擾素-α1b系我國(guó)首創(chuàng)，與國(guó)外同類產(chǎn)品比較，具有副作用低的優(yōu)點(diǎn)。但是，國(guó)際上干擾素的許多適應(yīng)癥是使用干擾素α2b型獲得的。
從2002年11月起在我國(guó)廣東省流行一種“非典型性肺炎”，在短短數(shù)個(gè)月時(shí)間內(nèi)，流行到全球，統(tǒng)稱為嚴(yán)重性急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，受到世界各國(guó)的關(guān)注。其原始病原主要是人類冠狀病毒的一個(gè)新變種。因此，冠狀病毒受到廣大醫(yī)務(wù)人員和病毒學(xué)家的重視。
SARS病毒的傳播方式原來(lái)認(rèn)為是由咳嗽和打涕引起的飛沫傳播為主，但是，根據(jù)其流行規(guī)律，以及發(fā)現(xiàn)患者糞便中存在的病毒量高于血液，因此，可能與動(dòng)物冠狀病毒感染一樣，除呼吸到外，還可糞-口傳播，通過(guò)患者排泄物的污染，手的直接觸等。WHO估計(jì)SARS的死亡率約為4％，死亡病例常伴有其它病情，如糖尿病或心臟病，或機(jī)體的免疫功能下降。約有90％的病例在感染后1周內(nèi)恢復(fù)。這與西尼羅河病毒感染類似。目前尚無(wú)特效藥物治療，也無(wú)疫苗可以預(yù)防。
干擾素噴霧劑個(gè)體防護(hù)預(yù)防是目前首選可實(shí)現(xiàn)的方法，其科學(xué)根據(jù)如下1、SARS病毒屬新型冠狀病毒，是(+)鏈RNA病毒，許多(+)鏈RNA病毒成員對(duì)干擾素均十分敏感，如鼻病毒，本實(shí)驗(yàn)室曾在細(xì)胞培養(yǎng)上大量進(jìn)行過(guò)干擾素治療鼻病毒14型和39型的研究工作，證明了干擾素對(duì)這一(+)鏈RNA鼻病毒的敏感性。
2、在英國(guó)貓腹膜炎冠狀病毒的網(wǎng)頁(yè)上，曾建議用干擾素治療和控制貓冠狀病毒。而貓冠狀病毒的抗體可以在細(xì)胞培養(yǎng)上抑制SARS病毒的生長(zhǎng)。
http//www.dr-addie.com/3、Pei et al.(2001)報(bào)道用雞干擾素I型可以抑制和治療雞支氣管炎冠狀病毒及其引起的感染。而雞支氣管炎冠狀病毒的抗血清也可以在細(xì)胞培養(yǎng)上抑制SARS病毒的生長(zhǎng)。
Pei et al.(2001)Chicken interferon type I inhibits infectious bronchitis virusreplication and associated respiratory illness.J Interferon Cytokine Res.21(12)1071-1077.
4、病毒唑(Ribavirin)對(duì)新分離的冠狀病毒效果有限其中CDC的MMWR指出病毒唑在體外試驗(yàn)中對(duì)新分離的冠狀病毒無(wú)抑制作用。Lancet關(guān)于香港大學(xué)找到冠狀病毒的報(bào)道也指出病毒唑在相當(dāng)部分重癥病人中效果不佳。
5、Aurisicchio et al.(2000)報(bào)道嗜肝性2型干擾素可以保護(hù)鼠肝炎病毒(一種冠狀病毒)的感染。
Aurisicchio et al.(2000)Liver-specific alpha 2 interferon gene expression resultsin protection from induced hepatitis.J Virol.74(10)4816-4823.
6、在試管內(nèi)和機(jī)體內(nèi)干擾素可以抑制豬產(chǎn)毒性呼吸道綜合征病毒(一種冠狀病毒)感染。Buddaert et al.(1998)In vivo and in vitro interferon(IFN)studies with the porcinereproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV).Adv Exp Med Biol.440461-467.
7、分離到新冠狀病毒的細(xì)胞系Vero E6(及FRhk-4)在產(chǎn)生干擾素方面有缺損的，所以易于分離并產(chǎn)生病變。
Emeny JM，Morgan MJ.(1979)Regulation of the interferon systemevidence thatVero cells have a genetic defect in interferon production.J Gen Virol43(1)247-252。
其它的對(duì)老年人，免疫水平下降者要進(jìn)行免疫加強(qiáng)治療(干擾素本身也有此作用)。因?yàn)楣跔畈《靖腥緯r(shí)會(huì)破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)。免疫加強(qiáng)劑有多種，包括預(yù)防動(dòng)物冠狀毒感染時(shí)使用的維生素A，E，C等，胸腺素，白介素-2等。
本發(fā)明已經(jīng)證明北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的重組人干擾素α2b以及其它類型的干擾素在細(xì)胞培養(yǎng)上可以抑制SARS病毒的繁殖。
本發(fā)明采用經(jīng)典的干擾素活性測(cè)定方法，采用SARS病毒-RDa細(xì)胞(人橫紋肌瘤細(xì)胞株)系統(tǒng)。將生長(zhǎng)在10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基的RDa細(xì)胞按1×105/ml接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100μl，過(guò)夜培養(yǎng)后加入100μl系列稀釋的干擾素a2b(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的重組人干擾素α2b)、a1b(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)、β(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)、ω(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)(各三個(gè)平行孔)，作用12小時(shí)后棄培養(yǎng)液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的50×TCID50的SARS病毒150μl(中國(guó)疾控中心病毒病所分離何培養(yǎng))，24小時(shí)后觀察病變，待病毒對(duì)照完全病變后，目測(cè)記錄抑制50％細(xì)胞病變(CPE)的干擾素的最小量，結(jié)果證實(shí)重組人干擾素a2b、a1b、β在RDa細(xì)胞培養(yǎng)上對(duì)SARS病毒(冠9株)有較為明顯的抑制作用、重組人干擾素ω抑制作用較小(結(jié)果見說(shuō)明書附

圖1)。
說(shuō)明書附圖1圖面說(shuō)明重組人干擾素a2b、a1b、β、ω在RDa細(xì)胞培養(yǎng)上對(duì)SARS病毒(冠9株)的抑制試驗(yàn)，重組人干擾素a2b、a1b、β、ω抑制SARS病毒引起50％RDa細(xì)胞病變的用量分別為每毫升0.28納克、7納克、9納克和39納克。
實(shí)施例1不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β噴霧劑用于鼻腔和鼻咽部用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實(shí)施例2不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β滴鼻劑用于鼻腔和鼻咽部用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實(shí)施例3不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β栓劑用于陰道、直腸用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實(shí)施例4不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β口服劑型(包括口腔劑型)用于消化道用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實(shí)施例5不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β注射劑型(包括水針劑和粉針劑)用于靜脈、腹腔、肌肉給藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
權(quán)利要求
1.重組人I型干擾素用于預(yù)防由冠狀病毒及其突變體引起的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)。其特征在于所用I型干擾素為重組人干擾素α1b、α2b和β干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，預(yù)防由冠狀病毒及其突變體引起的SARS的I型干擾素可以制成任何制劑形式，如噴霧劑、滴鼻劑、栓劑、口服劑、注射劑等，其特征在于無(wú)論采用何種劑型，其有效抗SARS病毒成份為I型干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗病毒的細(xì)胞因子——重組人干擾素(recombinant human interferon)的新治療適應(yīng)征，發(fā)現(xiàn)重組人干擾素α 1b、α 2b和β干擾素可以在體外抑制SARS病毒的繁殖，從而提示重組人干擾素α 1b、α 2b和β干擾素可用于由冠狀病毒及其突變體引起的SARS的預(yù)防，為保障生命健康提供有效的手段。
文檔編號(hào)A61K38/38GK1535724SQ0312222
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者候云德 申請(qǐng)人:北京金迪克生物技術(shù)研究所, 北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司