專利名稱：人腫瘤壞死因子-α突變體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及人腫瘤壞死因子-α突變體在治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著治療異常細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病(比如癌癥)的方法的發(fā)展，在臨床已有很多治療方法可以選擇。最近生物療法在難治愈的腫瘤(如黑色素瘤)上的進(jìn)展及美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)對生物治療的批準(zhǔn)，使得人們有希望采用新的蛋白藥物來治療一些用傳統(tǒng)藥物難以治愈的腫瘤，并且副作用比傳統(tǒng)的化學(xué)療法要小得多。
1.臨床癌癥治療目前用于臨床癌癥治療的藥物分為6大類烷化劑、抗生素類藥物、抗代謝藥、生物藥、激素類藥、植物藥。
烷基化試劑是一類能夠?qū)潆x子替換為烷基基團(tuán)的多功能復(fù)合物。烷基化試劑包括但不限于二氯乙胺類(氮芥，如苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，甲氧氮芥，左旋溶肉瘤素，尿嘧啶氮芥)，環(huán)乙亞胺類(如塞替派)，烷基炔硫酸鹽類(如白消安)，亞硝基脲(如卡莫司汀，洛莫司汀，鏈佐星，)，非典型烷基化試劑(六甲蜜胺、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼)，鉑類化合物(卡鉑和順鉑)。這些化合物與磷酸鹽、氨基、羥基、硫氫基、羧基和咪唑基發(fā)生反應(yīng)。在生理條件下，這些化合物離子化形成帶正電的離子，然后結(jié)合到敏感的核酸或蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致細(xì)胞循環(huán)周期中止而引起細(xì)胞凋亡，因為烷基化試劑發(fā)揮作用與細(xì)胞循環(huán)周期的特定階段無關(guān)，因此他們屬于細(xì)胞周期非特異性藥物。氮芥和烷基炔硫酸鹽類對G1期和M期的細(xì)胞最有效。亞硝基脲、氮芥和環(huán)乙亞胺類減少細(xì)胞從G1期和S期進(jìn)入M期。Chabnerand Collins eds.(1990)“Cancer ChemotherapyPrinciples and Practice”，PhiladelphiaJB Lippincott.
烷化劑在抗腫瘤疾病方面應(yīng)用得比較廣泛，不僅可用于治療實體瘤，在治療白血病和淋巴瘤方面也有一定的應(yīng)用。在臨床上這類藥物常常用來治療急性和慢性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腦瘤、以及乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌肺癌、膀胱癌子宮癌、頭頸癌和惡性黑素瘤。烷化劑的主要副作用是骨髓抑制，通常還有不同程度的胃腸道副作用，另外不同的化合物還會有不同的器官毒性。Black and Livingston(1990)Drugs 39489-501；and 39652-673.
抗生素類是一組天然產(chǎn)物經(jīng)修飾后獲得的抗腫瘤藥物，其生產(chǎn)類似于抗生素的生產(chǎn)。抗生素類試劑包括但不限于蒽環(huán)霉素(如多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和蒽二酮)，絲裂霉素C，博來霉素，放線菌素D，plicatomycin。這些抗生素類試劑通過作用于胞內(nèi)不同的組分而干擾細(xì)胞的生長。例如，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II能夠使DNA鏈解鏈，而恩環(huán)霉素能夠干擾處于轉(zhuǎn)錄活性DNA區(qū)域的拓?fù)洚悩?gòu)酶II的作用。博來霉素通常能夠鰲合離子形成一種激活復(fù)合物，此復(fù)合物結(jié)合到堿基上引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
抗生素類藥物被廣泛地應(yīng)用于各類腫瘤疾病，包括乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤和肉瘤。這類藥物中蒽環(huán)霉素的主要毒性是骨髓抑制，尤其是粒細(xì)胞減少，伴隨粒細(xì)胞減少經(jīng)常會發(fā)生粘膜炎，其嚴(yán)重程度與骨髓抑制程度相關(guān)。當(dāng)使用高劑量的蒽環(huán)霉素時還會有心臟毒性。
抗代謝物是一組能夠干擾腫瘤細(xì)胞生理和分化關(guān)鍵代謝過程的藥物?；钴S分化的腫瘤細(xì)胞需要持續(xù)合成大量的核酸、蛋白質(zhì)、脂類及其他重要的胞內(nèi)組分。許多抗代謝物能夠抑制嘌呤或嘧啶核苷的合成或者抑制DNA復(fù)制所需要的酶類。有些抗代謝物也干擾核糖核苷、RNA、氨基酸代謝及蛋白質(zhì)的合成。通過干擾胞內(nèi)重要組分的合成，抗代謝物能夠延緩或阻止腫瘤細(xì)胞的生長?？勾x物包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、氮尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、6-巰基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁、氟達(dá)拉濱磷酸鹽、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他濱。
抗代謝藥物被廣泛地應(yīng)用于多種常見的癌癥，包括結(jié)腸癌、直腸癌、乳房癌、肝癌、胃癌和胰臟癌、惡性黑素瘤、急性和慢性白血病、毛細(xì)胞癌等?？勾x藥物治療引起的副作用多數(shù)是抑制正常組織的增殖，如骨髓或胃腸粘膜。用這類藥物治療的病人通常會發(fā)生骨髓抑制、口腔炎、痢疾和脫發(fā)等。Chen and Grem(1992)Curr.Opin.Oncol.41089-1098.
激素類藥物是一類調(diào)節(jié)靶器官的生長和發(fā)育的藥物。多數(shù)激素類藥物是性激素及其衍生物和類似物，比如雌激素、雄激素、孕激素等。這些激素類藥物可以作為性激素的受體的拮抗劑向下調(diào)節(jié)受體的表達(dá)和關(guān)鍵基因的復(fù)制。激素類藥物有合成雌激素(如己烯雌酚)、抗雌激素(如他莫昔芬、托瑞米芬、氟甲睪酮、雷洛昔芬)、抗雄激素(如比卡魯胺、尼魯米特、氟他氨)、芳香酶抑制劑(如氨魯米特、阿納托(司)唑、四唑藍(lán))、酮康唑、戈舍瑞林乙酸鹽、亮丙瑞林、甲地孕酮乙酸鹽、米非司酮等。
激素類藥物一般用于治療乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和腦膜炎。由于激素的主要作用是通過類固醇受體介導(dǎo)的，因此60％的受體敏感的乳腺癌和少于10％的受體不敏感的癌癥對一線激素療法響應(yīng)。激素類藥物的主要副作用是紅腫，臨床上常常表現(xiàn)為突然加劇的骨痛，損傷皮膚周圍的紅斑，誘導(dǎo)性高血鈣。
植物衍生物是一組來源于植物或者在分子結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了修飾的藥物。植物衍生物包括但不限于以下種類，長春花堿(如長春新堿、長春堿、長春地辛、長春利定和長春瑞濱)，水溶性或不可溶的喜樹堿(如20(S)-喜樹堿，9-硝基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、拓?fù)涮婵?，鬼臼毒素(依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26))， 紫杉烷類(紫杉醇和多西他賽)。這些植物衍生物通常作為抗有絲分裂劑結(jié)合到微管蛋白上而抑制有絲分裂。鬼臼毒素，如依托泊甙通過影響使DNA解鏈的拓?fù)洚悩?gòu)酶II而干擾DNA的合成。
植物衍生物用于治療各類癌癥，例如長春新堿用于治療白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤和早期的成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤和Wilms腫瘤；長春堿被用于治療淋巴瘤、睪丸瘤、腎細(xì)胞癌、蕈樣肉芽腫病和Koposi's肉瘤；多西他賽在治療晚期乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌方面很有前景；依托泊甙對較廣范圍的腫瘤有作用，尤其是對小細(xì)胞肺癌、睪丸癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)效果顯著。
植物衍生物對治療病人有比較強(qiáng)的副作用。長春花生物堿有不同的臨床毒性，長春花生物堿的副作用包括神經(jīng)毒性、改變血小板功能、骨髓抑制和白細(xì)胞減少。紫杉醇會引起劑量限制的中性粒細(xì)胞減少。表鬼臼毒素類的主要毒性是血液系統(tǒng)毒性(中性粒細(xì)胞減少和血小板減少)，其他的副作用有暫時性肝臟酶異常、脫發(fā)、變態(tài)反應(yīng)和周圍神經(jīng)病。
生物制劑是一類單獨使用或與化療、放療合用時能夠引起腫瘤衰退的生物分子。生物制劑包括免疫調(diào)節(jié)蛋白(如細(xì)胞因子，抗腫瘤抗原的單克隆抗體)，腫瘤抑制子基因，腫瘤疫苗。
細(xì)胞因子具有很重要的免疫調(diào)節(jié)活性。某些細(xì)胞因子如IL-2和干擾素α已證實具有抗腫瘤活性，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤。IL-2是一種T-細(xì)胞生長因子，其對于T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有重要作用。IL-2對某些病人的選擇性抗腫瘤作用據(jù)信是由于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠區(qū)分自我和非我的結(jié)果。
干擾素α的亞型超過23種，都具有交叉的活性。已經(jīng)證實干擾素一α具有對抗多種實體瘤及血液系惡性疾病的活性，血液系統(tǒng)的惡性疾病對它特別敏感。干擾素包括干擾素α，干擾素β(纖維原細(xì)胞干擾素)和干擾素γ(纖維原細(xì)胞干擾素)。其他細(xì)胞因子包括促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子(filgrastin))、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(sargramostim)。
非細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)菌、左旋咪唑、奧曲肽(一種能夠模擬天然產(chǎn)生的生長激素抑制素的效果的、具長期作用的八肽)。
抗腫瘤抗原單克隆抗體是能夠抗腫瘤表達(dá)的抗原、最好是腫瘤的特異性抗原的抗體。如單克隆抗體HERCEPTIN(Trastruzumab)用來抗人表皮生長因子受體2(HER2)，這種受體在某些乳腺癌包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌中過量表達(dá)。HER2的過量表達(dá)與臨床中的許多侵略性疾病及較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。HERCEPTIN作為單一藥物用于治療那些體內(nèi)腫瘤過量表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人。
另一個抗腫瘤抗原單克隆抗體是RITUXAN(Rituximab)，它能夠抗淋巴瘤細(xì)胞上的CD20，能夠選擇性的消除正常和惡性的CD20+的前B細(xì)胞及成熟B細(xì)胞。RITUXAN作為單一藥物用于治療復(fù)發(fā)或難控制的低級或卵泡狀CD20+B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤病人。
MYELOTARG和CAMPATH也是有希望的抗腫瘤抗原單抗。
腫瘤抑制子基因是一類具有抑制細(xì)胞生長分裂循環(huán)從而阻止腫瘤形成發(fā)展功能的試劑。腫瘤抑制子基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞忽略抑制信號網(wǎng)絡(luò)中的一種或多種組分，克服細(xì)胞循環(huán)的關(guān)鍵點從而導(dǎo)致較高的細(xì)胞生長速率，即癌癥。腫瘤抑制子基因包括DPC-4，NF-1，NF-2，RB，p53，WT1，BRCA1、BRCA2。
DPC-4用于胰腺癌，參與抑制細(xì)胞分裂的細(xì)胞質(zhì)途徑。NF-1編碼一種能夠抑制復(fù)發(fā)性口瘡性口炎的蛋白(屬于細(xì)胞質(zhì)抑制蛋白)。NF-1用于治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的神經(jīng)纖維瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤以及髓樣白血病。NF-2編碼一種核蛋白，用于治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的腦[脊]膜瘤、schwanoma和室管膜瘤。RB編碼pRB蛋白，這是一種重要的細(xì)胞周期抑制因子，主要用于治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，還有骨癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌和乳腺癌。P53編碼p53蛋白(調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂以及能夠?qū)е录?xì)胞調(diào)亡)，在很多癌癥患者中發(fā)現(xiàn)p53的突變和/或失活。WT1用于治療腎母細(xì)胞瘤，BRCA1用于治療乳腺癌和卵巢癌，BRCA2用于治療乳腺癌。抑癌基因能夠被轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞中，從而發(fā)揮它的抑癌作用。
腫瘤疫苗是一類誘導(dǎo)人體對腫瘤發(fā)生特異性免疫的藥物。大多數(shù)腫瘤疫苗還在開發(fā)研究中，臨床試驗中的有腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，TAA是那些存在于腫瘤細(xì)胞而正常細(xì)胞中沒有的物質(zhì)(如蛋白、酶或糖類)。由于TAAs是腫瘤細(xì)胞中特有的，為免疫系統(tǒng)提供了靶目標(biāo)，使得免疫系統(tǒng)能夠識別和消滅癌細(xì)胞。TAAs有神經(jīng)節(jié)甙酯(GM2)、前列腺特異性抗原(PSA)、α-胎球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)(由結(jié)腸癌和其他一些腺癌提供，如乳腺癌、肺癌、胃癌和胰臟癌)、黑色素瘤抗原(MART-1，gp100，MAGE 1，3酪氨酸酶)、人乳頭狀瘤病毒E6和E7碎片、全細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解液的部分和同種異體癌細(xì)胞。
2.腫瘤壞死因子-α腫瘤壞死因子-α，即惡液素，是一種主要由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子-α在體外有多種生物效應(yīng)(Manogue and Cerami(1988)in“Cellular and Molecular Aspects ofInflammation)，Eds.Poste and Crooke，Plenum Press，New York，pp.123-150；Chen and Goeddel(2002)Science 2961634-1635；and Bodmeret al.(2002)Trends Biochem.Sci.2719-26)，包括殺死變異細(xì)胞(Carswell et al.，(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 723666-3670)、刺激粒細(xì)胞和纖維母細(xì)胞(Old(1985)Science 230630-632)；Vilchek et al.(1986)J.Exp.Med.163632-643)；Beutler and Cerami(1987)Nature316552-554)、損壞內(nèi)皮細(xì)胞(Sato et al，(1986)J.Natl.Cancer Inst.761113)和抗寄生作用(Taveme et al.(1984)Clin.Exp.Immunol.671-4)。在體內(nèi)，它作為一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)在炎癥、免疫和宿主防御功能方面起著重要的作用，它與人和鼠的很多病理狀況有關(guān)，如敗血性休克、惡病質(zhì)、毛細(xì)血管漏綜合征、器官內(nèi)出血壞死等，它能夠獨立地或與其他因子聯(lián)合影響不同機(jī)體功能的多血質(zhì)。這些效應(yīng)有些對宿主有益，有些則有害，有些是直接的，有些是由其他分泌因子介導(dǎo)的。TNF-α的生物效應(yīng)是通過結(jié)合到特定的細(xì)胞表面受體來介導(dǎo)的。
TNF超家族成員在免疫系統(tǒng)的組織和功能方面起著重要的作用，它們有共用的結(jié)構(gòu)基序，TNF同源性結(jié)構(gòu)域(THD)，能與TNF受體的半胱氨酸富含區(qū)(CRDs)相結(jié)合(Bodmer et al.(2002)TrendsBiochem.Sci.2719-26.)。人和鼠的TNF-α的一級結(jié)構(gòu)(Pennica et al.(1984)Nature 312724-729)；and Fransen et al.(1985)Nuc1.Acid.Res.134417-4429)以及兩個不同的TNF受體(p55-TNF-R和p75-TNF-R)的一級結(jié)構(gòu)是從克隆的cDNA的堿基序列推算出來的。兩個受體不僅僅與TNF-α結(jié)合，還與TNF-β或淋巴毒素具有高度親和性(Schoenfeld et al.(1991)J.Biol.Chem.2663863-3869)。TNF-是淋巴細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)物，具有與TNF-α非常相似的多效性活性。TNF-α和TNF-β在氨基酸序列水平上有32％的同源性。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析顯示兩種分子的三級結(jié)構(gòu)事實上是完全相同的，只是TNF-α三聚體的分子延伸不如TNF-β三聚體，后者頂端有個喇叭口(Eck et al.(1992)J.Biol.Chem.2672119-2122)。
除了細(xì)胞受體的相互作用，TNF-α還有類似凝集素的性質(zhì)，可以作為寡糖配體(Hession et al.(1987)Science 2371479-1484)；andSherblom et al.(1988)J.Biol.Chem.2635418-5424)。這些也說明了TNF-α蛋白在細(xì)胞表面受體上至少有兩個不同的結(jié)合位點，一個是類似凝集素的，另一個是直接在細(xì)胞表面的受體。
一些TNF-α突變體在與細(xì)胞的TNF受體p55和/或p75結(jié)合時受阻，所有的突變都位于有生物活性TNF-α三聚體的錐形結(jié)構(gòu)下半部(Van Ostade et al.(1991)EMBO J.10827-836；and Van Ostade et al.(1992)Nature 361266-269；and EP-A-0 486 908)。
TNF-α是內(nèi)毒素或感染性休克的基本調(diào)節(jié)物質(zhì)(Cerami andBeutler(1988)Immunol.Today 928-31)。感染性休克是在嚴(yán)重的感染情況下發(fā)生的，尤其是伴隨著革蘭氏陰性菌和內(nèi)毒素釋放的菌血癥。當(dāng)然，它也能由任何微生物引起，包括革蘭氏陽性菌、病毒、真菌、原生動物、螺旋體和立克次體。如果引起多器官功能衰竭和循環(huán)衰竭就會導(dǎo)致死亡，通過向動物靜脈注射LPS(或內(nèi)毒素)獲得了感染性休克綜合征的一些特征，即低血壓、系統(tǒng)血管抵抗力降低、白細(xì)胞減少、血小板減少和組織損傷)除了具有免疫調(diào)節(jié)能力外，TNF-α還與各種寄生蟲的成長和分化的控制有關(guān)。在感染了宿主之后，寄生蟲能夠誘導(dǎo)不同的細(xì)胞因子(如TNF)的分泌，我們拿瘧疾來做例子，TNF-α在特定的條件下是具有保護(hù)作用的，如抑制嚙齒動物瘧疾的存活(Clark et al.(1987)J.Immunol.1393493-3496；and Taverne et al.(1987)Clin.Exp.Immunol.671-4)，而如果過量的產(chǎn)生則對宿主是有害的，會導(dǎo)致一些疾病。
重組TNF增強(qiáng)了其在治療腫瘤方面的作用，但是TNF-α在體內(nèi)總是伴隨著一些毒副作用，如低血壓、肝功能異常、白細(xì)胞減少、寒戰(zhàn)和血栓。目前已有多種克服這些毒副作用的方法，如利用單抗來中和TNF-α的毒性。
綜上所述，雖然發(fā)現(xiàn)了有數(shù)千種有潛力的藥物，但是癌癥的治療伴隨著并發(fā)癥和副作用，這使得腫瘤的治療始終沒有最佳的治療方法。盡管在臨床上有很多可用于腫瘤治療的抗癌藥物，人們還是期待著更加有效的抗癌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是公開人腫瘤壞死因子-α(hTNF-α)突變體在治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。特別是治療血液系統(tǒng)失調(diào)、癌癥、惡性胸腔積水、惡性腹水、心臟瓣膜再狹窄和炎癥疾病中的應(yīng)用，該藥物可單獨或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。該藥物避免了原型TNF治療時所產(chǎn)生的系統(tǒng)毒性及其他副作用，具有更強(qiáng)的專一抗腫瘤活性，同時與其他抗腫瘤藥物具有潛在的相互增效作用。
本發(fā)明公開的治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病的藥物是指人腫瘤壞死因子α突變體，所述的hTNF-α突變體蛋白與原型TNF序列(見序列1)相比，其N-端1-7位氨基酸殘基缺失，在156或1 57位氨基酸殘基發(fā)生了替換，替換殘基為Gln、Ser、Thr、Tyr和Asn中的一種，在8-10位氨基酸殘基有一個或多個被Lys或Arg殘基替代，此hTNF-α突變體具有序列2、3、4或5的氨基酸序列和序列10的DNA序列；或所述的hTNF-α突變體與原型hTNF-α(序列1)的氨基酸序列相比在N-端80、90、92位氨基酸殘基發(fā)生了替換，具有序列6或7的氨基酸序列；或所述的hTNF-α突變體與原型hTNF-α(序列1)的氨基酸序列相比在N-端2位氨基酸殘基發(fā)生了替換，具有序列8或9的氨基酸序列。
本發(fā)明所述的與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病是指血液系統(tǒng)的失調(diào)、癌癥、惡性胸腔積水、惡性腹水、心臟瓣膜再狹窄和炎癥疾病。
血液系統(tǒng)失調(diào)包括血細(xì)胞的不正常生長，這可以導(dǎo)致血細(xì)胞的生長發(fā)育不良及血液系統(tǒng)的惡變，如各種類型的白血病。血液系統(tǒng)失調(diào)包括但不限于急性髓樣白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征、鐮狀細(xì)胞性貧血。
癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、直腸癌、副甲狀腺癌、甲狀腺癌、基底細(xì)胞癌、神經(jīng)組織瘤、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、潰爛型及乳頭狀的鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、膽石胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦癌、急性及慢性淋巴及粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞癌、腺瘤、超常增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、增生角膜神經(jīng)瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢癌、子宮頸發(fā)育不良原位瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌、局部皮膚病損、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤、鱗狀細(xì)胞癌及其他癌癥。
其中肺癌，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，如鱗狀癌、腺癌和大細(xì)胞癌；黑色素瘤或皮膚癌，特別是惡性黑色素瘤；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤，特別是惡性淋巴瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤。
所述的惡性胸腔積液(在胸腔中的液體)，是指由癌癥或其他惡性疾病引起；惡性腹水(在腹腔中的液體)，是指由癌癥或其他惡性疾病如肝炎引起。
hTNF-α突變體蛋白可采用不同的途徑給予病人服用，如口服的、不經(jīng)腸道的、腹膜內(nèi)的、靜脈、動脈、經(jīng)皮膚給藥的、舌下、肌內(nèi)的、直腸的、鼻內(nèi)的、脂質(zhì)體、吸入、陰道、局部傳輸系統(tǒng)(如通過導(dǎo)尿管或支架)、皮下、關(guān)節(jié)腔內(nèi)的或鞘內(nèi)給藥。hTNF-α突變體蛋白還可以通過緩釋劑型給藥。
所述的hTNF-α突變體蛋白可通過局部給藥，如瘤體內(nèi)、腹膜內(nèi)、通過隔離的肢體灌注、通過隔離的肺部灌注、隔離的肝部灌注、或膀胱內(nèi)、動脈灌注。
首選的應(yīng)用，hTNF-α突變體經(jīng)靜脈給藥，每星期給藥3-5天，給藥劑量范圍為0.1-100μg/m2，更好的給藥劑量為0.5-50μg/m2，最佳的給藥劑量為1-20μg/m2。首選的低于100μg/m2的給藥劑量與臨床上使用的重組原型hTNF-α的幾mg/m2的劑量相比低很多，首選的一個治療周期是3-4周。
還可選擇給病人每天靜脈注射hTNF-α突變體蛋白，每星期注射3-5天，較好的劑量為100,000-1,000,000單位/m2，更好的劑量為200,000-800,000單位/m2，最佳劑量為400,000-800,000單位/m2，首選的治療周期為3-4周，hTNF-α的活性單位定義是根據(jù)Meager和Das的方法所確定的國際標(biāo)準(zhǔn)單位。Meager and Das(1994)J.Immuno.Methods 1701-13.
還可選擇每天經(jīng)腹膜內(nèi)注射hTNF-α突變體蛋白，每星期給藥1-2天，優(yōu)化的給藥劑量為500,000-5,000,000單位，更好的給藥劑量為1,000,000-3,000,000單位，最佳的給藥劑量為2,000,000-3,000,000單位，優(yōu)化的給藥周期為2-3周。
作為一種選擇，也可采用基因治療的方法給予病人可以表達(dá)hTNF-α突變體的表達(dá)載體。例如，病毒載體或編碼hTNF-α突變體的質(zhì)粒，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、痘病毒，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體也可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染病人細(xì)胞。
下面對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明提供了新的、改進(jìn)的治療腫瘤類疾病的藥物組成及方法。特別是，本發(fā)明的hTNF-α突變體與原型hTNF-α比較，在N-端有氨基酸缺失和替換，同時，在C-端可以有氨基酸殘基替換。與原型TNF相比，這些hTNF-α突變體在臨床上給病人使用時毒性降低很多，而對腫瘤的選擇性和特異性提高很多。重組原型TNF在臨床使用時導(dǎo)致許多系統(tǒng)毒性，如低血壓、肝功能異常、白血球減少、寒戰(zhàn)及血栓，而這些突變體的應(yīng)用能減少這些系統(tǒng)毒性并將副作用降到最低。此外，發(fā)明者的臨床數(shù)據(jù)表明可能的配合劑及本發(fā)明的hTNF-α突變體與其他抗腫瘤藥物的新的組合用于治療某些類型的癌癥患者能顯著提高病人的響應(yīng)率并減少病人對這些抗癌藥物的抗性。另外，應(yīng)用本發(fā)明的方法及藥物組成進(jìn)行治療能夠顯著提高病人的生活質(zhì)量，減少病人采用傳統(tǒng)化療方法治療引起的疼痛及痛苦。
1.hTNF-α突變體及其使用方法本發(fā)明一方面提供了一種治療具有不正常分化細(xì)胞的患者的方法。具體講，此方法包括給病人服用一種hTNF-α突變體蛋白，該突變體與原型TNF(氨基酸序列見序列1)相比，其N-端1-7個氨基酸殘基缺失。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種與原型TNF相比具有更高的抗腫瘤活性和更低的系統(tǒng)毒性的突變體。雖然不希望被在此提出的理論所限制，但發(fā)明者認(rèn)為N-端前七個氨基酸殘基的缺失有助于提高此突變體的抗腫瘤活性。
此hTNF-α突變體進(jìn)一步在156或157位氨基酸殘基發(fā)生了替換，替換的殘基為Gln、Ser、Thr、Tyr和Asn中的一種。雖然不希望被在此提出的理論所限制，但發(fā)明者相信C-端最后兩個氨基酸殘基的替換可以減少此突變體的系統(tǒng)毒性。
此hTNF-α突變體進(jìn)一步在8-10位氨基酸殘基發(fā)生了一個或多個Lys或Arg替換，雖然不希望被在此提出的理論所限制，但發(fā)明者相信8-10位氨基酸殘基被堿性氨基酸如Lys和Arg替換后可以提高此突變體的抗腫瘤活性。
此hTNF-α突變體具有的氨基酸序列為序列2、3、4或5。其中具有氨基酸序列為序列2、3的為hTNF-α突變體1(hTNFm1)，具有氨基酸序列為序列4、5的為突變體2(hTNFm2)。突變體1或突變體2的氨基酸序列N-端可以包括也可以不包括甲硫氨酸殘基。編碼此hTNF-α突變體的DNA序列如序列10。
本發(fā)明提供的一種治療具有不正常分化細(xì)胞的患者的方法，亦包括給病人服用一種hTNF-α突變體蛋白，此突變體與原型TNF(序列1)相比，在N-端80、90、92位發(fā)生了氨基酸殘基替換，具有序列6或7的氨基酸序列為hTNF-α突變體3。突變體3的氨基酸序列在N-端可以包括也可以不包括一個甲硫氨酸。
本發(fā)明提供的一種治療具有不正常分化細(xì)胞的患者的方法，還包括給具有不正常分化細(xì)胞的病人服用一種hTNF-α突變體蛋白，與原型hTNF-α(序列1)相比，此突變體在N-端第二個氨基酸殘基發(fā)生了替換，具有序列8或9氨基酸序列為hTNF-α突變體4(hTNFm4)。突變體4的氨基酸序列在N-端可以包括也可以不包括一個甲硫氨酸。
值得注意的是，本發(fā)明中的hTNF-α突變體包括TNF前體形式和成熟的TNF形式。對于原型TNF，其前體形式是26kD的分子，而成熟的TNF是切去76個氨基酸前導(dǎo)序列(序列11)后形成的17kD的分子(157個氨基酸，序列1)。TNF前體形式是結(jié)合在膜上的，不能自由移動，而成熟的TNF不結(jié)合在膜上，能夠自由移動。作為一種選擇，前體形式中的76個氨基酸的前導(dǎo)序列可以除去和用其他前導(dǎo)序列替換以利于成熟TNF分子的分泌。有許多前導(dǎo)序列具有這種功能，如Gray等介紹的干擾素-γ前導(dǎo)序列。
本發(fā)明中hTNF-α突變體還可以在氨基酸殘基上進(jìn)行修飾以保持其抗腫瘤活性同時進(jìn)一步降低其副作用，例如，每個TNF三聚體進(jìn)行少于5個氨基酸殘基的修飾仍能保持其天然的細(xì)胞生物學(xué)活性。hTNF-α突變體還可以用脂類修飾形成脂質(zhì)體給病人服用減少副作用。
hTNF-α突變體可以修飾的位點包括N-端的氨基基團(tuán)和分子上賴氨酸殘基。當(dāng)這些基團(tuán)活化后就利于使一些化學(xué)基團(tuán)如脂肪酸結(jié)合到TNF的結(jié)構(gòu)上，脂肪酸修飾后的TNF增加了其脂溶性，因此利于提高形成脂質(zhì)體的效率和穩(wěn)定性。
例如，hTNF-α突變體可以在賴氨酸殘基上或在N-端氨基酸殘基上修飾。賴氨?；膫?cè)鏈可以成為脂肪酸結(jié)合到hTNF-α突變體上的一個位點。氨基殘基的修飾包括脂肪酸，最好是碳鏈長度為8-14個碳原子的脂肪酸，經(jīng)過這種修飾后的hTNF-α突變體與脂質(zhì)體具有很高的結(jié)合效率，適宜的情況下可超過80％的結(jié)合率。
本發(fā)明中的hTNF-α突變體也可以與線性或分支多聚體結(jié)合來修飾。我們相信hTNF-α突變體與多聚體結(jié)合修飾后能夠延長這種生物活性物質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)周期，同時降低其免疫原性。
例如，如美國專利(專利號No.4,179,337)中所說的PEG或類似的水溶性多聚烯基氧化物可用來修飾hTNF-α突變體。為了與多聚烯基氧化物結(jié)合，一個羥基基團(tuán)需要轉(zhuǎn)化為可以反應(yīng)的功能基團(tuán)，此過程通常稱為活化，得到的產(chǎn)物稱為活化的多聚烯基氧化物。其他沒有抗原性的多聚物可以類似的進(jìn)行活化。
活化后的多聚物與具有親核功能基團(tuán)的治療藥物反應(yīng)。通常作為結(jié)合位點的一個親核功能基團(tuán)是賴氨酸的ε-氨基，自由的羧酸基團(tuán)、適于活化的羰基基團(tuán)、氧化的碳水化合物組分及巰基基團(tuán)都可以作為結(jié)合位點。
同樣，傘狀分支的PAO或PEG多聚物(美國專利No.6,114,906)也可以修飾hTNF-α突變體，它可以與蛋白質(zhì)上的生物活性親核試劑反應(yīng)形成結(jié)合體。多聚物的結(jié)合位點決定于蛋白質(zhì)上的的功能基團(tuán)。例如，功能基團(tuán)如果是琥鉑酰亞胺琥珀酸鹽或碳酸鹽，它可以與賴氨酸上的ε-氨基反應(yīng)。另外，功能基團(tuán)如果是羧酸，它可以與具有生物學(xué)活性的親核試劑的羥基基團(tuán)反應(yīng)形成以酯鍵連接的前藥。具分支的多聚物也可以活化后與蛋白質(zhì)上的主鏈或側(cè)鏈氨基基團(tuán)、巰基基團(tuán)、羧酸基團(tuán)、具反應(yīng)性的羰基基團(tuán)或其他類似基團(tuán)結(jié)合。
本發(fā)明中hTNF-α突變體也可以用同位素標(biāo)記，通過與hTNF-α受體結(jié)合而定位于靶細(xì)胞進(jìn)行放射治療，這就類似于同位素標(biāo)記的抗體用于放射免疫治療。將同位素結(jié)合到與特定類型的靶細(xì)胞具有親和力或具有特異性的單克隆抗體上是最有效的放射免疫治療方法。
類似于同位素標(biāo)記單克隆抗體，同位素也可用于標(biāo)記hTNF-α突變體(Hunter et al.(1962)Nature 194495；and Hnatowich et al.(1983)Science 220613.)。典型的例子是，抗體被同位素原子131I，90Y，212Bi，186Re，221At，99mTc及其混合物標(biāo)記，同樣，這些同位素也可用于標(biāo)記hTNF-α突變體，此外，其他一些同位素也可用于標(biāo)記HTNF-α突變體。
本發(fā)明中的hTNF-α突變體還可以通過基因治療的方法給病人服用一種表達(dá)載體，該在病人體內(nèi)表達(dá)hTNF-α突變體。例如，可用來編碼hTNF-α突變體的病毒載體有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘病毒，這些病毒載體都可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)病人細(xì)胞。另外，編碼hTNF-α突變體的哺乳動物DNA表達(dá)質(zhì)粒也可作為裸露的DNA給病人服用后轉(zhuǎn)染病人細(xì)胞。這些表達(dá)載體可以整合到體內(nèi)，表達(dá)出膜結(jié)合的TNF前體，前體在體內(nèi)進(jìn)一步加工后釋放出可溶性的hTNF-α突變體。
編碼本發(fā)明的hTNF-α突變體的多核苷酸(序列10)可以通過重組技術(shù)克隆到載體后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而表達(dá)融合蛋白。
通常，本發(fā)明的克隆載體或表達(dá)載體采用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等遺傳工程技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞形成基因工程菌，載體可以是質(zhì)粒、病毒粒子或噬菌體等。基因工程菌能夠在經(jīng)調(diào)整后適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼hTNF-α突變體的多核苷酸的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)的溫度、pH等條件類似于宿主細(xì)胞用于表達(dá)的條件，這些條件對于技術(shù)工人來說是顯而易見的。
本發(fā)明提供了一種包含編碼本發(fā)明的hTNF-α突變體的多核苷酸的重組載體，此重組載體在宿主細(xì)胞中作為一個表達(dá)載體能夠表達(dá)hTNF-α突變體。宿主細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞(如人、猴子、兔子等)、魚、昆蟲、植物、酵母和細(xì)菌。
編碼hTNF-α突變體的多核苷酸的表達(dá)受合適的啟動子控制?？梢圆捎玫膯幼影ǖ幌抻谙俨《締幼尤缦俨《镜闹饕笃趩幼?、異源啟動子如細(xì)胞巨化病毒啟動子、呼吸道合胞病毒啟動子、可誘導(dǎo)啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、白蛋白啟動子、ApoAI啟動子、人球蛋白啟動子、病毒胸苷激酶啟動子如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子、人生長激素啟動子?？刂凭幋ahTNF-α突變體的啟動子也可以是用于原型TNF的天然啟動子。
本發(fā)明還提供了一種適于表達(dá)hTNF-α突變體的重組細(xì)胞。此重組細(xì)胞可以組成型的形式表達(dá)hTNF-α突變體，也可以在存在或缺少某種物質(zhì)的誘導(dǎo)后表達(dá)hTNF-α突變體。重組細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞(如人、猴子、老鼠、兔子等)、魚、昆蟲、植物、酵母和細(xì)菌。
2.與hTNF-α突變體合用的抗癌藥物本發(fā)明的組合物包括一種hTNF-α突變體蛋白、一種非hTNF-α突變體，和一種藥物賦形劑，組合物最好在治療某種疾病上具有協(xié)同作用。當(dāng)采用聯(lián)合治療比單獨采用其中任何一種藥物治療獲得了更好的治療結(jié)果時，就說明幾種藥物起到了協(xié)同作用。具有協(xié)同作用的聯(lián)合治療的一個益處就是降低其中一種藥物的劑量或同時降低幾種藥物的劑量，或者采用此種方法治療能夠獲得較高的治療指數(shù)同時減少毒性副作用。
許多抗腫瘤藥物可以與本發(fā)明中的hTNF-α突變體(重組hTNF-α突變體1-4)聯(lián)合使用來治療各種類型的具有不正常分化細(xì)胞的疾病，如癌癥。能夠與hTNF-α突變體聯(lián)合使用的抗腫瘤藥物種類決定于需要治療的腫瘤類型。
烷基化試劑是一類能夠?qū)潆x子替換為烷基基團(tuán)的多功能復(fù)合物。烷基化試劑包括但不限于二氯乙胺類(氮芥，如苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，甲氧氮芥，左旋溶肉瘤素，尿嘧啶氮芥)，環(huán)乙亞胺類(如塞替派)，烷基炔硫酸鹽類(如白消安)，亞硝基脲(如卡莫司汀，洛莫司汀，鏈佐星，)，非典型烷基化試劑(六甲蜜胺、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼)，鉑類化合物(卡鉑和順鉑)。這些化合物與磷酸鹽、氨基、羥基、硫氫基，羧基和咪唑基發(fā)生反應(yīng)。在生理條件下，這些化合物離子化形成帶正電的離子，然后結(jié)合到敏感的核酸或蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致細(xì)胞循環(huán)周期中止而引起細(xì)胞凋亡，因為烷基化試劑發(fā)揮作用與細(xì)胞循環(huán)周期的特定階段無關(guān)，因此他們屬于細(xì)胞周期非特異性試劑。氮芥和烷基炔硫酸鹽類對G1期和M期的細(xì)胞最有效。亞硝基脲、氮芥和環(huán)乙亞胺類減少細(xì)胞從G1期和S期進(jìn)入M期。Chabnerand Collins eds.(1990)“Cancer ChemotherapyPrinciples and Practice”，PhiladelphiaJB Lippincott.
有些抗腫瘤藥物就屬于烷基化試劑，烷基化試劑包括但不限于二氯乙胺類(氮芥，如苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，甲氧氮芥，左旋溶肉瘤素，尿嘧啶氮芥)，環(huán)乙亞胺類(如塞替派)，烷基炔硫酸鹽類(如白消安)，亞硝基脲(如卡莫司汀，洛莫司汀，鏈佐星，)，非典型烷基化試劑(六甲蜜胺、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼)，鉑類化合物(卡鉑和順鉑)。這些化合物與磷酸鹽、氨基、羥基、硫氫基，羧基和咪唑基發(fā)生反應(yīng)。在生理條件下，這些化合物離子化形成帶正電的離子，然后結(jié)合到敏感的核酸或蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致細(xì)胞循環(huán)周期中止而引起細(xì)胞凋亡。這些烷基化試劑與本發(fā)明的HTNF-α突變體聯(lián)合用于癌癥的治療具有協(xié)同效果，同時能夠減少這些化療藥物治療時產(chǎn)生的副作用。
有些抗腫瘤藥物屬于抗生素類試劑?？股仡愂且唤M天然產(chǎn)物經(jīng)修飾后獲得的抗腫瘤藥物，其生產(chǎn)類似于抗生素的生產(chǎn)。抗生素類試劑包括但不限于蒽環(huán)霉素(如多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和anthracenedione)，絲裂霉素C，博來霉素，放線菌素D，plicatomycin。這些抗生素類試劑通過作用于胞內(nèi)不同的組分而干擾細(xì)胞的生長。例如，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II能夠使DNA鏈解鏈，而恩環(huán)霉素能夠干擾處于轉(zhuǎn)錄活性DNA區(qū)域的拓?fù)洚悩?gòu)酶II的作用。博來霉素通常能夠鰲合離子形成一種激活復(fù)合物，此復(fù)合物結(jié)合到堿基上引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些抗生素類試劑與本發(fā)明的HTNF-α突變體聯(lián)合用于癌癥的治療具有協(xié)同效果，同時能夠減少這些化療藥物治療時產(chǎn)生的副作用。
有些抗腫瘤藥物屬于抗代謝物，抗代謝物是一組能夠干擾腫瘤細(xì)胞生理和分化關(guān)鍵代謝過程的藥物?；钴S分化的腫瘤細(xì)胞需要持續(xù)的合成大量的核酸、蛋白質(zhì)、脂類及其他重要的胞內(nèi)組分。許多抗代謝物能夠抑制嘌呤或嘧啶核苷的合成或者抑制DNA復(fù)制所需要的酶類。有些抗代謝物也干擾核糖核苷、RNA、氨基酸代謝及蛋白質(zhì)的合成。通過干擾胞內(nèi)重要組分的合成，抗代謝物能夠延緩或阻止腫瘤細(xì)胞的生長。抗代謝物包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)，氮尿苷(5-FUdR)，氨甲蝶呤、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、6-巰基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁、氟達(dá)拉濱磷酸鹽、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他濱。這些抗代謝物與本發(fā)明的hTNF-α突變體聯(lián)合用于癌癥的治療具有協(xié)同效果，同時能夠減少這些化療藥物治療時產(chǎn)生的副作用。
有些抗腫瘤藥物屬于植物衍生物。植物衍生物是一組來源于植物或者在分子結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了修飾的藥物。植物衍生物包括但不限于以下種類，長春花堿(如長春新堿、長春堿、長春地辛、長春利定和長春瑞濱)，水溶性或不可溶的喜樹堿(如20(S)-喜樹堿，9-硝基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、拓?fù)涮婵?，鬼臼毒素(依托泊苷(Vp-16)、替尼泊苷(VM-26))，紫杉烷類(紫杉醇和多西他賽)。這些植物衍生物通常作為抗有絲分裂劑結(jié)合到微管蛋白上而抑制有絲分裂。在轉(zhuǎn)錄過程中，核酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I負(fù)責(zé)使超螺旋的DNA雙鏈松弛，通過在DAN雙鏈中的一條鏈產(chǎn)生切口，使另一條鏈能夠從切口繞過，喜樹堿是此酶的有效的抑制劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶I彌補(bǔ)切口使復(fù)制得以發(fā)生。抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I導(dǎo)致形成穩(wěn)定的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物，并最終形成不可彌補(bǔ)的雙鏈DAN缺口，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或其他形式的細(xì)胞死亡。鬼臼毒素通過影響使DNA解鏈的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ而干擾DNA的合成。這些植物衍生物與本發(fā)明的hTNF-α突變體聯(lián)合用于癌癥的治療具有協(xié)同效果，同時能夠減少這些化療藥物治療時產(chǎn)生的副作用。
有些抗腫瘤藥物屬于生物制劑。生物制劑是一類單獨使用或與化療、放療合用時能夠引起腫瘤衰退的生物分子。生物制劑包括但不限于以下種類，免疫調(diào)節(jié)蛋白(如細(xì)胞因子，抗腫瘤抗原的單克隆抗體)，腫瘤抑制子基因，腫瘤疫苗。這些生物制劑與本發(fā)明的hTNF-α突變體聯(lián)合用于癌癥的治療具有協(xié)同效果，同時能夠減少這些生物藥物治療時產(chǎn)生的副作用。
細(xì)胞因子具有很重要的免疫調(diào)節(jié)活性。某些細(xì)胞因子如IL-2和干擾素α已證實具有抗腫瘤活性，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤。IL-2是一種T-細(xì)胞生長因子，其對于T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有重要作用。IL-2對某些病人的選擇性抗腫瘤作用據(jù)信是由于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠區(qū)分自我和非我的結(jié)果。能夠與本發(fā)明的HTNF-α突變體合用的白細(xì)胞介素包括但不限于IL-2、IL-4和IL-12。
干擾素α的亞型超過23種，都具有交叉的活性，所有的干擾素亞型都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。干擾素一α證實具有對抗多種實體瘤及血液系惡性疾病的活性，血液系統(tǒng)的惡性疾病對它特別敏感。能夠與本發(fā)明的TNP-α突變體合用的干擾素包括但不限于干擾素α，干擾素β(纖維原細(xì)胞干擾素)和干擾素γ(纖維原細(xì)胞干擾素)。
其他可以與本發(fā)明的TNF-α突變體合用的細(xì)胞因子包括那些對造血作用和免疫功能有重要作用的細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子包括但不限于促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子(filgrastin))、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(sargramostim)。這些細(xì)胞因子可以與本發(fā)明的hTNF-α突變體合用以減少化療引起的對髓細(xì)胞生成的毒性。
非細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)劑也可以與本發(fā)明的hTNF-α突變體合用以抑制不正常細(xì)胞的生長。免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于細(xì)菌Calmette-Guerin、左旋咪唑、奧曲肽(一種能夠模擬天然產(chǎn)生的生長激素抑制素的效果的具長期作用的八肽)。
本發(fā)明的hTNF-α突變體還可以與TNF超家族的其他成員合用，這些物質(zhì)包括但不限于原型hTNF-α、TNF-β、LT-β、OPGL、Fas配體(FasL)、TRAIL、CD27配體(CD27L)、CD30配體(CD30L)、CD40配體(CD40L)、4-1BB配體(4-1BBL)、DcR3，OX40L，TNF-γ(WO 96/14328)，AIM-I(WO 97/33899)，endokine-(WO 98/07880)、OPG、neutrokine-a(WO 98/18921)、OX40、神經(jīng)生長因子(NGF)。
抗腫瘤抗原單克隆抗體是能夠抗腫瘤表達(dá)的抗原的抗體，最好是腫瘤的特異性抗原。如單克隆抗體HERCEPTIN(Trastruzumab)用來抗人表皮生長因子受體2(HER2)，這種物質(zhì)在某些乳腺腫瘤包括轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中過量表達(dá)。HER2的過量表達(dá)與臨床中的許多侵略性疾病及較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。HERCEPTIN作為單一藥物用于治療那些體內(nèi)腫瘤過量表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人。本發(fā)明的hTNF-α突變體與HERCEPTIN合用治療腫瘤具有協(xié)同作用，尤其是對轉(zhuǎn)移性腫瘤。
另一個抗腫瘤抗原單克隆抗體是RITUXAN(Rituximab)，它能夠抗淋巴瘤細(xì)胞上的CD20，能夠選擇性的消除正常的和CD20+的前B細(xì)胞及成熟B細(xì)胞。RITUXAN作為單一藥物用于治療復(fù)發(fā)或難控制的低級或卵泡狀CD20+B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤病人。本發(fā)明的hTNF-α突變體與RITUXAN合用不僅對于淋巴瘤而且對于其它類型的惡性腫瘤具有協(xié)同治療作用。
腫瘤抑制子基因是一類具有抑制細(xì)胞生長分裂循環(huán)從而阻止腫瘤形成發(fā)展功能的試劑。腫瘤抑制子基因的突變引起細(xì)胞忽略一種或多種抑制信號網(wǎng)絡(luò)中的組分，克服細(xì)胞循環(huán)的關(guān)鍵點從而導(dǎo)致較高的細(xì)胞生長速率，即癌癥。腫瘤抑制子基因包括但不限于DPC-4，NF-1，NF-2，RB，p53，WT1，BRCA1、BRCA2。在體內(nèi)給予腫瘤抑制子治療(如經(jīng)基因治療)的同時可以合用本發(fā)明的hTNF-α突變體來治療各種類型的癌癥。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與左旋溶肉瘤素合用治療各種類型的癌癥，最好是黑色素瘤和原發(fā)性肢體肉瘤。hTNF-α突變體和左旋溶肉瘤素可以再和干擾素-α及/或溫?zé)岑煼?lián)合治療癌癥。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與阿霉素合用治療各種類型的癌癥，最好是惡性淋巴瘤。hTNF-α突變體與阿霉素可再和博來霉素、長春新堿及/或二甲基-三氮烯-咪唑羧酰胺合用治療癌癥。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與RITUXAN(Rituximab)合用治療各種類型的癌癥，較好的是惡性淋巴瘤，最好是非霍奇金淋巴瘤。hTNF-α突變體與Rituximab可再和其它抗腫瘤藥合用治療癌癥。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與環(huán)磷酰胺合用治療各種類型的癌癥，較好的是惡性淋巴瘤。hTNF-α突變體與環(huán)磷酰胺可再和阿霉素、博來霉素、長春新堿、強(qiáng)的松合用治療腫瘤。
本發(fā)明的HTNF-α突變體與絲裂霉素-C合用治療各種類型的腫瘤，較好的是非小細(xì)胞肺癌，hTNF-α突變體與絲裂霉素-C可再和長春地辛(Desacetyl vinblastine amide)、順鉑合用治療腫瘤。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與長春瑞濱合用治療各種類型的腫瘤，較好的是非小細(xì)胞肺癌，hTNF-α突變體與長春瑞濱可再和順鉑合用治療腫瘤。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與紫杉烷類(如紫杉醇和多西他賽)或它們的衍生物和類似物合用治療各種類型的腫瘤，較好的是卵巢癌和乳腺癌，hTNF-α突變體與紫杉烷類可再和其它抗腫瘤藥物合用治療腫瘤。
本發(fā)明的hTNF-α突變體與甲磺酸伊馬替尼(或GLEEVAC)合用治療各種類型的腫瘤，較好的是白血病、胃腸道基質(zhì)瘤和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，hTNF-α突變體與甲磺酸伊馬替尼可再和順鉑合用治療腫瘤。
3.單用hTNF-α突變體或與其它抗腫瘤藥物合用進(jìn)行治療的適應(yīng)癥使用本發(fā)明的組分進(jìn)行治療的較好的適應(yīng)癥包括那些不希望的或不受控制的細(xì)胞分化。那些適應(yīng)癥包括良性腫瘤、各種類型的癌癥如原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤、血液系統(tǒng)失調(diào)(如白血病、骨髓增生異常綜合征和鐮狀細(xì)胞血癥)，再狹窄(如冠脈、頸動脈和腦部損害)，內(nèi)皮細(xì)胞的異常刺激(如動脈硬化癥)，由于外科手術(shù)、傷口愈合異常、異常血管生成造成的機(jī)體組織損傷，產(chǎn)生組織纖維化、反復(fù)的運動失調(diào)導(dǎo)致的疾病，器官移植產(chǎn)生的非高度血管化及增生響應(yīng)的組織失調(diào)。
通常，良性腫瘤細(xì)胞保留其差異性特征，而且并不以完全不受控制的方式分裂，良性腫瘤通常是固定位置和非轉(zhuǎn)移性的，能夠用本發(fā)明治療的特殊類型的良性腫瘤包括血管瘤、肝細(xì)胞腺瘤、空洞性血管瘤、灶性結(jié)節(jié)狀增生、聽神經(jīng)瘤、纖維神經(jīng)瘤、膽管腺瘤、膽管cystanoma、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、結(jié)節(jié)再生性增生、沙眼化膿性肉芽瘤。
腫瘤細(xì)胞變得無差異性，對體內(nèi)的生長控制信號不再響應(yīng)、同時以不受控制的方式擴(kuò)增。惡性腫瘤具有進(jìn)攻性，能夠擴(kuò)散到遠(yuǎn)處，即轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤通常分為兩種類型原發(fā)性的和繼發(fā)性的。原發(fā)性腫瘤直接出現(xiàn)在他們被發(fā)現(xiàn)的組織。繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤可以來源于體內(nèi)的任何部位，單目前已經(jīng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的器官。通常的轉(zhuǎn)移路線是直接生長到臨近的組織結(jié)構(gòu)中、通過血管或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散和沿著組織表面和機(jī)體間隙(腹膜液、腦脊髓液等)跟蹤擴(kuò)散。
使用本發(fā)明能夠治療的特定種類的癌癥或轉(zhuǎn)移性腫瘤，不管是原發(fā)性的還是繼發(fā)性的，包括白血病、乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、直腸癌、副甲狀腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰爛型和乳頭狀鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、Ewing肉瘤、veticulum細(xì)胞瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、膽石胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦癌、急性及慢性淋巴及粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞癌、腺瘤、超常增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、增生角膜神經(jīng)瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢癌、子宮頸發(fā)育不良原位瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌、局部皮膚病損、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤、鱗狀細(xì)胞癌及其他癌癥。
本發(fā)明的hTNF-α突變體單獨或與其他抗腫瘤藥物合用治療肺癌，較好的是非小細(xì)胞肺癌。在美國，肺癌在男女癌癥患者中的死亡率都是第一的。而且它的發(fā)病率排在第三位，僅次于前列腺癌和乳腺癌，但是更多的美國人死于肺癌而不是前列腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌，因為其治愈率只有14％。(Parker et al.(1997)Cancer J.Clin.475-27.)四種主要的細(xì)胞類型占了所有原發(fā)性肺癌的95％，這四種類型是小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌(包括支氣管)、大細(xì)胞(無差異化的)癌。后三種細(xì)胞類型經(jīng)常集結(jié)成堆，被稱為非小細(xì)胞肺癌。
鱗狀細(xì)胞癌曾經(jīng)是所有肺癌中發(fā)病最頻繁的，鱗狀細(xì)胞癌最頻繁的出現(xiàn)在臨近部分的支氣管，首先是鱗狀上皮化生，隨著進(jìn)一步生長，鱗狀癌侵入基底膜并擴(kuò)展到支氣管腔中，產(chǎn)生障礙導(dǎo)致肺膨脹不全或肺炎。
腺癌已經(jīng)成為北美最普遍的肺癌，占所有肺癌病例的35-40％。此類腫瘤起源于肺泡表面的上皮細(xì)胞或支氣管粘液腺，大部分腫瘤就在起源位置周圍。它們也能產(chǎn)生于周圍的疤痕瘤。因為腺癌具有早期轉(zhuǎn)移的傾向，因此在手術(shù)階段它比鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后更差。
大細(xì)胞癌是所有非小細(xì)胞肺癌中最少的，在所有肺癌病例中只有15％，大部分腫瘤都位于外圍而且其預(yù)后類似于腺癌。
小細(xì)胞肺癌在生物學(xué)方面及臨床方面都與非小細(xì)胞肺癌不同，在生物學(xué)方面，小細(xì)胞肺癌具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征。這些特征導(dǎo)致頻繁的分泌物和神經(jīng)癌旁綜合癥。小細(xì)胞肺癌還具有更快的生長速度和更大的早期轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的傾向。小細(xì)胞肺癌在各種類型的肺癌中是最具有侵略性的，從診斷發(fā)現(xiàn)開始不經(jīng)過治療其中位存活期只有2-4個月。
本發(fā)明的hTNF-α突變體單獨使用或與其它抗腫瘤藥物合用治療惡性淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤。
在病理上，霍奇金的特征是存在具有突出的核仁的不正常的大細(xì)胞(里-施細(xì)胞或單核突變體)。然而，大部分腫瘤細(xì)胞是由表現(xiàn)正常的感染性細(xì)胞組成的混合物?；羝娼鸺膊】梢苑譃閹讉€組織學(xué)亞型。受到廣泛認(rèn)可的Rye分類將其分為四類淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的、小節(jié)硬化癥、混合多孔性和淋巴細(xì)胞衰竭。精確的階段劃分對于制定霍奇金疾病的治療計劃是至關(guān)重要的，因此針對疾病的位置及范圍需要采取不同的治療方法。
非霍奇金淋巴瘤是變化較多的腫瘤，其共同起源是淋巴細(xì)胞。他們通常起源或存在于淋巴組織，如淋巴結(jié)、脾、骨髓或Waldeyer環(huán)，但是幾乎在任何組織中都可發(fā)現(xiàn)他們。(Rosenberg SA(1993)“Non-Hodgkin′s lymphomas”，In Medical Oncology，second edition(Calabresi and Schein，eds.)，San FranciscoMcGraw-Hill，Inc.，417-33.)，淋巴瘤的瘤譜很廣，從具有最快擴(kuò)展并致命的腫瘤到最懶惰能很好耐受并延長穩(wěn)定性且在某些情況下能自發(fā)消退的腫瘤都存在。在美國，每年大約35000個新增腫瘤病人中有一個會發(fā)展，大約一半死于腫瘤。
由于非霍奇金淋巴瘤的多樣性，人們試著去建立一個統(tǒng)一的病理分類系統(tǒng)。基于病理亞型和存活的相關(guān)性，非霍奇金淋巴瘤分為三個主要級別低級、中級和高級，在不治療的情況下，低級具有最長的存活期，高級具有最短的存活期。淋巴腺增大的慢性淋巴性白血病屬于低級非霍奇金淋巴瘤。低級淋巴瘤病人的中位存活期是6.2年，轉(zhuǎn)化為更具侵略性細(xì)胞類型的發(fā)生率大約是30％。
任何級別的非霍奇金淋巴瘤復(fù)發(fā)感染的預(yù)后都很差，即使是初次治療獲得了完全響應(yīng)的病人，仍有一部分具有很高的復(fù)發(fā)幾率并有很差的完全預(yù)后。
本發(fā)明的hTNF-α突變體單獨或與其他抗腫瘤藥物合用治療黑色素瘤，包括惡性黑色素瘤、黑素瘤皮膚癌、影響皮膚的黑色素瘤，較好的是惡性黑色素瘤。
人類腫瘤中最頻繁的就是皮膚腫瘤。非黑色素瘤主要是鱗狀細(xì)胞和基底細(xì)胞瘤，這些腫瘤進(jìn)展緩慢，通?？梢栽缙谧R別并采用局部治療方法治愈。黑色素瘤是較少見但更具侵略性的皮膚腫瘤，隨著區(qū)域性及向遠(yuǎn)處擴(kuò)展，他們具有相當(dāng)大的致死潛力。黑色素瘤的致死病例增加速度已經(jīng)超過了其他實體瘤，而且黑色素瘤比基底或鱗狀細(xì)胞癌更容易轉(zhuǎn)移到身體的其他部位。
血液學(xué)紊亂疾病包括血細(xì)胞的不正常生長，這會導(dǎo)致血細(xì)胞發(fā)育異常和血液系統(tǒng)惡變，如各種白血病。有急性骨髓性胞白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓發(fā)育異常綜合癥和鐮刀型貧血等例子，還有其他疾病。
急性粒細(xì)胞白血病(AML)是成年人患急性白血病中最常見的一種。一些遺傳病和免疫缺陷也引發(fā)AML。這些由于DNA穩(wěn)定性缺陷引發(fā)的疾病，如范可尼氏貧血、Li-Fraumeni親緣病、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張和X染色體相關(guān)的丙球蛋白貧乏癥等，會導(dǎo)致染色體的隨機(jī)斷裂。
急性原粒細(xì)胞白血病(APML)是一類特征明顯的AML亞類。它的特征是含有15-17號染色體置換的原粒細(xì)胞質(zhì)體。這種染色體置換會引起類維生素A酸受體的融合轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致APML。
急性淋巴性白血病(ALL)這類血液學(xué)紊亂疾病有各種明顯的亞型臨床癥狀。細(xì)胞遺傳異常在此種病中不斷發(fā)生，最常見的是9-22染色體置換，合成產(chǎn)生費城染色體，病人預(yù)后很糟糕。
慢性骨髓性白血病(CML)是骨髓干細(xì)胞增殖紊亂疾病。CML的特點是包括9號和22號染色體特定位置異常，產(chǎn)生費城染色體。常用放療。
骨髓發(fā)育異常綜合癥(MDS)是由于造血干細(xì)胞及其分化細(xì)胞包括骨髓、類紅細(xì)胞和單核細(xì)胞發(fā)育異常造成多種疾病并發(fā)。三種細(xì)胞中的一種或幾種數(shù)量減少。MDS患者通常有貧血、嗜中性白血球減少癥(感染)或者血小板減少癥(出血)。一般10-70％的病人發(fā)展成為急性白血病。
異常細(xì)胞增殖可以用多種手術(shù)方法治療，如關(guān)節(jié)手術(shù)、腸手術(shù)和瘢痕瘤手術(shù)等。那些產(chǎn)生纖維組織的疾病包括肺氣腫、重復(fù)性顫動疾病包括腕骨隧道綜合癥也可以用本最新發(fā)明治療。這個發(fā)明治療細(xì)胞增殖紊亂疾病的另一個例子是骨瘤。
因為器官移植產(chǎn)生的細(xì)胞增殖包括那些可能產(chǎn)生排異反應(yīng)的增殖可以用此發(fā)明治療。特別是那些心臟、肺、肝臟、腎臟和其他器官或者器官系統(tǒng)移植手術(shù)引起的細(xì)胞增殖。
很多異常血管增生如，那些伴隨風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦部水腫和損傷導(dǎo)致局部缺血-重灌流、大腦皮層缺血的血管增生、卵巢增生和血管肥大癥(囊性卵巢綜合癥)、子宮內(nèi)膜異位癥、牛皮癬、糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病變及其他視血管增生疾病如早發(fā)性視網(wǎng)膜病(晶狀體纖維化異常)斑狀體變性、角膜移植排異、新血管化青光眼、Oster Webber綜合癥等等也適用本發(fā)明治療。
異常血管增生相關(guān)疾病需要或引起血管生長。例如，角膜血管增生有三個階段血管形成前，新血管形成和血管成熟及老化。已經(jīng)確認(rèn)參與各種血管增生機(jī)制的有包括炎癥反應(yīng)中的一些參與者如白細(xì)胞、血小板、細(xì)胞因子和類花生酸。還有一些因子有待確證。
此發(fā)明的又一個應(yīng)用提供了一個治療有關(guān)不必要和異常的血管增生疾病的方法。給這類患者施用hTNF-α的突變蛋白單劑或者和其他抗血管增生藥品的聯(lián)合使用。
用于抑制血管增生和/或血管增生性疾病的這些藥劑的劑量需要依據(jù)病情的嚴(yán)重程度、給藥途徑和其他由醫(yī)生認(rèn)為的有關(guān)情況來確定。一般而言，可接受的每日有效劑量足夠抑制血管增生和/或血管增生性疾病。
在這個應(yīng)用中，此發(fā)明可用于治療類似視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管化和角膜新血管化等非良性血管增生。視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管化疾病包括Bests病、近視眼、視覺凹陷、Stargarts病、變形性骨炎、靜脈閉塞、動脈閉塞、鐮刀型貧血、類肉瘤、梅毒、彈力纖維性假黃瘤、頸動脈阻塞病、慢性葡萄膜炎/病毒、分枝菌感染、萊姆關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、Eales病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、斑狀體病變、Bechets病、導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎或脈絡(luò)膜炎的感染、假性眼網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞真菌病、部分睫狀體平坦部炎、慢性視網(wǎng)膜剝落、高粘綜合癥、弓漿蟲病、外傷和激光治療后并發(fā)癥、有關(guān)rubesis的疾病(角的新血管化)、由纖維組織或含纖維組織增生包括一切形式的玻璃體視網(wǎng)膜增生病變導(dǎo)致的疾病。角膜新血管化疾病有流行性角膜炎、維他命A缺乏癥、過度佩戴隱形眼睛導(dǎo)致疾病、遺傳性過敏性角膜炎、外緣角膜炎、翼狀胬肉角膜炎、干燥癥、酒糟鼻、phylectenulosis、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、角膜移植排異、Mooren潰瘍、Terrien’s病、邊緣角蛋白溶解、多動脈炎、Wegener肉狀瘤、鞏膜炎、periphigoid放射性角膜炎、新血管化青光眼、晶狀體后纖維增生、梅毒、分枝菌感染、脂質(zhì)體惡變、化學(xué)損傷、細(xì)菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單一性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染和Kaposi瘤。
此發(fā)明還可用于治療與異常血管增生相關(guān)的慢性炎癥。方法是對此類疾病患者施用本品和DNA甲基化抑制因子、組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑。慢性炎癥需要毛細(xì)血管的不斷生長維持炎癥細(xì)胞的血液供應(yīng)。炎癥細(xì)胞在血液營養(yǎng)下產(chǎn)生肉芽并保持炎癥狀態(tài)。用這個療法可以防止肉芽的形成，從而減輕癥狀。這類慢性炎癥包括腸炎如局限性腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬、結(jié)節(jié)病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
腸炎如局限性腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎特征是腸胃道多處發(fā)炎和血管增生。比如局限性腸炎是慢性的透壁性的炎癥，常發(fā)生在回腸和結(jié)腸，但也可以在口腔到肛門及周圍的任何部位發(fā)病。局限性腸炎患者一般有慢性腹瀉伴有腹痛、發(fā)燒、厭食、體重減輕和腹脹。潰瘍性結(jié)腸炎也是慢性非特異的炎癥和潰瘍病，好發(fā)于結(jié)腸黏膜，病患有血性腹瀉的特征。腸胃道中，由新生長的毛細(xì)血管包圍一團(tuán)炎癥細(xì)胞形成的肉芽腫，它的發(fā)炎導(dǎo)致了多數(shù)的腸炎疾病。此發(fā)明和血管增生抑制因子的合劑可以防止肉芽的形成和血管的生長。腸炎疾病也會導(dǎo)致其他腸道問題如表皮的損傷。這種損傷可以在腸胃道的其他地方產(chǎn)生。療法中，本品抑制血管增生可以減少炎癥細(xì)胞的血液供應(yīng)，防止損傷形成。
另外一種慢性炎癥疾病---結(jié)節(jié)病，特征是多系統(tǒng)的肉芽腫病。這種病的肉芽腫會在身體的任何地方形成，所以癥狀要看發(fā)病的部位。肉芽腫是增生的毛細(xì)血管包圍的炎癥細(xì)胞。用本品抑制血管增生可以壓制肉芽腫生長。
牛皮癬也是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥疾病，患者身上有各種大小的丘疹斑塊。用本品可以防止新的血管在這些丘疹附近形成，緩解癥狀。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是在外周關(guān)節(jié)發(fā)病的非特異性慢性炎癥。先認(rèn)為是關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的潤滑膜里的血管發(fā)生了增生，形成了新的血管網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的因子和活性氧自由基導(dǎo)致關(guān)節(jié)翳生長和軟骨的破壞。血管增生相關(guān)因子積極參與并維持了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎癥過程。單獨使用本品或者與抗RA藥劑聯(lián)用可以防止維持炎癥的新血管的形成，抗RA藥品還可以緩解病痛。
在這個應(yīng)用中，本發(fā)明hTNF-α變異蛋白可用于治療多種與失控血管增生如視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管化和角膜新血管化有關(guān)疾病。
本發(fā)明TNF-α變異蛋白還可以和其他抗血管生長藥品聯(lián)用，以抑制不必須和不受控的血管增殖?？寡茉鲋车乃幤酚?，類維生素A酸及其衍生物、2-甲氧基雌二醇、ANGIOSTATINTM蛋白、ENDOSTATINTM蛋白、蘇拉明、角鯊胺、組織抑制因子金屬蛋白酶-1、血纖維蛋白酶原激活劑抑制因子-2、軟骨源抑制因子、紫杉醇、血小板因子4、硫酸魚精蛋白、硫酸甲殼素衍生物(來源于雪花蟹甲殼)、硫酸多聚糖肽聚酶復(fù)合物(sp-pg)、星形孢菌素。還有機(jī)體代謝調(diào)節(jié)因子如脯氨酸類似物(1-氮環(huán)丁烷-2-羧基酸(LACA))、順羥脯氨酸、d，1-3，4-去羥脯氨酸、硫氨脯氨酸、α，α-雙吡啶、β-氨基丙酸腈延胡索酸鹽、4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3h)-唑酮、甲氧喋呤、米托蒽醌、β-環(huán)糊精十四硫酸鹽、eponemycin、煙曲霉素、硫代蘋果酸金鈉、d-青霉胺(CDPT)、β-1-抗膠原酶-血清、α-2-抗纖溶酶、比生群、氯苯扎利二鈉鹽、n-(2-苯甲酸基)-4-氯蒽酮酸二鈉鹽又稱“CCA”、反應(yīng)停、制管張素膽固醇、cargboxynaminolmidazole、金屬蛋白酶抑制劑如BB94。其他抗血管增生藥劑包括抗體、專門抗血管生長因子(bFGF、aFGF、FGF-5、VEGF同功酶、VEGF-C、HGF/SF和Ang-1/Ang-2)的單克隆抗體。見Ferrara N和Alitalo K的“血管生長因子及其抑制劑的臨床應(yīng)用”(1999 Nature Medicine 51359-1364)4.給藥途徑和劑量將本發(fā)明應(yīng)用于治療有很多種給藥方法和途徑。
本發(fā)明-hTNF-α可以用在合劑中。例如包括了常用的藥用賦形劑和其他藥用非活性物質(zhì)和活性成分。這些活性成分甚至可以包括本發(fā)明中另一種hTNF-α突變體。最好的方法是在合劑中加入足夠有效量的hTNF-α以得到滿意的治療效果。
本發(fā)明的hTNF-α突變蛋白可以通過非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)皮內(nèi)、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、口腔、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體包裹、吸入、陰道、眼、局部給藥(如導(dǎo)尿管或者支架)、皮下、脂肪組織、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸內(nèi)等等多種方式單獨或者同時給藥。
hTNF-α突變蛋白給藥途徑多樣，而且可以以任何制劑形式單獨或者同時給藥。本文中，同時給藥的意思是指同時1種以上的藥品治療以取得更好的臨床療效。這種“同時”可以引申為給藥時間段的重疊。例如，其他抗腫瘤藥品前、同時或者后服用本發(fā)明的hTNF-α。
根據(jù)需要在指定部位得到一定的細(xì)胞毒性和抑制細(xì)胞生長的效果，與本片聯(lián)合使用的藥品的劑量可以變化。好的做法是總量小于TNF-α突變體和其他藥品的最大耐受劑量的總和，最好也小于所有這些抗腫瘤藥品的單個最大劑量。
對于緩釋制劑而言，緩釋時間各有不同，但盡量在1小時到6個月之間，最好是在1周至4周。配方依醫(yī)囑和病情而定，先討論到這里。
在使用hTNF-α突變蛋白治療前，病人可能已經(jīng)經(jīng)過了其他抗癌藥物治療。由于化療導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的效果，hTNF-α突變蛋白的用量應(yīng)比單用hTNF-α突變蛋白治療的用量低一些，這樣可以獲得療效的同時減少其副作用。
本發(fā)明中的hTNF-α突變蛋白也可制成試劑盒。試劑盒的組成安排也應(yīng)該很講究，要包括盛放hTNF-α突變蛋白的容器和/或其他給藥所需的器械。
試劑盒還可以帶上指導(dǎo)手冊。如果hTNF-α突變蛋白是以粉劑提供的，手冊應(yīng)介紹如何溶入輸液制成藥劑，怎樣給病人用。還可以介紹此發(fā)明的其他給藥方法。
配制好的治療劑應(yīng)裝在容器或者試劑盒里提供，應(yīng)可直接給藥或者是需要稀釋的濃縮液。如本發(fā)明里提到的治療劑可以直接用于輸液或者注射。
專業(yè)人員可以按本發(fā)明用途將其制成化合物、混合劑、試劑盒等。因此本專利已經(jīng)覆蓋了有關(guān)其療效的所有改型和變種，見附加聲明和同等專利。
具體實施例方式
實施例1rhTNFm1的表達(dá)和純化重組人TNF-α突變體1是在E.coli中表達(dá)，經(jīng)純化得到。簡述如下E.coli株HMS174，含編碼rhTNFm1的質(zhì)粒，在LB(Amp)中30℃培養(yǎng)至OD6000.4。LB培養(yǎng)液1％接種到裝有TH培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)到OD600至0.4。發(fā)酵中保持pH6.8-7.0，溶氧30％以上。
發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，在冷TSE(0.1M Tris，0.2M NaCl，and 0.05M EDTA at pH 7.2)緩沖液里超聲粉碎，離心取上清。加入固體硫酸銨分級沉淀。蛋白質(zhì)沉淀用19mM Tris·HCl溶解并透析。離子交換層析純化溶液中的rhTNFm1。在純化好的rhTNFm1中加入終濃度1％的白蛋白。經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)方法(見Meager and Das(1994)J.Immuno.Methods 1701-13)測定活性后，按＞500000 IU/安瓿瓶分裝。
實施例2用rhTNFm1臨床治療惡性腫瘤上述制備的重組rhTNFm1可以臨床上可以治療多種惡性腫瘤，包括惡性淋巴瘤、肺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、胸腹積水、(1)病人選擇臨床試驗共評價了310位病人，其中169人惡性胸腹水，141人為惡性淋巴癌、肺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌。
患者的選擇基于如下標(biāo)準(zhǔn)i)可測量實體瘤；ii)Karnofsky指數(shù)(KPS)≥60；iii)18-75歲；iv)主要器官正常；v)最近1個月內(nèi)未經(jīng)化療、放療和生物治療；vi)病人簽署同意書。
患者的剔除基于下列原則i)有TNF或其衍生物過敏史；ii)懷孕或哺乳期婦女；iii)主要器官有明顯損傷或功能不良；iv)發(fā)燒超過38℃；v)有明顯出血傾向；vi)有低或者高血壓史；vii)嚴(yán)重白蛋白血；viii)有強(qiáng)烈不依從或者抗拒用藥傾向。
有下列任意情況發(fā)生停止對病人的評價i)治療未完全按照既定方法執(zhí)行；ii)記錄不完整；iii)使用沒有列在既定方法中的抗癌手段。但是，因不良反應(yīng)退出治療的病人仍然計算在評估內(nèi)。
腫瘤治療效果的評估基于下列原則I)完全有效(CR)-可見病理部位完全消失至少4周；ii)部分有效(PR)-腫瘤的最大縱與橫直徑變小≥50％至少4周；iii)輕微有效(MR)-腫瘤最大縱與橫直徑減小25％到50％至少4周；iv)穩(wěn)定(SD)-腫瘤最大縱與橫直徑減小≤25％或增長不超過25％；v)發(fā)展(PD)腫瘤在一點或多點增大超過25％。
惡性胸腹水的治療效果評估按照修改的Millar標(biāo)準(zhǔn)(Millar JW，Hunfer AM，Home NW.(1980)“Inerapleural immunotherapy with CP”Recurrent Maligant Pleural Effusions.Thorax 35856)i)完全有效(CR)-胸腹水完全消失至少1個月；ii)部分有效(PR)-胸腹水等級下降1級至少1個月；iii)輕微有效(MR)-胸腹水等級下降不足1級至少1個月；iv)穩(wěn)定(SD)-胸腹水穩(wěn)定在原等級中至少1個月；v)發(fā)展(PD)胸腹水等級上升。
(2)rhTNFm1單獨治療用重組rhTNFm1蛋白單獨治療患以下癌癥的患者惡性淋巴癌、肺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、胸腹水。
治療劑量為6000000-9000000 U/m2(約1-50μg/m2根據(jù)包裝的生物活性)每日，一周靜脈注射5次(第3天到第7天)，第1、2天停。療程3-4周。惡性腫瘤的治療效果見表1。
表1患者 效果 有效率(％)病癥數(shù)量CRPRMRSDPDCRPR CR+PR肺癌 20 0 1 2 1340.00 5.00 5.00肝癌 12 0 0 0 1020.00 0.00 0.00結(jié)腸癌 7 0 0 0 3 40.00 0.00 0.00乳腺癌 10 0 0 0 6 40.00 0.00 0.00腎癌 3 0 0 1 1 10.00 0.00 0.00惡性淋 71 2 188 3211 2.82 25.35 28.17巴瘤惡性黑 18 0 2 3 1030.00 11.11 11.11色素瘤合計 1412 21147529 1.42 14.89 16.31表1包括了因不良反應(yīng)退出的患者，有3例惡性淋巴癌，1例肝癌，1例惡性黑色素瘤。
表2列出了按Hodgkin氏病和非Hodgkin氏淋巴瘤分類的治療結(jié)果。每類淋巴瘤中，病人進(jìn)一步分為2類初治和復(fù)治患者。初治患者是未用任何抗癌藥品治療過的，而復(fù)治病人已經(jīng)過一種或多種抗癌藥物治療。
表2中，患非Hodgkin氏淋巴癌的病人單用rhTNFm1有效。值得注意的是，2例復(fù)治病人在單用rhTNFm1完全有效。
表2

表3列出了單獨用rhTNFm1治療惡性胸腹水的結(jié)果。
表3療效 有效率(％)患者 CR+P數(shù)量 CR PRMR SDPDCRPRR胸積水14114 9192619.93 64.54 74.47腹水 28 11131213.57 39.29 42.86合計 16915 102 12 3828.88 60.36 69.23請注意表3包括了因不良反應(yīng)退出治療的患者，其中1例惡心胸積水，1例惡性腹水。對于惡心腹水的病人，將rhTNFm1混入30-50ml生理鹽水中，腹膜內(nèi)注射2000000-300000U/次，一周1-2次，一個療程2-3周。也可以交替進(jìn)行腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)注射rhTNFm1(6000000-9000000U/m2每天，連續(xù)28天一個療程)。腹膜內(nèi)注射rhTNFm1的治療日不進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。
以上的治療結(jié)果表明，單獨用rhTNFm1治療對非Hodgkin's淋巴癌、肺癌、惡性黑色素瘤、惡性胸腹水特別有效，對惡性胸腹水的有效率可達(dá)70％以上。
在單獨使用rhTNFm1治療過程中，不良反應(yīng)比較輕微，主要是發(fā)燒和寒戰(zhàn)。接受治療的患者中約38％的有2度以下的發(fā)熱；只有2例為3度。23％患者有寒戰(zhàn)，其中12％輕微寒戰(zhàn)，11％一般程度。剩下的病人既沒有發(fā)燒也無寒戰(zhàn)。
寒戰(zhàn)多在注射rhTNFm1后30分鐘內(nèi)發(fā)生，有時1小時后發(fā)生，一般持續(xù)半小時以上。發(fā)燒多在注射后1-2小時發(fā)生，通常持續(xù)不到半小時，可以通過治療前和/或治療后使用消炎痛栓減輕癥狀。發(fā)燒和寒戰(zhàn)的發(fā)生率隨著治療天數(shù)的增加而減少第一天各約24％和17％，第七天各約10％和5％，第21天各約5％和2％。相對原型TNF-α，用本發(fā)明的rhTNFm1治療對病人的不良反應(yīng)少的多而且程度輕的多。另外，受測試病人的KPS相對治療前大幅提高(P＝0.013)，在惡性胸腹水的治療中尤其顯著。
(3)rhTNFm1和其他抗腫瘤藥物的比較用rhTNFm1和化療聯(lián)合治療惡性淋巴癌和非小細(xì)胞肺癌患者。
(a)惡性淋巴癌惡性淋巴癌分為Hodgkin's癌(HD)和非Hodgkin's淋巴癌(NHL)。
rhTNFm1、阿霉素、博來霉素、長春新堿和二甲基-三氮烯基-咪唑基羧酰胺聯(lián)合治療HD患者。具體是，第一天和第15天，對病人靜脈注射阿霉素25mg/m2(E-ADM為40mg/m2)；博來霉素10mg/m2；長春新堿2mg；二甲基-三氮烯基-咪唑基羧酰胺375mg/m2。每天注射600000-900000U/m2(約1-50μg/m2依包裝的生物活性而定)rhTNFm1，一周5次(第3-7天)，第1、2天不注射。療程28天，2個療程后評估療效。
NHL患者用rhTNFm1、環(huán)磷酰胺、長春新堿、阿霉素、博來霉素和強(qiáng)的松聯(lián)合治療。具體是，第一天和第八天靜脈注射環(huán)磷酰胺650mg/m2；長春新堿1.4mg/m2；阿霉素25mg/m2(E-ADM40mg/m2)；第15天和第22天靜脈注射博來霉素10mg/m2；第15-28天靜脈注射100mg/m2強(qiáng)的松。rhTNFm1每日注射600000-900000U/m2(約1-50μg/m2依包裝的生物活性而定)，一周5次(第3-7天)，第1、2天不注射。療程28天，2個療程后評估療效。
聯(lián)合治療惡性淋巴癌的結(jié)果見表4。按Wilcoxon方法計算治療組(用rhTNFm1和化療聯(lián)合治療)和對照組(只化療)之間的比較關(guān)系(Z值)。
表4

結(jié)果表明rhTNFm1和化療聯(lián)合治療惡性淋巴癌總體有效率(約86％)高于單獨化療的有效率(約55％)，統(tǒng)計差異顯著(P＝0.015)。用rhTNFm1加化療聯(lián)合治療NHL患者特別有效，有效率(約75％)遠(yuǎn)高于單獨化療有效率(約30％)，統(tǒng)計差異顯著(P＝0.018)。另外，患者的KPS指數(shù)比治療前明顯提高(P＝0.004)。相反的，對照組的KPS指數(shù)沒有明顯提高。
(b)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)用rhTNFm1、絲裂霉素、長春地辛(去乙酰長春堿胺)和順式鉑氨聯(lián)合治療NSCLC患者。具體是，第一天和第八天靜脈注射絲裂霉素-C6mg/m2，長春地辛36mg/m2。第三第四天靜脈注射順式鉑氨。rhTNFm1每日注射600000-900000U/m2(約1-50μg/m2依包裝的生物活性而定)，一周5次(第3-7天)，第1、2天不注射。療程21天，2個療程后評估療效。
NSCLC病人也可以用rhTNFm1、諾維本(即失碳長春堿)和順式鉑氨聯(lián)合治療。具體是，第一天和第八天靜脈注射諾維本25mg/m2，第一天靜注順式鉑氨80-100mg/m2。rhTNFm1每日注射600000-900000U/m2(約1-50μg/m2依包裝的生物活性而定)，一周5次(第3-7天)，第1、2天不注射。療程21天，2個療程后評估療效。
聯(lián)合治療NSCLC的結(jié)果見表5。按Wilcoxon方法計算治療組(用rhTNFm1和化療聯(lián)合治療)和對照組(只化療)之間的比較關(guān)系(Z值)。
表5

用rhTNFm1加化療方法聯(lián)合治療NSCLC的有效率(約32)比單獨化療有效率(約16％)高很多，統(tǒng)計差異顯著(P＝0.015)。另外，治療組病人的生活質(zhì)量比治療前明顯提高(P＝0.001)。相反，對照組病人的生活質(zhì)量未見明顯提高(P＝0.668)。
序列表[序列1]原型hTNFVal Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Vall 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155[序列2]重組hTNF突變體1Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu1 5 10 15Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn20 25 30Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu35 40 45Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser50 55 60Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr65 70 75 80Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg85 90 95Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr100 105 110Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu115 120 125Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr130 135 140Phe Gly Ile Ile Ala Gln145 150[序列3]重組hTNF突變體1’Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala1 5 10 15Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala20 25 30Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly
35 40 45Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro50 55 60Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser65 70 75 80Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln85 90 95Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile100 105 110Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala115 120 125Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val130 135 140Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Gln145 150[序列4]重組hTNF突變體2Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu1 5 10 15Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn20 25 30Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu35 40 45Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser50 55 60Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr65 70 75 80Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gly Ala85 90 95Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln100 105 110Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr115 120 125Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu130 135 140[序列5]重組hTNF突變體2’Met Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala1 5 10 15Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala20 25 30Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly35 40 45Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro50 55 60Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser65 70 75 80Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gly85 90 95Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe100 105 110Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
115 120 125Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala130 135 140Leu145[序列6]重組hTNF突變體3Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ser65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr His Val Val Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155[序列7]重組hTNF突變體3’Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ser Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr His Val Val Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155 重組hTNF突變體4Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155[序列9]重組hTNF突變體4’Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155[序列10]重組hTNF突變體1的DNA序列atgcgcaaac gtaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc60cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac120cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc180caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc240taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca300gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg360gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag420
tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc cag 453[序列11]原型hTNF-α的前導(dǎo)序列的氨基酸順序Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala1 5 10 15Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe20 25 30Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe35 40 45Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro50 55 60Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala65 70 7權(quán)利要求
1.人腫瘤壞死因子-α突變蛋白在制備治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的人腫瘤壞死因子-α突變蛋白是在原型hTNF-α氨基酸序列上去除N端1-7號氨基酸殘基，在156或157位氨基酸殘基發(fā)生了替換，替換殘基為Gln、Ser、Thr、Tyr和Asn中的一種，在8-10位氨基酸殘基有一個或多個被Lys或Arg殘基替代，此hTNF-α突變體具有序列2、3、4或5的氨基酸序列和序列10的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的人腫瘤壞死因子-α突變蛋白是在原型hTNF-α氨基酸序列的N-端80、90、92位氨基酸殘基發(fā)生了替換，具有序列6或7的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的人腫瘤壞死因子-α突變蛋白是在原型hTNF-α氨基酸序列的N-端2位氨基酸殘基發(fā)生了替換，具有序列8或9的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的異常細(xì)胞增殖的疾病包括血液系統(tǒng)的失調(diào)、癌癥、惡性胸腔積水、惡性腹水、心臟瓣膜再狹窄和炎癥疾病。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的血液系統(tǒng)的失調(diào)疾病包括急性骨髓白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴母細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓發(fā)育異常綜合癥和鐮刀型貧血。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的癌癥包括乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、腦癌、肺癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、直腸癌、副甲狀腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、中樞組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型和乳突型鱗狀上皮細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移型皮膚癌、骨瘤、Ewing's瘤、veticulum細(xì)胞瘤、骨髓癌、巨細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膽癌、導(dǎo)狀細(xì)胞瘤、初級腦瘤、急慢性淋巴細(xì)胞粒細(xì)胞癌、毛細(xì)胞癌、腺癌、髓質(zhì)癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、平滑肌瘤、宮頸異常及癌癥、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、眼癌、軟組織瘤、惡變良性腫瘤、局部皮膚損傷、霉菌性真菌感染、橫紋肌肉瘤、Kaposi's癌、遺傳性骨癌、惡性血鈣增多、腎細(xì)胞癌、真性多血癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、表皮癌和其他癌癥和惡性腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的癌癥包括惡性淋巴癌、肺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、腎癌和結(jié)腸癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的惡性淋巴癌包括Hodgkin’s癌和非Hodgkin's淋巴癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的肺癌是指非小細(xì)胞肺癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的惡性胸腔積液或惡性腹水是指由癌癥或其他惡性疾病引起的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的hTNF-α突變蛋白可以通過非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)皮內(nèi)、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、口腔、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體包裹、吸入、陰道、眼、局部、皮下、脂肪組織、關(guān)節(jié)內(nèi)或胸內(nèi)等多種方式給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的hTNF-α突變蛋白可制成緩釋劑型。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于hTNF-α突變體蛋白經(jīng)靜脈注射，每星期注射3-5天，劑量為100,000-1,000,000單位/m2。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于hTNF-α突變體蛋白經(jīng)腹膜內(nèi)注射，每星期給藥1-2天，劑量為2,000,000-5,000,000單位。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物可單獨或與其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的抗癌藥物包括烷化劑、抗生素、抗代謝藥物、激素藥物、植物來源藥物、抗血管增生藥物和生物藥品。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的烷化劑包括二氯乙胺、氮丙啶、烷基酮硫酸鹽、亞硝基脲、非經(jīng)典烷化劑和鉑化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的抗生素包括阿霉素、柔毛霉素、表柔比星、去甲氧柔紅霉素、大黃素、絲裂霉素C、博來霉素、放線菌素D和plicatomycin。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的抗代謝藥物包括氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、氨甲喋呤、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、阿糖胞苷、噴司他丁、氟達(dá)拉濱磷酸鹽、克拉屈濱、天冬酰胺酶和吉西他濱。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的激素藥物包括己烯雌酚、它莫西芬、托瑞米芬、氟羚甲基睪丸素、雷洛昔芬、比卡魯胺、尼魯米特、氟他胺、氨魯米特、四唑、酮康唑、戈舍瑞林醋酸鹽、亮丙瑞林、甲地孕酮醋酸鹽和米非司酮。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的植物來源藥物包括長春新堿、長春堿、長春地辛、長春利定、長春瑞賓、依托泊苷、替尼泊苷、喜樹堿、紫杉酚和多烯紫杉醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的生物藥品包括免疫調(diào)節(jié)蛋白、抗腫瘤單克隆抗體、腫瘤抑制基因和腫瘤疫苗。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白包括白介素2、白介素4、白介素12、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、促紅細(xì)胞生成素、粒白血病集落刺激因子、粒白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Calmette-Guerin菌、左旋咪唑和奧曲肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的抗腫瘤單克隆抗體指HERPEPTIN(Trastruzumab)或者RITUXAN(美羅華)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的腫瘤抑制基因包括DPC-4，NF-1，NF-2，RB，p53，WT1，BRCA，and BRCA2。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的腫瘤疫苗包括神經(jīng)節(jié)苷脂、前列腺特異抗原、α-胎蛋白、癌胚抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原MART-1，糖蛋白100、乳突淋瘤病毒E6片段、乳突淋瘤病毒E7片段、腫瘤自體細(xì)胞全細(xì)胞或者部分或裂解物以及異源腫瘤細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其特征在于還包括對患者施用增加腫瘤疫苗效果的佐劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的佐劑包括Calmette-Gurin菌、脂多糖內(nèi)毒素、鎖眼貝血藍(lán)蛋白、白介素-2、粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和環(huán)磷酰胺。
30.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于抗癌藥物為左旋溶肉瘤素，與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病是和色素瘤和初級肢體癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子α(TNF－α)突變蛋白在制備治療與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病中的應(yīng)用。所述的異常細(xì)胞增殖的疾病包括血液系統(tǒng)的失調(diào)、癌癥、惡性胸腔積水、惡性腹水、心臟瓣膜再狹窄和炎癥疾病。相對于原型的腫瘤壞死因子α，這些突變蛋白有更強(qiáng)的專一抗腫瘤活性，并且對機(jī)體的毒性低和副作用輕(只引起發(fā)燒和寒戰(zhàn))。此外，TNF－α突變蛋白與其他抗腫瘤藥物有潛在相互增效作用，對特定癌癥、惡變或者特定階段的癌癥有良好效果。
文檔編號A61K38/18GK1509763SQ0310893
公開日2004年7月7日 申請日期2003年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者陳鋼, 吳德政, 張偉京, 杜心江, 鋼 陳 申請人:上海唯科生物制藥有限公司