替考拉寧在制備抗中東呼吸綜合征冠狀病毒藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗病毒藥物的新應(yīng)用，更具體地，涉及一種替考拉寧類化合物在制備 抗中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV)以及嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV)藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中東呼吸綜合征，是2012年發(fā)現(xiàn)的一種由新型冠狀病毒引起的急性呼吸道疾病， 2013年5月23日，世界衛(wèi)生組織將這種新型冠狀病毒感染命名為"中東呼吸綜合征"。該 病毒首現(xiàn)于沙特，繼而在中東其他國(guó)家及歐洲等地區(qū)蔓延，2015年初在韓國(guó)報(bào)告了首例確 診病例，并引起進(jìn)一步傳播。5月29日，根據(jù)我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)通報(bào)，廣東省 惠州市出現(xiàn)首例輸入性中東呼吸綜合征確診病例。
[0003] 中東呼吸綜合征冠狀病毒是從動(dòng)物傳染給人的人獸共患病毒，然后該病毒的起源 尚不完全清楚。就目前的報(bào)告病例統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，該病毒的感染病死率約為36%。然而，目前世 界上仍缺乏有效的抗中東呼吸綜合征冠狀病毒的疫苗和藥物。目前針對(duì)中東呼吸綜合征冠 狀病毒，市場(chǎng)沒(méi)有現(xiàn)成的抗病毒藥物可以使用。
[0004] 替考拉寧，又名太古霉素，1975年被首次發(fā)現(xiàn)。它是特定的游動(dòng)放線菌，經(jīng)發(fā)酵、提 取后得到的一種萬(wàn)古霉素族糖肽類抗生素，為多個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的化合物組成的抗生 素混合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種藥物替考拉寧新的應(yīng)用，一種替考拉寧類化合物在制備抗中東呼 吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV)以及嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV)藥物中的應(yīng) 用，所述的替考拉寧類化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示：
其中1?為1?1、1?2、1?3、1?4和1?5中的任一種，所述1?1~1?5結(jié)構(gòu)式如下：
所述替考拉寧由上述R1~R5所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)式I的化合物混合而成。
[0006] 所述的替考拉寧類化合物抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的包膜蛋白MERS-CoV-S 中的應(yīng)用。
[0007] 所述的考拉寧類化合物抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0008] 更具體地，提供一種替考拉寧類化合物在制備抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒包膜 蛋白MERS-CoV-S藥物中的應(yīng)用，所述的替考拉寧類化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示：
其中1?為1?1、1?2、1?3、1?4和1?5中的任一種，所述1?1~1?5結(jié)構(gòu)式如下： II、初示Si :
本發(fā)明利用pHIV-luciferase、pCMV-AR8. 2和MERS-CoV-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，包 裝出可以表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒包膜蛋白的假病毒，再用這些假病毒來(lái)感染相應(yīng)的 靶細(xì)胞，從而模擬中東呼吸綜合征冠狀病毒感染宿主細(xì)胞的一種狀態(tài)。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 本發(fā)明運(yùn)用此種假病毒包裝的細(xì)胞模型，通過(guò)篩選千個(gè)以上已經(jīng)上市使用的化合物 庫(kù)，從而發(fā)現(xiàn)了抗菌素替考拉寧可以有效的抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒感染293T細(xì)胞 的現(xiàn)象，經(jīng)多個(gè)試驗(yàn)證實(shí)，該抗菌素替考拉寧具有良好的抗病毒作用，IC50約為940nM。另 外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，替考拉寧也能夠抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV)，其通過(guò)抑 制SARS病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮作用，IC50約為1. 18剛。
[0010] 此藥物對(duì)人體的安全性已經(jīng)通過(guò)臨床實(shí)踐的檢驗(yàn)，我們目前確定了替考拉寧抗中 東呼吸綜合征冠狀病毒的明顯藥效，避免了新藥研發(fā)的漫長(zhǎng)周期，這為我們進(jìn)一步的研發(fā) 抗中東呼吸綜合征冠狀病毒提供的強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐基礎(chǔ)，具有重要的開發(fā)價(jià)值和 推廣意義。根據(jù)本發(fā)明的研宄發(fā)現(xiàn)替考拉寧類化合物對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒的包膜蛋 白有抑制作用。
[0011] 本發(fā)明所使用的化合物替考拉寧均采購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司（其是美國(guó) SelleckChemicals在上海設(shè)立的子公司）。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV )包膜蛋白S的抑制效果。
[0013] 圖2是不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)水皰性口炎病毒包膜VSV-G的抑制效 果。
[0014] 圖3是不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 (SARS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果。
[0015] 圖4是不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)A型流感病毒的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除特別說(shuō)明外，本發(fā)明采用 的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購(gòu)的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。
[0017] 實(shí)施例1 不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果 (1)包病毒：將 4. 5ygpHIV-luciferase、4. 5ygpCMV-AR8. 2 和 10ygMERS-CoV-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞（10cmdish)，48小時(shí)后，收集病毒上清，測(cè)p24。
[0018] (2)針對(duì)1^1?-(：〇￥-3的化合物篩選：將口24-11〇1'11^1126(1]\^1?-(：〇￥-3假病毒上清 (含8μg/mlPolybrene)感染96孔板中的293T細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的替考拉寧化合 物。
[0019] (3)換液：感染12小時(shí)后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。
[0020] (4)檢測(cè)luciferase活性：感染48小時(shí)后，每孔用PBS洗一次，然后加入100y1 裂解液，震蕩30min，取10y1裂解液檢測(cè)luciferase活性。
[0021] 根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果圖1說(shuō)明，抗菌素替考拉寧可以特異性的作用于中東呼吸綜 合征冠狀病毒（MERS-CoV)包膜蛋白S，抑制MERS-CoV病毒的進(jìn)入，并由此計(jì)算出替考拉寧 抑制MERS-CoV-S的IC50 約為 940nM。
[0022] 實(shí)施例2不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)水皰性口炎病毒包膜VSV-G的抑 制效果 (1)包病毒：將 4.5ygpHIV-luciferase、4.5ygpCMV-AR8.2 和 10ygVSV-G質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞（10cmdish)，48小時(shí)后，收集病毒上清，測(cè)p24。
[0023] (2)針對(duì)VSV-G的化合物篩選：將p24-normalizedVSV-G假病毒上清(含8yg/ mlPolybrene)感染96孔板中的293T細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的替考拉寧化合物。
[0024] (3)換液：感染12小時(shí)后，換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。
[0025] (4)檢測(cè)luciferase活性：感染48小時(shí)后，每孔用PBS洗一次，然后加入100ul 裂解液，震蕩30min，取10ul裂解液檢測(cè)luciferase活性。
[0026] 根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果圖2說(shuō)明，抗菌素替考拉寧對(duì)VSV-G的包膜蛋白沒(méi)有任何抑 制作用。
[0027] 實(shí)施例3不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 (SARS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果 (1)包病毒：將 6.5ygpHIV-luciferase、8ygpCMV-AR8.2 和 20ygSARS-CoV-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞（10cmdish)，48小時(shí)后，收集病毒上清，測(cè)p24。
[0028] (2)針對(duì)SARS-CoV-S的化合物篩選：將p24-normalizedSARS-CoV-S假病毒上清 (含8μg/mlPolybrene)感染96孔板中的293T細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的替考拉寧化合 物。
[0029] (3)換液：感染12小時(shí)后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。
[0030] (4)檢測(cè)luciferase活性：感染48小時(shí)后，每孔用PBS洗一次，然后加入100y1 裂解液，震蕩30min，取10y1裂解液檢測(cè)luciferase活性。
[0031] 根據(jù)實(shí)施例3的結(jié)果圖3說(shuō)明，抗菌素替考拉寧可以特異性的作用于嚴(yán)重急性呼 吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV)包膜蛋白S，抑制SARS-CoV病毒的進(jìn)入，并由此計(jì)算出替考 拉寧抑制SARS-CoV-S的IC50約為1. 18剛。
[0032] 實(shí)施例4 不同濃度的化合物抗菌素替考拉寧對(duì)A型流感病毒的抑制效果 (1)加藥與感染：將5X104A549細(xì)胞鋪于24孔板中，于37°C培養(yǎng)12小時(shí)后，加入不 同濃度的化合物，并且每孔以M0I=0. 1的A型流感病毒進(jìn)行感染，感染4小時(shí)后換液，24小 時(shí)后收取上清液。
[0033] (2)測(cè)定空斑形成單位（Plaque-formingunit,PFU):準(zhǔn)備細(xì)胞融合度彡95%的 MDCK細(xì)胞12孔培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，將收取的上清液10倍梯度稀釋至 需要的稀釋度，每個(gè)細(xì)胞孔接種500沿上清稀釋液，置于37°C孵育1小時(shí)。將2XMEM培養(yǎng) 基置于37°C下預(yù)熱，同時(shí)配置2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，完全溶解后置于50°C水浴鍋中防止凝 固。1小時(shí)后棄去病毒上清液，用PBS清洗2次，2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠和2XMEM培養(yǎng)基1:1 混合并加入終濃度為2l^g/ml的TPCK胰酶、0. 2%牛血清白蛋白（BSA)及100U/ml的青-鏈 霉素，混勻。每孔加入1ml瓊脂糖-MEM培養(yǎng)基，待其完全凝固后，倒扣放置于37°C的C02 培養(yǎng)箱，48小時(shí)后對(duì)空斑進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。
[0034] 根據(jù)實(shí)施例4的結(jié)果圖4說(shuō)明，抗菌素替考拉寧對(duì)A型流感病毒沒(méi)有任何抑制作 用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 替考拉寧類化合物在制備抗中東呼吸綜合征冠狀病毒藥物中的應(yīng)用； 其中，所述的替考拉寧類化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示：所述替考拉寧由上述Rl~R5所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)式I的化合物混合而成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的替考拉寧類化合物在制備抗中東呼吸綜合征冠狀病毒藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的替考拉寧類化合物抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的包膜蛋 白S中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的替考拉寧類化合物在制備抗中東呼吸綜合征冠狀病毒藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的替考拉寧類化合物抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒病毒進(jìn)入 宿主細(xì)胞中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的替考拉寧類化合物在制備抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的替考拉寧類化合物在制備抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的替考拉寧類化合物抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 進(jìn)入宿主細(xì)胞中的應(yīng)用。6. -種抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的包膜蛋白S的藥物，其特征在于，包括一種替 考拉寧類化合物，所述的替考拉寧類化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示：
【專利摘要】一種替考拉寧類化合物在制備抗中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)替考拉寧類化合物在體外能夠有效治療中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。
【IPC分類】A61K38/14, A61P31/14
【公開號(hào)】CN104958755
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510343520
【發(fā)明人】潘婷, 周南, 張輝
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年6月19日