專利名稱：組織工程支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于組織工程的支架的生產(chǎn)方法和組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及控制多孔聚合物支架的孔結(jié)構(gòu)。
背景組織工程包括利用活細(xì)胞生產(chǎn)用于組織替換的生物替代品。然而，為了使組織工程能實際使用，必須生產(chǎn)出允許組織生長的支架，所述組織生長近似于天然組織生長。
業(yè)已采用了若干技術(shù)來生產(chǎn)組織工程支架，并取得了不同程度的成功。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，由生物可降解聚合物組成的多孔支架廣泛應(yīng)用于若干組織類型的工程中(Hutmacher，D.W.，″Scaffolds in tissueengineering bone and cartilage″Biomaterials 212529 2000；Chaignaud，B.E.等人，″The history of tissue engineering usingsynthetic biodegradable polymer scaffolds and cells″InAtala，A.，Mooney，D.J.，eds.Synthetic biodegradable polymer scaffolds.Boston，MABirkhauser，1997，pp.1-14)。各種組織工程策略將支架材料用作三-維基材，所述基材或者用于體外細(xì)胞接種，然后是移植(基于細(xì)胞的方法)；或者作為傳導(dǎo)和誘導(dǎo)的基材，用于體內(nèi)直接移植(傳導(dǎo)方法)(Murphy，W.L.和Mooney，D.J.，″Controlled delivery ofinductive proteins，plasmid，proteins DNA and cells from tissueengineering matrices″J Periodontal Res 34413 1999)。這些方案成功的程度部分取決于支架體系的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。許多應(yīng)用要求在支架體系之內(nèi)高度地互相連接的大孔結(jié)構(gòu)，以便促進(jìn)神經(jīng)和纖維血管的向內(nèi)生長，增進(jìn)細(xì)胞接種的均勻性，并促進(jìn)接種細(xì)胞和由鄰近體內(nèi)位置遷移來的細(xì)胞的遷移。
支架建立于骨架上。骨架有助于調(diào)節(jié)支架材料的互連性和孔徑大小。在支架形成之后，骨架必須除去。上面所述形成組織工程支架的現(xiàn)行方法的困難包括最終產(chǎn)品的一致性問題，難于控制支架的互連性和孔徑大小，以及在形成支架之后除去骨架材料的問題。
目前所需的是形成功能性組織工程支架的經(jīng)濟(jì)方法，所述支架的生產(chǎn)是容易且廉價的，使支架互連性和孔徑大小具有一致性，并且在形成支架之后能夠容易地除去骨架材料。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于組織工程的支架的生產(chǎn)方法和組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及控制多孔聚合物支架的孔結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的實施方案總地涉及用于生產(chǎn)多孔材料的方法和組合物，所述多孔材料包括但不局限于組織工程支架。更特別地，本發(fā)明的實施方案涉及用于生產(chǎn)大孔的生物可降解組織工程支架的組合物和方法，所述支架具有受控的孔互連性和孔隙率，并且易于生產(chǎn)。更確切地說，本發(fā)明的實施方案涉及改進(jìn)生物可降解聚合物的加工處理方法以控制孔徑大小和孔互連程度的組合物和方法。
可以預(yù)期的是，孔通過可融合的顆粒的融合相連接(并且形狀和大小確定)，所述顆粒包括但不局限于晶體和非晶體材料。在一實施方案中，可融合顆粒或粒子包含鹽孔隙原(porogen)(例如鹽晶體)。融合步驟預(yù)期可以在形成三維聚合物支架之前進(jìn)行。本發(fā)明的實施方案不局限于任何特定的鹽。任何鹽都可以使用。盡管本發(fā)明的實施方案不局限于任何特定的鹽，可以用于本發(fā)明的合適鹽的例子是氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用氯化鈉。
本發(fā)明的鹽晶體可從市場上購得(例如，Mallinkrodt，Paris，Kentucky)。鹽晶體可以不同的直徑范圍購買，并且例如可以過篩，從而獲得希望的大小。
可以預(yù)期的是，本發(fā)明的鹽晶體經(jīng)受處理條件(例如濕度)一定時間，使鹽晶體能夠部分地融合在一起。本發(fā)明的實施方案既不局限于任何特定的百分濕度，也不局限于任何特定的時間長度，以及任何特定的融合程度。例如，在一實施方案中，鹽晶體暴露于50％-100％的濕度中。在另一實施方案中，鹽晶體暴露于75％-99％的濕度中。在另一實施方案中，鹽晶體暴露于92％-98％的濕度中。同樣地，在一實施方案中，鹽晶體暴露于濕氣中10分鐘至48小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露于濕氣中12-36小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露于濕氣中18-30小時。在另一實施方案中，鹽晶體暴露于濕氣中22-26小時。
預(yù)期到除濕度以外的處理條件。例如，可用酸和堿以及有機(jī)溶劑來融合孔隙原(例如鹽晶體)。
本發(fā)明的實施方案不局限于任何融合程度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識特定目的所需的融合程度將根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的種類以及所需互連性程度和孔徑大小而改變。在下文中將描述產(chǎn)生不同融合水平的條件。
在本發(fā)明的一實施方案中，打算將生物可降解或非-生物可降解的聚合物注入鹽晶格中。在另一實施方案中，預(yù)期非-生物可降解的聚合物是熱塑性塑料。另外，還打算使生物可降解或非-生物可降解的聚合物溶解于溶劑中以易化注入。本發(fā)明的實施方案不局限于任何特定的生物可降解或非-生物可降解的聚合物或溶劑。本發(fā)明的實施方案預(yù)期多種生物可降解或非-生物可降解的聚合物-溶劑組合，只要生物相容性聚合物-溶劑組合不溶解融合的鹽晶格。例如，預(yù)期的聚合物包括但不局限于任何聚酯(包括聚(α-羥基酯)，聚醚(包括聚環(huán)氧乙烷)，聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。在一實施方案中，打算將熱塑性塑料用作原料。在另一實施方案中，打算將非生物可降解的聚合物用于形成支架。在優(yōu)選的實施方案中，由于其生物相容性、變成天然代謝物的可控生物可降解性以及先前用作大孔組織工程支架體系，因此選擇共聚物聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)。根據(jù)其溶解聚合物的特性和其不是孔隙原(例如鹽晶體)的溶劑的特性，選擇所使用的聚合物溶劑。另外，打算與不溶解聚合物支架的任何溶劑一起除去融合的顆粒組分(例如鹽骨架)。在優(yōu)選的實施方案中，溶劑是水。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒(例如可融合的微粒)，所述顆粒包含鹽晶體，和ii)包含聚合物的溶液(例如溶解或懸浮于溶劑中的聚合物)；b)使所述顆粒暴露于一定條件使所述鹽晶體融合在一起，從而產(chǎn)生骨架(或晶格)，所述骨架包含框架和在所述融合鹽晶體之間的自由空間；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進(jìn)行處理，以致使所述聚合物形成連續(xù)或半-連續(xù)的支架(即，對所述溶液進(jìn)行處理以致使聚合物從溶液中出來并硬化)；和e)從所述支架中除去所述的融合鹽晶體(所得的支架具有由在該方法中使用的融合鹽晶體的自由空間限定的孔)。優(yōu)選的是，大于75％并且在某些實施方案中甚至大于95％的自由空間在步驟c)中被填充。步驟(d)的優(yōu)選處理方式包括使聚合物溶劑蒸發(fā)。步驟(e)的優(yōu)選除去方式包括溶解所述融合鹽晶體。步驟(b)的優(yōu)選條件包括使所述鹽晶體暴露于約90％至約100％之間的相對濕度中約8-約28小時。
另外也優(yōu)選的是，所采用的聚合物是生物相容的和/或生物可降解的。在一個所述的實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含鹽晶體，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露于使所述鹽晶體融合至一起的足夠的濕度條件下，從而產(chǎn)生骨架，所述骨架包含框架和在所述融合鹽晶體之間的自由空間；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進(jìn)行處理，以致使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合鹽晶體(最終的支架也具有孔)。
當(dāng)然，本發(fā)明也涉及根據(jù)上述方法生產(chǎn)的支架(以物質(zhì)的組合物形式)。在一實施方案中，所述支架在步驟(e)之后包含細(xì)胞。
在一實施方案中，本發(fā)明的支架打算用于細(xì)胞和組織的培養(yǎng)。本發(fā)明實施方案的這種支架不局限于特定的細(xì)胞或組織類型。任何非-造血的和造血的組織或細(xì)胞類型均能夠在本發(fā)明的組織工程支架上進(jìn)行培養(yǎng)。在一實施方案中，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的組織工程支架上使肌肉和神經(jīng)細(xì)胞和組織進(jìn)行生長。
除在神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用中是至關(guān)重要的以外，在要求感覺控制的其它組織，如功能性骨骼肌，心臟和腎組織中，神經(jīng)組織的向內(nèi)生長也可能是至關(guān)重要的。纖維血管組織向內(nèi)生長促進(jìn)物質(zhì)運輸出入正在發(fā)育的組織，并且對于大塊組織(即骨，肝，骨骼肌等等)的工程特別重要，在所述大塊組織中，細(xì)胞沒有用于氧和營養(yǎng)素獲取和代謝廢物排泄的通路。此外，均勻的細(xì)胞接種和輕易的細(xì)胞遷移，對于增進(jìn)在傳導(dǎo)性、誘導(dǎo)性和基于細(xì)胞的組織工程方法中產(chǎn)生的組織的均一性是十分重要的。
在其它的實施方案中，本發(fā)明打算在沒有事先將細(xì)胞或組織添加至支架中的情況下將支架移植入生物體中。在一實施方案中，植入支架，并使細(xì)胞從周圍組織遷移入支架中。在另一實施方案中，將支架設(shè)計成促進(jìn)期望的細(xì)胞類型遷移并阻礙不希望細(xì)胞類型的遷移。例如，通過控制支架的孔隙率和孔徑大小或通過對用于構(gòu)建支架的材料的選擇，而調(diào)節(jié)細(xì)胞類型遷移。在本發(fā)明中，支架的孔隙率和孔徑大小將通過對所述鹽的顆粒大小和在其上將構(gòu)建支架的骨架構(gòu)建期間所述鹽顆粒所暴露的時間長度和百分濕度的選擇來控制。
在另一實施方案中，本發(fā)明打算將支架設(shè)計成能使細(xì)胞誘導(dǎo)遷移入支架。例如，將支架設(shè)計成在移植之后能將細(xì)胞因子釋放入周圍環(huán)境中。細(xì)胞因子的釋放將導(dǎo)致特定細(xì)胞類型遷移入支架。在另一實施方案中，支架將質(zhì)粒DNA釋放入局部環(huán)境中，由此使大量細(xì)胞在局部位置發(fā)生轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明涉及這樣的實施方案，其中支架的孔隙率和孔徑大小通過構(gòu)建骨架中所用的鹽粒大小，用來融合鹽粒的百分濕度以及允許所述鹽粒融合的時間長度來控制。在另一實施方案中，本發(fā)明打算控制孔的形狀和方向。例如用長方形、正方形、球形或橢圓形鹽顆粒(和在某些實施方案中，各形狀鹽顆粒的混合物)來控制孔的形狀和方向。在另一發(fā)明中，本發(fā)明打算利用除水以外的溶劑來形成鹽骨架。例如，可以預(yù)期的溶劑如酸、堿和有機(jī)溶劑。另外還可以預(yù)期的是，在聚合物骨架聚合之后用這些溶劑來溶解骨架。在另一實施方案中，作為形成鹽骨架的方法，打算對鹽顆粒進(jìn)行加熱，使鹽顆粒經(jīng)受壓力以及經(jīng)受電場或磁場。在另一實施方案中，在融合期間使顆粒骨架經(jīng)受定向的機(jī)械力、電力或磁力，以控制孔方向和孔徑大小。
在另一實施方案中，本發(fā)明打算將例如藥物、生長因子、肽、抗體、抗生素、寡核苷酸、多核苷酸等等引入聚合物骨架中。盡管本發(fā)明不局限于任何特定的機(jī)理，但據(jù)信，引入的物質(zhì)將從骨架中濾出并進(jìn)入局部環(huán)境中，在其中，它們將有助于細(xì)胞趨化性，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對抗疾病和感染等等。在本發(fā)明的一實施方案中，組織工程支架的生產(chǎn)方法預(yù)期將涉及四個步驟1)生產(chǎn)起孔隙原作用的鹽骨架，2)將聚合物溶液引入鹽骨架中，3)使聚合物硬化成聚合物基質(zhì)，和4)從聚合物基質(zhì)中除去孔隙原，留下組織工程支架。在一實施方案中，聚合物是生物可降解的。
本發(fā)明的實施方案涉及一方法，該方法包括a)提供i)鹽晶體和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述鹽晶體暴露于使所述鹽晶體融合在一起的條件下，以產(chǎn)生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和d)從所述支架中除去所述框架。
本發(fā)明的實施方案還打算利用氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂鹽晶體以制備框架。
本發(fā)明的實施方案包括將聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)用作生產(chǎn)支架的生物可降解的聚合物。另外，本發(fā)明的實施方案還預(yù)期的是，聚酯為聚(α-羥基酯)且聚醚為聚環(huán)氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)。在一實施方案中，生物可降解的聚合物是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
但本發(fā)明并不局限于特定的聚合物或聚合物源。本發(fā)明涉及均聚物、共聚物和/或聚合物的混合物。在一實施方案中，聚合物源是比濃對數(shù)粘度約1.6的聚(L-乳酸)(PLLA)。在另一實施方案中，聚合物是比濃對數(shù)粘度約0.5-0.6的聚(D，L-乳酸-共聚-羥基乙酸)(PLGA)。在另一實施方案中，聚合物是分子量約103,000的聚(d，l-乳酸)(PDLLA)。所述聚合物可從市場上得到，并且可以購自BoehringerIngelheim(Ingelheim，Germany)和/或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。在特定的實施方案中，聚合物是比濃對數(shù)粘度為0.78的85∶15聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)共聚物。另外，在不經(jīng)進(jìn)一步提純的情況下使用這些聚合物。
另外也不打算將本發(fā)明局限于特定的溶劑。在一實施方案中，溶劑是二噁烷(D)。在另一實施方案中，溶劑是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一實施方案中，溶劑是四氫呋喃(THF)。在另一實施方案中，溶劑是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在另一實施方案中，溶劑是吡啶。在另一實施方案中，溶劑是甲醇。在另一實施方案中，溶劑是丙酮。在另一實施方案中，溶劑是氯仿。
本發(fā)明的實施方案涉及一方法，該方法包括a)提供i)鹽晶體和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述鹽晶體暴露于使所述鹽晶體融合在一起的濕度下，以產(chǎn)生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和，d)從所述支架中除去所述框架。
本發(fā)明的實施方案還打算用于鹽晶體融合的濕度處于約90％和100％之間。在一實施方案中，使孔隙原暴露至濕氣中小于24小時，更優(yōu)選小于10小時。在一實施方案中，，本發(fā)明還打算使鹽晶體暴露于濕氣中約20-28小時。另外，本發(fā)明的實施方案還涉及使支架形成條件包含氣體發(fā)泡。另外，本發(fā)明的實施方案還涉及使支架形成條件包含溶劑澆鑄。
本發(fā)明的實施方案涉及由下述方法生產(chǎn)的支架a)提供i)鹽晶體和ii)聚合物，b)使所述鹽晶體暴露至所述鹽晶體融合在一起的條件下，以產(chǎn)生框架和自由空間，c)使所述生物可降解的聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和，d)從所述支架中除去所述框架。
本發(fā)明的實施方案預(yù)期鹽晶體是氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。在其它的實施方案中，本發(fā)明預(yù)期支架由聚合物制成，所述聚合物選自聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。在一實施方案中，聚合物是生物可降解的。
在另外的實施方案中，本發(fā)明預(yù)期，支架的聚合物選自聚(α-羥基酯)，聚醚聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇。
本發(fā)明的實施方案涉及由下述方法生產(chǎn)的支架a)提供i)鹽晶體和ii)聚合物，b)使所述鹽晶體暴露至所述鹽晶體融合在一起的濕度下，以產(chǎn)生框架和自由空間，c)使所述聚合物與所述框架接觸，其接觸條件為所述聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空間，從而形成支架，和d)從所述支架中除去所述框架。在一實施方案中，濕度在約90％和100％之間。在另一實施方案中，使鹽晶體暴露于濕氣中約20-28小時。
本發(fā)明的實施方案涉及通過氣體發(fā)泡和溶劑澆鑄而生產(chǎn)的支架。
本發(fā)明的實施方案涉及由本發(fā)明的實施方案制得的支架，其中支架還包含細(xì)胞。本發(fā)明并不局限于細(xì)胞來源。例如，細(xì)胞可以為任意多細(xì)胞生物體的細(xì)胞。在一實施方案中，細(xì)胞選自植物和動物。在另一實施方案中，細(xì)胞為哺乳動物的。在另一實施方案中，細(xì)胞為人類的。
本發(fā)明的一實施方案涉及一種方法，該方法包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露至所述孔隙原融合在一起的條件下，以產(chǎn)生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述骨架和溶液進(jìn)行壓縮，以便形成固態(tài)物質(zhì)；e)使所述固態(tài)物質(zhì)暴露至高壓氣體；f)使氣體壓力減至環(huán)境壓力；和g)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。在另一實施方案中，所述方法預(yù)期在100和2000psi之間進(jìn)行壓縮。在另一實施方案中，所述方法預(yù)期氣體壓力在400和1200psi之間。在另一實施方案中，所述方法打算固態(tài)物質(zhì)為半-固體。


圖1a和1b示出了通過在95％濕度下進(jìn)行a)12小時或b)24小時處理而融合的鹽晶體的NaCl基質(zhì)橫截面的電子顯微照片。
圖2a，2b，2c，2d和2e示出了利用鹽融合法制得的溶劑澆濤組織工程支架橫截面的電子顯微照片。一小時的鹽融合將在孔壁(A，C)中形成低密度的孔(31±10微米直徑)，而24小時的融合處理將在孔壁(B，D)中形成高密度的更大孔(78±21微米)。另外，24小時鹽融合的支架還示出了有輪廓的孔壁，其中厚的環(huán)直接與互連的孔(B，D)鄰接，在更高放大率(E)時這將特別明顯。
圖3a和3b示出了通過在富含溶劑(約95％濕度)氣氛中固相擴(kuò)散而進(jìn)行的鹽融合過程。(A)在融合之前，鹽顆粒間具有小區(qū)域的接觸以及在邊緣和棱角處尖銳的半徑。(B)在暴露于95％濕度之中24小時之后，在接觸點附近的擴(kuò)散在顆粒之間形成厚的鹽橋，并且在每個鹽顆粒的邊緣和棱角處使曲率半徑增加。
圖4示出了在溶劑澆鑄/顆粒濾出方法中，在添加聚合物之前鹽晶體邊緣曲率半徑的增加。根據(jù)融合0、12和24小時的鹽晶體的電子顯微照片測量半徑?；贏NOVA，隨后進(jìn)行組平均值之間的對比(Bonferroni t檢驗)，0-12小時平均邊緣半徑改變不顯著(p＞0.05)，然而，12-24小時的改變卻極其明顯(p＜0.001)。
圖5a，5b，5c和5d示出了利用鹽融合法制得的氣體發(fā)泡的組織工程支架橫截面的電子顯微照片。一小時的鹽融合將在孔壁(A，C)中形成一些很小的孔，其類似于溶劑澆鑄支架中的那些。24小時鹽融合的支架顯示出無組織的孔結(jié)構(gòu)，其中鄰接的孔似乎彼此進(jìn)入(B，D)。
圖6a和6b示出了經(jīng)受不同時間鹽融合、且通過溶劑澆鑄(a)或氣體發(fā)泡(b)制得的支架的壓縮模量。數(shù)值表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝4)，并且*表示相對于對照有統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p＜0.05)。
定義為了更好地理解本發(fā)明，提供如下定義。
“生物相容性聚合物”應(yīng)該定義為與生物學(xué)體系相容(即無毒性)的合成或天然材料。
“生物可降解的生物相容性聚合物”應(yīng)該定義為當(dāng)暴露或置于生物學(xué)體系中時將發(fā)生降解(即分解)的生物相容性聚合物。降解速率不以任何方式受本發(fā)明實施方案的限制，并且可以是快速的(例如可以在幾分鐘之內(nèi)發(fā)生降解)或慢速的(例如降解可以發(fā)生若干小時，若干天，若干周或若干月)。
“鹽晶體”和“鹽孔隙原”是用于本發(fā)明實施方案中的鹽晶體，用以形成構(gòu)建聚合物組織工程支架的骨架。
“融合(fusion)”應(yīng)該定義為匯合并連接結(jié)合在一起。在本發(fā)明的一實施方案中，鹽晶體通過在局部環(huán)境或氣氛中的濕氣并且有時通過加熱而融合在一起。在另一實施方案中，本發(fā)明還打算，通過酸、堿或有機(jī)溶劑而使孔隙原(例如鹽晶體)融合。
“可融合的顆?！睉?yīng)該定義為當(dāng)暴露至導(dǎo)致顆粒熔融的條件時融合在一起的顆粒，以便當(dāng)除去導(dǎo)致所述熔融的條件時，所述顆?；旧媳舜诉B接并具有引入融合顆?；|(zhì)內(nèi)的自由空間。通過顆粒最長的度量，可融合顆粒約為0.02mm至5mm。可融合顆粒由如上所述發(fā)生反應(yīng)的任何物質(zhì)構(gòu)成。可以一起使用多于一種類型的可融合顆粒。
對于基質(zhì)，“半連續(xù)”應(yīng)該定義為這樣的基質(zhì)，其具有與基質(zhì)的其它部分是連續(xù)的(即在兩處或更多處連接的)基質(zhì)部分，但其中并不要求所有基質(zhì)部分與基質(zhì)的其它部分是連續(xù)的(即僅一處連接)。
“濕度”和“相對濕度”應(yīng)該定義為在鹽晶體的局部氣氛(空氣)中的水分。濕度測量與在該溫度和大氣壓力下空氣能夠保持的水蒸汽最大量相比，在所述氣氛中水蒸汽的量。用水蒸汽充分飽和的空氣的相對濕度為100％。
“組織培養(yǎng)”和“細(xì)胞培養(yǎng)”應(yīng)該定義為在體外無菌條件下細(xì)胞的生長。
“支架”應(yīng)該定義為在其上細(xì)胞可以生長的三維結(jié)構(gòu)。
“基本上填充”應(yīng)該定義為填充自由空間的區(qū)域至滿負(fù)載或近乎滿負(fù)載。在一實施方案中，基本上填充應(yīng)當(dāng)指大于約50％的自由空間被填充(例如被聚合物或聚合物溶液填充)。在另一實施方案中，基本上填充應(yīng)當(dāng)指大于約75％的自由空間被填充。在另一實施方案中，基本上填充應(yīng)當(dāng)指大于約90％的自由空間被填充。在另一實施方案中，基本上填充應(yīng)當(dāng)指大于約95％的自由空間被填充。
在此將“自由空間”定義為在本發(fā)明中實施的鹽晶體框架(例如，融合孔隙原)之間的區(qū)域。在此將“框架”定義為在內(nèi)部有開放空間(即自由空間)的固態(tài)或半固態(tài)材料。
“傳導(dǎo)遷移”應(yīng)該定義為在沒有利用細(xì)胞因子或已知或懷疑會誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的其它生物活性劑(例如，肽或DNA)的情況下細(xì)胞遷移入支架中。
“誘導(dǎo)遷移”應(yīng)該定義為在細(xì)胞因子或已知或懷疑會誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的其它生物活性劑(例如肽或DNA)的幫助下細(xì)胞遷移入支架中。
在此“孔隙原”應(yīng)該定義為通過使聚合物溶液分布遍及整個孔隙原之中，可用于在基質(zhì)中形成孔的物質(zhì)。所述聚合物(或聚合物溶液)的所述分布可以在孔隙原融合成為骨架之前或之后。所述孔隙原可以是但不是必須是結(jié)晶物質(zhì)。
“溶劑”應(yīng)該定義為使另一物質(zhì)保持溶解狀態(tài)的液體或氣體(例如CO2)。在本發(fā)明的一實施方案中，溶劑應(yīng)該是使聚合物保持溶解狀態(tài)的液體，包括但不局限于生物相容的(和生物可降解的)聚合物。另外也不打算將本發(fā)明局限于特定的溶劑。在一實施方案中，溶劑是二噁烷(D)。在另一實施方案中，溶劑是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一實施方案中，溶劑是四氫呋喃(THF)。在另一實施方案中，溶劑是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在另一實施方案中，溶劑是吡啶。在另一實施方案中，溶劑是甲醇。在另一實施方案中，溶劑是丙酮。在另一實施方案中，溶劑是氯仿。在另一實施方案中，溶劑是液體如水，其用來溶解聚合物溶液被引入其中和其后聚合物硬化的融合鹽骨架。
在此“聚合物”定義為由重復(fù)(單體)單元或多體組成的大分子。在本發(fā)明的上下文中，將聚合物溶解或懸浮于合適的“溶劑”中，以形成“聚合物溶液”。在一實施方案中，通過除去溶劑使聚合物進(jìn)行聚合。在另一實施方案中，除去溶劑簡單地造成從液態(tài)聚合物溶液至固態(tài)連續(xù)聚合物基質(zhì)的相變。
“聚合”應(yīng)該定義為形成多于一個單體的鏈。
在此，“聚合物溶液”應(yīng)該定義為包含溶解或懸浮的聚合物(例如溶解或懸浮于溶劑中)的溶液。
在此“聚合物溶劑”應(yīng)該定義為其中可以溶解聚合物但同時不會明顯地溶解用作孔隙原的物質(zhì)的溶劑。
“熱塑性塑料”應(yīng)該定義為當(dāng)加熱至指定溫度以上時將熔融并且當(dāng)冷卻至該溫度以下時將固化的一類聚合物。
在本發(fā)明中，“固態(tài)”應(yīng)該是定義剛性量度的相對術(shù)語。術(shù)語“固態(tài)”應(yīng)該包括術(shù)語“半固態(tài)”。半固體應(yīng)該是保持可延展特性的固體。
發(fā)明總述本發(fā)明涉及用于組織工程的支架的生產(chǎn)方法和組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及在各種條件下利用氯化鈉晶體及其他鹽來形成其上可以構(gòu)建支架(包括但不局限于組織工程支架)的骨架。然而，本發(fā)明的方法不局限于利用結(jié)晶物質(zhì)。另外，非晶態(tài)的物質(zhì)預(yù)期也可以用于生產(chǎn)支架。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明的用于生產(chǎn)組織工程支架的新穎方法改善了孔隙率，互連性并且易于制造，而且還能夠更好地控制這些性質(zhì)。
組織工程是在合成的、生物可降解的支架上由細(xì)胞生長新的結(jié)締組織或器官，從而生產(chǎn)出用于移植回至供體宿主的部分或完全功能性的組織或器官。在一實施方案中，該技術(shù)涉及由植入(而不是移植)而生長的器官，并因此沒有免疫排斥。在另一實施方案中，該技術(shù)涉及由供體移植細(xì)胞。在另一實施方案中，該技術(shù)涉及植入組織工程支架，使細(xì)胞在體內(nèi)遷移入支架內(nèi)。在某些實施方案中，可以預(yù)期的是，任何組織工程器官的起始點是收獲來自組織工程器官的未來接受者的少量組織。對于有些應(yīng)用，這可以小至2mm的鉆孔活檢組織。
當(dāng)在二維表面上生長時，細(xì)胞相互作用并自己組織成功能性組織的能力是有限的。相比之下，三維骨架使細(xì)胞能夠成長并組裝成更接近類似其體內(nèi)相應(yīng)物的組織。
在正常生長和發(fā)育中，身體利用特化的結(jié)締組織細(xì)胞以形成給各器官提供三維結(jié)構(gòu)的“基質(zhì)”或活基質(zhì)?；|(zhì)還提供附著位點并產(chǎn)生促進(jìn)器官細(xì)胞成長發(fā)育成為有功能組織的生長因子。盡管基質(zhì)的具體組分和構(gòu)造對于各器官可以各不相同，但三維基質(zhì)支持的基本原理可應(yīng)用于體內(nèi)絕大多數(shù)的器官。
簡言之，所述方法將從支架著手，根據(jù)需要進(jìn)行成型，用活細(xì)胞對其接種，并用培養(yǎng)基和生長因子對其浸泡。當(dāng)細(xì)胞繁殖時，它們將填充支架并生長成為三維組織，并且一旦植入體內(nèi)，細(xì)胞將再現(xiàn)其預(yù)定的組織功能。血管附著至新的組織上，支架溶解，并且新生長的組織最終將融入其周圍環(huán)境。
在一實施方案中，器官特異性細(xì)胞可以在模擬體內(nèi)環(huán)境的密閉生物反應(yīng)體系中接種至三維支架上。例如，在皮膚組織工程中，細(xì)胞將附著、分裂、并分泌胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和生長因子，形成完全人類的功能性組織。
組織工程常常涉及干細(xì)胞，這是在1992年首先被分離出的一種成熟前的細(xì)胞。根據(jù)它們在培養(yǎng)皿或體內(nèi)接觸的生長因子，細(xì)胞將分化成特異性細(xì)胞類型，因此將干細(xì)胞植入合適的位置可產(chǎn)生從骨至肌腱至軟骨的一切。
盡管本發(fā)明的實施方案不局限于特定的用途，但組織工程支架和組織工程可以用來再造許多組織和器官。一個例子是軟骨修復(fù)。每年發(fā)生約900,000例關(guān)節(jié)軟骨外傷損傷。在運動損傷及其他導(dǎo)致并發(fā)癥的身體損傷之后，成人軟骨通常不會再生。另一例子是骨修復(fù)。僅在美國估計每年有800,000個患者因嚴(yán)重骨折而住院，其中一半患者需要切開骨折復(fù)位操作。相當(dāng)大部分的這些骨折不能適當(dāng)?shù)赜希虼诵枰o助程序，如骨移植。其它骨折對于任何努力都是無響應(yīng)的，但它們可能是組織工程的理想候選者。另一例子是皮膚傷口愈合。皮膚傷口不能適當(dāng)?shù)赜显诿绹磕暧绊懝烙?,600,000個患者。這些傷口常常是其它病癥如糖尿病、循環(huán)疾病和制動的并發(fā)癥。這些傷口甚至在若干月或若干年之后還不愈合，因此將導(dǎo)致嚴(yán)重的且危及生命的并發(fā)癥如感染。患病肢體常常需要截肢。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明A.溶劑澆鑄和氣體發(fā)泡。
傳統(tǒng)上，組織工程支架通過溶劑澆鑄法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制備和表征″Polymer 351068，1994)和氣體發(fā)泡法(Harris，L.D.等人，″利用氣體發(fā)泡形成的開孔生物可降解基質(zhì)″JBiomed Mater Res 42396，1998)制得。在溶劑澆鑄法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制備和表征″Polymer 351068，1994)中，將聚合物溶解于合適的溶劑中，添加至含孔隙原的模具中并使孔隙原分散。然后，在環(huán)境條件下使溶劑從混合物中蒸發(fā)出，留下包含孔隙原的聚合物基質(zhì)，然后可將孔隙原在合適的溶劑中濾出(leachedout)。在氣體發(fā)泡法中(Harris，L.D.等人，″利用氣體發(fā)泡形成的開孔生物可降解基質(zhì)″J Biomed Mater Res 42396，1998)，聚合物顆粒與孔隙原顆?；旌?，并將該混合物壓成散布有孔隙原的不連續(xù)聚合物的固體混合物。然后，使得到的粒料暴露于高壓二氧化碳?xì)怏w，并且在使壓力平衡一段時間之后，迅速釋放壓力，從而使所述混合物的聚合物組分產(chǎn)生熱力學(xué)不穩(wěn)定性。所述不穩(wěn)定性將使聚合物發(fā)泡，并且初始不連續(xù)的聚合物顆粒將融合在一起，從而形成在散布孔隙原顆粒周圍的連續(xù)聚合物基質(zhì)，然后將孔隙原顆粒在溶劑中濾出。在這些方法的每一種方法中，在得到的支架中孔之間的互相連接程度分別由溶劑蒸發(fā)或聚合物發(fā)泡步驟期間孔隙原顆粒的互相連接來確定。由于在融合之前孔隙原分散在聚合物內(nèi)部，因此，孔隙原顆粒之間的互相連接程度不能主動地控制，并且在最終支架產(chǎn)品中孔的互連性也未受到控制。
考慮到支架內(nèi)部孔互連性的相當(dāng)大的益處，在各種組織工程策略中，對孔隙原互連性的增強(qiáng)和控制將是十分重要的。本發(fā)明的某些實施方案解決了控制支架孔隙率和互連性的這些問題。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，孔隙原不是分散的，而是融合從而產(chǎn)生一骨架(或晶格)并將聚合物溶液引至該骨架上和其中。
B.細(xì)胞培養(yǎng)并不打算使本發(fā)明受限于細(xì)胞來源。在一實施方案中，用于組織工程的細(xì)胞來自活檢。然后使來自活檢的細(xì)胞由外植體或膠原蛋白酶消化而培養(yǎng)，從而產(chǎn)生“細(xì)胞庫”。然后，在合適的生理條件下，在基質(zhì)和支架上進(jìn)一步對這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而形成用于植入的組織工程構(gòu)建構(gòu)。該方法在組織培養(yǎng)裝置中進(jìn)行以維持無菌環(huán)境。細(xì)胞的生物化學(xué)和物理活性可通過添加生長因子或細(xì)胞因子以及通過利用物理刺激而增強(qiáng)。在某些應(yīng)用中，施加小物理負(fù)載的裝置刺激存在于支架中的細(xì)胞群成為通常與器官發(fā)生和組織修復(fù)有關(guān)的生物-化學(xué)和生物-物理活性。在合適條件下進(jìn)一步組織培養(yǎng)之后，該構(gòu)建物然后可植回最初從其上取下細(xì)胞的患者。該技術(shù)將消除對抗排異反應(yīng)藥物的需要，這是因為組織工程組織由患者自己的細(xì)胞生長，因此，將作為患者身體的天然部分而被接受。
C.孔隙原融合在本發(fā)明的實施方案中，鹽晶體可通過暴露至某些條件(例如約95％濕度)而融合，從而增加溶劑澆鑄和氣體發(fā)泡PLG支架內(nèi)的孔互連性。在溶劑澆鑄之前鹽基質(zhì)的融合將在孔壁中形成洞孔，并且這些洞孔的直徑和球形度將隨鹽融合處理的增加而增加。鹽融合處理將使溶劑澆鑄支架的壓縮模量增加，這可能是由于孔壁中洞孔的鄰近形成厚的環(huán)形支柱的緣故。在各種組織工程應(yīng)用中，增加的孔互連性可能是有用的，特別是那些要求密切的細(xì)胞-細(xì)胞接觸的應(yīng)用(即神經(jīng)和肌肉應(yīng)用)。另外，由于鹽融合法不僅在溶劑澆鑄法而且在氣體發(fā)泡方法中均賦予了改善的孔互連性，因此該構(gòu)思可應(yīng)用于其它基于固體孔隙原的方法，以生產(chǎn)具有高度互連性的大孔或微孔材料體系。
在溶劑澆鑄，顆粒濾出方法中采用融合鹽模具將在支架中的孔壁之間形成洞孔。隨著鹽融合時間增加，在支架橫截面內(nèi)的孔結(jié)構(gòu)變得組織條理性下降。明顯缺乏有組織條理的孔結(jié)構(gòu)是由于鹽融合試樣優(yōu)異的互連性，這將減少組織化良好的、大部分關(guān)閉的孔的存在。當(dāng)支架對切開時，許多孔由于其缺乏連續(xù)的孔壁，因此將變平。實際上，融合鹽基質(zhì)增加的連續(xù)性在聚合物基質(zhì)中將產(chǎn)生相應(yīng)的不連續(xù)性，從而導(dǎo)致在孔之間的大通道和優(yōu)異的互連性。另外，利用48小時或更長的鹽融合時間不能制備出完整的試樣。這進(jìn)一步支持了鹽基質(zhì)連續(xù)性和組織工程支架連續(xù)性之間的相反關(guān)系。利用鹽分散于其中的溶劑澆鑄顆粒濾出法的先前的研究不能夠控制根據(jù)本研究中所顯示出的孔壁中的洞孔的孔互連性(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制備和表征″Polymer 351068，1994；Kaufmann，P.M.等人，″Highlyporous polymer matrices as a three-dimensional culture system forhepatocytes″Cell Transplant 6463，1997；Murphy，W.L.等人，″連續(xù)骨樣礦物質(zhì)在體外在多孔聚(丙交酯-共聚-乙交酯)支架內(nèi)的生長″JBiomed Mater Res 5050，2000)。在近來的研究中，研究人員利用熱在溶劑澆鑄之前使聚合孔隙原顆粒融合在一起(Ma，P.X.和Choi，J.“具有良好限定互連球形孔網(wǎng)絡(luò)的生物可降解的聚合物支架”TissueEng 723，2001)。盡管利用加熱可以證明在若干組織工程應(yīng)用中是有用的，但在此所述的局部溶解方法可持有更寬的適用性，這是因為其可在室溫融合若干類型的孔隙原顆粒(有機(jī)的和無機(jī)的)，以及其可能添加至包括生物活性誘導(dǎo)因子的處理技術(shù)(即氣體發(fā)泡/顆粒濾出)。
在氣體發(fā)泡之前，在PLG/NaCl混合物內(nèi)NaCl晶體的融合對孔結(jié)構(gòu)也具有顯著的影響。在24小時鹽融合(SF)、氣體發(fā)泡支架內(nèi)的孔似乎直接互相進(jìn)入，這意味著很高的互連性而沒有大大減小支架壓縮模量(例如，參見圖6b)。氣體發(fā)泡法先前已用來加工處理包含生物活性血管內(nèi)皮生長因子的支架(Sheridan，M.等人，″Bioabsorbablepolymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growthfactor delivery″J Control Rel 6491，2000；Murphy，W.L.等人，″Sustained release of vascular endothelial growth factor frommineralized poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissueengineering″Biomaterials 212521，2000)和包含編碼血小板衍生生長因子的質(zhì)粒DNA的支架(Shea，L.D.等人，″DNA delivery frompolymer matrices for tissue engineering″Nat Biotech 17551，1999)以促進(jìn)血管組織的向內(nèi)生長。將本發(fā)明的新穎的鹽融合方法添加至氣體發(fā)泡法和溶劑澆鑄法，將在組織工程支架整個內(nèi)部形成高度互相連接的血管供應(yīng)。在支架體系內(nèi)使血管向內(nèi)生長達(dá)到最大深度是大塊組織工程策略中重大的目標(biāo)，而本發(fā)明高度互連的孔結(jié)構(gòu)對于最佳的血管組織向內(nèi)生長是有利的。
當(dāng)暴露于潮濕環(huán)境中時，在所謂“結(jié)塊”的過程中相鄰鹽晶體將融合，這常常會形成巖鹽或不適當(dāng)貯存的食鹽的大結(jié)塊(將抗-結(jié)塊劑如硅酸鈣添加至食鹽中，以防止結(jié)塊，其主要是通過吸收在包裝內(nèi)的水分，否則這些水分會被吸入鹽顆粒的表面內(nèi))。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明不打算利用抗結(jié)塊劑。在固態(tài)鹽晶格內(nèi)原子的擴(kuò)散速率通過吸收水的存在而增加。增加的擴(kuò)散使得接觸的鹽顆粒的表面能夠結(jié)合，從而以類似于用于非-玻璃狀陶瓷材料固態(tài)燒結(jié)法的過程在顆粒之間形成橋連。由于在所述過程中，鹽顆粒的總表面積減少，從而降低表面能，因此單獨的顆粒將開始融合(Van Vlack，L.H.“Elements ofMaterials Science and Engineering，”第4版，Addison-WesleyPublishing Company，Reading，MA，PP.120 & 316，1980)。各鹽顆粒增加的球形度也是熱力學(xué)有利的，因為這也降低各顆粒的總表面能。
D.支架模制在鹽融合24小時之后，溶劑澆鑄支架具有明顯增加的壓縮模量，而氣體發(fā)泡支架卻沒有。對于溶劑澆鑄支架，PLG材料的更厚支柱在鹽顆粒的圓角和邊緣所空出的空間中形成，其形成更硬的結(jié)構(gòu)，而PLG在支架中的體積分?jǐn)?shù)不增加。隨著NaCl融合時間的增加，氣體發(fā)泡支架模量不發(fā)生類似的增加。這可能是由于在氣體發(fā)泡法中鹽融合期間存在著PLG顆粒的緣故。無庸置疑的是，甚至在兩種類型顆粒(NaCl和PLG)都存在的情況下，在相鄰NaCl晶體之間也會存在一些互相作用的空隙空間。由于擴(kuò)散所造成的鹽表面的位移限于在可利用的空隙空間內(nèi)的移動。支持所述情況的證據(jù)在圖5(b & d)中是顯而易見的，其中支架由微多孔片材組成，而這在溶劑澆鑄支架中卻不存在，提示在NaCl融合過程期間，移動的鹽晶體表面被更小的PLG顆粒所妨礙并可能在其周圍流動。因此，盡管在相鄰鹽顆粒之間形成了橋連，但結(jié)晶表面的移動卻由于PLG顆粒的存在而受到約束。這可能阻止了鹽結(jié)構(gòu)中空隙空間的生長，而其會導(dǎo)致在PLG支架中形成厚截面支柱，這就是對為什么在氣體發(fā)泡支架中孔互連性增加而壓縮模量不增加的解釋。
E.舉例性的應(yīng)用盡管不局限于任何特定的應(yīng)用，但本發(fā)明實施方案的鹽融合方法可應(yīng)用于神經(jīng)和肌肉組織的工程，這是因為所述組織對孔互連性的依賴性所致。橋接神經(jīng)組織缺損(軸突延伸)和功能性骨骼肌組織的形成(成肌細(xì)胞融合)中的再生過程是需要密切細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的生理學(xué)過程的例子。利用各種天然和合成支架材料進(jìn)行神經(jīng)間隙橋連的策略甚至在間隙長度小于10毫米的情況下也只取得了適度的成功(Valentini，R.F.等人，″Collagen-and laminin-containing gels impedeperipheral nerve regeneration through semipermeable nerve guidancechannels″Exp Neurol 98350，1987；Aldini，N.N.等人，″Effectivenessof a bioabsorbable conduit in the repair of peripheral nerves″Biomaterials 17959，1996)，在許多情況下失敗的原因包括導(dǎo)管缺乏足夠的孔互連性以及不足的機(jī)械完整性。
利用多孔聚(乳酸-共聚-羥基乙酸)(Evans，G.R.D.等人，″Tissueengineered conduitsthe use of biodegradable poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)scaffolds in peripheral nerveregeneration″InStark，G.E.，Horch，R.，Tanczos，E.，Eds.BiologicalMatrices and Tissue Reconstruction.BerlinSpringer，1998，pp.225-235)和聚(L-乳酸)(Evans，G.R.D.等人，″In vivo evaluation ofpoly(L-lactic acid)porous conduits for peripheral nerveregeneration″Biomaterials 201109，1999)支架用于神經(jīng)再生的最近研究已在大鼠坐骨神經(jīng)模型中在12毫米神經(jīng)缺損中顯示出希望。將該基本構(gòu)思延伸至更大的關(guān)鍵神經(jīng)缺損要求控制孔互連性從而使血管能夠向內(nèi)生長，避免在軸突延伸期間再生纖維的修剪并保證延伸軸突到達(dá)其靶器官。
為了促進(jìn)成功的成肌細(xì)胞融合，增加且受控的孔互連性是必需的支架特征。此外，在功能性肌肉類器官內(nèi)細(xì)胞的存活是擴(kuò)散限制性的(Dennis，R.G.和Kosnik，P.E.，″Excitability and isometric contractileproperties of mammalian skeletal muscle constructs engineered invitro″In Vitro Cell Dev Biol-Animal 36327，2000)，因此血管組織的向內(nèi)生長對于增加功能性肌肉構(gòu)建物的最大直徑以便增強(qiáng)可收縮性能是必要的。盡管不局限于任何特定的應(yīng)用，但本發(fā)明的某些實施方案(例如鹽融合方法)特別適用于制備用于神經(jīng)和肌肉應(yīng)用的高度互相連接的支架。盡管本發(fā)明不局限于任何特定的理論，但據(jù)信，在促進(jìn)三維細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中孔互連性的重大優(yōu)點有助于神經(jīng)和肌肉組織在組織工程支架中的生長。
實驗下面實施例將用來解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案和方面，但這些并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的任何限定。
在下面的實驗中，應(yīng)用下列縮略語eq(當(dāng)量)、M(摩爾的)、μM(微摩爾的)、N(當(dāng)量的)、mol(摩爾)、mmol(毫摩爾)、μmol(微摩爾)、nmol(毫微摩爾)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、L(升)、dl(分升)、ml(毫升)、μl(微升)、cm(厘米)、mm(毫米)、μm(微米)、nm(納米)、℃(攝氏度)、RDA(代表性差異分析)、nts(核苷酸)、kV(千伏)。
實施例1在本實施例中，生產(chǎn)NaCl框架和生物可降解聚合物支架。對鹽顆粒(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)進(jìn)行過篩以獲得一定大小范圍。使用約250-425微米直徑的NaCl晶體。
利用NaCl作為顆粒孔隙原，通過溶劑澆鑄/顆粒濾出方法或氣體發(fā)泡/顆粒濾出方法制備多孔支架?；旧先鏜ikos，A.G.等人所述制備溶劑澆鑄支架(″聚(L-乳酸)泡沫材料的制備和表征″Polymer 351068，1994；在此將其引入作為參考)。通過使NaCl晶體(直徑約250-425微米)經(jīng)受95％濕度為期0-24小時，從而在溶劑澆鑄之前使NaCl晶體融合，而制備NaCl模子。使用保持在37℃的密閉的、水夾套細(xì)胞培養(yǎng)器(Forma Scientific，Inc.)形成用于NaCl晶體融合的95％濕度環(huán)境。
由Medisorb，Inc.(特性粘度(I.V.)＝0.78dl/g)和Boehringer-Ingelheim Inc.(I.V.＝1.5dl/g)獲得丙交酯∶乙交酯比為85∶15的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)粒料。將高比濃對數(shù)粘度PLG用于溶劑澆鑄方法中，以保證支架盡管其相對高的孔隙率(～97％)還會保持適當(dāng)足夠的機(jī)械完整性。將PLG粒料溶解于氯仿中(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)從而獲得10％(w/v)的溶液。然后，將聚合物溶液倒入如上所述其中鹽晶體已融合的含NaCl模子中。在溶劑蒸發(fā)之后，通過在蒸餾水中浸約48小時而除去鹽。
基本上如Harris，L.D.等人所述制備氣體發(fā)泡的支架(″Open porebiodegradable matrices formed with gas foaming″J Biomed MaterRes 42396，1998；在此將其引入作為參考)。通過使NaCl晶體(直徑約250-425微米)經(jīng)受95％濕度為期0-24小時，從而在溶劑澆鑄之前使NaCl晶體融合，而制備NaCl模子。在95％濕度中處理之后，在進(jìn)一步處理之前，在真空干燥器中對試樣干燥48小時。使用保持在37℃的密閉的、水夾套細(xì)胞培養(yǎng)器(Forma Scientific，Inc.)形成用于NaCl晶體融合的95％濕度環(huán)境。將(如上制得的)PLG粒料溶解于氯仿中。將與PLG混合的融合NaCl的框架裝載入鋁模具中(1.35cm直徑；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin)并利用CarverLaboratory Press(Fred S.Carver，Inc.，Menominee Falls，Wisconsin)在1500Psi下壓制1分鐘，從而獲得固態(tài)圓片(厚度約3.4mm)。然后，將該試樣暴露于高壓CO2氣體(800psi)24小時，從而用氣體飽和聚合物。然后通過使氣壓降至環(huán)境壓力而造成熱力學(xué)不穩(wěn)定性。這將導(dǎo)致二氧化碳?xì)饪自诰酆衔锘|(zhì)內(nèi)的成核和生長。然后，通過在蒸餾水中對基質(zhì)浸濾48小時而從基質(zhì)中除去NaCl顆粒。所有處理步驟均在室溫下進(jìn)行。
支架是圓形片，其直徑約12毫米且厚度約為3毫米。在處理中，通過利用直徑約250-425微米的NaCl顆粒來控制孔大小范圍。利用固態(tài)聚合物已知的密度，測量的支架的聚合物質(zhì)量，以及測量的支架的外部體積，來計算支架的總孔隙率。
實施例2在本實施例中，將對支架進(jìn)行表征。在95％濕度中溫育NaCl晶體導(dǎo)致晶體的融合，從而形成高度互相連接的NaCl基質(zhì)(圖1a-b)。在溶劑澆鑄之前，將融合鹽模對切并成像，以觀察NaCl晶體融合的程度。此外，在制備之后通過冷凍斷裂將聚合物支架二等分。將碳涂層蒸發(fā)至各二等分鹽模和聚合物支架的表面上，并利用在20-30kV操作的Hitachi S-3200N SEM在高真空下使試樣成像。在添加在氯仿中的PLG(溶解澆鑄)之前鹽晶體的融合在支架內(nèi)造成增加的孔互連性。象期望的那樣，在支架內(nèi)的孔結(jié)構(gòu)(圖2)類似于融合鹽基質(zhì)的結(jié)構(gòu)(圖1a-b)。在1小時鹽融合(SF)試樣的橫截面內(nèi)的孔顯示出了在孔壁中具有間斷洞孔的限定的孔結(jié)構(gòu)(圖2a，2c)，而24小時SF試樣所產(chǎn)生的支架的橫截面顯示出了組織條理性差得多的孔結(jié)構(gòu)，并且在孔壁中洞孔的密度很大(圖2b，2d)。隨著融合時間的增加，孔徑尺寸將從1小時融合之后31±10微米的平均直徑明顯增加至24小時融合之后78±21微米(p＜0.05)。此外，在24小時SF支架中的孔壁顯示出厚度輪廓線，因此在鄰近孔壁中洞孔和沿著壁外徑的區(qū)域中，孔壁似乎更厚(圖2d)。更高放大率觀察在24小時SF支架內(nèi)的孔壁進(jìn)一步顯示出孔壁起伏狀的結(jié)構(gòu)(圖2e)。鹽融合過程對支架的孔隙率沒有影響，并且對于每一鹽融合時間，溶劑澆鑄支架的計算的總孔隙率為97±1％。
對NaCl融合1小時和24小時之后形成的溶劑澆鑄支架的電子顯微照片的仔細(xì)觀察表明暴露至95％濕度中使鹽顆粒的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生若干重大的改變。除了在接觸點處顆粒間形成橋連以外，鹽的單獨顆粒中，邊緣和棱角的曲率半徑增加了(圖1a和1b)。這些改變由圖表示(圖3)。利用MicrosoftTMPaintTM軟件，根據(jù)電子顯微照片計算鹽晶體的曲率半徑。對各圖像的象素大小進(jìn)行校準(zhǔn)，并用鉛筆工具在結(jié)晶邊緣上標(biāo)記相切點。然后用校準(zhǔn)值和象素坐標(biāo)來計算相切點之間的弦線長度，將其乘以(2/2，以便獲得晶體的曲率半徑。利用microsoft paint測量各洞孔主要的和次要的直徑軸，并取平均值，來確定孔壁中洞孔的直徑。在鹽的各顆粒的邊緣和棱角處曲率半徑的增加使各顆粒的球形度增加(圖4)，并因此使支架中每個所得的孔的球形度得以增加。晶體邊緣的平均曲率半徑從19±10微米增加至暴露至95％濕度12小時之后的32±15微米，然后增加至完整24小時暴露之后的62±18微米(圖4)。結(jié)果，在24小時融合之后，許多較小的晶體變成幾乎為球形。一個另外的結(jié)果是，在由各鹽晶體的棱角和邊緣所空出的空間中可以形成更厚的聚合物支柱，這可能會導(dǎo)致如上所述孔壁中的厚度輪廓線，并導(dǎo)致變化的機(jī)械性能。
在氣體發(fā)泡之前在PLG/NaCl粒料中鹽晶體的融合也導(dǎo)致孔結(jié)構(gòu)的明顯變化。1小時SF試樣的橫截面(圖5a，5c)示出了類似于溶劑澆鑄1小時SF試樣的孔壁中的小洞孔。24小時鹽融合的試樣缺乏限定的孔結(jié)構(gòu)，并且孔看來似乎簡單地彼此進(jìn)入(圖5b，5d)。氣體發(fā)泡的SF支架沒有顯示出在溶劑澆鑄SF試樣中觀察到的在孔壁中的任何輪廓線。同樣，鹽融合過程對總支架孔隙率也沒有影響。對于各種鹽融合時間，氣體發(fā)泡支架的總孔隙率為94±1％。
鹽晶體融合24小時造成溶劑澆鑄支架的壓縮模量增加2倍(圖6a)。支架的壓縮模量利用MTS Bionix 100機(jī)械測試體系來測量。利用1mm/min的恒定變形速率，在壓盤之間對試樣進(jìn)行壓縮。壓板的直徑為45毫米，因此將覆蓋支架的整個12毫米直徑的表面。將小的預(yù)載荷施加至各試樣上，以保證整個支架表面在測試之前與壓板接觸，并且在每次測試之前板間距等于所測試的支架的測量厚度。對未經(jīng)鹽融合的支架以及各鹽融合時間的四個試樣的每一個測量壓縮模量。在圖中的值表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用InStatTM軟件(2.01版)進(jìn)行統(tǒng)計分析。在每個時間點，通過Student′s t-檢驗，將試驗?zāi)Ａ颗c對照模量進(jìn)行對比，從而揭示出壓縮模量的顯著差異。在鹽融合1小時或12小時之后，沒有觀察到明顯的模量改變。另外，當(dāng)與對照支架相比較時，利用鹽融合處理的氣體發(fā)泡支架的壓縮模量存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的減小(圖6b)。
實施例3在本實施例中，本發(fā)明的支架用來培養(yǎng)細(xì)胞。通過γ照射，環(huán)氧乙烷或冷殺菌劑對支架進(jìn)行滅菌。如果需要的話利用任何必需的生長因子，在合適的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞接種至支架上。細(xì)胞培養(yǎng)基可以借助分批補(bǔ)料或借助灌注的方法來更換。不論何時總是保持無菌。
實施例4在本實施例中，用本發(fā)明的支架將組織植入試驗受試者的體內(nèi)。在其它的實施例中，在沒有組織或細(xì)胞的情況下支架用于直接植入，以使得細(xì)胞能夠從身體進(jìn)行傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性遷移。從16只小鼠取活組織檢查。從任何非造血組織或造血組織取活檢?；罱M織檢查取自所有試驗動物的同一組織源。本實施例可以根據(jù)所需在許多種組織類型上進(jìn)行。通過膠原蛋白酶處理將細(xì)胞與基底膜和合胞體解離。將來自8只小鼠的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。從另8只老鼠得到的細(xì)胞在本發(fā)明的支架上進(jìn)行培養(yǎng)。在約7-21天的培養(yǎng)之后，將細(xì)胞或帶有細(xì)胞的支架再植回至各小鼠身上。追蹤觀察表明，本發(fā)明的細(xì)胞/支架植入物中有血管陷入并且維持三維結(jié)構(gòu)。追蹤觀察表明，在沒有本發(fā)明支架的情況下所培養(yǎng)的細(xì)胞散入宿主動物中，并且既沒有血管陷入，也沒有維持可識別的三維結(jié)構(gòu)。在其中細(xì)胞從周圍組織遷移入支架的實施例中，追蹤觀察表明，支架中細(xì)胞的建立伴有循環(huán)血管的陷入。
正如由前述很明顯的是，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)組織工程支架的新穎的組合物和方法。這些新穎的組合物和方法能夠有效生產(chǎn)孔徑大小和互連性一致的生物相容的結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露于所述孔隙原融合在一起的條件下，以產(chǎn)生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進(jìn)行處理，以使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(c)中填充大于75％的自由空間。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述孔隙原由鹽晶體組成。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述鹽晶體選自氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物選自聚酯、聚(α-羥基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚醚是聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(d)的處理包括使聚合物溶劑蒸發(fā)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(e)的除去包括溶解所述融合的鹽晶體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(b)的條件包括使所述鹽晶體暴露于約90％和約100％之間的相對濕度中約8-約28小時。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述支架在步驟(e)之后包含細(xì)胞。
12.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露于所述孔隙原融合在一起的濕度下，以產(chǎn)生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述溶液進(jìn)行處理，以使所述聚合物形成支架；和e)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在步驟(c)中填充大于75％的自由空間。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述孔隙原包含鹽晶體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述鹽晶體選自氯化鈣、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、磷酸鈣和氯化鎂。
16.權(quán)利要求12的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物選自聚酯、聚(α-羥基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述聚醚是聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述步驟(d)的處理包括使聚合物溶劑蒸發(fā)。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述步驟(e)的除去包括溶解所述融合的鹽晶體。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所述步驟(b)的條件包括使所述鹽晶體暴露于約90％和約100％之間的相對濕度中約8-約28小時。
22.權(quán)利要求12的方法，其中所述支架在步驟(e)之后包含細(xì)胞。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述步驟b)另外還包括將所述孔隙原暴露于正壓，以使所述融合孔隙原之間的所述自由空間得以控制。
24.一種方法，包括a)提供i)大量顆粒，所述顆粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述顆粒暴露于所述孔隙原融合在一起的條件下，以產(chǎn)生包含框架和在所述融合孔隙原之間的自由空間的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空間的條件下，使所述骨架與所述溶液接觸；d)對所述骨架和溶液進(jìn)行壓縮，以形成固態(tài)物質(zhì)；e)使所述固態(tài)物質(zhì)暴露于高壓氣體；f)使氣體壓力減至環(huán)境壓力；和g)從所述支架中除去所述融合的孔隙原。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的壓縮在100和2000psi之間。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述的氣體壓力在400和1200psi之間。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述固態(tài)物質(zhì)是半固體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)支架的方法和組合物，所述支架可用于包括組織工程在內(nèi)的多種目的。更具體地說，本發(fā)明涉及利用融合晶體如融合的鹽晶體來形成骨架。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明支架的生產(chǎn)方法改善了孔隙率、互連性并且易于制備。
文檔編號A61L27/56GK1617669SQ02827998
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月2日
發(fā)明者W·L·莫菲, R·G·丹尼斯, D·J·穆尼 申請人:密歇根大學(xué)董事會