專利名稱：β－淀粉樣蛋白結(jié)合因子及其抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合β-淀粉樣蛋白的VEGF多肽。本發(fā)明還涉及螯合β-淀粉樣蛋白的化合物。反過來說，本發(fā)明涉及螯合VEGF的化合物。因此，本發(fā)明還涉及篩選一種化合物的方法，該化合物可抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合。另外，本發(fā)明涉及診斷和治療阿爾茨海默氏病以及治療血管生成過多的方法。
b)相關(guān)技術(shù)阿爾茨海默氏病(AD)是老年人癡呆的最常見病因，它是臨床特征在于認(rèn)知能力進行性喪失的中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合病癥。AD的病理學(xué)特點是，細胞外老年斑，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，神經(jīng)元丟失，大腦淀粉樣蛋白血管病，以及腦部一些區(qū)域的腦血管變性(Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Yamada M.，Neuropathology 2000，20(1)8-22；YanknerBA，Neuron 1996，16(5)921-932)。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，由蛋白水解裂解淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生(Vassar等，Neuron 2000，27(3)419-422)。盡管積累的證據(jù)表明Aβ是AD的關(guān)鍵性致病劑(Calhoun等，Nature1998，395(6704)755-756；Hardy等，Science 1992，256(5054)184-185；Hsiao等，Science 1996，274(5284)99-102；Lewis等，Science 2001，293(5534)1487-1491；Schenk等，Nature 1999，400(6740)173-177；SommerB.，Curr Opin Pharmacol 2002，2(1)87-92；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)，但是AD中神經(jīng)元變性的確切機制尚不清楚。盡管如此，很可能多種因素與該疾病的形成相關(guān)。
AD的大多數(shù)病例伴隨著腦血管病變，例如腦淀粉樣蛋白血管病，內(nèi)皮變性，和血流灌注不足(de la Torre JC.Stroke2002，33(4)1152-1162；KalariaRN.Neurobiol Aging 2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology 1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817；Thomas等，Nature1996，380(6570)168-171)。已知與腦血管疾病和中風(fēng)相關(guān)聯(lián)的血管危險因素，例如高血壓，動脈粥樣硬化，糖尿病，和心臟病，明顯增加形成AD的危險。這些血管病中大多數(shù)引起通常在AD患者中出現(xiàn)的大腦局部缺血。這些觀察結(jié)果表明腦血管機能障礙可能在AD的神經(jīng)變性級聯(lián)中起重要作用。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是包括滲透性過高，內(nèi)皮細胞生長，和葡萄糖運輸增強的血管功能的主要調(diào)節(jié)劑。VEGF也在生理性血管形成和諸如腫瘤生長和局部缺血疾病等病理性新血管生成中起關(guān)鍵作用(Ferrara N.，Am JPhysiol Cell Physiol 2001，280(6)C1358-C1366；Harrigan等，Neurosurgery2002，50(3)589-598；Plate等，Nature 1992，359(6398)845-848；Shweiki等，Nature 1992，359(6398)843-845；Zhang等，J Cin Invest 2000，106(7)829-838)。在包括腦的各種器官中VEGF及其受體的表達與AD中出現(xiàn)的低氧或低血糖應(yīng)激反應(yīng)而上調(diào)(Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Marti等，Am J Pathol 2000，156(3)965-976；Stein等，Mol Cell Biol 1995，15(10)5363-5368)。
也有報道與老年對照相比，在AD患者的腦脊液中VEGF水平升高，且患有AD的受試者中，在血管周星形細胞和腦血管壁的周圍，VEGF免疫反應(yīng)增強(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，Neurobiol Aging 2002，23(2)237-243)。而且，由于AD相關(guān)性腦血管病變引起大腦局部缺血，VEGF在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中高度表達(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，NeurobiolAging 2002，23(2)237-243)。然而，在這些報道中，還沒有確定VEGF與Aβ的直接相互作用和共同定位。
最近，報道了VEGF對局部缺血和谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性(excitotoxic)損傷具有神經(jīng)營養(yǎng)以及神經(jīng)保護功能(Jin等，Proc Natl Acad Sci USA 2000，97(18)10242-10247；Matsuzaki等，F(xiàn)ASEB J2001，15(7)1218-122P；Ogunshola等，J Biol Chem 2002，277(13)11410-11415；Oosthuyse等，Nature Genet 2001，28(2)131-138；Schratzberger等，Nature Med 2000，6(4)405-413；Sondell等，J Neurosci 1999，19(14)5731-5740)。這些研究提出了這樣的可能性，即VEGF可能涉及與AD相關(guān)的血管和神經(jīng)元病理學(xué)。本申請描述了在患有AD的患者腦中VEGF與Aβ斑的過度積累和共同定位。體外實驗表明VEGF與Aβ以高親和性結(jié)合且與Aβ共聚集。一旦結(jié)合，VEGF以非常緩慢的速度從復(fù)合物中釋放。
本領(lǐng)域仍然需要提供更精確和敏感的分子方法用于檢測存在的B-淀粉樣蛋白形成和聚集，以便可在早期檢測和治療諸如阿爾茨海默氏病等神經(jīng)疾病。另外，本領(lǐng)域仍然需要可抑制VEGF與Aβ結(jié)合的化合物以便釋放VEGF用于在腦中發(fā)揮其神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)活性。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了上述問題的解決方案。本發(fā)明基于這樣的驚人發(fā)現(xiàn)，即VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白特異性結(jié)合。闡明了可互相結(jié)合的VEGF和β-淀粉樣蛋白的具體片段。且由于VEGF與β-淀粉樣蛋白斑共同積累，因此本發(fā)明涉及通過使用標(biāo)記的VEGF多肽或特異性結(jié)合VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的抗體測定聚集的β-淀粉樣蛋白或斑的存在。因此，本發(fā)明涉及診斷阿爾茨海默氏病或特征在于存在淀粉樣蛋白斑的任何其它疾病的方法。
本發(fā)明還涉及根據(jù)VEGF多肽設(shè)計的，可結(jié)合并吸收自由流動的B-淀粉樣蛋白，從而導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白不能聚集的多肽。反過來，在另一實施方案中，本發(fā)明涉及基于β-淀粉樣蛋白序列設(shè)計的，用于螯合并失活VEGF的多肽，其中該多肽有利于從環(huán)境中去掉VEGF，以治療或預(yù)防由過度的血管生成引起的疾病，例如癌癥，動脈粥樣硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，子宮內(nèi)膜異位，腎病或肥胖，及其它疾病。
具體地說，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合肝素和β-淀粉樣蛋白的β-淀粉樣蛋白結(jié)合多肽(β-ABP)，其中該多肽不是SEQ ID NO5。該多肽可與SEQ ID NO3具有至少85％的序列相同性，與SEQ ID NO3具有至少90％，95％，或至少97％的序列相同性。具體地說，該多肽以SEQ ID NO3表示，且可從N-末端或C-末端增加或減少大約5個氨基酸。而且，該多肽可與β-淀粉樣蛋白上的一個區(qū)域特異性結(jié)合，該區(qū)域從SEQ ID NO4的大約位置25的Gly殘基到大約位置35的Met殘基。
該多肽對β-淀粉樣蛋白的結(jié)合親和性以解離常數(shù)表示為大約10nM，1nM或100pM。
本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合上述多肽的抗體。該抗體可以是對上述多肽特異性的單克隆抗體。
本發(fā)明涉及編碼上述多肽的分離核酸。另外，本發(fā)明涉及含有該核酸的表達載體。此外，本發(fā)明涉及含有該表達載體的宿主細胞。
本發(fā)明還涉及預(yù)防β-淀粉樣蛋白與內(nèi)源性VEGF之間結(jié)合的方法，包括(a)產(chǎn)生含有與啟動子可操作地連接的編碼VEGF多肽的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；和(b)給需要的患者施用該病毒或質(zhì)粒載體，以便所述DNA序列在腦內(nèi)的表達導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白和VEGF多肽之間結(jié)合。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及在血管生成過多的區(qū)域滅活內(nèi)源性VEGF的方法，包括(a)產(chǎn)生含有與啟動子可操作地連接的編碼β-淀粉樣蛋白多肽的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；和(b)給需要的患者施用該病毒或質(zhì)粒載體，以便所述DNA序列在血管生成過多的位點的表達導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白和內(nèi)源性VEGF之間結(jié)合。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及測定VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合的方法，包含(a)給懷疑含有β-淀粉樣蛋白的樣品提供VEGF；和(b)如果樣品中存在β-淀粉樣蛋白，則檢測VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合。
在該方法中，該多肽可與聚集前的(pre-aggregated)β-淀粉樣蛋白結(jié)合。另外，該多肽可與細胞外斑(plaque)結(jié)合。另外，在該方法中，該多肽是VEGF的肝素結(jié)合區(qū)。此外，該多肽實質(zhì)上是肝素結(jié)合區(qū)的C-末端半分子。
本發(fā)明的另一實施方案涉及診斷由存在淀粉樣蛋白斑指示的疾病的方法，包括(a)提供懷疑含有淀粉樣蛋白斑的樣品組織；(b)將所述的樣品組織與能夠特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白的VEGF多肽接觸；和(c)檢測所述多肽與所述淀粉樣蛋白斑的結(jié)合，其中結(jié)合指示為患病狀態(tài)。
在該方法中，VEGF多肽可以是β-淀粉樣結(jié)合多肽(β-ABP)。另外，可標(biāo)記該多肽。此外，在上述方法的步驟(c)中，所述的檢測通過檢測特異性結(jié)合所述VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白，或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物之一的配體實現(xiàn)，其中標(biāo)記了所述的配體。
本發(fā)明還涉及診斷試劑盒，包括(a)一種容器，包含特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白的VEGF多肽；(b)與所述VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白，或多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物特異性結(jié)合的第一配體；(c)與所述第一配體特異性結(jié)合的標(biāo)記的第二配體；和(d)其使用說明。
本發(fā)明涉及預(yù)防VEGF與β-淀粉樣蛋白之間結(jié)合的方法，包括提供抑制VEGF和β-淀粉樣蛋白之間的相互作用的化合物。在該方法中，給患有由淀粉樣蛋白斑形成指示的疾病的哺乳動物提供該化合物。該化合物可以是包含具有酚或硫酸取代基的糖主鏈的單體或多聚體。另外，該化合物可以是兒茶素或兒茶素酚化合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及篩選抑制VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的化合物的方法，包括(a)將化合物與含有VEGF和β-淀粉樣蛋白的樣品接觸；(b)在VEGF與β-淀粉樣蛋白正常情況下特異性互相結(jié)合的條件下測定VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合水平；(c)在存在所述化合物的條件下測定VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合水平；并比較(a)和(b)部分中所述的VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合水平，其中如果(c)中所述水平比(b)的低，則所述的化合物是VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的抑制劑。
本發(fā)明還涉及治療阿爾茨海默氏病的方法，包括給需要的人施用治療有效量的抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白之間結(jié)合的化合物。
本發(fā)明還涉及含有β-淀粉樣蛋白多肽的分離的分子，它能結(jié)合VEGF以形成無功能的復(fù)合物，它包含(a)含有包含與VEGF結(jié)合的β-淀粉樣蛋白多肽的氨基酸序列的第一多肽組分；和(b)多聚化組分。
本發(fā)明涉及形成VEGF的無功能復(fù)合物的方法，包括將懷疑含有VEGF的樣品與上述分子接觸。
本發(fā)明涉及含有VEGF多肽的分離的分子，它能夠結(jié)合β-淀粉樣蛋白以形成無功能復(fù)合物，且包含(a)含有包含與β-淀粉樣蛋白多肽結(jié)合的VEGF多肽的氨基酸序列的第一多肽組分；和(b)多聚化組分。
另外，本發(fā)明涉及形成β-淀粉樣蛋白的無功能復(fù)合物的方法，包括將懷疑含有β-淀粉樣蛋白的樣品與上述分子接觸。
從本發(fā)明下面的描述，參照其附圖和所附的權(quán)利要求書將能更充分地理解本發(fā)明的這些及其它主題。


從本文下面給出的詳細描述，和僅以例證的方式給出且因此不限制本發(fā)明的附圖將能更充分地理解本發(fā)明，且其中圖1A-1G顯示了患有AD的人受試者大腦皮層中Aβ和VEGF的共同定位。AD患者(70歲，男性，Braak stage VI，A，B)和老年正常受試者(85歲，男性，C，D)的腦切片用VEGF抗體(A，C)和剛果紅(B，D)染色。箭頭表示嗜剛果紅斑。另一AD患者的腦切片(80歲，男性，Braak stage VI)用Aβ抗體(E)和VEGF抗體(F)進行雙重免疫染色，并重疊其圖像(G)。箭頭表示的位點也用剛果紅染色(數(shù)據(jù)未顯示)。注意VEGF的濃染色區(qū)以及兩者之間的匹配模式。放大率400x。顯示了來自老年正常受試者(n＝4)和AD患者(n＝7)的代表性數(shù)據(jù)。
圖2A-2C顯示了VEGF與Aβs的特異性結(jié)合。A和B，已知的Aβ-結(jié)合蛋白和VEGF與固定在CM5感應(yīng)芯片上的Aβ肽相互作用的胞質(zhì)團(Plasmon)共振分析。RU，共振單位。A，已知的Aβ-結(jié)合蛋白和VEGF與Aβ肽的結(jié)合。α2M，α2-巨球蛋白；α1ACT，α1-抗胰凝乳蛋白酶；SAP，血清淀粉樣蛋白P成份；ApoE4，載脂蛋白E4。B，應(yīng)用于固定化Aβ1-40上的各種濃度的VEGF的感應(yīng)圖(Sensorgrams)。用Aβ1-42獲得了相似的結(jié)合感應(yīng)圖(數(shù)據(jù)未顯示)。C，未標(biāo)記的VEGF抑制125I-VEGF結(jié)合固定的Aβ1-40。用固定的Aβ1-42獲得了相似的抑制模式(數(shù)據(jù)未顯示)。所有值表示為平均值±SEM。
圖3A-3C顯示了VEGF與Aβ的共聚集。A，VEGF與Aβ1-40共聚集而不與Aβ40-1共聚集。離心后在沉淀中出現(xiàn)大約相同比例的輸入Aβ1-40和標(biāo)記VEGF。*，P＝0.0076。B，VEGF對Aβ的聚集速率無影響。顯示了溫育單獨的Aβ1-40(■，實線)以及溫育Aβ1-40與VEGF(▲，虛線)在不同溫育時間點后的可沉積Aβ。C，VEGF與聚集前的，而不是新溶解的Aβ1-40有效共沉淀。結(jié)果表明VEGF與聚集前的Aβ結(jié)合。**，P＜0.0001。所有值都表示為平均值±SEM。
圖4A-4B顯示了從Aβ/VEGF共聚集體緩慢釋放VEGF。A，VEGF從Aβ/VEGF共聚集體中緩慢解離。插圖，注意3天后從共聚集體中釋放不超過1.5％的VEGF。所有值都表示為平均值±SEM。B，Aβ/VEGF復(fù)合物對SDS處理敏感。顯示了在非還原條件下對A中獲得的沉淀進行SDS-PAGE后的放射自顯影圖。泳道1單獨的125I-VEGF。泳道2Aβ/125I-VEGF復(fù)合物。左側(cè)的數(shù)字表示分子量大小標(biāo)記的位置。注意與單獨的VEGF相比在Aβ/VEGF復(fù)合物中無增加的帶。
圖5顯示了Aβ主要與VEGF的肝素結(jié)合區(qū)的C-末端(29-55氨基酸)區(qū)結(jié)合。Aβ與肝素結(jié)合區(qū)的C-末端亞區(qū)結(jié)合，而不與肝素結(jié)合區(qū)的N-末端半分子結(jié)合。所有值都表示為平均值±SEM。GST-HBD與GST融合的完整肝素結(jié)合區(qū)，GST-NHBD與GST融合的肝素結(jié)合區(qū)的N-末端半分子(氨基酸1-29)；GST-CHBD與GST融合的肝素結(jié)合區(qū)的C-末端半分子(氨基酸29-55)。
圖6顯示了VEGF與Aβ的殘基25-35結(jié)合。在試驗的各種部分Aβ片段中，Aβ25-35與Aβ競爭結(jié)合固定的VEGFl65。該結(jié)果表明Aβ25-35很可能是VEGF的結(jié)合位點。
圖7顯示了肝素抑制Aβ與VEGF的結(jié)合。GST-肝素結(jié)合區(qū)固定在微量滴定孔上并測定在不含或存在肝素的條件下生物素標(biāo)記的Aβ1-42的結(jié)合。隨著肝素濃度增加，生物素標(biāo)記的Aβ與肝素結(jié)合區(qū)的結(jié)合受到抑制。IC50≅25ng/ml.]]>圖8顯示了Aβ與VEGF的結(jié)合受到黃棓酰單寧(PGG)，表兒茶素沒食子酸鹽(EGCG)和鞣酸的抑制。將VEGF165(50ng/孔)覆蓋在塑料孔上且在濃度遞增的PGG，EGCG或鞣酸存在下加入生物素標(biāo)記的Aβ(100ng/ml)。與VEGF165結(jié)合的經(jīng)生物素標(biāo)記的Aβ，通過與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白的相互作用來檢測。
優(yōu)選實施方案詳述在本申請中，“一”和“一個”用于指單個和多個對象。
本文使用的“大約”或“基本上”通常為防止被局限于確切的數(shù)字提供了余地。例如，在多肽序列長度背景中使用的“大約”或“基本上”表示該多肽不局限于列舉的氨基酸數(shù)目?？砂ㄔ贜-末端或C-末端添加或減去幾個氨基酸，只要其仍具有諸如結(jié)合活性等功能活性。
本文使用的一種或多種其它治療劑的“組合”給藥包括同時(并行)和以任何順序連續(xù)的給藥。
本文使用的“氨基酸”和“多個氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。該定義意味著包括正亮氨酸，鳥氨酸，和高半胱氨酸。
一般來說，本文使用的術(shù)語“氨基酸序列變異體"是指與參照(例如，天然序列)多肽相比在其氨基酸序列中具有一些差異的分子。氨基酸變更可以是在天然氨基酸序列中的取代，插入，缺失或這些改變的任何所需組合。
取代變異體是去掉了天然序列中至少一個氨基酸殘基且在相同位置插入一個不同的氨基酸代替的變異體。該取代可以是只取代了分子中的一個氨基酸的單一取代，或者可以是在相同分子中取代了兩個或多個氨基酸的多重取代。
序列內(nèi)的氨基酸取代可選自該氨基酸所屬類型中的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括表現(xiàn)出相同或相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或其片段或衍生物和在翻譯期間或之后通過例如，糖基化，蛋白水解裂解，與抗體分子或其它細胞配體連接等方式差別修飾的衍生物。
插入變異體是在天然氨基酸序列中緊靠特定位置的氨基酸插入了一個或多個氨基酸的變異體。緊靠一個氨基酸意思是與該氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團之一連接。
缺失變異體是指去掉了天然氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的變異體。一般來說，缺失變異體在該分子的特定區(qū)域缺失了一個或兩個氨基酸。
在一個方面，本發(fā)明的多肽變異體可在多肽的非-β-淀粉樣蛋白結(jié)合區(qū)或非-VEGF結(jié)合區(qū)含有任意數(shù)目的氨基酸或氨基酸變更，包括在該多肽分子的任何其它區(qū)域的取代和/或插入和/或缺失，只要該多肽變異體包含與SEQ IDNO3或SEQ ID NO4表示的多肽序列具有至少大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列，且存在該變異不會妨礙VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白和β-淀粉樣蛋白多肽與VEGF的特異性結(jié)合。
本文使用的“β-淀粉樣蛋白結(jié)合多肽”或“β-ABP”是指特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白且與SEQ ID NO3表示的多肽序列具有至少大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同性的多肽。具體地說，β-ABP結(jié)合β-淀粉樣蛋白從大約殘基25開始到大約殘基35的區(qū)域。另外，β-ABP可在N-末端或C-末端的任一端從SEQ ID NO3的核心多肽增加或減少大約0到10個氨基酸，大約0到5個氨基酸，或者從0到4個，或者從0到3個，或者從0到2個，或者從0到1個氨基酸。
本文使用的“β-淀粉樣蛋白多肽”是指從β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的多肽，但不限于來自β-淀粉樣蛋白的具體序列。應(yīng)理解可容忍各種突變和保守氨基酸改變，以及一些非保守氨基酸改變，只要該多肽能結(jié)合VEGF即可。片段和一些糖基化也是允許的，事實上對β-淀粉樣蛋白多肽的幾乎任何改變都是允許的，只要該多肽保留了結(jié)合VEGF的能力。
申請人首次發(fā)現(xiàn)了β-淀粉樣蛋白與VEGF結(jié)合，因此，對該序列作出一些改變，且保留與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的能力在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。具體地說，當(dāng)用于捕獲結(jié)構(gòu)以便與VEGF形成無功能復(fù)合物時，可使用各種β-淀粉樣蛋白序列，包括與SEQ ID NO4所示的多肽具有大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列相同性的分子。另外，該多肽可以是全長1-40或1-42氨基酸的β-淀粉樣蛋白或者可包括諸如區(qū)域25-35等片段。
本文使用的術(shù)語“在高度嚴(yán)格條件下能夠雜交”是指在高度嚴(yán)格條件下與目的DNA互補的DNA鏈退火。同樣，“在低度嚴(yán)格條件下能夠雜交”是指在低度嚴(yán)格條件下與目的DNA互補的DNA鏈退火。用于退火過程的“高度嚴(yán)格條件”可包括，例如，不利于錯配堿基對之間的氫鍵連接的高溫和/或低鹽含量?！暗投葒?yán)格條件”可包括比高度嚴(yán)格條件更低的溫度，和/或更高的鹽濃度。該條件允許在兩條鏈之間存在基本互補性，盡管不是幾乎完全互補時兩條DNA鏈可退火，例如在編碼同一蛋白質(zhì)但是由于遺傳密碼的簡并性在序列上有區(qū)別的DNA鏈之間的情況。例如，在大約45℃的6xSSC中促進DNA雜交，接著在50℃的2x SSC中洗滌的合適的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的或者可參見Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，6.31-6.3.6。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可選自從50℃下大約2x SSC的低度嚴(yán)格條件到50℃下大約0.2xSSC的高度嚴(yán)格條件。另外，洗滌步驟中的溫度可從室溫，大約22℃的低度嚴(yán)格條件增加到大約75℃的高度嚴(yán)格條件。其它嚴(yán)格性參數(shù)在Maniatis，T.，等，Molecular CloningALaboratory Manual，冷泉港實驗室出版社，Cold Spring N，Y.，(1982)，第387-389頁中描述；也參見Sambrook J.等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，第2卷，冷泉港實驗室出版社，Cold Spring，N.Y.，第8.46-8.47頁(1989)。
本文使用的“載體”包括藥用上可接受的載體，賦形劑，或者在所用劑量和濃度下對與其接觸的細胞或哺乳動物無毒性的穩(wěn)定劑。通常藥用上可接受的載體是含水pH緩沖溶液。藥用上可接受的載體的例子包括，但不限于諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽，和其它有機酸等緩沖液；抗氧化劑(包括抗壞血酸)；低分子量(不超過大約10個殘基)的多肽；諸如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖，二糖，以及其它糖類(包括葡萄糖，甘露糖，或糊精)；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；和/或諸如TWEEN，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS等非離子表面活性劑。
本文使用的“共價衍生物”包括用有機蛋白或非蛋白衍生化試劑修飾天然多肽或其片段，和翻譯后修飾。通過周能與選定側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機衍生化試劑與靶氨基酸殘基反應(yīng)，或者通過在選定重組宿主細胞中進行的翻譯后修飾的加工機制按常規(guī)可導(dǎo)入共價修飾。一些翻譯后修飾由重組宿主細胞對表達多肽的作用引起。谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢ǔＴ诜g后脫酰胺成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。另外，這些殘基在適度酸性條件下脫酰胺基。在本發(fā)明的B-淀粉樣蛋白或VEGF結(jié)合多肽中可能存在這些殘基的任一形式。其它翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰，酪氨酸或蘇氨酰殘基的羥基磷酸化，賴氨酸，精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁(1983))。
本文使用的“有效量”是指足以實現(xiàn)有益的或所需的臨床或生化結(jié)果的量。有效量可一次或多次給藥。為了本發(fā)明的目的，抑制劑化合物的有效量是指足以減輕，改善，穩(wěn)定，逆轉(zhuǎn)，減緩或延遲該疾病狀態(tài)進行的量。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，“有效量”定義為能夠防止VEGF與β-淀粉樣蛋白或淀粉樣蛋白斑結(jié)合的化合物的量。在另一實施方案中，“有效量”定義為VEGF的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護有效量。在另一實施方案中，“有效量”可以是結(jié)合和螯合自由流動的未聚集的β-淀粉樣蛋白使其不能反應(yīng)的VEGF多肽的量。在本發(fā)明的另一實施方案中，“有效量”可指在需要防止或減少血管生成的情況下足以結(jié)合和螯合VEGF并使其在進一步的反應(yīng)中失活的β-淀粉樣蛋白多肽的量。
本文使用的“片段”是指保留了可用的和有功能的特征的多肽的一部分。例如，在本發(fā)明說明書中使用的多肽片段具有結(jié)合β-淀粉樣蛋白，聚集前的β-淀粉樣蛋白，或含有β-淀粉樣蛋白的斑塊的功能。另外，β-淀粉樣蛋白的片段可與VEGF結(jié)合。
本文使用的“GFP”是指綠色熒光蛋白。
本文使用的“GST”是指谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶。
本文使用的“宿主細胞”包括可以是或者已成為本發(fā)明載體的受體的單個細胞或細胞培養(yǎng)物。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，且該后代由于天然，偶然，或故意突變和/或改變可不必與原始親代細胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上或在總DNA成份上)。宿主細胞包括用含有編碼血管生成因子的多核苷酸的載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染或感染的細胞。
本文使用的“免疫組織化學(xué)”是指測量各種組織中特定蛋白質(zhì)水平的方法。
本文使用的“免疫沉淀”是指定量測量蛋白質(zhì)表達水平和定性多肽間相互作用的生物學(xué)方法。
本文使用的“抑制劑”是指抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的分子。
本文使用的“配體”是指與諸如多肽等分子共價或瞬時特異性結(jié)合的任何分子或試劑，或者化合物。在一些上下文中使用的配體可包括抗體。在另一上下文中，“配體”可指在諸如配體捕獲中尋找被另一分子以高親和性結(jié)合的分子。
本文使用的用于治療目的的“哺乳動物”是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人類，家畜和農(nóng)場動物，和動物園，運動場，或?qū)櫸飫游?，例如狗，貓，牛，馬，綿羊，豬，等等。優(yōu)選地，該哺乳動物是人。
本文使用的“midkine”是指主要在胎兒中出現(xiàn)表達的結(jié)合肝素的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子。
本文使用的“純化的”或“分離的”分子是指從其天然環(huán)境中取出的和分離或分開的且不含與其天然相聯(lián)的其它成份的生物學(xué)分子。
本文使用的“樣品”或“生物學(xué)樣品”是指其最廣義，且包括根據(jù)需要進行的試驗類型從可能含有β-淀粉樣蛋白或VEGF的個體，體液，細胞系，組織培養(yǎng)物，或其它來源獲得的任何生物學(xué)樣品。因此，生物學(xué)樣品包括體液，例如精液，淋巴，血清，血漿，尿，滑液，脊髓液等等。從哺乳動物獲得組織活檢標(biāo)本和體液的方法是本領(lǐng)域熟知的。腦組織的活檢標(biāo)本是優(yōu)選的來源。
在該生物學(xué)樣品中，也可通過成像在體內(nèi)檢測該多肽。用于蛋白質(zhì)的體內(nèi)成像的標(biāo)記包括通過X-射線照相術(shù)，NMR或ESR檢測的那些標(biāo)記。對于X-射線照相術(shù)，合適的標(biāo)記包括諸如鋇或銫等放射性同位素，它們發(fā)出可檢測的射線但對受試者無明顯傷害。NMR和ESR的合適標(biāo)記包括諸如氘等具有可檢測的特征性自旋的那些標(biāo)記，可使用常規(guī)技術(shù)通過標(biāo)記將它們摻入多肽中。
另外，從患者獲得的“生物學(xué)樣品”可稱為“生物學(xué)樣品”或“患者樣品”?？梢岳斫猓治觥盎颊邩悠贰辈槐厝〕龌颊叩募毎蚪M織。例如，可給受試者注射合適標(biāo)記的多肽(例如，結(jié)合β-淀粉樣蛋白的抗體或多肽，例如VEGF多肽，VEGF的肝素結(jié)合區(qū)或β-ABP)并使用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)(例如，CAT，NMR，EPR，PET等)觀察(當(dāng)與靶結(jié)合時)。
本文使用的“序列相同性”定義為在對位排列該序列并按需要導(dǎo)入間隔以達到最大序列相同性百分?jǐn)?shù)，且任何保守取代都不作為序列相同性部分后與天然多肽序列中氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基百分?jǐn)?shù)。％序列相同性值通過NCBI BLAST2.0軟件按Altschul等，(1997)，“Gapped BLASTand PSI-BLASTa new generation of protein database search programs”，NucleicAcids Res.，253389-3402的限定產(chǎn)生。除了錯配扣分設(shè)定為-1外，參數(shù)都設(shè)定為默認(rèn)值。
本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指兩個分子之間的非隨機結(jié)合結(jié)合反應(yīng)，例如，與抗原免疫反應(yīng)的抗體分子之間，或與諸如β-淀粉樣蛋白等另一多肽反應(yīng)的非抗體配體。另外，該特異性結(jié)合也可在化學(xué)化合物或小肽與VEGF之間發(fā)生。
本文使用的“受試者”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。
本文使用的“治療”是獲得有益的或所需的臨床效果的方案。為了本發(fā)明的目的，有益的或所需的臨床效果包括，但不限于，癥狀減輕，疾病程度減輕，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即，不惡化)，疾病進展延遲或減緩，疾病狀態(tài)的改善或減輕，和緩解(無論部分或總體)，而不論該效果是可檢測的還是不能檢測的?！爸委煛币部芍概c不接受治療時預(yù)期的存活期相比存活期延長?！爸委煛笔侵钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性措施。需要治療的情況包括已患有疾病的情況以及需要預(yù)防該疾病的情況?！皽p輕”疾病是指與無治療的情況相比，疾病狀態(tài)的程度和/或不希望的臨床表現(xiàn)減輕和/或該疾病進行的時間過程減緩或延長。
本文使用的“載體”，“多核苷酸載體”，“構(gòu)建體”和“多核苷酸構(gòu)建體”在本文中可互換使用。本發(fā)明的多核苷酸載體可以是一些形式中的任一種，包括，但不限于，RNA，DNA，包入逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼中的RNA，包入腺病毒衣殼中的DNA，在另一病毒或病毒樣形式(例如，單純皰疹病毒，和腺伴隨病毒(AAV))中包裝的DNA，包入脂質(zhì)體中的DNA，與聚賴氨酸復(fù)合的，與合成聚陽離子分子復(fù)合的，與諸如聚乙二醇(PEG)等化合物復(fù)合以便在免疫學(xué)上“屏蔽”該分子和/或延長半壽期的，或者與非病毒蛋白質(zhì)偶聯(lián)的DNA。優(yōu)選地，該多核苷酸是DNA。本文使用的“DNA”不僅包括堿基A，T，C，和G，而且包括其任一類似物或這些堿基的修飾形式，例如甲基化核苷酸，核苷酸間修飾，例如不帶電荷的連接和thioates，使用糖類似物，和修飾的和/或選擇的主鏈結(jié)構(gòu)，例如聚酰胺。
本文使用的“VEGF多肽”是指來自于VEGF的多肽，但不限于來自VEGF的具體序列。應(yīng)理解可容忍各種突變和保守氨基酸改變，以及一些非保守氨基酸改變，只要該多肽能與β-淀粉樣蛋白結(jié)合。片段和一些糖基化也是允許的，事實上幾乎對VEGF多肽的任何改變都是允許的，只要該多肽保留了結(jié)合β-淀粉樣蛋白的能力。在另一實施方案中該多肽也結(jié)合肝素。應(yīng)明白，申請人首次發(fā)現(xiàn)VEGF且特別是其肝素結(jié)合區(qū)與β-淀粉樣蛋白結(jié)合，因此對該序列進行一些突變而保留其與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的能力在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。VEGF多肽包括，但不限于，β-ABP。VEGF多肽還包括與SEQ ID NO1所示的多肽具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的序列相同性的多肽。
VEGF的β-淀粉樣蛋白結(jié)合區(qū)VEGF前體RNA進行各種任選的RNA剪接事件，導(dǎo)致產(chǎn)生4種成熟的同型二聚體蛋白，各單體分別具有121，165，189和206個氨基酸(分別為VEGF121，VEGF 165，VEGF189和VEGF206)(Leung等，Science 1989，2461306-1309；Tischer等，J.Biol.Chem.1991，26611947-11954；Houck等，Mol.Endocrinol.1991，5，1806-1814)。其中，VEGF165是最豐富的VEGF表達同種型。在各種同種型中，VEGF165，189和206在C-末端具有肝素結(jié)合區(qū)且與細胞表面和細胞外基質(zhì)中的肝素硫酸蛋白聚糖結(jié)合。VEGF121缺乏肝素結(jié)合區(qū)且不能結(jié)合硫酸肝素。VEGF的肝素結(jié)合區(qū)的作用似乎是將VEGF螯合到諸如內(nèi)皮細胞等靶細胞表面并提高VEGF與其細胞表面受體的結(jié)合親和力(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.1992，267，6093-6098)。事實上，VEGF165比VEGF121對其細胞表面受體具有更高的結(jié)合親和力。另外，VEGF165的生物活性比VEGF121高100倍(Keyt等，J.Biol.Chem.1996，2717788-7795)。
VEGF的受體結(jié)合區(qū)與血小板衍生的生長因子(PDGF)和與包括神經(jīng)生長因子(NGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)的生長因子家族在結(jié)構(gòu)上相關(guān)(Ferrara等，Endocrinol Rev.1992，13，18-32；Murray-Rust等，Structure 1993，1，153-159)。然而，我們發(fā)現(xiàn)在所測試的一些生長因子如NGF，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，PDGF..VEGF和midkine等(Yu等，Neurosci Lett 1998，254，125-128，對于midkine的描述)中，只有VEGF和midkine與Aβ結(jié)合。盡管似乎midkine與Aβ的結(jié)合可通過肝素結(jié)合區(qū)，但是VEGF(Fairbrother等，Structure 1998，6，637-648)和midkine(Iwasaki等，EMBO J 1997，16，6936-6947)的肝素結(jié)合區(qū)似乎互不相關(guān)，因為在其各自的肝素結(jié)合區(qū)之間只有4％的序列相同性。midkine的肝素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列如下ADCKYKFENW GACDGGTGTK VRQGTLKKAR YNAQCQETIRVTKPCTPKTK AKAKAKKGKG KD(SEQ ID NO5)。
VEGF的亞基通過兩個同型亞基的不對稱締合組裝成二聚體，VEGF165的兩個肝素結(jié)合區(qū)暴露且可被纖溶酶選擇性裂解，釋放55個氨基酸的C-末端肝素結(jié)合區(qū)和110個氨基酸的VEGF主體(Fairbrother等，Structure 1998，6，637-648)。
55個氨基酸的肝素結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)現(xiàn)已明確(Fairbrother等，Structure1998；6，637-648)，并提示下列殘基的帶正電荷的側(cè)鏈與肝素結(jié)合相關(guān)Arg13，Arg14，Lys15，Lys30，Arg35，Arg39和Arg46，且Lys52，Arg54和Arg55也可能有貢獻。還提示肝素多聚體中的己糖單位與肝素結(jié)合區(qū)的正電荷結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)55個氨基酸的肝素結(jié)合區(qū)分成N-末端(大約1-29個氨基酸)和C-末端(大約29-55個氨基酸)部分時，Aβ主要與C-末端半分子結(jié)合(圖5)。
VEGF165的氨基酸序列如下APMAEGGGQN HHEVVKFMDVYQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVPTEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDRARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO1)。VEGF165的肝素結(jié)合區(qū)具有下列序列ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO2)。VEGF165的肝素結(jié)合區(qū)的例證性C-末端半分子是SEQ ID NO2的殘基29-55CK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO3)。
對1-55(VEGF165的111-165區(qū))的肝素結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)分析揭示了肝素結(jié)合區(qū)的1-29 N-末端部分具有反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)(18-21，26-29)，且肝素結(jié)合區(qū)的29-55 C-末端部分具有與一個反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)(42-44，49-51)堆積在一起的一個短的α-螺旋(33-38)區(qū)。
在本發(fā)明的一個方面，與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的VEGF多肽與SEQ IDNO1具有大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本發(fā)明的另一方面，與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的VEGF多肽與SEQ ID NO2的多肽具有大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本發(fā)明的另一方面，與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的VEGF多肽與SEQ ID NO3具有大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本發(fā)明的另一實施方案中，VEGF多肽保留與肝素和β-淀粉樣蛋白都特異性結(jié)合，但不必同時結(jié)合的能力。多肽的長度可以是大約17至100個氨基酸長，大約17至70個氨基酸長，大約17至47個氨基酸長，大約20至45個氨基酸長，大約25至大約40個氨基酸長，大約22至32個氨基酸長，大約25至30個氨基酸長，或大約27至47個氨基酸長。
VEGF/β-淀粉樣蛋白的共積累在患有AD的患者大腦中VEGF與淀粉樣蛋白斑嚴(yán)重共積累和共定位。VEGF以高親和力和特異性直接與Aβ肽結(jié)合。相反，在年齡匹配的受試者皮層切片中很少檢測到VEGF。體外實驗表明VEGF以高親和力和特異性結(jié)合Aβs，但不能結(jié)合反向肽，即Aβ40-1。另外，Aβ與VEGF的結(jié)合不影響VEGF與表達neuropilin-1的內(nèi)皮和腫瘤細胞上受體的結(jié)合，也不影響VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖。相反，VEGF與Aβ1-40共聚集對Aβ的聚集率無明顯影響，且強烈結(jié)合聚集前的Aβ。VEGF從共聚集的Aβ/VEGF復(fù)合物中非常緩慢地釋放，但是Aβ/VEGF復(fù)合物對SDS處理敏感。
令人驚奇的是作為已知最有效的血管生成因子之一的VEGF直接與Aβ以高親和力結(jié)合，并在患有AD的患者大腦中嚴(yán)重積累且與Aβ斑共定位。我們的結(jié)果表明VEGF比已知結(jié)合Aβs的其它分子對Aβ1-42和Aβ1-40的結(jié)合強得多(Bohrmann等，J Biol Chem 1999，274(23)15990-15955；Hamazaki H.，J Biol Chem 1995，270(18)10392-10394；Hughes等，Proc Natl Acad Sci USA1998，95(6)3275-3280；Strittmatter等，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90(17)8098-8102)。在試驗的分子中VEGF是Aβ最強的結(jié)合配偶體(KD≈50pM)，且VEGF與Aβ之間的親和力比得上VEGF對其自身受體，即KDR/Flk-1和Flt-1的親和力(de Vries等，Science 1992，255(5047)989-991；Terman等，Biochem Biophys Res Commun 1992，187(3)1579-1586)。
在我們的研究中，Aβs不影響VEGF的細胞結(jié)合和促分裂活性，盡管它們與VEGF以高親和力結(jié)合。與正常老年受試者相比在AD患者大腦中VEGF與Aβ沉積物的嚴(yán)重積累和共定位可能是由于VEGF的高度表達，VEGF與Aβ的強烈相互作用和共聚集，和VEGF從這些復(fù)合物中釋放非常緩慢共同引起。這樣可引起VEGF與不溶性Aβ沉積物在AD患者大腦中持續(xù)積累和共定位。
不受理論的約束，預(yù)期在AD大腦中VEGF與Aβ斑的顯著積累與腦血管機能障礙相關(guān)。大多數(shù)AD病例伴隨著腦血管病，例如腦淀粉樣蛋白血管病和內(nèi)皮退化，表明血管機能障礙可能在AD的神經(jīng)變性級聯(lián)中起致病作用(de la Torre JC.Stroke 2002，33(4)1152-1162；Kalaria RN.Neurobiol Aging2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology 1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)。由于其腦血管病變，AD中腦細胞嚴(yán)重患有葡萄糖和氧的血流灌注不足。證據(jù)表明腦血流灌注不足是分散型和家族型AD早期的主要臨床特征之一，且局部缺血性中風(fēng)的病史和共存增加了AD的危險性(Kalaria RN.Neurobiol Aging 2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817)。
VEGF是血管功能的主要調(diào)節(jié)劑。VEGF是低氧癥和低血糖誘導(dǎo)的血管生成肽。另外，低氧癥誘導(dǎo)的VEGF及其受體可增強血管生成和腦血管灌注，且顯著改善腦局部缺血的神經(jīng)恢復(fù)(Harrigan等，Neurosurgery 2002，50(3)589-598；Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Zhang等，J Clin Invest 2000，106(7)829-838)。最近的研究表明VEGF具有其它活性，例如在低氧癥和葡萄糖缺乏狀況下的神經(jīng)營養(yǎng)功能以及對谷氨酸毒性和局部缺血性外周神經(jīng)病的神經(jīng)保護功能(Jin等，Proc Natl Acad SciUSA 2000，97(18)10242-10247；Matsuzaki等，F(xiàn)ASEB J 2001，15(7)1218-1220；Oosthuyse等，Nature Genet 2001，28(2)131-138；Schratzberger等，Nature Med 2000，6(4)405-413；Sondell等，J Neurosci 1999，19(14)5731-5740)，與AD的神經(jīng)元病變相關(guān)。
由于與老年匹配的對照相比在AD患者腦中VEGF的水平升高(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，NeurobiolAging 2002，23(2)237-243)，很可能在AD腦中誘導(dǎo)的VEGF可導(dǎo)致新血管生成增強以補償血流灌注不足的攻擊并通過其對神經(jīng)元細胞的直接神經(jīng)保護作用和其血管生成活性抑制局部缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。
然而，在AD患者中，我們的結(jié)果表明AD病程期間表達的大多數(shù)VEGF與Aβ沉積物結(jié)合而不周轉(zhuǎn)。該情況可能導(dǎo)致缺乏用于保護腦血管和神經(jīng)元抵抗與AD病理學(xué)相關(guān)的血流灌注不足所需的可溶性VEGF。還值得注意的是局部缺血觸發(fā)淀粉樣蛋白前體蛋白的積累和裂解成Aβ以及Aβ在大腦中的沉積(Bennett等，Neurobiol Aging 2000，21(2)207-214；Jendroska等，ActaNeuropathol(Berl)1995，90(5)461-466)。除了其在AD發(fā)病機理中推測的作用(Calhoun等，Nature 1998，395(6704)755-756；Hardy等，Science 1992，256(5054)184-185；Hsiao等，Science 1996，274(5284)99-102；Lewis等，Science 2001，293(5534)1487-1491；Schenk等，Nature 1999，400(6740)173-177；Sommer B.，Curr Opin Pharmacol 2002，2(1)87-92；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)外，Aβ可能充當(dāng)AD大腦中表達的VEGF的分子庫，通過封閉VEGF的血管生成和神經(jīng)保護活性而加重AD的進行。
β-淀粉樣蛋白的VEGF結(jié)合區(qū)Aβ1-42的序列是DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNRGAIIGLMVGGVV IA(SEQ ID NO4)。1-28區(qū)是具有高比例帶電殘基(46％)的親水區(qū)；具有交叉-β結(jié)構(gòu)且形成原纖維。29-42區(qū)是具有高比例β-分支氨基酸的充分疏水區(qū)。25-35區(qū)是其神經(jīng)毒性功能的生物活性結(jié)構(gòu)域。申請人發(fā)現(xiàn)VEGF與Aβ的25-35區(qū)結(jié)合(圖6)。
在本發(fā)明的一個方面，與VEGF結(jié)合的β-淀粉樣多肽與SEQ ID NO4具有大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本發(fā)明的另一方面，該多肽保留了與VEGF特異性結(jié)合的能力。可保留VEGF結(jié)合活性的β-淀粉樣多肽的長度可從大約10個變化到大約42個且可包括與其連接的其它序列。具體地說，β-淀粉樣多肽可從大約10個到大約40個氨基酸長，從大約10個到大約35個，從大約10個到大約30個，從大約10個到25個，從大約10個到20個，從大約10個到15個，或大約10個氨基酸長。在本發(fā)明的另一方面，該10個氨基酸的片段可以是SEQ ID NO4的殘基25至35。
在本發(fā)明的一個方面，β-淀粉樣多肽可用作捕獲劑以便在諸如血管生成過多，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，癌癥，動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，腎病和肥胖等中的不需要VEGF活性的區(qū)域固定VEGF。β-淀粉樣多肽可以是全長或更長或更短或變異體或衍生物，只要該多肽與SEQ ID NO4具有至少70％的序列相同性且保留了特異性結(jié)合VEGF的能力。
VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的抑制劑在一個實施方案中，本發(fā)明涉及篩選化合物的方法，例如抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的多肽或化合物。預(yù)期該抑制劑化合物可治療患有至少部分由β-淀粉樣蛋白沉積物與VEGF引起的疾病的病人。如果使用抑制劑，VEGF不能與β-淀粉樣蛋白沉積物堆積，因此，它能游離出來發(fā)揮正常功能并誘導(dǎo)對病變區(qū)的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用從而治療該疾病。
在這點上，在一個方面，本發(fā)明涉及能與VEGF相互作用以封閉VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的任何抑制劑分子。具體地說，該分子與VEGF的肝素結(jié)合區(qū)相互作用，且更具體地說，該分子與肝素結(jié)合區(qū)的C-末端一側(cè)相互作用。作為選擇，該分子可與β-淀粉樣蛋白結(jié)合從而破壞VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合。
一個這樣的抑制劑可以是這樣的VEGF多肽，即它保留了β-淀粉樣蛋白結(jié)合功能但與諸如受體結(jié)合活性或激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等等VEGF功能相關(guān)的一些或全部其它特征的水平缺乏或下降。該抑制劑VEGF多肽可包括肝素結(jié)合區(qū)。在另一實施方案中，該抑制劑VEGF多肽可以是β-ABP。
應(yīng)明白該抑制劑化合物可削弱VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白之間的相互作用，該削弱作用可通過諸如競爭性，非競爭性，或反競爭性抑制等任何生化或酶促抑制動力學(xué)進行，只要該化合物削弱了VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合。
因此，在一個具體方面，本發(fā)明涉及使用能夠抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白之間結(jié)合的任何多聚體或單體化合物。在一個具體實施方案中，該多聚體或單體具有糖主鏈。該糖主鏈單位可以是葡萄糖或蔗糖，或者是具有一個氧原子和其余是碳原子的六元環(huán)的任何基團。該主鏈可具有任何化學(xué)類型的取代基團。優(yōu)選地，該取代基團是苯酚或多元酚，例如可通過與沒食子酸反應(yīng)形成的多元酚。在該方面，鞣酸以及同時包含葡萄糖和多元酚基團的黃棓酰單寧(PGG)在本文中作為VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的抑制劑進行了例證。另外，可預(yù)期該抑制劑是兒茶素或兒茶素酚化合物，包括但不限于表兒茶素(EC)，表兒茶素沒食子酸鹽(ECG)，表兒茶素(EGC)，或表兒茶素沒食子酸鹽(EGCG)。參見Jung等，Int J Exp Path 2001，82309-316(以其整體引用以供參考)對于這些化合物及其活性的描述。
也應(yīng)明白可對糖主鏈作出一些不同的變異。因此，在本發(fā)明的一個具體實施方案中，模擬肝素或PGG的分子也在本發(fā)明的框架內(nèi)，只要這些模擬物和類似物能抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白之間的結(jié)合。在該方面，應(yīng)明白本發(fā)明包含肝素，PGG，EGCG，和鞣酸的類似物和模擬物。另外，該抑制劑可包括各種類型的糖胺聚糖鏈，例如透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素，硫酸角質(zhì)素，硫酸皮膚素等，它們可以是與肝素相關(guān)的分子。
一些肝素相關(guān)性分子可包括但不限于透明質(zhì)酸，其中D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺單位可重復(fù)多達大約50,000個單位；硫酸軟骨素，其中D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺單位可重復(fù)多達大約250,000個單位；硫酸皮膚素，其中L-艾杜糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺單位可重復(fù)多達大約250,000個單位，且至少一個羥基可被硫酸基團取代；肝素或硫酸乙酰肝素，其中D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸和N-乙?；蛘逳-硫代-D-葡萄糖胺單位可重復(fù)大約15至30個單位，其中在一些情況下，優(yōu)選用至少一個硫酸基團取代羥基基團；硫酸角質(zhì)素，其中D-半乳糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺單位可重復(fù)大約20至40次，其中至少一個羥基被硫酸基團取代。
在本發(fā)明的另一實施方案中，涉及包含VEGF/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的抑制劑的天然食品提取物或“功能性食品”。茶的兒茶素僅僅是這類抑制劑的一個例子。除了兒茶素外，作為功能性食品主要成分的其它多元酚包括，但不限于類黃酮，白藜蘆醇，和櫟皮黃酮。
肝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。
PGG的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。
EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。
鞣酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。
l+m+n＝0，1，2，3，4，5，6，7編碼與β-淀粉樣蛋白或VEGF結(jié)合的多肽的核酸用“分離的”多核苷酸序列試圖包含從其天然環(huán)境中分離的核酸分子，DNA或RNA。它包括編碼本發(fā)明的VEGF多肽或β-淀粉樣多肽的DNA片段，且還包含諸如載體序列或其它外源DNA等異源性序列。例如，為達到本發(fā)明的目的，載體中包含的重組DNA分子認(rèn)為是分離的，它可以是部分或基本上純化的。
另外，本發(fā)明的分離的核酸分子包括這樣的DNA分子，即它們包含由于遺傳密碼的簡并性或者其它變異體基本上不同于上述序列，但仍然編碼VEGF多肽或β-淀粉樣多肽及其肽的序列。因此，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言產(chǎn)生上述變異體以便例如，優(yōu)化對特定宿主的密碼子表達或一般性功能是常規(guī)技術(shù)。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有多核苷酸的分離的核酸分子，該多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下與上述本發(fā)明的核酸分子中的部分多核苷酸雜交。雜交多核苷酸用作上述的診斷探針和引物?？捎米魈结樅鸵锏呐c以SEQ IDNOS1-3舉例并描述的VEGF多肽編碼序列雜交的部分多核苷酸可由5′和3′堿基位置或由上述核苷酸堿基大小明確限定或者以相同的方式明確排除。同樣，與以SEQ ID NOS4舉例并描述的與β-淀粉樣多肽雜交的部分多核苷酸可用作探針和引物。本發(fā)明優(yōu)選的雜交多核苷酸是當(dāng)標(biāo)記并用于本領(lǐng)域已知的雜交試驗(例如，Southern和Northern印跡分析)時顯示出最大的信號強度的序列而不考慮以等摩爾量存在的其它異源性序列。
變異體和突變體多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼VEGF多肽或β-淀粉樣多肽的一部分，類似物或衍生物的核酸分子變異體。變異體可以是天然存在的，例如天然等位基因變異體?！暗任换蜃儺愺w”是指占據(jù)生物染色體給定基因座的一個基因的幾種選擇形式之一。非天然存在的變異體可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。
該核酸變異體包括通過核苷酸取代，缺失，或添加產(chǎn)生的變異體。取代，缺失，或添加可涉及一個或多個核苷酸。氨基酸序列的改變可產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是沉默取代，添加和缺失，它不改變本發(fā)明的多肽或其部分的特性和活性。在這點上還優(yōu)選保守取代。
本申請涉及編碼多肽的核酸分子，該多肽在分別保留特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白或VEGF的功能的條件下，與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的多肽至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。
本發(fā)明允許將該序列用于表達載體中，以及用于轉(zhuǎn)染宿主細胞和細胞系，不論是原核還是真核細胞。本發(fā)明還允許純化從該表達載體表達的多肽。該表達載體可含有便于純化的各種分子標(biāo)記。隨后可將獲得的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進選定的任何宿主細胞中。用本領(lǐng)域熟知的既定方法可分離宿主細胞的溶胞產(chǎn)物。含有GFP-或GST-的表達載體可用于定位宿主細胞中的VEGF多肽或β-淀粉樣多肽。該表達載體可含有誘導(dǎo)型或組成型啟動子。
變異體和突變體多肽為了改良或改變本發(fā)明的VEGF多肽或β-淀粉樣多肽的特征，可使用氨基酸工程學(xué)方法?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含單個或多個氨基酸取代，缺失，添加的新型突變多肽，或融合蛋白。該修飾的多肽表現(xiàn)出，例如增大/減小的活性或增大/減小的穩(wěn)定性。另外，它們與相應(yīng)的天然多肽相比至少在一些純化和貯存條件下純化出更高的產(chǎn)量和表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。
特別感興趣的是帶電荷的氨基酸被其它帶電荷或中性氨基酸取代，可產(chǎn)生具有非常需要的改良特性的蛋白質(zhì)，例如產(chǎn)生的多肽較少聚集。聚集不僅可降低活性，而且在制備藥用配制品時也成問題，因為聚集體可能具有免疫原性。
抗體在一個實施方案中，本發(fā)明涉及使用各種檢測方法檢測β-淀粉樣蛋白形成。一種檢測VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的方法是使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)使用的標(biāo)記和分離技術(shù)直接標(biāo)記VEGF多肽并測定其結(jié)合。其它方法包括使用可特異性結(jié)合VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的標(biāo)記配體。該配體可以是抗體。
可使用純化的VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。也可使用VEGF多肽的片段產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。隨后可使用獲得的單克隆或多克隆抗體測定各種樣品中VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合和VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的形成，該樣品包括細胞，組織，和體液，例如但不限于血清，血漿，和尿?？墒褂酶鞣N分子生物學(xué)方法測定VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物，該方法包括但不限于原位雜交，免疫沉淀，免疫熒光染色，Western印跡分析等。使用抗VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的單克隆抗體進行ELISA可測定腦組織中或包括相信具有所示疾病的人類受試者體液的身體其它部分中的β-淀粉樣蛋白的含量，其中在所述疾病中β-淀粉樣蛋白聚集和積累并形成淀粉樣蛋白斑。
本發(fā)明的抗體包括，但不限于，多克隆，單克隆，多特異性，人的，人源化或嵌合的抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab′)片段，通過Fab表達文庫產(chǎn)生的片段，抗獨特型(抗-Id)抗體(包括，例如抗本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)，和上述任一抗體的表位結(jié)合片段。本文使用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任一類型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，種類(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亞類。
本發(fā)明的抗體可具有單特異性，雙特異性，三特異性或更多特異性。多特異性抗體可以對本發(fā)明的一個多肽的不同表位具有特異性或者可以對本發(fā)明多肽以及對諸如異源多肽或固相支持物等異源表位具有特異性。
本發(fā)明的抗體可用它們所識別或特異性結(jié)合的本發(fā)明多肽的表位或部分進行描述或限定。表位或多肽部分按本文所述限定，例如通過N-末端和C-末端位置，通過連續(xù)氨基酸殘基的大小進行限定。
本發(fā)明的抗體可用于例如，但不限于，純化，檢測，和靶向本發(fā)明的多肽，包括體外和體內(nèi)診斷和治療方法。例如，該抗體可用于定性和定量測量生物學(xué)樣品中本發(fā)明的VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物水平的免疫測定中。
正如下面更詳細的討論，本發(fā)明的抗體可單獨或者與其它成份組合使用。該抗體可重組融合到異源性多肽的N-或C-末端或者與多肽或其它成份化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))。例如，本發(fā)明的抗體可與在檢測試驗中用作標(biāo)記的分子以及諸如異源多肽，藥物，放射性核素，或毒素等效應(yīng)器分子重組融合或偶聯(lián)。
本發(fā)明的抗體可通過本領(lǐng)域已知的任一合適的方法產(chǎn)生?？鼓康目乖亩嗫寺】贵w可通過本領(lǐng)域熟知的各種方法產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的多肽可給藥到各種宿主動物，包括但不限于兔，小鼠，大鼠等以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有抗原特異性的多克隆抗體的血清。根據(jù)宿主種類的不同可使用各種佐劑以增強免疫學(xué)反應(yīng)，該佐劑包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐劑，諸如氫氧化鋁等礦物膠體，諸如溶血卵磷脂等表面活性物質(zhì)，多聚醇，聚陰離子，肽，油狀乳劑，匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，二硝基酚，以及諸如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(corynebacterium parvum)等潛在有用的人佐劑。這樣的佐劑也是本領(lǐng)域熟知的。
可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備單克隆抗體，該技術(shù)包括使用雜交瘤，重組，和噬菌體展示技術(shù)，或其組合。例如，可使用包括本領(lǐng)域已知技術(shù)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”是指從包括任何真核，原核，或噬菌體克隆的單個克隆產(chǎn)生的抗體，而不論產(chǎn)生該抗體的方法。
使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特異性抗體的方法是本領(lǐng)域常規(guī)的和熟知的方法。在一個非限制性的例子中，可用VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物或表達該實體的細胞免疫小鼠。一旦檢測到免疫反應(yīng)，例如在小鼠血清中檢測到對該抗原特異性的抗體，可收獲小鼠脾臟并分離脾細胞。然后通過熟知的技術(shù)將脾細胞與任何合適的骨髓瘤細胞，例如可從ATCC得到的細胞系SP20的細胞融合。選擇雜交瘤并通過有限稀釋克隆。然后通過本領(lǐng)域已知的方法測定雜交瘤克隆中分泌抗體的細胞，該抗體能夠結(jié)合本發(fā)明的多肽或該多肽與其結(jié)合配偶體的復(fù)合物。通過用陽性雜交瘤克隆免疫小鼠可產(chǎn)生一般含有高水平抗體的腹水液。
抗體也可附著到固相支持物上，它對于靶抗原的免疫沉淀或純化特別有用。該固相支持物包括，但不限于，玻璃，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙稀或聚丙烯。
抗體結(jié)合試驗可用本領(lǐng)域已知的任何方法測定本發(fā)明的抗體的免疫特異性結(jié)合?？墒褂玫拿庖邷y定法包括但不限于競爭性和非競爭性試驗系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用的技術(shù)有例如Western印跡，放射免疫測定法，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)，“夾心”免疫測定法，免疫沉淀測定法，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴散沉淀素反應(yīng)，免疫擴散試驗，凝集試驗，補體結(jié)合試驗，免疫放射測定法，熒光免疫測定，蛋白質(zhì)A免疫測定法，列舉的只是少數(shù)。該測定法是本領(lǐng)域常規(guī)的和熟知的(參見，例如，Ausubel等，編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，本文引用其整體以供參考)。舉例性的免疫測定法在下文簡單描述但不打算用作限制。
免疫沉淀方案一般包含在諸如添加了蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％NP-40或TritonX-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01 M磷酸鈉，pH7.2，1％抑肽酶)等裂解緩沖液中裂解細胞群體，向細胞溶胞產(chǎn)物中加入目的抗體，在4℃下溫育一段時間(例如，1-4小時)，向細胞溶胞產(chǎn)物中加入蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G的瓊脂糖珠，在4℃下溫育大約1小時或更長時間，在裂解緩沖液中洗滌珠并將珠重懸于SDS/樣品緩沖液中。目的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可通過例如，Western印跡分析進行評估。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解可修改參數(shù)以增強抗體與抗原的結(jié)合和降低本底(例如，用瓊脂糖珠預(yù)澄清溶胞產(chǎn)物)。對于免疫沉淀方案的進一步討論參見，例如，Ausubel等，編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，見10.16.1節(jié)。
Western印跡分析一般包括制備蛋白質(zhì)樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如，根據(jù)抗原的分子量用8％-20％SDS-PAGE)中電泳蛋白質(zhì)樣品，從聚丙烯酰胺凝膠將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到諸如硝酸纖維素，PVDF或尼龍等膜上，在封閉溶液(例如，含3％BSA或脫脂奶粉的PBS)中封閉該膜，在洗滌緩沖液(例如，PBS-Tween 20)中洗滌膜，用在封閉緩沖液中稀釋的第一抗體(目的抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，用在封閉緩沖液中稀釋的與酶底物(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如，32P或125I)偶聯(lián)的第二抗體(可識別第一抗體，例如，抗人抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，并檢測存在的抗原。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解可修改參數(shù)以增強檢測的信號和降低本底噪聲。關(guān)于western印跡方案的進一步討論參見，例如，Ausubel等，編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，見10.8.1節(jié)。
ELISAs包括制備抗原，該抗原可包括含有VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白的樣品，用該抗原覆蓋96孔微量滴定板的孔，向孔中加入與諸如酶底物(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測化合物偶聯(lián)的目的抗體并溫育一段時間，檢測該抗原的存在。在ELISAs中，目的抗體不必與可檢測的化合物偶聯(lián)，相反，可向孔中加入與可檢測的化合物偶聯(lián)的第二抗體(可識別目的抗體)。另外，代替用抗原覆蓋孔，可用抗體覆蓋孔。在這種情況中，可在向覆蓋的孔中加入目的抗原的同時或者之后加入與可檢測的化合物偶聯(lián)的第二抗體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解可修改參數(shù)以增強檢測的信號以及作出本領(lǐng)域已知的對ELISAs的其它改變。關(guān)于ELISAs的進一步討論參見，例如，Ausubel等，編，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，見11.2.1節(jié)。
診斷試驗本發(fā)明還提供了檢測生物學(xué)樣品中存在β-淀粉樣蛋白的診斷方法。可直接(例如，通過使用與VEGF多肽或其片段反應(yīng)誘導(dǎo)的抗體測定多肽水平)或者間接(例如，通過測定對VEGF多肽或其片段具有特異性的抗體)進行該測定。
如果已經(jīng)作出了疾病狀態(tài)的診斷，通過測量患者中存在的β-淀粉樣蛋白/VEGF復(fù)合物的量或者根據(jù)表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白生產(chǎn)增強的患者相對于以較低水平產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白的患者具有更差的臨床結(jié)果可將本發(fā)明用于監(jiān)測該疾病狀態(tài)的進行或消退。
可使用本領(lǐng)域已知用于體內(nèi)掃描的方法在患者中檢測標(biāo)記分子的存在。這些方法依賴于所用的標(biāo)記類型。技術(shù)人員能夠確定檢測特定標(biāo)記的合適方法?？稍诒景l(fā)明的診斷方法中使用的方法和裝置包括，但不限于計算機體層攝影(CT)，諸如正電子發(fā)射體層攝影(PET)等整體掃描，磁共振成像(MRI)，和聲象圖檢查，以及電子順磁共振(EPR)和核磁共振(NMR)。
在一個具體實施方案中，用放射性同位素標(biāo)記諸如與β-淀粉樣蛋白特異性結(jié)合的多肽等分子并使用放射反應(yīng)外科儀器檢測患者(Thurston等，美國專利號5,441,050)。在另一實施方案中，用熒光化合物標(biāo)記該分子并使用熒光反應(yīng)掃描儀器檢測患者。在另一實施方案中，用正電子發(fā)射金屬標(biāo)記該分子并使用正電子發(fā)射體層攝影檢測患者。在另一實施方案中，用順磁標(biāo)記物標(biāo)記該分子并使用磁共振成像(MRI)檢測患者。
在一個方面，通過使用按上述方法或一些其它原理可檢測且對受試者無毒性的標(biāo)記，將標(biāo)記的多肽注射進受試者以便該多肽遷移并結(jié)合到諸如β-淀粉樣蛋白聚集區(qū)等與其結(jié)合的靶上，從而檢測諸如β-淀粉樣蛋白或β-淀粉樣蛋白聚集物等靶物質(zhì)的存在可作出體內(nèi)診斷。
標(biāo)記合適的酶標(biāo)記包括，例如來自氧化酶類的那些酶，它們通過與底物反應(yīng)催化過氧化氫的產(chǎn)生。葡萄糖氧化酶是特別優(yōu)選的，因為它具有良好的穩(wěn)定性且其底物(葡萄糖)容易得到。通過測量酶標(biāo)記的抗體/底物反應(yīng)形成的過氧化氫濃度可測定氧化酶標(biāo)記的活性。除了酶外，其它合適的標(biāo)記包括放射性同位素，例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)，和锝(99mTc)，和熒光標(biāo)記，例如熒光素和羅丹明，和生物素。
下面提供了用于本發(fā)明的VEGF多肽-，β-淀粉樣蛋白-或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物-特異性抗體的其它合適標(biāo)記。合適的酶標(biāo)記的例子包括蘋果酸脫氫酶，δ-5-類固醇異構(gòu)酶，酵母乙醇脫氫酶，α-甘油磷酸脫氫酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，過氧化物酶，堿性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，過氧化氫酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶，和乙酰膽堿酯酶。
合適的放射性同位素標(biāo)記的例子包括3H，111In，125I，131I，32P，35S，14C，51Cr，57To，58Co，59Fe，75Se，152Eu，90Y，67Cu，217Ci，211At，212Pb，47Sc，109Pd，等。111In是使用體內(nèi)成像時優(yōu)選的同位素，因為其避免了125I或131I-標(biāo)記的多肽被肝臟脫鹵的問題。另外，該放射性核素具有更有利于成像的γ發(fā)射能力。例如，與帶有1-(P-異硫氰酸苯甲基)-DPTA的單克隆抗體偶聯(lián)的111In顯示出在非腫瘤組織，特別是肝臟中吸收低，因此增強了腫瘤定位的特異性。
合適的非放射性同位素標(biāo)記的例子包括157Gd，55Mn，162Dy，52Tr，和56Fe。
合適的熒光標(biāo)記的例子包括152Eu標(biāo)記，熒光素標(biāo)記，異硫氰酸鹽標(biāo)記，羅丹明標(biāo)記，藻紅蛋白標(biāo)記，藻藍蛋白標(biāo)記，別藻藍蛋白標(biāo)記，鄰苯二醛(o-phthaldehyde)標(biāo)記，和熒光胺標(biāo)記。
合適的毒素標(biāo)記的例子包括，假單胞菌屬毒素，白喉毒素，蓖麻毒蛋白，和霍亂毒素。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的例子包括魯米那(luminal)標(biāo)記，異魯米那(isoluminal)標(biāo)記，芳香吖啶鎓酯(aromatic acridinium ester)標(biāo)記，咪唑標(biāo)記，吖啶鎓鹽(acridinium salt)標(biāo)記，草酸酯標(biāo)記，螢光素標(biāo)記，螢光素酶標(biāo)記，和水母發(fā)光蛋白標(biāo)記。
核磁共振造影劑的例子包括重金屬原子核，例如Gd，Mn，和鐵。也可使用氘。對于EPR，PET或其它成像原理還存在其它造影劑，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。
將上述標(biāo)記與多肽結(jié)合的一般技術(shù)由Kennedy等(1976)Clin.Chim.Acta701-31，和Schurs等(1977)Clin.Chim.Acta 811-40提供。偶聯(lián)技術(shù)包括戊二醛法，過碘酸鹽法，二馬來酰亞胺法，m-馬來酰亞胺苯甲基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯法，所有這些方法在本文中引用以供參考。
本發(fā)明的多肽和抗體，包括其片段，可用于使用生物芯片和生物傳感器技術(shù)檢測VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的生物芯片和生物傳感器可包含本發(fā)明的多肽以檢測能特異性識別VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的抗體。本發(fā)明的生物芯片和生物傳感器也可包含特異性識別本發(fā)明多肽的抗體以檢測VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物。
試劑盒本發(fā)明還包括分析樣品的試劑盒，用于分析生物學(xué)樣品中存在的VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物。在一般實施方案中，該試劑盒包含在一個或多個容器中的特異性結(jié)合VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的配體，可優(yōu)選抗VEGF多肽，或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的純化抗體。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有基本上分離的多肽，該多肽含有與試劑盒中包含的抗體具有特異性免疫反應(yīng)的表位。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含不能與目的多肽反應(yīng)的對照抗體。該試劑盒還包含關(guān)于其使用的說明書和標(biāo)簽。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有檢測抗體與目的多肽結(jié)合的工具(例如，該抗體可與諸如熒光化合物，酶底物，放射性化合物或發(fā)光化合物等可檢測的底物偶聯(lián)，或者可識別第一抗體的第二抗體與可檢測的底物偶聯(lián))，和關(guān)于其使用的說明書和標(biāo)簽。
該試劑盒也可含有作為β-淀粉樣蛋白指示劑的帶有其使用說明書的標(biāo)記VEGF多肽。
β-淀粉樣蛋白和VEGF的高親和力捕獲物(Trap)封閉配體活性的配體捕獲物可通過螯合配體且因而導(dǎo)致其不能與諸如受體或共聚集組件等天然配對物相互作用來充當(dāng)其關(guān)連配體的選擇性高親和力拮抗劑。關(guān)于制備該配體捕獲物的一些詳細情況可參見美國專利號6,472,179，本文引用其整體以供參考。
配體捕獲物可包含與其它分子，包括但不限于，諸如異數(shù)(heteromeric)免疫球蛋白重鏈/輕鏈?zhǔn)荏w等多肽相聯(lián)的VEGF多肽以形成可結(jié)合或螯合β-淀粉樣蛋白，優(yōu)選自由流動的β-淀粉樣蛋白的捕獲物。反之，該配體捕獲物可包含與其它分子，包括但不限于諸如異數(shù)免疫球蛋白重鏈/輕鏈?zhǔn)荏w等多肽相聯(lián)的β-淀粉樣多肽以形成可結(jié)合或螯合VEGF的捕獲物。如果需要化學(xué)結(jié)合的捕獲物，則異數(shù)配體捕獲物可由二硫鍵連接的蛋白質(zhì)組成?；蛘?，可通過使用重組融合蛋白形成該配體捕獲物。
例如，在一個實施方案中，可制備諸如VEGF或β-淀粉樣蛋白等配體的高親和力捕獲物，其中本領(lǐng)域的技術(shù)人員可構(gòu)建含有編碼包含配體結(jié)合區(qū)的氨基酸序列的第一多肽元件的核苷酸序列，和編碼包含多聚化元件(例如，IgG的Fc區(qū))的氨基酸序列的多肽元件的至少一個其它核苷酸序列的融合核酸以產(chǎn)生該配體的高親和力捕獲物。融合構(gòu)建體可由編碼至少一個配體結(jié)合區(qū)多肽和至少一個編碼多聚化元件(multimerizer)的多肽的DNA組成?；蛘?，該多聚化元件和配體結(jié)合區(qū)可在不同的DNA構(gòu)建體中編碼和表達。然而，應(yīng)明白該多聚化元件不限于多肽，而且可包括一方面能夠結(jié)合配體且另一方面與其它多聚化元件相聯(lián)以形成配體捕獲物的任何分子。
該配體結(jié)合捕獲物可以是可溶性的或者可與固相表面相聯(lián)。另外，可在各種不同的試驗中檢測該配體結(jié)合捕獲物與VEGF或β-淀粉樣蛋白結(jié)合的能力。例如，結(jié)合在配體捕獲物上的VEGF或β-淀粉樣蛋白的解離率，可以與VEGF或β-淀粉樣蛋白從抗-VEGF或抗-β-淀粉樣蛋白單克隆中和抗體上解離的速率平行測量。預(yù)定量的標(biāo)記配體可以與單克隆抗體或配體捕獲物預(yù)溫育大約20小時。加入過量的未標(biāo)記配體。定期取反應(yīng)液的等分試樣并用蛋白質(zhì)G-瓊脂糖沉淀配體捕獲物，測定保持結(jié)合的標(biāo)記計數(shù)的數(shù)量。
基因治療在一個具體實施方案中，可通過基因治療的方式施用包含編碼VEGF多肽或β-淀粉樣多肽的序列的核酸以治療，抑制或預(yù)防與本發(fā)明的多肽的異常表達和/或活性相關(guān)的疾病或病癥?；蛑委熓侵竿ㄟ^給受試者施用表達的或可表達的核酸進行的治療。在本發(fā)明的該實施方案中，該核酸產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)治療效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明可使用本領(lǐng)域可得到的任一基因治療方法。舉例性的方法在下面描述。
關(guān)于基因治療方法的綜述參見Goldspiel等，Clinical Pharmacy12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993)?？墒褂玫闹亟MDNA技術(shù)的本領(lǐng)域公知方法在Ausubel等(編)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述。
在一個優(yōu)選的方面，核酸序列可編碼VEGF多肽或β-淀粉樣多肽，其中該核酸序列是在合適宿主中表達該多肽的表達載體的一部分。具體地說，該核酸序列具有與多肽編碼區(qū)可操作地相連的啟動子，所述的啟動子是誘導(dǎo)型或組成型，且任選具有組織特異性。在另一具體實施方案中，使用多肽編碼序列和任何其它目的序列側(cè)翼為可在基因組目的位點啟動同源重組的區(qū)域的核酸分子，從而提供編碼抗體的核酸的染色體內(nèi)表達(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)。
可直接或者間接將核酸給藥到患者中，在直接的情況下，患者直接接觸該核酸或攜帶核酸的載體，在間接的情況下，首先用該核酸體外轉(zhuǎn)化細胞，然后移植進患者。這兩種方法分別稱為體內(nèi)或離體基因治療。
在一個具體實施方案中，該核酸序列可直接體內(nèi)給藥，其中該核酸表達以產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這一點可通過本領(lǐng)域已知的眾多方法中的任一種實現(xiàn)，例如，通過將它們構(gòu)建成合適的核酸表達載體的一部分并給藥使其變成細胞內(nèi)成份，例如，通過使用缺陷型或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體感染，或者通過通過直接注射裸露的DNA，或者用脂類或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包裹，在脂質(zhì)體，微顆粒，或微膠囊中包埋，或者通過將它們與已知進入細胞核的肽連接給藥，通過將它與進行受體介導(dǎo)的胞吞的配體連接給藥(參見，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(可用于靶向特異性表達該受體的細胞類型)等等。在另一實施方案中，可形成核酸-配體復(fù)合物，其中該配體包含融合病毒肽以破壞核內(nèi)體，使得該核酸可避免溶酶體降解。在另一實施方案中，該核酸通過靶向特異性受體可體內(nèi)靶向細胞特異性吸收。作為選擇，該核酸可通過同源重組在細胞內(nèi)導(dǎo)入和摻入宿主細胞DNA中進行表達(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989))。
在一個具體實施方案中，使用含有編碼該多肽的核酸序列的病毒載體。將編碼用于基因治療的多肽的核酸序列克隆進有利于將基因遞送進患者的一種或多種載體中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和腺伴隨病毒是可使用的病毒載體的例子。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有修正病毒基因組包裝和整合進宿主細胞DNA中必需的元件。
腺病毒是將基因送遞到呼吸上皮的特別有吸引力的載體，因為它們天然感染呼吸上皮，并引起較輕的疾病。基于腺病毒的給藥系統(tǒng)的其它靶是肝臟，中央神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)皮細胞，和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優(yōu)點。另外，腺伴隨病毒(AAV)也有建議用于基因治療。
基因治療的另一方案涉及通過諸如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒感染等方法將基因轉(zhuǎn)移進組織培養(yǎng)物的細胞中。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將可選擇的標(biāo)記轉(zhuǎn)移給細胞。然后將該細胞放在選擇條件下以分離吸收并表達該轉(zhuǎn)移基因的那些細胞。然后將這些細胞送遞給患者。
在該實施方案中，體內(nèi)施用所得的重組細胞前將該核酸導(dǎo)入細胞中。通過本領(lǐng)域已知的任何方法可實現(xiàn)該導(dǎo)入，該方法包括但不限于轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細胞融合，染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)球融合等等。將外源基因?qū)爰毎脑S多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的且可用于本發(fā)明中，只要它不破壞受體細胞的必要發(fā)育和生理功能。該技術(shù)應(yīng)將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進細胞，以便該細胞可表達該核酸且優(yōu)選可通過其細胞后代遺傳和表達。
可導(dǎo)入核酸用于基因治療目的的細胞包含任何所需的，可得到的細胞類型，且包括但不限于上皮細胞，內(nèi)皮細胞，角質(zhì)細胞，成纖維細胞，肌肉細胞，肝細胞，諸如T-淋巴細胞，B-淋巴細胞，單核細胞，巨噬細胞，嗜中性白細胞，嗜酸性粒細胞，巨核細胞，粒細胞等血液細胞；各種干細胞或祖細胞，特別是例如從骨髓，臍帶血，外周血，胎兒肝臟獲得的造血干細胞或祖細胞等等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于基因治療的細胞是患者自身的。
在基因治療中使用重組細胞的一個實施方案中，可將編碼該多肽的核酸序列導(dǎo)入該細胞中以便通過該細胞或其后代可表達它們，然后體內(nèi)施用該重組細胞以達到治療效果。在一個具體實施方案中，可使用干細胞或祖細胞。可分離并在體外維持的任何干細胞和/或祖細胞可潛在地用于根據(jù)本發(fā)明的該實施方案。
在一個具體實施方案中，為基因治療目的導(dǎo)入的核酸包含與編碼區(qū)可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，以便通過控制合適的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑的存在或缺乏，來控制該核酸的表達。
治療組合物在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療以形成β-淀粉樣蛋白聚集物或淀粉樣蛋白斑為特征的各種疾病。這樣，通過提供抑制VEGF與Aβ結(jié)合的化合物給患有，或者傾向于患有該疾病的病人施用本發(fā)明的治療化合物。具體地說，該疾病與癡呆，腦慢性神經(jīng)變性疾病，神經(jīng)細胞損失，特別是在海馬和大腦皮層中的神經(jīng)細胞損失，神經(jīng)遞質(zhì)減少，腦血管變性，和/或認(rèn)知能力喪失相關(guān)。更具體地說，本發(fā)明涉及治療阿爾茨海默氏病。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及治療以血管生成過多為特征的各種疾病，該疾病包括但不限于癌癥，動脈粥樣硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，子宮內(nèi)膜異位，腎病或肥胖?？山o患有這些疾病的患者施用包括β-淀粉樣蛋白配體捕獲物的各種形式的β-淀粉樣肽以便結(jié)合并失活作為血管生成主要引發(fā)劑的VEGF。
治療性化合物的劑型是本領(lǐng)域公知的且通?？蓞⒖糝emington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，可按每天每千克體重從大約0.05μg到大約20mg給藥?？烧{(diào)整劑量方案以獲得最佳治療反應(yīng)。例如，可每天給藥幾個分開的劑量或者按治療情況的急迫性所示按比例降低該劑量。該活性化合物可按常規(guī)方式給藥，例如，通過口服，靜脈內(nèi)(如果是水溶性的)，肌肉內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，真皮內(nèi)或栓劑途徑或植入(例如，通過腹膜內(nèi)途徑使用緩釋分子或者通過使用細胞，例如體外致敏的單核細胞或樹突細胞和過繼轉(zhuǎn)移到接受者)。根據(jù)給藥途徑，需要在一種材料中包裹該肽以防止受到可滅活所述成份的酶，酸和其它天然條件的影響。
例如，該肽的低親油性使其在胃腸道被能夠裂解肽鍵的酶破壞和在胃中被酸水解。為了通過非腸胃外給藥施用肽，可用一種材料包裹它們或者與其一起給藥以防止其失活。例如，肽可在佐劑中給藥，與酶抑制劑共同給藥或者在脂質(zhì)體中給藥。本文涉及的佐劑包括間苯二酚，諸如聚氧化乙烯油酰醚和n-十六烷基聚乙烯醚等非離子表面活性劑。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑，二異丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂質(zhì)體包括水包油包水的CGF乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體。
該活性化合物也可通過腸胃外或腹膜內(nèi)給藥。也可在甘油液態(tài)聚乙二醇，和其混合物和在油中制備分散體。在常規(guī)貯存和使用條件下，這些制品含有防腐劑以防止微生物的生長。
適于注射的藥用形式包括無菌水溶液(如果是水溶性的)或分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉末。在所有情況中該形式必須是無菌的且必須是能夠容易地進行注射的流體。它在制備和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，且必需保存在防止諸如細菌和真菌等微生物污染的條件下。該載體可以是含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，其合適的混合物，和植物油的溶劑或者分散介質(zhì)。例如，通過使用諸如卵磷脂等包衣，通過在分散情況下維持所需顆粒的大小和通過使用表面活性劑(superfactants)可維持合適的流動性。通過諸如氯丁醇，苯酚，山梨酸，theomersal等各種抗細菌和抗真菌劑可實現(xiàn)防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如硬脂酸鋁和明膠可實現(xiàn)注射組合物的長時間吸收。
無菌注射液可通過將所需量的活性化合物與上面列舉的各種其它成份按需要摻入合適的溶劑中，接著過濾滅菌來制備。一般來說，通過將各種無菌活性成份摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上面列舉的所需其它成份的無菌載體中可制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，它可產(chǎn)生活性成份加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何其它所需成份的粉末。
當(dāng)該肽按上述適當(dāng)保護時，該活性化合物可與例如，惰性稀釋劑或能同化的可食載體一起口服給藥，或者可密封進硬或軟殼明膠膠囊中，或者可壓成片劑，或者可直接摻入食物中。對于口服治療給藥，該活性化合物可摻入賦形劑中并以可服用的片劑，口含片，錠劑，膠囊，酏劑，懸液，糖漿劑，糯米紙囊劑等的形式使用。該組合物和制品應(yīng)含有至少1％重量的活性化合物。當(dāng)然，該組合物和制品的百分?jǐn)?shù)可變化且通常在大約5到大約80％的重量單位之間。在該治療上有用的組合物中的活性化合物的量是可獲得的合適劑量。可制備根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的組合物或制品以便該口服劑量單位形式含有大約0.1μg和2000mg的活性化合物。
片劑，丸劑，膠囊劑等也可含有下列成份諸如膠黃芪，阿拉伯膠，玉米淀粉或明膠等粘合劑；諸如磷酸二鈣等賦形劑，諸如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，海藻酸等分解劑；諸如硬脂酸鎂等潤滑劑；且可加入諸如蔗糖，乳糖或糖精等甜味劑或諸如薄荷，冬青油，或櫻桃調(diào)料等調(diào)味劑。當(dāng)劑量單位形式是膠囊劑時，除了上述類型的物質(zhì)外，可含有液體載體。可存在各種其它物質(zhì)作為包衣或者可修飾該劑量單位的物理形式。例如，片劑，丸劑，或膠囊劑可用蟲膠，糖或兩者同時包裹。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物，作為甜味劑的蔗糖，作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和丙酯，諸如櫻桃或橙味的染料和調(diào)味劑。當(dāng)然，在制備任一劑量單位形式中使用的任何材料應(yīng)是藥用上純的且在所用劑量下基本上是無毒的。另外，該活性化合物可摻入緩釋制品和劑型中。
本文使用的“藥用上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何和全部溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細菌和抗真菌劑，等滲劑和延遲吸收劑等。將該介質(zhì)和試劑用于藥用活性物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的。除了任一常規(guī)介質(zhì)或試劑與該活性成份不相容的情況外，其在治療組合物中的用途是可預(yù)期的。也可向該組合物中摻入補充活性成份。
以容易給藥和劑量均勻的劑量單位形式配制腸胃外組合物特別具有優(yōu)勢。本文使用的劑量單位形式是指物理上分離的單位，它們適于作為需要治療的哺乳動物受試者的單位劑量；每個單位含有預(yù)定量的活性物質(zhì)以及所需的藥用載體，其中活性物質(zhì)的預(yù)定量是經(jīng)過計算可產(chǎn)生所需治療效果的量。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格通過下列情況指定，且直接依賴于下列情況(a)該活性物質(zhì)的特有特征和需要達到的具體治療效果，和(b)配合該活性物質(zhì)用于治療具有損害身體健康的疾病狀態(tài)的活受試者時本領(lǐng)域固有的限制。
該主要活性成份在劑量單位形式中以有效量與合適的藥用上可接受的載體配合用于方便和有效地給藥。例如，單位劑量形式可含有從0.5μg到大約2000mg量范圍的主要活性化合物。按比例表示時，該活性化合物一般以大約0.5μg/ml載體存在。對于含有補充活性成份的組合物，通過參考所述成份給藥的通常劑量和方式測定該劑量。
給藥系統(tǒng)各種給藥系統(tǒng)是已知的且可用于本發(fā)明化合物的給藥，例如密封在脂質(zhì)體，微顆粒，微膠囊中，能夠表達該化合物的重組細胞，受體介導(dǎo)的胞吞，構(gòu)建核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分，等。導(dǎo)入方法包括但不限于真皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，硬膜外，和口腔途徑。該化合物或組合物可按任何方便的途徑給藥，例如通過輸注或大丸劑注射，通過上皮或粘膜內(nèi)層(例如，口腔粘膜，直腸和腸粘膜，等)吸收且可與其它生物學(xué)活性劑一起給藥。給藥可以是全身性的或局部給藥。另外，可能需要通過包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射的任何合適的途徑將本發(fā)明的藥用化合物或組合物導(dǎo)入中央神經(jīng)系統(tǒng)；心室內(nèi)注射可借助于例如連接到諸如Ommaya貯液池等貯液池上的心室內(nèi)導(dǎo)管。也可采用肺部給藥，例如，通過使用吸入器或噴霧器，和含有煙霧劑的配制品。
在一個具體實施方案中，可能需要給需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥用化合物或組合物；實現(xiàn)這點可通過例如但不限于手術(shù)期間局部輸注，局部應(yīng)用，例如與手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合，通過注射，借助于導(dǎo)管，借助于栓劑，或借助于植入物，所述的植入物是多孔，無孔，或膠狀材料，包括膜，例如sailastic膜，或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用包括本發(fā)明的抗體或肽的蛋白質(zhì)時，必需小心使用該蛋白質(zhì)不能吸收的材料。在另一實施方案中，該化合物或組合物可在載體，特別是脂質(zhì)體中給藥。在另一實施方案中，該化合物或組合物可在控釋系統(tǒng)中給藥。在一個實施方案中，可使用泵。在另一實施方案中，可使用聚合材料。在另一實施方案中，控釋系統(tǒng)可放在治療靶，即腦的附近，從而只需要部分系統(tǒng)劑量。
當(dāng)一種組合物的給藥可以被接受者動物耐受，且該組合物適合于給該動物給藥，則認(rèn)為該組合物是“藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的”。當(dāng)給藥量是生理學(xué)上有效的，則認(rèn)為該試劑是以“治療有效量”給藥。當(dāng)一種試劑的存在導(dǎo)致在接受者患者生理學(xué)上有可檢測的變化，則該試劑是生理學(xué)上有效的。
本發(fā)明不限于本文所述的具體實施方案的范圍。事實上，除了本文所述的內(nèi)容外，本發(fā)明的各種修飾對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言根據(jù)上面的描述和附圖將是顯而易見的。該修飾試圖落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。下面的實施例僅以例證本發(fā)明的方式而不是以限制的方式提供。
實施例實施例1-組織學(xué)和免疫細胞化學(xué)福爾馬林固定的大腦皮層尸體解剖組織從波士頓大學(xué)阿爾茨海默氏病中心(Boston University Alzheimer’s Disease Center)獲得。冷凍的大腦以30μm的厚度切片。切片在明膠覆蓋的載玻片上封固，其后用3.5％的低聚甲醛固定30分鐘，再用0.3％H2O2預(yù)溫育15分鐘。為進行免疫組織化學(xué)，可將該切片用0.25％Triton X-100處理，用10％馬血清溫育l小時，并與小鼠抗Aβ的單克隆抗體(ZYMED，South San Francisco，USA)或山羊抗人VEGF的多克隆抗體(R&D Systems Inc.，Minneapolis，USA)反應(yīng)12-16小時。然后將切片與偶聯(lián)了德克薩斯紅(Texas red)的抗小鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame，USA)或標(biāo)記了生物素的兔抗山羊IgG(Vector Laboratories)反應(yīng)。后者與偶聯(lián)了熒光素的鏈霉抗生物素蛋白(Vector Laboratories)反應(yīng)。為進行剛果紅(Congo Red)染色，將免疫標(biāo)記的切片在已于使用前用2.5mM NaOH堿化的飽和醇氯化鈉溶液(含4％(w/v)NaCl的80％EtOH)中溫育20分鐘，然后加入0.2％剛果紅(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)。20分鐘后，切片用無水乙醇漂洗并用VECTASHIELD封固介質(zhì)(Vector Laboratories)封固。
實施例2-結(jié)合試驗通過表面胞質(zhì)團共振分光術(shù)(surface plasmon resonance spectroscopy)測定已知的Aβ-結(jié)合蛋白和VEGF與Aβ肽的結(jié)合。Aβ1-40，Aβ1-42，和Aβ40-1(BACHEM，Bubendorf，Switzerland)用胺偶聯(lián)試劑固定在CM5傳感器芯片(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)上。α2-巨球蛋白，α1-抗凝乳蛋白酶，血清淀粉樣蛋白P成份，載脂蛋白E4，和VEGF165(100nM)以10μl/分鐘的流速使其與固定的Aβ結(jié)合并實時記錄傳感器圖。為了測定結(jié)合親和性，用0.5μM的Aβ肽(100μl)覆蓋微量滴定孔，用結(jié)合緩沖液(含0.1％BSA的M199/25mMHEPES/NaOH，pH7.4)封閉多余的位點，且通過單獨或在存在各種濃度的未標(biāo)記VEGF下加入50pM的125I-VEGF(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)測定結(jié)合。
實施例3-共聚集試驗Aβ1-40的聚集按改良的方法(Chang等，Brain Res Brain Res Protoc 2000，6(1-2)6-12)來測定。將Aβ1-40(100μM)與偶聯(lián)了FITC的Aβ1-40(1μM)在50mM MES，pH5.8中37℃溫育2天后，離心該混合物，測量該沉淀中的熒光。對于VEGF與Aβ的共聚集，將100μM的Aβ1-40或Aβ40-1與125I-VEGF165(1nM)混合并在37℃溫育2天。然后離心該混合物并在γ-計數(shù)器中測定沉淀的放射性。為了研究VEGF對Aβ聚集率的影響，在37℃下溫育單獨的Aβ1-40混合物(50μM的Aβ1-40和1μM的FITC-Aβ1-40)或含1μM VEGF的Aβ1-40，離心后通過測量沉淀中的熒光測定聚集程度。對于VEGF與聚集前的Aβ1-40的結(jié)合，將50μM新鮮的Aβ或預(yù)溫育2天的Aβ與125I-VEGF(1nM)混合并立即離心。測定沉淀中的放射性。
實施例4-解離試驗對于VEGF從Aβ/VEGF共聚集體的解離，可將在共聚集試驗中獲得的沉淀重懸于50mM MES，pH5.8中，溫育不同時間并離心。測定上清液中的放射性。為了研究Aβ/VEGF復(fù)合物對SDS處理的敏感性，向125I-VEGF165或在共聚集試驗中獲得的沉淀中加入非還原型SDS-PAGE樣品染料且混合物煮沸10分鐘。通過SDS-PAGE(10％)分離混合物并放射自顯影。
實施例5-結(jié)果實施例5.1-VEGF與患有AD的患者腦中的淀粉樣蛋白斑共定位。我們檢查了在AD患者顳葉皮層(temporal cortex)中VEGF的表達方式是否改變。我們觀察到與老年對照相比AD患者腦中VEGF的免疫反應(yīng)增強(圖1A和C)。意想不到的是，在AD患者皮層區(qū)的嗜剛果紅斑中觀察到VEGF的嚴(yán)重積累(圖1A和B)。在年齡匹配的受試者皮層切片中很少檢測到VEGF免疫反應(yīng)和淀粉樣蛋白斑(圖1C和D)。疊加免疫細胞化學(xué)揭示了VEGF與AD患者神經(jīng)炎和彌散斑中的Aβ共定位(圖1E-1G)。從我們檢查的所有AD腦樣品(7個患者)中獲得了相似的結(jié)果。
實施例5.2-VEGF以高親和力和特異性結(jié)合Aβ肽。我們研究了Aβ和VEGF是否特異性和以高親和力相互作用。我們將Aβ1-42，Aβ1-40，和Aβ40-1固定在BIAcore CM5傳感器芯片上并通過表面胞質(zhì)團共振分光術(shù)研究了VEGF和其它分子與Aβ肽的結(jié)合(圖2A和B)。該結(jié)果表明VEGF與Aβ1-42和Aβ1-40的結(jié)合比諸如α2-巨球蛋白，α1-抗凝乳蛋白酶，血清淀粉樣蛋白P成份，和載脂蛋白E4等已知結(jié)合Aβs的其它分子強得多(Bohrmann等，J BiolChem 1999，274(23)15990-15955；Hamazaki H.，J Biol Chem 1995，270(18)10392-10394；Hughes等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(6)3275-3280；Strittmatter等，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90(17)8098-8102)。用生物素標(biāo)記的Aβ1-40進行的ELISA分析顯示出的結(jié)果與通過表面胞質(zhì)團共振分光術(shù)獲得的結(jié)果相似(數(shù)據(jù)未顯示)。VEGF不與Aβ40-1結(jié)合，該肽具有與Aβ1-40相反順序的氨基酸序列。我們通過分析在遞增濃度的非標(biāo)記VEGF存在下放射性標(biāo)記的VEGF與固定的Aβ肽的結(jié)合測定了Aβ與VEGF之間的結(jié)合親和力(圖2C)。在該試驗中，對于Aβ1-40獲得了大約50pM的解離常數(shù)(KD＝IC50-[125I-VEGF])(DeBlasi等，TrendsPharmacol Sci 1989，10(6)227-229)。Aβ1-42對VEGF顯示出相似的結(jié)合親和性(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明VEGF特異性和以高親和力與Aβ肽直接結(jié)合。
實施例5.3-Aβ肽對VEGF的細胞結(jié)合和促分裂活性具有很小的影響。接著我們研究了Aβ肽對VEGF的細胞結(jié)合和促分裂活性的影響。即使在高濃度(1μM)下Aβ1-40或Aβ1-42都不影響VEGF與內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合或VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。最近的研究表明VEGF與神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞和一些腫瘤中表達的neuropilin-1相互作用(Soker等，Cell 1998，92(6)735-745)。Aβ1-40和Aβ1-42都不影響VEGF與表達neuropilin-1的MDA-MB-231腫瘤細胞的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合起來，Aβ肽似乎不影響VEGF的細胞結(jié)合和促分裂活性，盡管它們與VEGF以高親和力結(jié)合。
實施例5.4-VEGF與Aβ共聚集，強烈結(jié)合聚集前的Aβ且從共聚集的復(fù)合物中非常緩慢地釋放。由于VEGF在AD腦的Aβ斑中積累且與Aβ肽強烈相互作用，我們檢查了VEGF與Aβ共聚集的機理。當(dāng)我們溫育單獨的Aβ2天時，離心后在沉淀中出現(xiàn)大約60％的Aβ(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在溶液中一起溫育125I-VEGF和Aβ1-40時在沉淀中也出現(xiàn)大約相同比例的VEGF(圖3A)。然而，反向肽Aβ40-1的存在不會引起VEGF的廣泛沉積(P＝0.0076)。時間過程實驗表明VEGF(1μM)對50μM和100μM的Aβ1-40的聚集無明顯影響(圖3B且數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)VEGF與新鮮的或聚集前的Aβ混合并立即離心時，VEGF與聚集前的Aβ結(jié)合且這些復(fù)合物可通過離心沉淀(圖3C)。接著我們研究了VEGF從Aβ/VEGF復(fù)合物的解離率。3天后，從復(fù)合物中釋放不超過1.5％的VEGF(圖4A)。然而，Aβ/VEGF復(fù)合物對SDS處理敏感(圖4B)。這些結(jié)果清楚地表明VEGF可與Aβ共聚集而對Aβ的聚集率無任何明顯的影響，強烈結(jié)合聚集前的Aβ，且從共聚集的Aβ/VEGF復(fù)合物中非常緩慢地釋放。
實施例6-測定VEGF的Aβ結(jié)合區(qū)為了測定VEGF的Aβ結(jié)合區(qū)，我們按以前所述將完整VEGF，肝素結(jié)合區(qū)，和肝素結(jié)合區(qū)的部分區(qū)域與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合(Soker等，JBiol Chem 1996，272(50)31582-31588)。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化的蛋白質(zhì)。GST和GST-融合蛋白以200nM的濃度固定在微量滴定孔中，而VEGF以100nM固定，因為VEGF二聚體具有兩個肝素結(jié)合區(qū)。用3％BSA/PBS封閉非特異性結(jié)合位點，向每孔中加入200nM的Aβ且使其與固定蛋白結(jié)合。去掉未結(jié)合的Aβ且用兔抗-Aβ抗體接著用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體測定結(jié)合的Aβ。結(jié)果見圖5。
實施例7-測定Aβ的VEGF結(jié)合區(qū)以兩種方法測定Aβ中的VEGF結(jié)合區(qū)。VEGF以100nM的濃度固定在微量滴定孔上且用3％BSA/PBS封閉非特異性位點。單獨或者在30μM突變體Aβs存在下向各孔中加入Aβ1-42(50nM)并使其結(jié)合到固定的VEGF上。去掉未結(jié)合的Aβ后，通過兔抗-Aβ抗體的結(jié)合接著用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體測定結(jié)合的Aβ。作為選擇，單獨或者在50μM突變體Aβs存在下向固定的VEGF中加入生物素標(biāo)記的Aβ1-42(50nM)，代替Aβ。用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白測定結(jié)合的生物素標(biāo)記的Aβ。結(jié)果見圖6。
實施例8-肝素作為VEGF/Aβ相互作用的抑制劑為了研究肝素對VEGF與Aβ相互作用的影響，將GST-肝素結(jié)合區(qū)以100nM的濃度固定在微量滴定孔中，并用3％BSA/PBS封閉非特異性位點。單獨或者在遞增濃度的肝素存在下向孔中加入生物素標(biāo)記的Aβ1-42(50nM)。去掉未結(jié)合的生物素標(biāo)記的Aβ后，用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白測定結(jié)合的肽。結(jié)果見圖7。
實施例9-PGG，EGCG，鞣酸作為VEGF/Aβ相互作用的抑制劑PGG，EGCG和鞣酸的抑制性效果測定如下在塑料孔中覆蓋VEGF165(50ng/well)，用含3％牛血清白蛋白的PBS處理孔2小時并用PBS漂洗。在遞增濃度的試驗化合物存在下向各孔中加入生物素標(biāo)記的Aβ(100ng/ml)。2小時后，用含0.05％Tween的PBS漂洗各孔幾次。用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白測定結(jié)合的生物素標(biāo)記的Aβ。結(jié)果見圖8。
本文引證的所有參考文獻以其整體引用以供參考。
*****本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，或者使用不超出常規(guī)的實驗?zāi)軌虼_定，本文具體描述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等價形式。該等價形式試圖包含在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>POSCO公司(POSCO)學(xué)校法人 浦項工科大學(xué)校(POSTECH Foundation)蔡治范(Chae，Chi-Bom)高用松(Gho，Yong Song)楊勝弼(Yang，Seung-Pil)權(quán)炳吾(Kwon，Byung Oh)裴銅球(Bae，Dong-Goo)黃世旭(Hwang，Sewook)<120>β-淀粉樣蛋白結(jié)合因子及其抑制劑<130>10011-00001<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys1 5 10 15Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu20 25 30Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys35 40 45Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu50 55 60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe85 90 95Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg100 105 110Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe115 120 125Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser130 135 140Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys145 150 155 160Asp Lys Pro Arg Arg165<210>2<211>55<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His1 5 10 15Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr20 25 30Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys35 40 45Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg50 55
<210>3<211>27<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn1 5 10 15Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg20 25<210>4<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>5<211>62<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Ala Asp Cys Lys Tyr Lys Phe Glu Asn Trp Gly Ala Cys Asp Gly Gly1 5 10 15
Thr Gly Thr Lys Val Arg Gln Gly Thr Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Asn20 25 30Ala Gln Cys Gln Glu Thr Ile Arg Val Thr Lys Pro Cys Thr Pro Lys35 40 45Thr Lys Ala Lys Ala Lys Ala Lys Lys Gly Lys Gly Lys Asp50 55 60
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合肝素和β-淀粉樣蛋白的β-淀粉樣蛋白結(jié)合多肽(β-ABP)，其中該多肽不是SEQ ID NO5。
2.權(quán)利要求1的多肽，它與SEQ ID NO3具有至少85％的序列相同性。
3.權(quán)利要求2的多肽，它與SEQ ID NO3具有至少90％的序列相同性。
4.權(quán)利要求3的多肽，它與SEQ ID NO3具有至少95％的序列相同性。
5.權(quán)利要求4的多肽，它與SEQ ID NO3具有至少97％的序列相同性。
6.權(quán)利要求5的多肽，它以SEQ ID NO3表示，且可在N-末端或C-末端增加或減少大約5個氨基酸。
7.權(quán)利要求1的多肽，它與β-淀粉樣蛋白上從SEQ ID NO4的大約位置25的Gly殘基到大約位置35的Met殘基的區(qū)域特異性結(jié)合。
8.權(quán)利要求1的多肽，它對β-淀粉樣蛋白具有以解離常數(shù)約10nM所表示的結(jié)合親和力。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述的解離常數(shù)是大約1nM。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述的解離常數(shù)是大約100pM。
11.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求1的多肽的抗體。
12.權(quán)利要求11的抗體，它是單克隆抗體。
13.一種編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的核酸。
14.一種含有權(quán)利要求13的核酸的表達載體。
15.一種含有權(quán)利要求14的表達載體的宿主細胞。
16.一種預(yù)防β-淀粉樣蛋白與內(nèi)源性VEGF結(jié)合的方法，包括(a)產(chǎn)生重組的病毒載體或質(zhì)粒載體，它包含與啟動子可操作相連的編碼VEGF多肽的DNA序列；和(b)給需要的患者施用該病毒載體或質(zhì)粒載體，以便所述的DNA序列在腦內(nèi)的表達導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白與VEGF多肽結(jié)合。
17.一種在血管生成過多的區(qū)域滅活內(nèi)源性VEGF的方法，包括(a)產(chǎn)生重組的病毒載體或質(zhì)粒載體，它包含與啟動子可操作相連的編碼β-淀粉樣多肽的DNA序列；和(b)給需要的患者施用該病毒載體或質(zhì)粒載體，以便所述DNA序列在血管生成過多的位點的表達導(dǎo)致該β-淀粉樣多肽與內(nèi)源性VEGF結(jié)合。
18.測定VEGF多肽與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合的方法，包括(a)給懷疑含有β-淀粉樣蛋白的樣品提供VEGF；和(b)檢測當(dāng)樣品中存在β-淀粉樣蛋白時VEGF與β-淀粉樣蛋白的結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該多肽與聚集前的β-淀粉樣蛋白結(jié)合。
20.權(quán)利要求18的方法，其中該多肽與細胞外斑結(jié)合。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述的多肽是VEGF的肝素結(jié)合區(qū)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的多肽基本上是肝素結(jié)合區(qū)的C-端半分子。
23.診斷以淀粉樣蛋白斑的存在為指征的疾病的方法，包括(a)提供懷疑具有淀粉樣蛋白斑的樣品組織；(b)將所述樣品組織與能夠特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白的VEGF多肽接觸；和(c)檢測所述多肽與所述淀粉樣蛋白斑的結(jié)合，其中結(jié)合表示處于疾病狀態(tài)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的VEGF多肽是β-淀粉樣蛋白結(jié)合多肽(β-ABP)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的多肽被標(biāo)記。
26.權(quán)利要求23的方法，其中在步驟(c)中，所述的檢測通過檢測特異性結(jié)合所述VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白，或VEGF多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的配體來實現(xiàn)，其中，所述的配體被標(biāo)記。
27.一種診斷試劑盒，包含(a)一種含有特異性結(jié)合β-淀粉樣蛋白的VEGF多肽的容器；(b)特異性結(jié)合所述VEGF多肽，β-淀粉樣蛋白，或多肽/β-淀粉樣蛋白復(fù)合物的第一配體；(c)標(biāo)記的特異性結(jié)合所述第一配體的第二配體；以及其使用說明。
28.防止VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的方法，包括提供一種抑制VEGF與β-淀粉樣蛋白之間的相互作用的化合物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中將所述化合物提供給患有以淀粉樣蛋白斑形成為指征的疾病的哺乳動物。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述化合物是一種單體或多聚體，它包含具有酚或硫酸取代基的糖主鏈。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述的化合物是兒茶素或兒茶素酚化合物。
32.一種篩選抑制VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的化合物的方法，包括(a)將化合物與含有VEGF和β-淀粉樣蛋白的樣品接觸；(b)在VEGF與β-淀粉樣蛋白正常特異性互相結(jié)合的條件下測定VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的水平；(c)在所述化合物存在的條件下測定VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的水平；和(d)比較(a)和(b)部分所述的VEGF與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的水平，其中當(dāng)所述水平在(c)中比在(b)中低，則所述化合物是VEGF/β-淀粉樣蛋白結(jié)合的抑制劑。
33.治療阿爾茨海默氏病的方法，包括給需要的病人施用治療有效量的抑制VEGF和β-淀粉樣蛋白結(jié)合的化合物。
34.一種分離的含有β-淀粉樣多肽的分子，它能夠結(jié)合VEGF以形成無功能的復(fù)合物，它包含(a)第一多肽元件，該元件包含含有與VEGF結(jié)合的β-淀粉樣多肽的氨基酸序列；和(b)多聚化元件。
35.一種形成VEGF的無功能復(fù)合物的方法，包含將懷疑含有VEGF的樣品與權(quán)利要求34的分子接觸。
36.一種分離的含有VEGF多肽的分子，它能夠結(jié)合β-淀粉樣蛋白以形成無功能的復(fù)合物，它包括(a)第一多肽元件，該元件包含含有與β-淀粉樣多肽結(jié)合的VEGF多肽的氨基酸序列；和(b)多聚化元件。
37.一種形成β-淀粉樣蛋白的無功能復(fù)合物的方法，包含將懷疑含有β-淀粉樣蛋白的樣品與權(quán)利要求36的分子接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及與β－淀粉樣蛋白結(jié)合的VEGF多肽。本發(fā)明還涉及螯合β－淀粉樣蛋白的化合物。且反之，本發(fā)明涉及螯合VEGF的化合物。因此，本發(fā)明還涉及篩選抑制VEGF與β－淀粉樣蛋白結(jié)合的化合物的方法，且因此涉及阿爾茨海默氏病的診斷和治療。
文檔編號A61P25/00GK1617884SQ02827991
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月13日
發(fā)明者蔡治范, 高用松, 楊勝弼, 裵銅球, 權(quán)炳吾, 黃世旭 申請人:Posco公司, 學(xué)校法人浦項工科大學(xué)校