專利名稱：哺乳動(dòng)物的配子募集和發(fā)育能力－通過抑制固醇從頭生物合成和/或促進(jìn)固醇外流的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物，由此建立改善至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞、配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎發(fā)育和生存的細(xì)胞條件，提高它們的發(fā)育能力的方法。本發(fā)明也涉及通過施用能夠促進(jìn)固醇外流的化合物，在受精前提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢、卵母細(xì)胞、雌配子或者卵母細(xì)胞周圍的卵巢衍生細(xì)胞的固醇外流，由此降低細(xì)胞的磷脂/固醇比的方法。
背景技術(shù)：
在過去的十年間，不育的醫(yī)學(xué)治療經(jīng)歷了很長的歷程，通過醫(yī)學(xué)干預(yù)為低生育力或不育的夫婦提供了育兒的可能性。不過，大量的夫婦自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的系列不育治療中未獲得任何效益。因而，生育治療的醫(yī)學(xué)實(shí)踐的選擇過程通常是令人困惑和耗費(fèi)情感的經(jīng)歷。
人類中所有不育的大約40％歸因于女性，40％歸因于男性，而在20％的病例中，配偶雙方共同造成了這個(gè)問題。不育根據(jù)女性的年齡而被不同地定義。不育的標(biāo)準(zhǔn)定義是當(dāng)女性低于35歲時(shí)，配偶無防護(hù)性交1年后不能實(shí)現(xiàn)妊娠。與此平行，生育力顯示從大約34歲年齡開始下降，在超過42歲的女性中，除非使用供體卵，否則幾乎跌至0。因而，需要治療不育的改善方法，因?yàn)槠骄袐D年齡在升高。
新哺乳動(dòng)物的發(fā)育根本上起始于傾向于參與受精過程的可受精生殖細(xì)胞，即配子的發(fā)育。兩個(gè)高度特化的細(xì)胞，即精子和卵母細(xì)胞接合產(chǎn)生受精卵，通過這個(gè)過程，可以依次產(chǎn)生新個(gè)體。在可能的受精前準(zhǔn)備中，雄性和雌性生殖細(xì)胞系都經(jīng)歷包括核及胞質(zhì)的許多變化。這些變化的目的是雙重的1)將同源染色體對的染色體數(shù)目(如體細(xì)胞中所代表的)(二倍體)減半(單倍體)，以及2)改變準(zhǔn)備受精的生殖細(xì)胞的形狀和生物化學(xué)特征。
卵泡以及卵母細(xì)胞的個(gè)體發(fā)生雌性的生殖細(xì)胞先祖細(xì)胞是所謂的初級卵母細(xì)胞。初級卵母細(xì)胞復(fù)制其DNA并進(jìn)入第一次減數(shù)分裂前期。此時(shí)細(xì)胞退化開始，許多初級卵母細(xì)胞閉鎖并死亡。不過，所有存活的初級卵母細(xì)胞，進(jìn)入第一次減數(shù)分裂前期，并且它們這時(shí)被一層上皮體細(xì)胞原始卵泡單獨(dú)包圍。
出生時(shí)，人類初級卵母細(xì)胞被阻抑在減數(shù)分裂前期，而不進(jìn)入中期。在哺乳動(dòng)物中，初級卵母細(xì)胞不繼續(xù)減數(shù)分裂，直到青春期(圖1)。只有稍微在青春期之前，部分原始卵泡才會發(fā)育，經(jīng)由假定的激素(促性腺激素，即卵泡刺激素FSH和促黃體生成激素LH)獨(dú)立階段，到達(dá)促性腺激素依賴性階段，自此進(jìn)一步的發(fā)育依賴于激素刺激。在之后的促性腺激素依賴性生長中，多數(shù)哺乳動(dòng)物(包括人類)的卵泡發(fā)展為充液腔，即所謂的卵泡腔，自此后卵泡被稱之為竇狀或格雷夫氏卵泡。稍后再次的促性腺激素(主要是LH)的循環(huán)高峰，引發(fā)卵母細(xì)胞繼續(xù)減數(shù)分裂，自卵泡萌出并排卵。
只有某一數(shù)目的原始卵泡自靜息庫起始生長。大量的卵泡在從原始卵泡期向竇前期發(fā)育期間經(jīng)歷閉鎖并死亡。即使從該階段開始，絕大多數(shù)的竇狀卵泡還會經(jīng)歷閉鎖并死亡，導(dǎo)致顯著的卵母細(xì)胞流失。這些選擇過程共同確保排除不可育或誤發(fā)育的生殖細(xì)胞。不過，卵巢內(nèi)調(diào)控機(jī)制也決定了僅有一定數(shù)目的卵泡實(shí)現(xiàn)排卵。排出的卵子的平均數(shù)目是物種特異性的，并且與所討論物種的繁殖策略有關(guān)，而與排除不可育或誤發(fā)育的生殖細(xì)胞無關(guān)。確保足夠數(shù)目的卵母細(xì)胞的機(jī)制據(jù)信與循環(huán)促性腺激素水平以及竇前卵泡中體細(xì)胞區(qū)室上促性腺激素受體的數(shù)目有關(guān)。
在所謂的卵泡期(期間小的竇狀卵泡發(fā)育成排卵前卵泡)，用外源促性腺激素刺激成年雌性，導(dǎo)致可以從增加數(shù)目的排卵前卵泡收回增加數(shù)目的存活卵母細(xì)胞?；诖说呐R床治療仍然是復(fù)雜的，且在許多病例中未完全成功。
在人類IVF治療以及家畜育種期間，收回的活卵母細(xì)胞的數(shù)目依然常常是后面的懷孕成功的限制因素。此外，激素治療有明顯的缺陷，即，增加循環(huán)促性腺激素(尤其是LH)或者功能等同的人類絨毛膜促性腺激素hCG可能對女性造成副作用。
精子的個(gè)體發(fā)生雄性的生殖細(xì)胞先祖細(xì)胞是精原細(xì)胞。前精原細(xì)胞被體細(xì)胞包圍，并且在出生前或出生后不久被包在所謂的睪丸索中。這代表了兩性生殖細(xì)胞發(fā)育中主要的結(jié)構(gòu)相似性。周圍細(xì)胞被稱之為支持細(xì)胞并行使滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，用于生殖細(xì)胞的發(fā)育，類似于滋養(yǎng)卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞。
雌性和雄性生殖細(xì)胞系的主要差別在于減數(shù)分裂循環(huán)的時(shí)間選擇和進(jìn)程。在雄性中，二倍體前精原細(xì)胞以某種方式分化為精原干細(xì)胞靜息庫和精原細(xì)胞的有絲分裂活躍庫。后者的分裂產(chǎn)生仍能有絲分裂的A-精原細(xì)胞以及注定要進(jìn)入減數(shù)分裂的B-精原細(xì)胞。雄性生殖細(xì)胞系減數(shù)分裂僅發(fā)生在青春期開始后，但不同于雌性生殖細(xì)胞系的雙線期阻抑，其之后沒有阻抑地繼續(xù)發(fā)育直到從單個(gè)B-精原細(xì)胞產(chǎn)生4個(gè)單倍體生殖細(xì)胞(圖1)。兩次減數(shù)分裂的產(chǎn)物是精母細(xì)胞(1′和2′)，且第二精母細(xì)胞進(jìn)一步分化為精子細(xì)胞并稍后分化為將釋放到睪丸生精小管內(nèi)腔中的游動(dòng)精子。
釋放到內(nèi)腔中以后，精子進(jìn)入附睪，在這里發(fā)生許多生物化學(xué)過程使得精子能夠經(jīng)歷所謂的精子獲能，這是精-卵融合及受精期間所謂的頂體反應(yīng)的必要條件。在自然界中，精子獲能發(fā)生在雌性的子宮道中，并且除其它可能的因素之外，還涉及細(xì)胞膜膽固醇向周圍環(huán)境的丟失。
雄性生殖細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量取決于許多因素，包括激素、細(xì)胞加工、環(huán)境因子和脅迫。原理上，雄性生殖細(xì)胞的數(shù)目是無限的，因?yàn)榇嬖诰杉?xì)胞，它將產(chǎn)生分裂的B-精原細(xì)胞以及后來的成熟精子。然而，實(shí)際上，睪丸中滋養(yǎng)雄性生殖細(xì)胞成熟的支持細(xì)胞的數(shù)目限制了該數(shù)目。
低數(shù)目的成熟精子導(dǎo)致雄性低生育力及不育、低質(zhì)量的射出精子或兩者兼而有之。“低精子質(zhì)量”是一個(gè)廣義的操作術(shù)語，可以覆蓋遺傳、生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)成分，以及甚至是環(huán)境誘導(dǎo)的因素。
固醇生物合成固醇是所有后生動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組分。膽固醇是最普遍的固醇，以及哺乳動(dòng)物固醇生物合成中的天然生物合成終點(diǎn)。固醇被定義為含環(huán)戊烷多氫菲四元環(huán)系統(tǒng)的物質(zhì)，具有至少碳17(C17)取代的側(cè)鏈和C3β-羥基取代基(圖4)。在本發(fā)明上下文中，固醇的概念可限于與這些結(jié)構(gòu)要求一致的結(jié)構(gòu)，并在生理環(huán)境下表現(xiàn)為從羊毛甾醇到膽固醇的中間物(例如參見圖2)。
哺乳動(dòng)物的固醇生物合成根本上起始于碳源。乙酸是膽固醇從頭生物合成的前體。不過，這不等同于乙酸僅可用于膽固醇生物合成的概念，因?yàn)橐宜岽x路徑中存在許多分支，其中導(dǎo)致膽固醇生產(chǎn)的分支只是其中一個(gè)(見圖3)。這些產(chǎn)物中任一個(gè)的生物合成程度都取決于生物合成路徑的生理勢能以及相對于其它分支會助長某些分支的優(yōu)勢的調(diào)控模式。具體地，多年來已認(rèn)識到，在異戊烯化蛋白、長醇、輔酶Q、血紅素a側(cè)鏈以及膽固醇的生物合成中，3-羥基-3-甲基戊二酰轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的步驟是限速步驟。該生物合成步驟由3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A-還原酶(HMG-CoA-還原酶)催化(圖3)。乙酸和膽固醇間的生物合成路徑涉及20多種不同的酶。HMG-CoA-還原酶在該路徑早期出現(xiàn)，并是固醇及其它下游因子和代謝物合成的限速酶(Goldstein等，1990)。
生殖細(xì)胞中的固醇和固醇動(dòng)力學(xué)固醇是生物膜的重要組分，并與磷脂共同構(gòu)成了細(xì)胞中所有膜結(jié)構(gòu)的大量脂質(zhì)物質(zhì)。固醇以游離形式，即非共價(jià)修飾的固醇出現(xiàn)在膜中，但以固醇-酯貯藏在亞細(xì)胞區(qū)室中。在哺乳動(dòng)物中，膽固醇是占優(yōu)勢的固醇物質(zhì)，且該固醇的定量出現(xiàn)決定了膜的重要物理性質(zhì)。質(zhì)膜中膽固醇與磷脂比率的變化影響膜透性、膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能、細(xì)胞融合性、酶活性及膜流動(dòng)性。
精子哺乳動(dòng)物精子具有獨(dú)特的固醇組成，正如在恒河猴精子中發(fā)現(xiàn)鏈甾醇而在倉鼠精子中發(fā)現(xiàn)鏈甾醇和膽甾基-7，24-二烯-3β-醇(Awano等，1989)，以及在人類精子中發(fā)現(xiàn)睪丸減數(shù)分裂激活固醇(T-MAS)那樣(Baltsen等，1998)?？偟膩碚f，膽固醇似乎是哺乳動(dòng)物精子中主要的固醇。不過，在某些物種的某些精子階段，非膽固醇的固醇可能占高達(dá)90％的固醇總量(Awano等，1989)。
交配期間，精子在子宮和輸卵管運(yùn)輸期間獲能。生理學(xué)上，精子的頂體反應(yīng)由細(xì)胞融合前精子與卵母細(xì)胞上的透明帶(卵殼)結(jié)合以及(也是由輸卵管中新近排卵排出的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的)孕酮誘導(dǎo)。精子在體外可以通過暴露于使得膽固醇自膜中流失的藥劑而獲能，且外源膽固醇和鏈甾醇抑制頂體對孕酮的應(yīng)答(Cross，1996)。固醇含量或與固醇保持均衡的分子的含量因而是雄性生殖細(xì)胞發(fā)育期間的關(guān)鍵參數(shù)。長久以來已知游離膽固醇和磷脂之間的比率在精子獲能期間變化(Davis，1981)。已證明游離膽固醇對獲能行使抑制作用，這與其酯化對應(yīng)物相反(Davis，1980)。已經(jīng)操作地證實(shí)膽固醇自質(zhì)膜的流失對于精子使卵受精的能力是至關(guān)重要的。在某些物種中，精子頂體反應(yīng)之前是精子質(zhì)膜脂雙層中固醇的去除。在實(shí)驗(yàn)上，精子中的固醇標(biāo)記在精子通過附睪期間顯著下降(Lopez等，1991)。并且，外源膽固醇抑制小鼠精子的獲能(Go等，1985)。
通常認(rèn)為雖然精子能夠自乙酸從頭合成膽固醇(Gunasegaram等，1995)，但其接收來自支持組織的膽固醇(Cross，1998)。然而，這種陳述未進(jìn)行徹底研究，而且對雄性生殖細(xì)胞成熟中的實(shí)際固醇代謝知之甚少。長期用富含膽固醇的飲食處理兔子，與飼喂對照飲食的兔子相比，導(dǎo)致更低的精子計(jì)數(shù)和精子游動(dòng)性(Yamamoto等，1999)。不過，長期用抑制素治療高膽固醇血癥的男子似乎不影響血漿睪酮、總精子計(jì)數(shù)、精子形態(tài)或精子游動(dòng)性(Bernini等，1998)。因而不確定生殖道細(xì)胞中的固醇遞送或固醇含量是否受干擾固醇動(dòng)力學(xué)的藥劑的系統(tǒng)治療的影響。
已經(jīng)證明精子膜的固醇含量決定了精-卵識別時(shí)重要的某些表面蛋白的表達(dá)程度(Benoff等1993a，b)。膽固醇釋放也與精子蛋白酪氨酸磷酸化的增加和胞內(nèi)pH的升高有關(guān)，這兩者對頂體釋放和受精后事件很重要。導(dǎo)致精子獲能的體外精子中膽固醇釋放可通過與許多已知結(jié)合膽固醇的物質(zhì)溫育來實(shí)現(xiàn)。
每個(gè)精子的膽固醇總量在個(gè)體之間可能變化不止10倍，但與膽固醇含量有關(guān)的受精能力似乎主要與射精后階段的膽固醇丟失能力相關(guān)(Benhoff等，1993b)。精子的絕對固醇含量可能不如游離膽固醇和磷脂間的比率重要。與正?？捎凶酉啾?，不明的不育男子和精子活力不足的男子可能具有升高的游離膽固醇/磷脂(C/PL)比，但膽固醇水平的臨床重要性似乎是不明確的(Sugkraroek等，1991；Huacuja等，1981)。用磷脂制劑處理人類精子，伴隨著精子C/PL比的下降，精子與卵透明帶的結(jié)合得以提高(Gamzu等，1987)。
精子的脂質(zhì)含量與游動(dòng)性參數(shù)相關(guān)(Connor等，1997)。而且，C/PL比與游動(dòng)性(Hamamah等，1995)和精子融合性負(fù)相關(guān)。盡管C/PL比可能對于精子質(zhì)量是重要的，固醇的絕對量仍然是未解決的問題。
卵母細(xì)胞目前未公開有關(guān)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中膽固醇含量、膽固醇生物合成以及膽固醇動(dòng)力學(xué)的任何內(nèi)容。該事實(shí)很可能歸因于只有低量的組織可用于分析。
抑制素抑制素是競爭性且可逆地抑制HMG-CoA-還原酶的化合物的通稱。在體內(nèi)施用時(shí)，抑制素通過抑制身體自身的膽固醇產(chǎn)量而介導(dǎo)血清低密度脂蛋白(LDL)的下降和血清高密度脂蛋白(HDL)的升高。在本申請中，術(shù)語抑制素覆蓋了通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-Co-還原酶)而抑制膽固醇從頭生物合成的任何化合物。
流行病學(xué)研究已證明升高的血膽固醇水平，或者更具體地，升高的LDL-膽固醇水平原因性地與提高的冠心病危險(xiǎn)有關(guān)。也有降低總的膽固醇水平和LDL-膽固醇水平會減少冠心病發(fā)生的大量證據(jù)。由于這種效果，過去10年的深入研究產(chǎn)生了多種能夠抑制HMG-CoA-還原酶的化合物。一般認(rèn)為這些化合物是安全和普遍無毒性的。僅有非常少的報(bào)道涉及抑制素對生殖的危害。一份有關(guān)人類毒性的報(bào)道引述到在每天口服接受40mg洛伐他汀計(jì)4個(gè)月的II型高脂蛋白血癥患者中，與單獨(dú)的飲食控制期間相比較，精子游動(dòng)性具有小的但是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降(危險(xiǎn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，SigmaAldrich挪威)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了提高雌性和雄性生殖細(xì)胞以及由此類生殖細(xì)胞受精所產(chǎn)生的生物體的數(shù)目和發(fā)育能力的簡單新方法。作為一個(gè)卓越的方法，其實(shí)現(xiàn)生育力的改善而沒有目前大多數(shù)使用的方法中所應(yīng)用的激素治療的副作用。此外，本發(fā)明也能夠與目前臨床上所用的體外方法聯(lián)合應(yīng)用，例如體外成熟(IVM)及體外受精-胚胎轉(zhuǎn)移(IFV-ET)技術(shù)，不同程度的外源促性腺激素刺激的應(yīng)用和生殖細(xì)胞培養(yǎng)。與用于治療低生育或不育的體外技術(shù)有關(guān)的時(shí)間進(jìn)行順序在圖12中描繪。作為這些常規(guī)方法的補(bǔ)充，本方法降低可能的副作用。
本發(fā)明涉及提高哺乳動(dòng)物配子和胚胎的數(shù)目及質(zhì)量的方法。所述方法可以體內(nèi)或體外應(yīng)用，其或者抑制兩種性別的生殖細(xì)胞及其相鄰細(xì)胞的固醇從頭生物合成，或者促進(jìn)受精前固醇自雌性生殖細(xì)胞的外流，或者兩方面兼而有之。預(yù)期可以由本發(fā)明所述物質(zhì)操作的過程描述在圖11中。工作機(jī)制被認(rèn)為涉及降低哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子中游離(非衍生的)固醇和磷脂之間的比率，但可能也涉及到與甲羥戊酸及甲羥戊酸后面的產(chǎn)物的利用有關(guān)的其它機(jī)制。
在一個(gè)方面，本發(fā)明使用藥理學(xué)方案通過施用或添加拮抗生殖細(xì)胞和生殖細(xì)胞支持組織中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的化合物在體內(nèi)和/或在體外抑制內(nèi)源膽固醇從頭生物合成。不過，HMG-CoA-還原酶抑制劑的這種使用是以脈沖方式(pulsate manner)進(jìn)行的，這與這些化合物用于動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防時(shí)的通常使用不同。而且，HMG-CoA-還原酶抑制劑的使用濃度可以比動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防時(shí)通常所用的濃度高相當(dāng)多。該治療介導(dǎo)胞內(nèi)效應(yīng)，挽救否則將不可育或不可受精的生殖細(xì)胞，并使得此類生殖細(xì)胞可育且易于受精。實(shí)際上，該治療導(dǎo)致生殖細(xì)胞存活率升高，且促進(jìn)生殖細(xì)胞成熟。并且，該治療使得生殖細(xì)胞更易于成熟及參與影響受精和早期胚胎發(fā)育的成熟后事件，這很可能是通過影響固醇和磷脂之間的比率實(shí)現(xiàn)的?？捎糜谏院蟮氖芫纳臣?xì)胞的數(shù)目由此得以提高，這導(dǎo)致受孕成功性提高，以及每個(gè)成年雌性每個(gè)生殖周期中后代的數(shù)目增加。
本發(fā)明涉及在卵泡期的非激素藥理學(xué)治療，其導(dǎo)致收回的卵母細(xì)胞數(shù)目增加，且就形態(tài)學(xué)和受精力而言卵母細(xì)胞質(zhì)量得以改善。作為一項(xiàng)卓越的技術(shù)，可操作本發(fā)明的方法而沒有常規(guī)激素治療的可能的副作用危險(xiǎn)。不過，當(dāng)需要改良的方法增加收回的生殖細(xì)胞的數(shù)目和就生育力和受精力而言改善卵母細(xì)胞質(zhì)量時(shí)，這種新的非激素藥理學(xué)方法也可聯(lián)合常規(guī)的女性IVF治療方案以及家畜或動(dòng)物育種中的一般應(yīng)用技術(shù)，在體外技術(shù)施用的條件下應(yīng)用。
發(fā)明詳述在最廣義的方面，本發(fā)明涉及抑制固醇從頭生物合成的方法，其效果是降低生殖細(xì)胞的固醇含量，并有可能降低至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子中游離固醇和磷脂之間的比率，由此提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞、配子、受精卵、早期胚胎、胚泡、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力，和/或哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡、胚胎和/或胎兒的數(shù)目，所述方法包括向需要此的哺乳動(dòng)物施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或一個(gè)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流的方法，由此提高所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力，所述方法包括施用能夠在需要的哺乳動(dòng)物中促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“生殖細(xì)胞”涉及能夠產(chǎn)生配子的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而“配子”被定義為擁有單倍染色體組的成熟雄性或雌性生殖細(xì)胞，其通過與相對性別的配子融合能夠起始新的二倍體個(gè)體的形成，該術(shù)語因而包括如次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子、卵丘包圍的卵母細(xì)胞(卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞)以及分離的卵母細(xì)胞。
在本上下文中，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”涉及脊椎動(dòng)物亞門最高等級的綱，包括用乳腺分泌的乳汁養(yǎng)育其幼子的所有動(dòng)物，例如人類、馬、牛、大鼠、小鼠、豬、綿羊、山羊、駱駝(llama)、狗、貓和貂。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人類。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由于人類農(nóng)業(yè)和寵物產(chǎn)業(yè)而在工業(yè)上可用的哺乳動(dòng)物，例如上文所述的動(dòng)物。
本發(fā)明上下文中所用的術(shù)語“受精卵”是描述通過兩個(gè)配子結(jié)合形成的細(xì)胞，其經(jīng)歷原核發(fā)生和原核融合發(fā)育，并起始首次細(xì)胞分裂，或者更廣義地，是指由配子產(chǎn)生的發(fā)育中個(gè)體。術(shù)語“早期胚胎”在本上下文中被定義為自受精卵產(chǎn)生的、直到胚泡期的兩細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，胚泡被定義為出現(xiàn)了充液腔即囊胚腔的早期胚胎階段。術(shù)語“植入的胚泡”在本上下文中涉及已開始由周圍的卵殼即透明帶孵出并且剛剛開始穿入養(yǎng)育母體的子宮內(nèi)膜的胚泡。本上下文中的胚胎被定義為哺乳動(dòng)物從植入過程終止以及生長和分化早期階段開始起的發(fā)育階段，以細(xì)胞分裂、基本組織的擬定以及原始器官和器官系統(tǒng)形成為特征。該術(shù)語尤其指從植入之時(shí)到受孕后8周結(jié)束時(shí)的發(fā)育中人類個(gè)體，這將胚胎與胎兒區(qū)分開。
自“生殖細(xì)胞”到“胎兒”的發(fā)育在本上下文中構(gòu)成了哺乳動(dòng)物發(fā)育的連續(xù)過程，不允許不適合上述定義之一的任何中間階段發(fā)生。
術(shù)語“發(fā)育能力”被定義為發(fā)育成特定單細(xì)胞或多細(xì)胞期的能力，并且在本上下文中包括任何細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟、受精，以及覆蓋早期胚胎發(fā)育、胚泡形成、植入和胚胎及胎兒生長的受精后過程。
在本發(fā)明的方法的最優(yōu)選的實(shí)施方案中，生殖細(xì)胞是人類生殖細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞、通過抽吸竇前卵泡(pre-antral follicle)收回的未成熟卵母細(xì)胞、通過抽吸小的或中等大小的竇狀卵泡(antral follicle)收回的未成熟卵母細(xì)胞和/或在培養(yǎng)至少一個(gè)處于原始卵泡期到竇前期的未成熟卵泡后獲得的未成熟卵母細(xì)胞、射出的精子、自雄性生殖道收回的未成熟精子、精子細(xì)胞或精母細(xì)胞。術(shù)語“未成熟”涉及自然情況下在其目前的階段不能夠受孕的生殖細(xì)胞和配子。
待用于本發(fā)明的方法且能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物優(yōu)選選自拮抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的化合物類，例如與HMG-CoA競爭性或非競爭性地和HMG-CoA-還原酶可逆或不可逆結(jié)合、且降低每摩爾HMG-CoA-還原酶單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的甲羥戊酸的摩爾量的任何物質(zhì)。可利用一種或多種化合物，即化合物可以獨(dú)立地使用，或者兩種或多種化合物可聯(lián)合使用。
本上下文中的相關(guān)HMG-CoA-還原酶抑制劑可通過涉及純化溶解的HMG-CoA-還原酶、冷凍融化溶解的HMG-CoA-還原酶、由哺乳動(dòng)物生殖腺或生殖腺細(xì)胞獲得的微粒體級分的測試法來鑒定資格。此類細(xì)胞或亞細(xì)胞級分在下文被稱之為“HMG-CoA-還原酶制品”。
在涉及游離濃度為20μM的HMG-CoA、溫育介質(zhì)中最高10mg/ml的“HMG-CoA-還原酶制品”的體外實(shí)驗(yàn)中，在于空氣中平衡且添加了輔因子NADH和NADPH以及氧再生系統(tǒng)的生理緩沖液中于37℃溫育，穩(wěn)態(tài)期間每摩爾HMG-CoA-還原酶單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的甲羥戊酸的摩爾量為對照值，Vc＝產(chǎn)生的甲羥戊酸摩爾數(shù)/mg酶制品/秒。
如果在相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)置下添加一定濃度的抑制HMG-CoA-還原酶的物質(zhì)使得產(chǎn)生游離濃度為100μM的該物質(zhì)(游離濃度是自由擴(kuò)散而不是結(jié)合到大分子實(shí)體上的物質(zhì)的濃度)，則穩(wěn)態(tài)下每摩爾HMG-CoA-還原酶單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的甲羥戊酸的摩爾量為抑制值，Vi(100μM)＝產(chǎn)生的甲羥戊酸摩爾數(shù)/mg酶制品/秒。
如果Vi(100μM)≤0.9×Vc則該物質(zhì)使每摩爾HMG-CoA-還原酶單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的甲羥戊酸的摩爾量降至對照值的90％或更低，其中對照值是不施加抑制劑時(shí)的轉(zhuǎn)化率。如果滿足在添加100μM的物質(zhì)時(shí)抑制至少10％的條件，該物質(zhì)有資格作為本上下文的HMG-CoA-還原酶抑制劑。
優(yōu)選地，所述量小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物在上述條件下導(dǎo)致3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A向甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化率幾乎徹底地下降。
能夠降低固醇從頭生物合成的其它化合物可以是抑制參與起始于乙酰-CoA并終止于羊毛甾醇的固醇前生物合成路徑的酶(圖2和3)的任何化合物。待抑制的酶的實(shí)例有甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶、牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶、角鯊烯合酶、角鯊烯單加氧酶、氧化鯊烯羊毛甾醇環(huán)化酶及羊毛甾醇合成酶。
此類藥物的抑制潛力應(yīng)當(dāng)由它們在溫育的生殖腺組織或組織塊中，與潛在抑制劑不存在時(shí)的溫育相比，降低每摩爾酶每單位時(shí)間內(nèi)的酶產(chǎn)物量的能力評價(jià)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置因此應(yīng)當(dāng)類似于上文所述的用于測試HMG-CoA-還原酶抑制劑物質(zhì)的條件——除了用所討論的酶的天然底物替代HMG-CoA之外，其中該底物應(yīng)當(dāng)以等于酶-底物反應(yīng)的Km(米曼氏常數(shù))的游離濃度使用。在類似于上述用于HMG-CoA-還原酶抑制作用的條件(即以100μM濃度施用物質(zhì))下，所述物質(zhì)的抑制效果應(yīng)當(dāng)至少為10％，以便有資格作為固醇合成抑制劑。
此類列表將包括但不限于，zaragozic acid，重氮角鯊烯(azasqualene)、雙膦酸鹽(例如環(huán)庚基氨基亞甲基-1，1-雙膦酸、(3-(1-吡咯烷基)-1-羥基亞丙基-1，1-雙膦酸)和PHPBP(3-(1-哌啶子基)-1-羥基亞丙基-1，1-雙膦酸))及其它squalestatin(角鯊烯合酶抑制劑)、咪唑類化合物、氨羥二膦酸鹽、阿侖特羅(alendronate)及氧固醇類。
一般而言，本發(fā)明涉及應(yīng)用在其與生殖腺組織相互作用期間會抑制固醇從頭生物合成并由此導(dǎo)致哺乳動(dòng)物附睪精子或卵母細(xì)胞及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中游離固醇的含量下降，并可能最終導(dǎo)致生殖細(xì)胞支持細(xì)胞中固醇/磷脂比降低的任何化合物。本發(fā)明涉及化合物與施用方式的任何組合，該組合將通過與固醇前路徑(即乙酸和羊毛甾醇之間的生物合成路徑)中涉及的酶的抑制性相互作用，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物附睪精子或卵母細(xì)胞及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中總游離固醇下降。
本發(fā)明涉及上述任何能導(dǎo)致與未接受此類處理的哺乳動(dòng)物的情況相比，哺乳動(dòng)物附睪精子或卵母細(xì)胞及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中游離固醇下降至少10％(如至少5％)的方案。本發(fā)明也涉及固醇從頭生物合成抑制方案與為在需要的哺乳動(dòng)物中增殖生殖細(xì)胞而應(yīng)用的公知技術(shù)，例如IVM和IVF-ET技術(shù)、用外源促性腺激素刺激和/或其它技術(shù)的任何組合。
在本上下文中，術(shù)語“促性腺激素”涉及由垂體或胎盤產(chǎn)生的含兩個(gè)肽亞基α和β的哺乳動(dòng)物肽激素，其中α亞基為它們共有，而β亞基具有不同的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特征。迄今已知的促性腺激素包括促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)。
在本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于抑制固醇從頭生物合成的化合物為抑制素。抑制素存在幾種普通名稱，因而下述列表并不旨在限制本發(fā)明的范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制素選自托伐他汀、西伐他汀、達(dá)伐他汀(RG 12561)、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(從前稱之為美維諾林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(從前稱之為美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氫美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氫美降脂L、美維諾林、3β-羥基美伐他汀酸單鈉鹽(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
在本上下文中，能夠促進(jìn)固醇外流的化合物(SBTS＝固醇結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì))是在溫育組織或細(xì)胞期間將導(dǎo)致固醇增加擴(kuò)散到介質(zhì)中、從而導(dǎo)致所述固醇從生物材料外流到最初未被固醇飽和的固醇受體，例如血清白蛋白或其它蛋白、碳水化合物或脂質(zhì)材料上的任何物質(zhì)。
固醇外流可通過在補(bǔ)充有3mg/mL(3‰w/v)人類血清白蛋白以及所關(guān)心的推斷的固醇結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基中溫育放射性標(biāo)記的條件Fu5AH大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞來進(jìn)行測定。細(xì)胞的條件培養(yǎng)和標(biāo)記以及培養(yǎng)期間的細(xì)胞密度必需與Moya等(Moya etal.，1994，Arterioscler.Thromb.，14(7)1056-1065)的文獻(xiàn)描述一致。如果Fu5AH大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞在這些條件下于37℃溫育4小時(shí)，在溫育后隨后通過離心分離用過的培養(yǎng)基，在新培養(yǎng)基(補(bǔ)充有3mg/mL人類血清白蛋白的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基)中洗滌細(xì)胞，并在這兩個(gè)級分中測量放射性，則細(xì)胞中放射性＝RA細(xì)胞培養(yǎng)基中放射性＝RA培養(yǎng)基其中RA細(xì)胞代表細(xì)胞級分中的總放射性，而RA培養(yǎng)基代表了包括來自3次連續(xù)洗滌的培養(yǎng)基在內(nèi)的培養(yǎng)基級分中的總放射性。如果培養(yǎng)中不存在除3mg/mL血清白蛋白之外的其它物質(zhì)，則細(xì)胞中放射性(標(biāo)準(zhǔn))＝RA細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中放射性(標(biāo)準(zhǔn))＝RA培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)如果添加SBTS，則細(xì)胞中放射性(SBTS)＝RA細(xì)胞SBTS培養(yǎng)基中放射性(SBTS)＝RA培養(yǎng)基SBTS如果物質(zhì)有資格作為本上下文中的SBTS，則在37℃溫育4小時(shí)后，來自細(xì)胞的3H-膽固醇級分釋放提高50％或更多，即(RA培養(yǎng)基SBTS)/(RA細(xì)胞SBTS)≥150％×(RA培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn))/(RA細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn))在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向培養(yǎng)基中添加的SBTS量導(dǎo)致培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度增加0.001-10％。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，向培養(yǎng)基中添加的SBTS量在0.001-10mM的范圍內(nèi)。又在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，向培養(yǎng)基中添加的SBTS量在0.01-50‰(w/w)的范圍內(nèi)，例如但不限于0.5-4‰。
令人感興趣的能夠促進(jìn)固醇外流的化合物可以是環(huán)糊精，化學(xué)修飾的環(huán)糊精，例如但不限于硫酸化環(huán)糊精，高密度脂蛋白(HDL)，來自HDL的脫輔基蛋白，固醇載體蛋白I和II或者能夠溶解固醇的任何其它蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠促進(jìn)固醇外流的化合物選自環(huán)糊精，化學(xué)修飾的環(huán)糊精，例如但不限于硫酸化環(huán)糊精，高密度脂蛋白(HDL)，來自HDL的脫輔基蛋白，以及固醇載體蛋白I和II。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠促進(jìn)固醇外流的化合物是環(huán)糊精。
在本上下文中，術(shù)語“環(huán)糊精”涉及通過環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶對淀粉或相似底物的作用獲得的由α-1，4鍵合的葡萄糖單位構(gòu)成的一組環(huán)狀葡聚糖同系物。環(huán)糊精與廣泛種類的物質(zhì)形成包函復(fù)合體，從而使得否則在水或緩沖液中不溶或低溶的物質(zhì)共溶。環(huán)糊精彼此在結(jié)構(gòu)上存在吡喃葡萄糖單位數(shù)目的差異。含6、7和8個(gè)吡喃葡萄糖單位的母體環(huán)糊精分別被稱為阿爾法(α)、貝塔(β)和伽馬(γ)環(huán)糊精。作為實(shí)例，圖13顯示了硫酸化環(huán)糊精的通用結(jié)構(gòu)(R＝H)。如果R＝CH2CH(OH)CH3，則該結(jié)構(gòu)代表下文實(shí)施例8中所用的羥丙基-β-環(huán)糊精。
應(yīng)當(dāng)向需要的哺乳動(dòng)物施用的抑制素或能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物的量取決于所選的特定抑制素和/或化合物，并且在每天每kg體重0.01-100mg之間，例如每天每kg體重0.05-90mg、每天每kg體重0.1-80mg、每天每kg體重1-50mg、每天每kg體重1-25mg、每天每kg體重1-10mg、每天每kg體重1.0-10mg、每天每kg體重2.0-10mg、每天每kg體重2.5-10mg、每天每kg體重3.0-10mg、每天每kg體重4.0-10mg、每天每kg體重5.0-10mg、每天每kg體重6.0-10mg、每天每kg體重7.0-10mg、每天每kg體重8.0-10mg、每天每kg體重9.0-10mg或者每天每kg體重1.0-9.0mg之間、每天每kg體重2.0-8.0mg、每天每kg體重2.5-7.5mg、每天每kg體重4.0-6.0mg或每天每kg體重4.5-5.5mg。
應(yīng)當(dāng)向需要的哺乳動(dòng)物施用的能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的量取決于所選的特定化合物，但可能在每天每kg體重0.01-1000mg之間，例如每天每kg體重0.5-900mg、每天每kg體重1-800mg、每天每kg體重10-500mg、每天每kg體重10-250mg、每天每kg體重10-100mg、每天每kg體重20-100mg、每天每kg體重25-100mg、每天每kg體重30-100mg、每天每kg體重40-100mg、每天每kg體重50-100mg、每天每kg體重600-100mg、每天每kg體重70-100mg、每天每kg體重80-100mg、每天每kg體重90-100mg或者每天每kg體重10-90mg之間、每天每kg體重20-80mg、每天每kg體重25-75mg、每天每kg體重40-60mg或每天每kg體重45-55mg。
雌性哺乳動(dòng)物的生殖狀態(tài)是循環(huán)的，下丘腦、垂體前葉和卵巢之間復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致排卵過程。在人類中，該循環(huán)以平均周期為28天左右(范圍21-35天)重復(fù)。第一階段月經(jīng)期持續(xù)3-5天。人類循環(huán)的第一天就是所述第一階段的第一天，也就是月經(jīng)流血的第一天。人類卵巢的第二卵泡期對應(yīng)于子宮內(nèi)膜的增生期，并且至少5-16天(即高度可變)。接著是排卵期(36小時(shí))，最后是黃體期，它對應(yīng)于子宮內(nèi)膜的分泌期，并且通常更恒定，為14天左右。在本上下文中，排卵時(shí)刻就是卵子自卵巢釋放的時(shí)間。
有必要使用本發(fā)明的治療方案的時(shí)期在每個(gè)排卵周期內(nèi)計(jì)算。排卵周期在哺乳動(dòng)物各物種之間不同，因此需要施用的最佳時(shí)期應(yīng)當(dāng)優(yōu)選就每一物種根據(jù)其排卵周期計(jì)算。在幾種哺乳動(dòng)物中，排卵周期的持續(xù)時(shí)間與人類周期高度不同。多種哺乳動(dòng)物的平均排卵周期持續(xù)時(shí)間在下表1中給出表1
根據(jù)本發(fā)明的方法，向需要的雌性動(dòng)物施用能夠抑制固醇從頭生物合成和/或促進(jìn)固醇外流的化合物的時(shí)間在排卵前0小時(shí)-12天期間，例如排卵前0小時(shí)-11天、0小時(shí)-10天、0小時(shí)-9天、0小時(shí)-8天、0小時(shí)-7天、0小時(shí)-6天、0小時(shí)-5天、0小時(shí)-4天、0小時(shí)-3天、0小時(shí)-2天或0小時(shí)-24小時(shí)。
能夠抑制固醇從頭生物合成和/或促進(jìn)固醇外流的化合物的施用可以延至排卵后不超過3天，例如排卵后1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)或72小時(shí)。
本發(fā)明一個(gè)重要的方面涉及藥物組合物，其包含能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物與能夠提高固醇外流的化合物的組合，以任選地藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于對細(xì)胞固醇含量具有影響的兩個(gè)不同過程在時(shí)間上同時(shí)發(fā)生，故可以獲得抑制素和環(huán)糊精的協(xié)同效應(yīng)，產(chǎn)生的效果超過兩個(gè)方案單獨(dú)使用的加和，優(yōu)選地至少3倍。
優(yōu)選的本發(fā)明組合物是包含抑制素和環(huán)糊精的組合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將抑制素和環(huán)糊精連同藥學(xué)上可接受的載體用于制備提高需要的哺乳動(dòng)物的生育力的藥物。
生長因子長久以來就用于臨床，因而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及進(jìn)一步包含生長因子的含抑制素和環(huán)糊精的組合物。此類生長因子可以是促性腺激素(FSH、LH、CG)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素、生長激素、白介素或其它肽激素。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生長因子選自促性腺激素(FSH、LH、CG)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素、生長激素、白介素及其它肽激素。
本發(fā)明另一個(gè)重要的方面涉及藥物組合物，其包含能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物與生長因子的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物為抑制素。
又在另一個(gè)重要的方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含能夠促進(jìn)固醇外流的化合物與生長因子的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物為環(huán)糊精。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，一天向哺乳動(dòng)物施用化合物和/或上文提及的任一組合物1-10次，例如一天1次、一天2次、一天3次、一天4次、一天5次、一天6次、一天7次、一天8次、一天9次或一天10次。
化合物和/或組合物也可以1次至幾次施用，或者在該段時(shí)間通過組織泵送裝置連續(xù)地施用?；衔锖?或組合物可以在該段時(shí)間通過組織泵送裝置連續(xù)地施用1次至幾次?；衔锖?或組合物可以以能延緩其體內(nèi)釋放的制劑形式施用。此類制劑使得可以在前述階段之前一段時(shí)期比如說0-30天施用化合物和/或組合物，而通過體內(nèi)緩釋在非常相同的時(shí)間段上實(shí)現(xiàn)組織暴露。此類施用將藉此對生殖細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生與導(dǎo)致立即體內(nèi)釋放的施用方案相似的期望效果。
本發(fā)明也涉及將上文提及的任一組合物用于制備本發(fā)明任一方法中使用的藥物組合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知卵是經(jīng)歷染色體減少因而可準(zhǔn)備受精的卵子，其采取相對大的非游動(dòng)性配子的形式，提供了受精卵的大部分胞質(zhì)。這些卵即使以成熟及準(zhǔn)備受精的形式釋放，在某種程度上仍可能缺失完成受精過程的能力，這可以通過添加能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物而得到幫助。
在實(shí)施例中，證明Mevacor(通過抑制膽固醇從頭生物合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟HMG-CoA-還原酶起作用的抑制素類藥物產(chǎn)品)導(dǎo)致血清膽固醇下降，并且如這里所證明的，影響器官象肝和卵巢中游離膽固醇的含量(實(shí)施例3)。與此相應(yīng)，卵巢應(yīng)答而產(chǎn)生大量可受精的卵母細(xì)胞和/或提高這些占優(yōu)勢的排出卵的發(fā)育能力——這通過在與正常(未處理)雄性小鼠交配后輸卵管中2-細(xì)胞數(shù)目的增加得到證實(shí)(實(shí)施例1)。
抑制素對減數(shù)分裂成熟的改善通過實(shí)施例4證明，它表明向培養(yǎng)基添加抑制素(美伐他汀，Sigma)介導(dǎo)卵母細(xì)胞的體內(nèi)減數(shù)分裂成熟。而且，該效果似乎可以與公知的促性腺激素(此處FSH)的減數(shù)分裂成熟效果累加。
此處包括了證明卵母細(xì)胞成熟和膽固醇從頭生物合成之間相關(guān)性的代謝數(shù)據(jù)。在體外用美伐他汀替換Mevacor是必要的，因?yàn)镸evacor、洛伐他汀的活性成分只有在肝中生物轉(zhuǎn)化后才有活性。與更為天然的排卵引發(fā)劑hCG相比，抑制素對膽固醇降低的增強(qiáng)作用通過實(shí)施例3證實(shí)。在激素誘導(dǎo)的小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵期間游離膽固醇的總體下降通過實(shí)施例5提供的數(shù)據(jù)得到證實(shí)。
抑制素對受精的改善通過實(shí)施例7顯示，它證明使用IVF時(shí)向IVM培養(yǎng)基中添加抑制素(美伐他汀，Sigma)改善卵母細(xì)胞的精子受精。已證明與對照溫育及和FSH的溫育相比，IVM期間美伐他汀的存在介導(dǎo)IVF后受精的卵母細(xì)胞數(shù)目的提高。退化的卵母細(xì)胞的比率保持相同(圖8)。令人驚訝的是，與添加FSH相比，抑制素具有增強(qiáng)的效果。在圖9中，結(jié)果表明與用于比較的上述兩個(gè)組相比，用美維諾林處理的細(xì)胞在IVF后的72小時(shí)培養(yǎng)后到達(dá)更為前進(jìn)的狀態(tài)。美維諾林處理組中72小時(shí)培養(yǎng)后的退化比率與上述兩個(gè)用于比較的組相比低，這可能與在存在美維諾林時(shí)培養(yǎng)的卵母細(xì)胞在IVM后表現(xiàn)出在顯微鏡檢期間不可見的高度卵丘擴(kuò)展的事實(shí)相符。卵丘擴(kuò)展對于適當(dāng)?shù)穆涯讣?xì)胞成熟和受精準(zhǔn)備是必要條件。
以羥丙基-β-環(huán)糊精為例，固醇結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)對受精的改善通過實(shí)施例8證明，它表明向IVM培養(yǎng)基中施加羥丙基-β-環(huán)糊精改善卵母細(xì)胞在使用IVF時(shí)的精子受精，如圖10所示。卵母細(xì)胞退化比率不受本范圍內(nèi)的環(huán)糊精的影響。
本發(fā)明的背景是有關(guān)游離固醇自質(zhì)膜的流失是哺乳動(dòng)物精子最終正確成熟的必要條件的現(xiàn)有知識。不過，本發(fā)明以三個(gè)新的主要思想為基礎(chǔ)。
1)膜固醇下降是同樣發(fā)生在卵母細(xì)胞最終受精前成熟期間的生物化學(xué)過程。迄今尚無有關(guān)卵巢或卵母細(xì)胞在受精前流失固醇的認(rèn)識發(fā)表在科學(xué)文獻(xiàn)或別處。
2)固醇的流失和/或與胞內(nèi)固醇含量降低有關(guān)的過程，可通過施加固醇從頭生物合成路徑的抑制劑在兩種性別的生殖細(xì)胞中得以增強(qiáng)。這種抑制不會導(dǎo)致生殖細(xì)胞或生殖細(xì)胞環(huán)境，例如通過提高脂蛋白攝入或提高固醇酯水解來進(jìn)行完全的固醇補(bǔ)償。這很可能是因?yàn)榻咏芫暗纳臣?xì)胞環(huán)境中絕大多數(shù)固醇是在天然條件下原位產(chǎn)生的。固醇生物合成抑制作用將導(dǎo)致膜固醇含量的顯著下降，這可以取代激素刺激的天然固醇流失。而且，天然固醇流失將通過固醇從頭生物合成的抑制得以增強(qiáng)。
3)對固醇從頭生物合成的抑制不僅介導(dǎo)重要的成熟過程本身如減數(shù)分裂成熟，而且是一種除介導(dǎo)精子獲能之外還介導(dǎo)生殖細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵步驟的機(jī)制。并且，膜固醇流失介導(dǎo)重要的成熟過程。
本申請?zhí)峁┝死靡种扑匾载?fù)操縱卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞環(huán)境中的游離固醇水平的實(shí)驗(yàn)。與本發(fā)明有關(guān)的實(shí)驗(yàn)證明在最終卵母細(xì)胞成熟期間增強(qiáng)天然固醇流失導(dǎo)致卵母細(xì)胞生存力和受精能力的提高，這很可能是通過拯救許多否則會變得閉鎖從而在激素依賴性生長期流失的“邊緣”卵母細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。而且，可以考慮向雄性小鼠體內(nèi)給予抑制素導(dǎo)致附睪游動(dòng)細(xì)胞(正常精子)中固醇從頭生物合成下降和/或磷脂/固醇比下降。
本發(fā)明證明(圖5)用激素刺激和抑制素處理青春期前雌性小鼠比單獨(dú)用激素刺激相同小鼠，產(chǎn)生多平均大約70％的2-細(xì)胞。我們認(rèn)為通過調(diào)整抑制素劑量和處理周期可獲得甚至更高的百分比。該實(shí)例證明向雌性哺乳動(dòng)物施加抑制素可以提高其配子的發(fā)育能力。
本發(fā)明證明可在卵泡成熟的卵泡期期間體內(nèi)施用抑制素，達(dá)到增強(qiáng)成熟事件的效果。該效果很可能有賴于與發(fā)生固醇從頭生物合成的動(dòng)物相比，生殖細(xì)胞中總游離固醇含量的下降，這導(dǎo)致質(zhì)膜中固醇與磷脂比率的下降，從而使生殖細(xì)胞更傾向于參與受精過程。而且，體外卵母細(xì)胞成熟和受精也將得益于抑制固醇從頭生物合成的處理，導(dǎo)致減數(shù)分裂速率的提高和減數(shù)分裂后成熟的增強(qiáng)。
已知的精子體內(nèi)或體外獲能期間的固醇流失過程從未與胞內(nèi)固醇從頭合成聯(lián)系起來。膽固醇存在于細(xì)胞內(nèi)部和外部膜中，并且根據(jù)胞外環(huán)境的性質(zhì)，在所有細(xì)胞中發(fā)生膽固醇向胞外間隙的穩(wěn)定流失。而且，膽固醇被用作為合成例如膽汁酸和類固醇的底物。在另一方面，細(xì)胞自內(nèi)部膽固醇-酯儲藏、外部脂蛋白來源以及從頭合成獲得游離膽固醇。抑制這些過程之一通常導(dǎo)致其它過程之一增強(qiáng)，以獲得恒定的細(xì)胞膜和細(xì)胞器固醇水平。
這些過程共同確保細(xì)胞中膽固醇的穩(wěn)態(tài)，并且不可想象抑制單個(gè)膽固醇遞送過程會改變膽固醇穩(wěn)態(tài)的總體圖像以及依賴于膽固醇利用的過程。例如，如本發(fā)明實(shí)施例3所例示的那樣，雌性生殖腺中進(jìn)行的類固醇生產(chǎn)不受完全阻斷固醇從頭生產(chǎn)的影響。因此，同樣可能預(yù)期，阻斷固醇從頭合成路徑對穩(wěn)態(tài)的貢獻(xiàn)將提高膽固醇攝入(脂蛋白攝取和游離膽固醇釋放)和胞內(nèi)動(dòng)員(膽固醇-酯水解)。然而，本實(shí)施例3和6證明在卵巢和附睪(雄性成熟精子的儲藏部位)的能動(dòng)細(xì)胞級分中結(jié)果是每重量單位或磷脂單位的下降。實(shí)施例1和9證明這種固醇下降伴隨著生殖細(xì)胞發(fā)育和/或質(zhì)量的改善。
在另一方面，即使可以想到阻斷固醇從頭生物合成將導(dǎo)致其它生物化學(xué)過程中的固醇使用下降，引起如類固醇的產(chǎn)出下降，但由于這會干預(yù)類固醇產(chǎn)出和有賴于類固醇的生殖細(xì)胞成熟過程，故將嚴(yán)重削弱本發(fā)明方法在提高生育力方面的潛在治療用途。本方法證明了藥理學(xué)阻遏固醇從頭生物合成可以導(dǎo)致雌性生殖細(xì)胞質(zhì)量提高這一令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。該方案不負(fù)面地影響類固醇生成，也就是有賴于膽固醇使用的過程。因而在雌性生殖細(xì)胞和/或生殖細(xì)胞環(huán)境中固醇以二分方式使用，這使得細(xì)胞可以通過降低一個(gè)細(xì)胞和/或生物化學(xué)區(qū)室中的固醇產(chǎn)出，并在同時(shí)保留另一個(gè)區(qū)室在固醇的使用和/或存在方面不受影響而作出應(yīng)當(dāng)。
本發(fā)明涉及利用已知的一般化合物通過抑制從頭固醇生成來改善哺乳動(dòng)物生育力。引起此經(jīng)證明的生育力改善的潛在機(jī)制可能是固醇/磷脂比的調(diào)整。本發(fā)明證明通過藥理學(xué)干預(yù)降低哺乳動(dòng)物固醇從頭生物合成可以產(chǎn)生具有改善的發(fā)育能力的雌性生殖細(xì)胞。此固醇降低機(jī)制在相反性別方面已經(jīng)引導(dǎo)出雄性生殖細(xì)胞也將得益于建立在受精前的固醇抑制作用上的方案。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知導(dǎo)致妊娠的性交時(shí)間選擇在不同物種間變化。因此本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物生產(chǎn)后代有困難的情形，例如雌性哺乳動(dòng)物在超過一天的無防護(hù)性交，例如2天、3天、4天、5天、10天、15天、20天、30天、1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、15年、20年或多于60年的無防護(hù)性交后不能夠?qū)崿F(xiàn)妊娠的情形。
上文所述的無防護(hù)性交的時(shí)間選擇已知與哺乳動(dòng)物規(guī)律地為受孕目的進(jìn)行性交的時(shí)期有關(guān)。
由于本發(fā)明公開了新的和令人驚訝的抑制固醇從頭生物合成可以改善哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞成熟的觀察結(jié)果，本發(fā)明也涉及無不育之苦但僅希望獲得更高的受孕機(jī)會從而加速受孕的哺乳動(dòng)物，特別是年齡從28到42歲的人類女性，其受孕水平隨年齡成比例下降。本發(fā)明也涉及可以受益于該治療獲得雙胞胎或三胞胎的人類女性。一般而言，本方法涉及可受益于此從而每次妊娠生產(chǎn)胎兒的數(shù)目提高的家畜及其它經(jīng)濟(jì)上有價(jià)值的哺乳動(dòng)物。
不育的病灶當(dāng)然不僅僅只基于雌性。在本發(fā)明中，對雌性生殖細(xì)胞成熟的影響推測也可以反映在雄性生殖細(xì)胞上。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子中的固醇從頭合成，由此提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力和/或哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目的方法，該方法包括在射精前0小時(shí)-12天向雄性施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物，例如射精前0小時(shí)-11天、0小時(shí)-10天、0小時(shí)-9天、0小時(shí)-8天、0小時(shí)-7天、0小時(shí)-6天、0小時(shí)-5天、0小時(shí)-4天、0小時(shí)-3天、0小時(shí)-2天以及0小時(shí)-24小時(shí)。術(shù)語射精在本上下文中涉及從雄性輸精管的任何精液釋放。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及在體外提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子的數(shù)目和發(fā)育能力，由此提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子的受精能力和/或所得受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力和/或哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目的方法，該方法包括向培養(yǎng)基中添加能夠抑制細(xì)胞中固醇從頭生物合成的物質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流，由此提高所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力的方法，所述方法包括向培養(yǎng)基中添加能夠促進(jìn)任何上述細(xì)胞或組織的固醇外流的化合物或化合物組合。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的目的在于提供各種細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含能夠通過提高固醇外流和/或抑制固醇從頭生物合成而降低磷脂/固醇比的多種不同化合物。因而在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含環(huán)糊精的細(xì)胞培養(yǎng)基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含抑制素的細(xì)胞培養(yǎng)基。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含抑制素和環(huán)糊精的細(xì)胞培養(yǎng)基。
存在多種商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基，其可以支持配子呼吸和/或成熟，并且也能夠培養(yǎng)哺乳動(dòng)物受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎，例如但不限于Ham′s F10、Menezo B2、Medi-Cult Universal IVF培養(yǎng)基、Dulbecco′s改良eagle培養(yǎng)基(DMEM)、McCoy氏5A、Waymouth′s培養(yǎng)基、TCM-199、MEM、RPMI-1640及Leibovitz L-15。
在本上下文中，體外培養(yǎng)基被定義為支持至少一個(gè)卵母細(xì)胞單獨(dú)地或者在其體細(xì)胞環(huán)境中和/或至少一個(gè)精子進(jìn)行呼吸和/或成熟的介質(zhì)，所述介質(zhì)可以包括支持體外受精(IVF)方案和/或支持配子體外存活及成熟的細(xì)胞培養(yǎng)基。可以為可能用于體外受精(IVF)方案和/或支持配子存活及成熟的培養(yǎng)基建立多個(gè)參數(shù)以限定所述培養(yǎng)基。首要地，進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)的pH、摩爾滲透壓濃度以及緩沖空氣的內(nèi)容具有高度重要性。因而，在本上下文中，體外培養(yǎng)基優(yōu)選具有240到320mOsm/l之間的摩爾滲透壓濃度、7到7.8的pH、并在3-7％CO2的大氣或者53-7％CO2、1-5％O2和88-96％N2下由CO2緩沖。
200到370mOsm/l之間的摩爾滲透壓濃度可以更具體地涉及例如250到310mOsm/l、260到300mOsm/l、270到290mOsm/l、275到285mOsm/l、276到284mOsm/l、277到283mOsm/l、278到282mOsm/l或279到281mOsm/l的水平。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，摩爾滲透壓濃度為大約280mOsm/l。
在本上下文中，7到7.8之間的pH可以更具體地涉及例如7.1到7.7、7.2到7.6、7.3到7.5、7.35到7.45、7.36到7.44、7.37到7.43、7.38到7.42例如7.39到7.41的pH水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為大約7.4。
并不旨在限制本發(fā)明的范圍，IVF-培養(yǎng)基的其它一般特征可以是所述培養(yǎng)基包含111到171mEq/l Na+、2.1到6.1mEq/l K+、96到146mEq/l Cl-、22.6到26.6mEq/l HCO3-、0.3到1.2mM Ca++、29到69mg/l磷、0.56到1.56g/l葡萄糖、0-50000IU/l青霉素、0-50000IU/l鏈霉素、0.1到10.0g/l白蛋白、0-75IU/l FSH、0-250IU/l LH和0-6g/l總蛋白。其它可能的添加劑包括胎牛血清、人血清例如母體血清、抗氧化劑例如生育酚和/或抗壞血酸、激素、Mg++、丙酮酸鹽、乳酸鹽、酚紅、嘌呤、嘧啶、氨基酸和膽固醇。通常，培養(yǎng)基在37℃(+/-1℃)培養(yǎng)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基涉及化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基。術(shù)語“化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基”用于指沒有生物學(xué)提取的血清物質(zhì)的培養(yǎng)基，且其中所有組分和其濃度是已知的且有描述。如果需要向培養(yǎng)基中添加激素或血清來源物質(zhì)，優(yōu)選重組激素或血清來源物質(zhì)。在替代的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有通過重組方法獲得的BSA或HSA，從而消除了與哺乳動(dòng)物血清間的接觸。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，未成熟人類配子在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而不添加血清直接來源的產(chǎn)品或患者自身的血清或任何其它直接來源于哺乳動(dòng)物(例如人類或牛)的血清產(chǎn)品。
生長因子例如但不限于促性腺激素目前用于IVM治療中。因而，上文描述的任何培養(yǎng)基的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)一步涉及還包含至少一種生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述生長因子選自促性腺激素(FSH，LH，CG)、IGF、EGF、胰島素、生長激素、白介素或其它肽。
本發(fā)明的方法將優(yōu)選起始于未成熟或未完全成熟的雌配子。在女性中，未成熟卵母細(xì)胞可作為具有緊密卵丘物質(zhì)、無極體或可見生發(fā)泡的卵母細(xì)胞而被識別。這些卵母細(xì)胞容易被參與常規(guī)IVF-治療的人員識別為未成熟卵母細(xì)胞，因而一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使從原始卵泡階段到竇前階段獲得的未成熟卵母細(xì)胞成熟的方法，包括在如上文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟卵母細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向體外培養(yǎng)基中施加抑制素的量取決于特定的抑制素，并且為0.01-1000μM、0.05-1000μM、0.1-1000μM、0.5-1000μM、1-1000μM、5-1000μM、10-1000μM、20-1000μM、25-1000μM、30-1000μM、50-1000μM、75-1000μM、100-1000μM、200-1000μM、300-1000μM、400-1000μM、500-1000μM、750-1000μM或者10-900μM之間、25-750μM、50-500μM、100-400μM、200-300μM、0.01-20μM、0.01-15μM、0.05-15μM、0.1-10μM或1-10μM。
可以通過如下方式優(yōu)化根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行的至少一個(gè)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，以抑制固醇從頭生物合成和/或促進(jìn)固醇外流和/或降低游離固醇與磷脂之間的比率在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)單獨(dú)的或處于其體細(xì)胞環(huán)境中的至少一個(gè)卵母細(xì)胞1秒至15天，例如1秒到14天，1秒到13天，1秒到12天、1秒到10天、1秒到9天、1秒到8天、1秒到7天、1秒到6天、1秒到5天、1秒到4天、1秒到3天、1秒到2天、1秒到1天、1秒到23小時(shí)、1秒到22小時(shí)、1秒到21小時(shí)、1秒到21小時(shí)、1秒到20小時(shí)、1秒到19小時(shí)、1秒到18小時(shí)、1秒到15小時(shí)、1秒到12小時(shí)、1秒到11小時(shí)、1秒到10小時(shí)，例如1秒到5小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明的方法在體外培養(yǎng)基中進(jìn)行的精子培養(yǎng)可以通過在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)精子1秒到8天，例如1秒到7天、1秒到6天、1秒到6天、1秒到4天、1秒到3天、1秒到2天、1秒到1天、1秒到23小時(shí)、1秒到22小時(shí)、1秒到21小時(shí)、1秒到21小時(shí)、1秒到20小時(shí)、1秒到19小時(shí)、1秒到18小時(shí)、1秒到15小時(shí)、1秒到12小時(shí)、1秒到11小時(shí)、1秒到10小時(shí)，例如1秒到5小時(shí)而優(yōu)化，以抑制固醇從頭生物合成和/或促進(jìn)固醇外流。
IVF治療一般包括對需要治療的雌性哺乳動(dòng)物實(shí)施激素治療。雖然激素治療確實(shí)具有許多副作用，但它仍然是當(dāng)今不育最有效的治療方法之一。不育夫婦的標(biāo)準(zhǔn)IVF治療通常包括用外源激素治療后從女性收集成熟卵樣本。此方案通常意味著女性用促性腺激素釋放素激動(dòng)劑或拮抗劑處理，它們均導(dǎo)致垂體釋放促性腺激素的程度實(shí)質(zhì)性地下降。隨后由肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射提供外源促性腺激素，它確保許多卵母細(xì)胞生長并成熟。此類治療后面的理論在于女性循環(huán)促性腺激素的確切量可任意調(diào)控，結(jié)果是優(yōu)化隨后可用于受精的卵母細(xì)胞數(shù)目，并且在任何情況下該數(shù)目將超過未治療(自發(fā)循環(huán))女性中準(zhǔn)備受精的卵母細(xì)胞數(shù)目(通常僅一個(gè))。在普通方案中，該治療包括在施用的促性腺激素引發(fā)卵子從卵巢釋放到輸卵管之前通過抽吸從女性獲取卵母細(xì)胞。
與促性腺激素或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知用于IVF治療的其它激素聯(lián)合施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物，這種累加的且可能地協(xié)同的效應(yīng)是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。
在雌性哺乳動(dòng)物中，能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的體內(nèi)治療聯(lián)合外源促性腺激素、促性腺激素釋放激素(gnrh)或gnrh激動(dòng)劑和/或拮抗劑的體內(nèi)治療，提供了累積/協(xié)同效應(yīng)，與標(biāo)準(zhǔn)IVF治療相比，提高了準(zhǔn)備體內(nèi)或體外受精的成熟卵子的數(shù)目，和/或總數(shù)卵子中受精的卵子的數(shù)目，和/或受精的卵子中胚泡的數(shù)目，和/或發(fā)育胚泡中植入胚泡的數(shù)目，和/或每個(gè)生殖周期中遞送的子代的數(shù)目。
并且，在激素刺激的抽吸前階段向女性施用固醇從頭生物合成抑制劑和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物將可能導(dǎo)致節(jié)省用于獲得一定數(shù)目的成熟卵母細(xì)胞、受精的卵子、胚泡、植入和/或隨后的妊娠的外源促性腺激素的量。此激素節(jié)省方案將成為可替代單獨(dú)利用外源激素的一種副作用降低且費(fèi)用降低的替代方案，并且這構(gòu)成了本發(fā)明的又一個(gè)重要范圍。在不期望的副作用中有卵巢過刺激綜合癥(OHSS)和多囊卵巢綜合癥(PCO)。在體內(nèi)刺激卵巢期間利用抑制素作為助劑將導(dǎo)致體內(nèi)所用的促性腺激素劑量的減少和隨后這些副作用發(fā)生率的降低。
在本上下文中，術(shù)語“促性腺激素釋放激素”或“gnrh”涉及由下丘腦產(chǎn)生的刺激垂體或其它器官或組織釋放促性腺激素的內(nèi)源哺乳動(dòng)物肽激素。該類激素的其它名稱包括促黃體生成激素釋放因子和黃體生成激素釋放激素。
在本上下文中，術(shù)語“促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑”涉及刺激哺乳動(dòng)物垂體或別處的促性腺激素釋放激素受體產(chǎn)生第二信使的任何物質(zhì)，所述第二信使正常地參與gnrh-受體與gnrh結(jié)合和促性腺激素生成和/或促性腺激素從垂體或別處的釋放之間的信號傳導(dǎo)。
在本上下文中，術(shù)語“促性腺激素釋放激素拮抗劑”涉及抑制gnrh與gnrh-受體結(jié)合和/或抑制正常地參與gnrh-結(jié)合的信號傳導(dǎo)，從而阻礙攜帶gnrh-受體的細(xì)胞在與gnrh接觸后產(chǎn)生和/或釋放促性腺激素的任何物質(zhì)。
標(biāo)準(zhǔn)IVF治療包括雄性通過手淫或電刺激射精遞送精液樣品。在獲得用于IVF治療的精液樣品前施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的協(xié)同作用同樣是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。在雄性哺乳動(dòng)物中，能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的體內(nèi)聯(lián)合治療，提供了累積協(xié)同效應(yīng)，與標(biāo)準(zhǔn)IVF治療相比，提高了準(zhǔn)備體內(nèi)或體外受精的成熟精子的數(shù)目，和/或總數(shù)卵子中受精的卵子的數(shù)目，和/或受精的卵子中胚泡的數(shù)目，和/或發(fā)育胚泡中植入胚泡的數(shù)目，和/或每個(gè)生殖周期中遞送的子代的數(shù)目。
IVF治療的概念也包括在從雄性或雌性收回生殖細(xì)胞后，在許多精子與至少一個(gè)卵母細(xì)胞混合的適當(dāng)條件下培養(yǎng)這些生殖細(xì)胞。本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是利用固醇從頭生物合成抑制劑和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物在混合精子和卵子前添加到溫育卵子和/或精子的培養(yǎng)基中以及添加到溫育精子和卵子的培養(yǎng)基中，以便獲得受精的卵子。此類添加將導(dǎo)致與標(biāo)準(zhǔn)IVF治療相比，提高準(zhǔn)備體內(nèi)或體外受精的成熟卵子的數(shù)目，和/或總數(shù)卵子中受精的卵子的數(shù)目，和/或受精的卵子中胚泡的數(shù)目，和/或發(fā)育胚泡中植入胚泡的數(shù)目，和/或每個(gè)生殖周期中遞送的后代的數(shù)目。
應(yīng)當(dāng)理解上文討論的有關(guān)根據(jù)本發(fā)明的方法的任何特征和/或方面適用于根據(jù)本發(fā)明的類似用途。


圖1哺乳動(dòng)物雌性和雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的二分圖。雄性和雌性生殖細(xì)胞發(fā)育的一個(gè)主要區(qū)別由靜息階段顯示。雄性生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂階段前靜息，而卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂階段(前期)靜息。靜息階段是胚胎發(fā)育或出生后生命早期與青春期之間的階段，其中生殖細(xì)胞是不分裂的。雄性和雌性生殖細(xì)胞發(fā)育的另一個(gè)主要區(qū)別表現(xiàn)為雄性生殖細(xì)胞群通過干細(xì)胞有絲分裂而更新，這與雌性生殖細(xì)胞群數(shù)目固定相反。
圖2哺乳動(dòng)物從頭固醇前和固醇生物合成路徑。固醇前生物合成根本上起始于乙酸與輔酶A縮合形成乙酰-輔酶A。乙酰-輔酶A在多酶促步驟中加工，可以導(dǎo)致產(chǎn)生角鯊烯。角鯊烯通過兩個(gè)酶轉(zhuǎn)化成羊毛甾醇，它是固醇生物合成途徑的基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的固醇生物合成至少包括所示的7個(gè)酶，但可能與此平行還包括許多具有相似催化特征的酶。酶以斜體在灰色背景中標(biāo)出，而固醇中間物以普通字母表示，上標(biāo)指示相關(guān)C-C雙鍵和非膽固醇甲基取代基。雙向箭頭表示酶促步驟是可逆的。24-烯(左手圖)與側(cè)鏈飽和固醇(右手圖)之間的虛線箭頭表示固醇Δ24還原酶可能具有多種固醇底物。
圖3固醇前生物合成路徑的分支。上圖2所示的固醇代謝僅僅是HMG-CoA-還原酶介導(dǎo)的甲羥戊酸生成的許多可能的結(jié)果之一。代謝物之間的兩個(gè)箭頭表示多步酶促轉(zhuǎn)化。
圖4環(huán)戊烷多氫菲環(huán)結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)、碳編號及環(huán)命名。C-編號依據(jù)IUPAC約定。
圖5促性腺激素刺激的青春期前雌性小鼠在用Mevacor處理后輸卵管中的2-細(xì)胞數(shù)目。平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差由誤差條表示。該圖代表5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)的平均值在右側(cè)顯示。
圖6在FSH和抑制素(美伐他汀)中培養(yǎng)后小鼠卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)的減數(shù)成熟率。GVBD代表在光學(xué)顯微鏡下無可見生發(fā)泡的卵母細(xì)胞，這表明卵母細(xì)胞重新開始減數(shù)分裂。PB/GVBD表示在培養(yǎng)期間重新開始減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞中極體形成的比率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行一式四份，并且每個(gè)實(shí)驗(yàn)代表30-40個(gè)COC。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。條上方不同的字母表示在95％置信度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
圖7圖6中所示的COC培養(yǎng)20小時(shí)后從乙酸進(jìn)入游離膽固醇中的3H的放射性跟蹤?？v軸上的DPM表示在由HPLC方法矯正計(jì)數(shù)效率和純化效率后通過閃爍探測器測量的放射性。N表示提取后用于通過HPLC分離膽固醇的COC的總數(shù)。
圖8和9與對照和FSH相比，用抑制素(美維諾林)體外成熟的卵母細(xì)胞的受精率。與存在7.5I.U./L FSH下培養(yǎng)的CEO和對照CEO相比，受精的卵母細(xì)胞(PB2-卵母細(xì)胞到4+細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)通過向CEO的IVM-培養(yǎng)基中添加抑制素美維諾林而提高。而且，(未顯示)美維諾林處理的卵母細(xì)胞在IVM培養(yǎng)期后相對于對照卵母細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的卵丘擴(kuò)展。FSH-處理的卵母細(xì)胞在這方面介于這兩組之間。退化程度在組間無差別。并且在胚胎培養(yǎng)72小時(shí)之后，與兩個(gè)對照組相比，美維諾林處理組中的發(fā)育到達(dá)更為前進(jìn)的狀態(tài)。
圖10用環(huán)糊精(羥丙基-β-環(huán)糊精)體外成熟的卵母細(xì)胞與對照相比的受精率。與對照NO相比，受精的卵母細(xì)胞(PB2-卵母細(xì)胞到4+細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)通過向NO的IVM-培養(yǎng)基中添加固醇結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)羥丙基-環(huán)糊精而提高。退化率不受IVM-培養(yǎng)基中環(huán)糊精存在的影響。
圖11
由本發(fā)明操縱的發(fā)育進(jìn)程的綜覽。本發(fā)明涉及體內(nèi)及體外的成熟和受精過程而不涉及任何胚胎發(fā)育。與固醇從頭生物合成抑制有關(guān)的概念對雄性和雌性都適用，而與使用固醇結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)有關(guān)的概念僅在雌性的成熟期間適用。
圖12本發(fā)明描述的體外發(fā)育過程的綜覽。
圖13硫酸化環(huán)糊精的通式。如果R＝CH2CH(OH)CH3，則該結(jié)構(gòu)代表下文實(shí)施例8中所用的羥丙基-β-環(huán)糊精。
實(shí)施例實(shí)施例1向雌性小鼠施用抑制素對受精后體內(nèi)2-細(xì)胞數(shù)目的影響青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)通過腹膜內(nèi)注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麥)被刺激超數(shù)排卵(0天上午11點(diǎn))。該促性腺激素制品就生物學(xué)活性而言含50％人類FSH和50％人類LH。半數(shù)小鼠通過將含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到5ml PBS中，并從0天起連續(xù)3天腹膜內(nèi)注射所得200μL漿液而額外接受1.6mg洛伐他汀注射。另一半(對照小鼠)注射類似體積的PBS。在第2天下午1點(diǎn)，向動(dòng)物給予排卵劑量的10IU hCG(Ferring，丹麥)。1小時(shí)后小鼠各自與相同株系和供應(yīng)商的成熟雄性小鼠(每只雌性1只雄性)一起獨(dú)立籠養(yǎng)。雌性和雄性小鼠在第3天上午9點(diǎn)分開，雌性再單獨(dú)留置48小時(shí)。在處死雌性小鼠和解剖輸卵管后，通過將玻璃吸量管放置在分離的輸卵管一端，并用嘴通過過濾器吹氣，將2-細(xì)胞沖到具有培養(yǎng)基的塑料盤中(見后面)。之后計(jì)數(shù)從每只小鼠沖出的2-細(xì)胞總數(shù)。所述2-細(xì)胞隨后在通用IVF-培養(yǎng)基(Medicult，丹麥)上于孵育器(37℃，95％空氣，5％CO2)中在4孔板(Nunclon 176740，Nunc，丹麥)上培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，利用顯微鏡對孔評分并確定桑椹胚、胚泡或退化實(shí)體的數(shù)目。
當(dāng)小鼠在卵泡期成熟期間用3×1.6mg抑制素處理時(shí)，每只動(dòng)物的2-細(xì)胞數(shù)目顯著升高(圖4)。這代表了膽固醇降低治療在生殖方面的主要結(jié)果與對照動(dòng)物相比，排出的和受精的卵母細(xì)胞數(shù)目升高。2-細(xì)胞在體外培養(yǎng)，并以和對照無區(qū)別的恢復(fù)速率發(fā)育成胚泡。
實(shí)施例2利用不同方案向雌性小鼠施用抑制素對受精后體內(nèi)2-細(xì)胞數(shù)目的影響青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)如實(shí)施例1中那樣處理，但有些許變化。在實(shí)驗(yàn)A中，抑制素劑量降至100μg/動(dòng)物，并在hCG-注射前15分鐘作為單次注射給予。在實(shí)驗(yàn)B中，抑制素劑量降至3×100μg/動(dòng)物，并如實(shí)施例1中那樣施用。在實(shí)驗(yàn)C中，抑制素劑量在9月齡小鼠的hCG-注射前15分鐘作為單次注射給予。在實(shí)驗(yàn)D中，促性腺激素劑量逐漸降低，而抑制素劑量如實(shí)施例中那樣施用。
整體而言，該實(shí)驗(yàn)表明抑制素劑量可以降至實(shí)施例1中所用劑量的十分之一。并且，與卵泡期階段較寬的時(shí)間窗口中的應(yīng)用不同，合適濃度的抑制素可在hCG的排卵刺激前作為單次注射給予。實(shí)驗(yàn)D證實(shí)了一個(gè)附加概念，即，降低的促性腺激素施用可部分地通過共施用抑制素補(bǔ)償。不過，在就這些方面作出結(jié)論之前，本實(shí)施例中的所有實(shí)驗(yàn)尚需要定量地具體化。
表2施用外源促性腺激素和抑制素(Mevacor)之后C57黑色×DBA 2 F1小鼠中的2-細(xì)胞數(shù)目實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物階段 GnrhhCG 抑制素治療 施用方案 交配動(dòng)物中的 交配 交配編號(I.U.) (I.U.)2-細(xì)胞數(shù)目 數(shù)目 頻率- 22.0±8.933/4A青春期前 1210 100μg Mevacor單次27.5±3.522/4排卵期1000μg Mevacor 單次15.3±7.344/4排卵期- 9.5±2.2 44/4B青春期前 1210 100μg Mevacor單次19.3±4.144/6排卵期3×100μg Mevacor 多次6.5±1.0 44/5卵泡期- 25.2±7.155/8C成熟周期 1510 1.0mg Mevacor 單次16.8±3.455/8排卵期12-123×1.0mg Mevacor 多次11.4±2.966/8卵泡期4 - 7.2±1.4 66/8D青春期前 4 5 3×1.0mg Mevacor 多次511/4卵泡期1.2 - 111/41.2 3×1.0mg Mevacor 多次 00/4卵泡期00/4實(shí)施例3刺激青春期前小鼠生殖腺后施用抑制素增強(qiáng)LH/hCG誘導(dǎo)的卵巢中游離膽固醇組織密度的下降青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)通過腹膜內(nèi)注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麥)被刺激超數(shù)排卵(0天上午11點(diǎn))。半數(shù)小鼠通過將含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到5ml PBS中，并從0天起連續(xù)3天腹膜內(nèi)注射所得200μL漿液而額外被給予1.6mg洛伐他汀注射(如實(shí)施例1中那樣)。另一半(對照小鼠)注射類似體積的PBS。在第2天下午1點(diǎn)，向動(dòng)物給予排卵劑量的10IU hCG(Ferring，丹麥)并于6小時(shí)后處死，制備卵巢提取物并進(jìn)行HPLC-分析。卵巢成對分離，稱重，凍干，再次稱重，且隨后在1.0ml(v/v)75％正庚烷∶25％異丙醇中提取。有機(jī)提取物在流動(dòng)相中重構(gòu)，進(jìn)行直相(straight-phase，SP)HPLC分離(ChromSpherSi，5μm，250×4.6mm HPLC柱，在(v/v)99.5％正庚烷(Fischer，Leicestershire，U.K.)∶0.5％異丙醇(Baker，NL)中以1.00ml/分跑樣)。洗脫物通過200-300nm之間的紫外光吸收檢測。在HPLC分析之前，含膽固醇、FF-MAS和孕酮(P4)的標(biāo)準(zhǔn)混合物跑樣三次，以確定標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)因子的穩(wěn)定性。膽固醇(Steraloids C6760)和P4(Sigma P-0130)標(biāo)準(zhǔn)品由商業(yè)上獲得，而所用的FF-MAS標(biāo)準(zhǔn)品如以前所述(Baltsen等，1999)在實(shí)驗(yàn)室中制備。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線在全部樣品值范圍內(nèi)是線性的。
表3用hCG和抑制素刺激的促性腺激素致敏的青春期前小鼠卵巢中的游離膽固醇(C)、卵泡液減數(shù)分裂激活固醇(FF-MAS)和孕酮(P4)。不同后綴字母(粗體)代表t-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
刺激組hCG+抑制素 hCG -N 13 66小鼠稱重(g) 14.6±0.2A 15.3±0.3A 14.6±0.3AN 5 53卵巢稱重(mg) 2.3±0.1A 2.2±0.2AB 1.9±0.1BC，卵巢(mg/g濕重) 2.2±0.1A 2.7±0.1B3.0±0.2BC，卵巢(mg/g干重) 10.5±0.6A§11.0±0.4A§12.1±0.5AC，肝臟(mg/g濕重) 1.7±0.1A#(未測)2.9±0.3BC，肝臟(mg/g干重) 6.5±0.5A#(未測)7.1±0.4AFF-MAS(μg/g濕重) 0.13±0.05A3.0±0.5B 0.76±0.66AP4(μg/g濕重) 14.9±0.9A 13.0±0.5A1.3±0.7B#)N＝3§)顯著性邊界線(P＝0.055，備擇假設(shè)″hCG+抑制素″＜″對照″)。顯著性邊界線(P＝0.061，備擇假設(shè)″hCG″＜″對照″)。
排卵前小鼠卵巢中游離膽固醇的組織密度下降。hCG刺激后卵巢中游離膽固醇組織密度的下降趨勢因抑制素處理而明顯。所述下降不能完全由產(chǎn)生類固醇的hCG激素的腫脹效應(yīng)解釋，因?yàn)楫?dāng)基于干組織重量評價(jià)時(shí)膽固醇組織密度也下降。施加HCG以模擬天然排卵前的LH高峰。重點(diǎn)指出的是孕酮(類固醇)產(chǎn)生的程度不受抑制素處理的影響。并且，應(yīng)當(dāng)注意抑制素完全阻斷LH/hCG誘導(dǎo)的膽固醇前代謝物FF-MAS的累積，并使卵巢中FF-MAS的水平低于未用hCG刺激的小鼠。而且，與對照和hCG刺激的小鼠卵巢的比較揭示就組織密度而言，膽固醇的絕對下降是FF-MAS升高的100倍以上。
實(shí)施例4HMG-CoA-還原酶抑制劑在體外刺激卵丘包圍的卵母細(xì)胞的成熟并在體外增強(qiáng)促性腺激素刺激的卵丘包圍的卵母細(xì)胞的成熟青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)如實(shí)施例1和2中那樣，通過腹膜內(nèi)注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麥)被刺激超數(shù)排卵(0天上午11點(diǎn))。46小時(shí)后，將卵巢浸泡在補(bǔ)充有4mM次黃嘌呤的培養(yǎng)基(α-MEM 22571-020，Gibco BRL，蘇格蘭)(見下文)中，通過用0.20mm的針穿刺卵巢中排卵前的卵泡，從卵巢收回來自排卵前卵泡的卵母細(xì)胞。通過制備性顯微鏡鑒定并隨后用裝有膜的開口吸量管吸取收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)，并在α-MEM中于孵育器(37℃，95％空氣∶5％CO2)中在4孔板(Nunc，丹麥)上培養(yǎng)。培養(yǎng)基補(bǔ)充有4mM次黃嘌呤(HX)(Sigma H-9377，Sigma-Aldrich，丹麥)、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L鏈霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)和3mg/ml BSA(SigmaA-7030，Sigma-Aldrich，丹麥)。所有溫育添加25mCi3H-乙酸鹽(NEN，U.S.A.)以便在溫育后通過閃爍測量膽固醇的從頭合成。添加50mM處于DMSO(所有設(shè)置(包括對照)中培養(yǎng)基DMSO終濃度為1％v/v)中的抑制素美伐他汀(Sigma，Sigma-Aldrich，丹麥)，并添加7.5IU/L終濃度的重組人類卵泡刺激激素(Gonal-F，Serono，DK)。培養(yǎng)22小時(shí)后，評價(jià)卵母細(xì)胞中生發(fā)泡(GV)的存在、生發(fā)泡的破裂(GVB)以及極體(PB)的存在。這3個(gè)狀態(tài)代表卵母細(xì)胞成熟的進(jìn)程。
膽固醇降低方案本身具有減數(shù)分裂成熟效果，此效果似乎可以累積到公知的FSH成熟效果上(圖4)。將四份平行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞匯合，并測量自乙酸代謝的3H的量，證實(shí)膽固醇的從頭生物合成確實(shí)通過添加抑制素而下降(圖5)。美伐他汀的效果顯著，而FSH在抑制膽固醇從頭生物合成方面的作用不太有效。該實(shí)驗(yàn)證明利用抑制素抑制膽固醇從頭生物合成增強(qiáng)由促性腺激素導(dǎo)致的體外天然成熟事件，且同時(shí)增強(qiáng)對膽固醇從頭合成的阻斷。
實(shí)施例5hCG在體外介導(dǎo)小鼠卵巢中膽固醇從頭生物合成的停止青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)如實(shí)施例1-4中那樣，通過腹膜內(nèi)注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麥)被刺激超數(shù)排卵(0天)。46小時(shí)后如實(shí)施例4中那樣分離卵巢并在0.25mCi3H-乙酸(NEN，U.S.A.)的存在下于α-MEM(Gibco BRL，蘇格蘭)中培養(yǎng)。培養(yǎng)物中添加0(對照)或5IU/ml hCG與0(對照)或20％FCS的組合。2個(gè)卵巢在1.0ml培養(yǎng)基中共同溫育。22小時(shí)后，終止培養(yǎng)，沖洗卵巢，并如實(shí)施例3所闡釋的那樣提取。提取的固醇用HPLC柱分離ChromSpherSi 250×4.6mm，5μm；流動(dòng)相99.65％正庚烷(Fisher，Leicester，U.K.)∶0.35％異丙醇(Baker，Deventer，NL)(vol.∶vol.))、再生90％正庚烷∶10％異丙醇。在直相樣品分析前，對含角鯊烯、4，4-二甲基固醇、7-脫氫膽固醇、鏈甾醇、膽固醇和P4的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)3次跑樣，以便對收集的時(shí)間窗口進(jìn)行制表。收集含角鯊烯的窗口1(2′50″-4′00″)、含4，4-二甲基固醇的窗口2(10′30″-14′00″)、含膽固醇和鏈甾醇的窗口3(25′00″-29′00″)、含5，7-烯的窗口4(29′30″-33′00″)和窗口5(含P4)，干燥并置于反相LiChrospher RP-8.5μm，250×4.6mm HPLC柱在(v/v)92.5％乙腈∶7.5％水中以1.00ml/分于40℃跑樣。分析物通過200-300nm之間的UV光吸收鑒定。角鯊烯(Merck S21362)、羊毛甾醇(Sigma L5768)、酵母甾醇(Steraloids C3200)、7-烯膽甾烷醇(Steraloids C7400)，7-脫氫膽固醇(Steraloids C3000)、羊毛甾醇(steraloids C7400)、7-脫氫膽固醇(steraloids C3000)、鏈甾醇(Steraloids C3150)、膽固醇(Steraloids C6760)和P4(Sigma P-0130)由商業(yè)上獲得，而FF-MAS和T-MAS標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)室制備。所有下文所列的分析物在反相分離中作為均質(zhì)單峰洗脫。收集峰，在閃爍瓶中與3.0ml閃爍液(Packard，NL)混合。在Beckman LS 1801液閃計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。針對計(jì)數(shù)效率和樣品注射校正CPM值。
表4存在3H乙酸時(shí)體外溫育小鼠卵巢后通過HPLC分離的分析物的閃爍數(shù)據(jù)分析物 對照/hCG P 對照/FCS P角鯊烯 80±9％0.099 136±20％0.139n.s.
羊毛甾醇22±7％0.000074331±98％0.065n.s.
FF-MAS 72±16％ 0.133 63±11％ 0.021**T-MAS 43±5％0.00005996±13％ 0.76n.s.
5，7-烯 35±4％0.000071161±33％0.142n.s.
鏈甾醇 58±7％0.0041 91±13％ 0.55n.s.
膽固醇 226±39％ 0.032*111±32％0.75n.s.
孕酮13±5％0.000085-n.c.***P值得自于6+6個(gè)樣品的成對檢驗(yàn)，假定對照值不等于測試值。*)添加hCG后下降。**)隨著FCS添加而增加。***)由于低閃爍數(shù)值而未比較。N.s.代表不顯著。
該實(shí)驗(yàn)證實(shí)在hCG處理后，小鼠卵巢中膽固醇從頭生物合成下降，而從頭產(chǎn)生的膽固醇前固醇的累積增加。并且，與孕酮(hCG/LH處理后卵巢中產(chǎn)生的主要類固醇)相關(guān)的放射活性量下降。這揭示當(dāng)卵巢被刺激排卵時(shí)，起源于從頭產(chǎn)生的膽固醇的底物總量下降。事實(shí)上，摻入到各種固醇級分中的放射活性量獨(dú)立于脂蛋白(FCS)的補(bǔ)充，這表明排卵刺激后卵巢中膽固醇降低的生物學(xué)機(jī)制不受通常的膽固醇穩(wěn)態(tài)機(jī)制的影響。
實(shí)施例6通過事先施用抑制素改變小鼠附睪游動(dòng)細(xì)胞級分中的膽固醇與磷脂比(C/PL-比)使用青春期后的C57黑色×DBA 2F1雄性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)。按每30g體重1.0mg洛伐他汀給予4只小鼠3次腹膜內(nèi)注射，具體為將含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到8ml PBS中，并將附睪精子收集日記作0天，于-6、-3和-1天下午1點(diǎn)腹膜內(nèi)注射所得200μL漿液。4只其它小鼠(對照小鼠)注射相似體積的PBS。在0天上午10點(diǎn)處死所有小鼠，并在生理鹽水中制備附睪。之后，將附睪轉(zhuǎn)移到含MEM(Gibco BRL，蘇格蘭)的1-mL培養(yǎng)孔中，其中MEM中補(bǔ)充有2.3mM丙酮酸、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L鏈霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)和0.2mg/ml BSA(Sigma A-7030，Sigma-Aldrich，丹麥)，然后將附睪置于孵育器(37℃，95％空氣∶5％CO2)中。
溫育1.5小時(shí)后，上層液相吸出，并轉(zhuǎn)移到新的玻璃瓶中并離心。離心后，棄上清，將沉淀凍干，之后由50％甲醇∶50％氯仿(vol./vol.)提取。隨后將提取物分成兩等份。一半如上文實(shí)施例中所指出的進(jìn)行固醇分析，并計(jì)算由膽固醇、鏈甾醇、膽甾-7，24-二烯-3β-醇、T-MAS和羊毛甾醇組成的總固醇含量。另一半根據(jù)Bartlett(Bartlett，1958)的方法進(jìn)行磷脂測定。計(jì)算每一個(gè)體動(dòng)物的C/PL-比。
認(rèn)為抑制素處理組中的C/PL-比率比對照組中的C/PL-比率低。
實(shí)施例7IVM期間施加抑制素提高IVF后小鼠卵丘包圍的卵母細(xì)胞(CEO)的受精率小鼠卵母細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例3中的描述分離并培養(yǎng)，但有一處變化，即IVM培養(yǎng)基還補(bǔ)充有1mg/mL胎球蛋白(Sigma F-3385，Sigma，U.S.A.)。將CEO分成3組，并在含添加了如下成分的培養(yǎng)基的板中培養(yǎng)1％(v/v)乙醇(對照)、濃度7.5IU/L的重組人類卵泡刺激激素(Gonal-F，Serono，DK)連同1％(v/v)乙醇(FSH)或10μM美伐他汀(美維諾林M2147，Sigma-Aldrich，丹麥)連同1％(v/v)乙醇(美維諾林)。為了在培養(yǎng)基中溶解美維諾林，乙醇是必需的。在體外成熟22小時(shí)后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到由極限必需培養(yǎng)基(MEM)(21090-022，Gibco BRL，蘇格蘭)、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)、20000IU/L鏈霉素(Gibco BRL，蘇格蘭)、3mg/ml BSA(Sigma A-7030，Sigma-Aldrich，丹麥)、2.3mM丙酮酸鈉(S-8636，Sigma)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA，Merck 1.08418.0250)和1mg/mL胎球蛋白(Sigma F-3385，Sigma，U.S.A.)組成的受精培養(yǎng)基中，在將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受精培養(yǎng)基之前，以下列方式獲得用于IVF的小鼠精子處死6-9月齡的C57黑色×DBA 2F1雄性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麥)，并在生理鹽水中制備附睪。之后，將附睪切成小塊，并將成塊的材料轉(zhuǎn)移到4個(gè)含800uL上文所述IVF-培養(yǎng)基的1-mL培養(yǎng)孔中，隨后置于孵育器(37℃，95％空氣∶5％CO2)中。溫育1.5小時(shí)后，4個(gè)孔之每一的300μL上層液相被吸出，并轉(zhuǎn)移到新的玻璃瓶中。所得的游動(dòng)精子庫在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)，并向每個(gè)卵母細(xì)胞培養(yǎng)物中添加50000個(gè)游動(dòng)精子細(xì)胞。IVF培養(yǎng)物在孵育器中于37℃，95％空氣∶5％CO2溫育20小時(shí)，之后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到在相同條件下平衡的新鮮IVF培養(yǎng)基中。使這些卵母細(xì)胞留置另外48小時(shí)，隨后根據(jù)卵母細(xì)胞的成熟狀態(tài)或者受精卵的進(jìn)程計(jì)數(shù)，所述進(jìn)程也就是GV-卵母細(xì)胞、GVBD-卵母細(xì)胞、PB-卵母細(xì)胞、PB2-卵母細(xì)胞(具有可見的第二極體的卵母細(xì)胞)、2-細(xì)胞、3-4細(xì)胞、4+細(xì)胞(具有多于4個(gè)分裂球的受精卵)以及退化細(xì)胞(通常是顆?；?，或者具有廣泛的質(zhì)膜皺折的細(xì)胞)。
實(shí)施例8IVM期間施加環(huán)糊精提高IVF后裸鼠卵母細(xì)胞(NO)的受精率小鼠卵母細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例？？所述分離并培養(yǎng)，將NO分成三組，并在含有添加了0‰、0.5‰、2.0‰或5‰羥丙基-環(huán)糊精(ICN 153540，ICNOhio，美國)的培養(yǎng)基的板中培養(yǎng)。IVM和IVF條件與實(shí)施例6中相同。
實(shí)施例9通過事先施用抑制素提高小鼠精子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)設(shè)置包括與實(shí)施例6中相同的動(dòng)物和抑制素施用。通過為評價(jià)受精潛力和精子質(zhì)量而建立的方法分析動(dòng)物。認(rèn)為與對照動(dòng)物相比，抑制素處理的動(dòng)物具有受精優(yōu)勢。
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權(quán)利要求
1.抑制哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞和/或至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子和/或以固醇支持生殖細(xì)胞的生殖腺來源細(xì)胞中固醇從頭生物合成，由此提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力，和/或提高具有受精能力的哺乳動(dòng)物配子的數(shù)目，導(dǎo)致交配后雌性每個(gè)生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目增加的方法，所述方法包括向需要此方法的哺乳動(dòng)物施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物或化合物組合。
2.提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流的方法，由此提高所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力的方法，所述方法包括向需要此方法的哺乳動(dòng)物施用能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中需要所述方法的哺乳動(dòng)物是雌性，并且抑制作用和/或外流發(fā)生在排卵前0-12天和/或排卵后0-3天的一段時(shí)期內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中需要所述方法的哺乳動(dòng)物是雄性，并且抑制發(fā)生在射精前0-12天的一段時(shí)期內(nèi)。
5.提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力和/或提高具有受精能力的哺乳動(dòng)物配子的數(shù)目，從而導(dǎo)致雌性每個(gè)生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目增加的方法，所述方法包括向支持至少一個(gè)卵母細(xì)胞和/或至少一個(gè)精子呼吸和/或成熟的體外培養(yǎng)基中添加能夠抑制所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎中固醇從頭生物合成的化合物或化合物組合。
6.提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢、卵母細(xì)胞、雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流，由此提高所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力的方法，所述方法包括向支持至少一個(gè)卵母細(xì)胞呼吸和/或成熟的體外培養(yǎng)基中添加能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3-5中任一項(xiàng)的方法，其中的化合物是拮抗一種或多種參與乙酰輔酶A和羊毛甾醇之間的生物合成路徑的哺乳動(dòng)物酶的物質(zhì)或物質(zhì)組合，所述酶為HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶、牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶、角鯊烯合成酶、角鯊烯單加氧酶、氧化鯊烯羊毛甾醇環(huán)化酶及羊毛甾醇合成酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、3-5和7中任一項(xiàng)的方法，其中的化合物是拮抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的物質(zhì)或物質(zhì)組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3-5和7-8中任一項(xiàng)的方法，其中的化合物是一種抑制素或多種抑制素的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、3-5和7-9中任一項(xiàng)的方法，其中的抑制素選自托伐他汀、西伐他汀、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(從前稱之為美維諾林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(從前稱之為美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氫美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氫美降脂L、美維諾林、3β-羥基美伐他汀酸單鈉鹽(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-3和6中任一項(xiàng)的方法，其中能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合選自環(huán)糊精、化學(xué)修飾的環(huán)糊精、高密度脂蛋白(HDL)、來自HDL的脫輔基蛋白以及固醇載體蛋白I和II。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-3、6和11中任一項(xiàng)的方法，其中的化合物是環(huán)糊精。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中抑制素和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的施用量為每天每kg體重0.01-100mg之間。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中向體外培養(yǎng)基中施用的抑制素和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的量為0.01-1000μM。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)1秒到15天。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、3-5、7-10和13-15中任一項(xiàng)的方法，其中精子在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)1秒到8天。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述施用和/或添加與促性腺激素的施用和/或添加聯(lián)合。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述施用和/或添加與哺乳動(dòng)物生長因子的施用和/或添加聯(lián)合。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中促性腺激素在體外的施用量為0-1000 IU/L之間。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中促性腺激素在體內(nèi)的施用量為每天每kg體重0-5 IU FSH和每天每kg體重0-200IU LH。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物選自人、馬、牛、大鼠、小鼠、豬、綿羊、山羊、駱駝、狗、貓和貂。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是以固醇支持生殖細(xì)胞的人類細(xì)胞或分離的生殖細(xì)胞。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是卵丘包圍的卵母細(xì)胞或分離的卵母細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求1、3-5、7-10和13-23中任一項(xiàng)的方法，其中生殖細(xì)胞是射出的精子。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是自大的竇狀卵泡收回的具有粘附的卵丘細(xì)胞的未成熟卵母細(xì)胞和/或分離的未成熟卵母細(xì)胞或者自竇前卵泡、小的或中等大小的竇狀卵泡收回的具有粘附的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞和/或未成熟卵母細(xì)胞，小的人類竇狀卵泡直徑0.4-＜5mm，中等大小的人類竇狀卵泡是5-＜15mm，而大的人類竇狀卵泡直徑在15mm或以上。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中生殖腺細(xì)胞是在培養(yǎng)來自原始卵泡期至竇前期間階段的至少一個(gè)未成熟卵泡之后獲得的未成熟或成熟的卵母細(xì)胞。
27.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含抑制素或抑制素組合。
28.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合，例如環(huán)糊精。
29.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含抑制素和環(huán)糊精。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含至少一種生長因子。
32.根據(jù)權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述生長因子選自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰島素、生長激素、白介素及其它肽因子。
33.使由原始卵泡期和竇前期之間階段獲得的未成熟卵母細(xì)胞成熟的方法，包括在根據(jù)權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的未成熟卵母細(xì)胞。
34.藥物組合物，其包含能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物與能夠提高固醇外流的化合物的組合以及藥學(xué)上可接受的載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述化合物是抑制素和環(huán)糊精。
36.根據(jù)權(quán)利要求34-35中任一項(xiàng)的藥物組合物，其進(jìn)一步包含生長因子。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述生長因子選自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰島素、生長激素、白介素及其它肽因子。
38.藥物組合物，其包含能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物與生長因子的組合。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述化合物為抑制素。
40.藥物組合物，其包含能夠促進(jìn)固醇外流的化合物與生長因子的組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述化合物為環(huán)糊精。
42.根據(jù)權(quán)利要求38或40的藥物組合物，其中所述生長因子選自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰島素、生長激素、白介素及其它肽因子。
43.能夠抑制哺乳動(dòng)物生殖腺和/或至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子和/或生殖腺來源細(xì)胞中的固醇從頭生物合成的化合物或化合物組合在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞和/或配子和/或以固醇支持生殖細(xì)胞的生殖腺來源細(xì)胞中的固醇從頭生物合成，由此提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力，和/或用于提高具有受精能力的哺乳動(dòng)物配子的數(shù)目，導(dǎo)致交配后雌性每個(gè)生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目增加。
44.能夠促進(jìn)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流的化合物或化合物組合在制備藥物中的用途，所述藥物用于促進(jìn)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流，由此提高所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44的用途，其中哺乳動(dòng)物是雌性的，并且抑制作用發(fā)生在排卵前0-12天和/或排卵后0-3天的一段時(shí)期內(nèi)。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中哺乳動(dòng)物是雄性的，并且抑制作用發(fā)生在射精前0-12天的一段時(shí)期內(nèi)。
47.能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物或化合物組合在制備支持至少一個(gè)卵母細(xì)胞和/或至少一個(gè)精子呼吸和/或成熟的體外培養(yǎng)基中的用途，所述培養(yǎng)基用于提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力，和/或用于提高具有受精能力的哺乳動(dòng)物配子的數(shù)目，導(dǎo)致雌性每個(gè)生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的數(shù)目增加。
48.能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合在制備支持至少一個(gè)卵母細(xì)胞呼吸和/或成熟的體外培養(yǎng)基中的用途，所述培養(yǎng)基用于提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢和/或哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物雌配子和/或卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的發(fā)育能力。
49.根據(jù)權(quán)利要求43和45-47中任一項(xiàng)的用途，其中的化合物是拮抗一種或多種參與乙酰輔酶A和羊毛甾醇之間的生物合成路徑的哺乳動(dòng)物酶的物質(zhì)或物質(zhì)組合，所述酶為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶、牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶、角鯊烯合成酶、角鯊烯單加氧酶、氧化鯊烯羊毛甾醇環(huán)化酶及羊毛甾醇合成酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求43、45-47和49中任一項(xiàng)的用途，其中的化合物是拮抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的物質(zhì)或物質(zhì)組合。
51.根據(jù)權(quán)利要求43、45-47和49-50中任一項(xiàng)的用途，其中的化合物是抑制素或抑制素組合。
52.根據(jù)權(quán)利要求43、45-47和49-51中任一項(xiàng)的用途，其中的抑制素選自托伐他汀、西伐他汀、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(從前稱之為美維諾林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(從前稱之為美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氫美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氫美降脂L、美維諾林、3β-羥基美伐他汀酸單鈉鹽(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
53.根據(jù)權(quán)利要求44-45和48中任一項(xiàng)的用途，其中能夠促進(jìn)固醇外流的化合物或化合物組合選自環(huán)糊精、化學(xué)修飾的環(huán)糊精、高密度脂蛋白(HDL)、來自HDL的脫輔基蛋白以及固醇載體蛋白I和II。
54.根據(jù)權(quán)利要求44-45、48和53中任一項(xiàng)的用途，其中的化合物是環(huán)糊精。
55.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中抑制素的施用量為每天每kg體重0.01-100mg之間。
56.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中向體外培養(yǎng)基中施用的抑制素和/或能夠促進(jìn)固醇外流的化合物的量為0.01-1000μM。
57.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中至少一個(gè)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)1秒到15天。
58.根據(jù)權(quán)利要求43、45-47、49-52和55-57中任一項(xiàng)的用途，其中精子在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)1秒到8天。
59.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述施用和/或添加與促性腺激素的施用和/或添加聯(lián)合。
60.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述施用和/或添加與哺乳動(dòng)物生長因子的施用和/或添加聯(lián)合。
61.根據(jù)權(quán)利要求59的用途，其中促性腺激素的體外施用量為0-1000IU/L。
62.根據(jù)權(quán)利要求59的用途，其中促性腺激素的體內(nèi)施用量為每天每kg體重0-5 IU FSH和每天每kg體重0-200IU LH。
63.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物選自人、馬、牛、大鼠、小鼠、豬、綿羊、山羊、駱駝、狗、貓和貂。
64.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是以固醇支持生殖細(xì)胞的人類細(xì)胞或分離的生殖細(xì)胞。
65.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是卵丘包圍的卵母細(xì)胞或分離的卵母細(xì)胞。
66.根據(jù)權(quán)利要求43、4547、49-52和55-65中任一項(xiàng)的用途，其中生殖細(xì)胞是射出的精子。
67.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中生殖細(xì)胞是卵母細(xì)胞。
68.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中生殖細(xì)胞是通過抽吸收回的未成熟卵母細(xì)胞或通過抽吸小的或中等大小的竇狀卵泡收回的未成熟卵母細(xì)胞。
69.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中生殖細(xì)胞是在培養(yǎng)處于原始卵泡期至竇前期的至少一個(gè)未成熟卵泡之后獲得的未成熟卵母細(xì)胞。
70.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物生殖腺細(xì)胞是自大的竇狀卵泡收回的具有粘附的卵丘細(xì)胞的未成熟卵母細(xì)胞和/或分離的未成熟卵母細(xì)胞，或者自竇前卵泡、小的或中等大小的竇狀卵泡收回的具有粘附的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞和/或未成熟卵母細(xì)胞，小的人類竇狀卵泡直徑0.4-＜5mm，中等大小的人類竇狀卵泡是5-＜15mm，而大的人類竇狀卵泡直徑在15mm或以上。
71.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中生殖腺細(xì)胞是在培養(yǎng)來自原始卵泡期至竇前期間階段的至少一個(gè)未成熟卵泡之后獲得的未成熟或成熟的卵母細(xì)胞。
全文摘要
本申請涉及通過施用能夠抑制固醇從頭生物合成的化合物并由此建立改善細(xì)胞發(fā)育和存活的細(xì)胞條件，提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞、配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的發(fā)育能力的方法。本發(fā)明也涉及在受精前提高至少一個(gè)哺乳動(dòng)物卵巢、卵母細(xì)胞、雌配子或者卵母細(xì)胞周圍的卵巢來源細(xì)胞的固醇外流的方法，該方法通過施用能夠促進(jìn)固醇外流的化合物并由此降低所述細(xì)胞的磷脂/固醇比來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號A61K31/225GK1620499SQ02828079
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者M·巴爾特森 申請人:哥本哈根大學(xué)醫(yī)院