專利名稱：用于診斷和治療b細胞惡性腫瘤的b細胞淋巴瘤特異性抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及分子，例如肽和抗體，其與B細胞淋巴瘤特異性抗原(“BLSA”)相結(jié)合。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤經(jīng)常表達典型抗原或“標(biāo)記”，其提供腫瘤預(yù)防抵抗或治療的機制。這些以腫瘤為特征的抗原可以進行提純和配制成疫苗。這可以刺激有助于控制腫瘤生長的抗體反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)。在最小值時，由這些抗原引起的抗體可用作探測工具來監(jiān)控宿主中與淋巴瘤相關(guān)的標(biāo)記以便于跟蹤疾病的進程、識別在通常無癥狀的疾病初期階段的患者，或者監(jiān)控治療的效果。
B細胞淋巴瘤顯著地影響世界范圍內(nèi)癌癥死亡率。此疾病分階段發(fā)展。在初期階段，B細胞淋巴瘤常常是無痛疾病，其特征是具有相當(dāng)長半衰期的小的成熟的功能不完全惡性B細胞的積聚。最終，惡性B細胞倍增時間減少且患者癥狀日益明顯。盡管治療可以提供癥狀的減輕，但是患者的總存活期僅受到最低限度的影響。在晚期階段，顯著的貧血和/或血小板減少成為疾病的特征。由于細胞增殖的速率非常低，而且這種類型的B細胞淋巴瘤經(jīng)常抵抗通用治療，因此疾病導(dǎo)致死亡。
B細胞淋巴瘤顯著地影響世界范圍內(nèi)癌癥死亡率。此疾病分階段發(fā)展。在初期階段，B細胞淋巴瘤常常是無痛疾病，其特征是具有相當(dāng)長半衰期的小的成熟的功能不完全惡性B細胞的積聚。最終，惡性B細胞倍增時間減少且患者癥狀日益明顯。盡管治療可以提供癥狀的減輕，但是患者的總存活期僅受到最低限度的影響。在晚期階段，顯著的貧血和/或血小板減少成為疾病的特征。由于細胞增殖的速率非常低，而且這種類型的B細胞淋巴瘤經(jīng)常抵抗通用治療，因此疾病導(dǎo)致死亡。
B細胞淋巴瘤通用的診斷方法包括通常是通過針或外科活體解剖采集一個組織樣品，然后對該組織中的癌性細胞進行分析。通常，采集一個血樣并由病理學(xué)者分析B細胞的惡性。惡性細胞的存在表明病人有B細胞淋巴瘤。
治療B細胞淋巴瘤的通用方法取決于疾病的階段和程度。在疾病初期階段的成年患者可以用帶有或不帶有化學(xué)療法的局部放射療法進行治療。更晚期但是低程度疾病的患者可以保持不治療、觀察和等候策略，只要無癥狀或無淋巴瘤相關(guān)的器官損害發(fā)生。當(dāng)治療變得必要時，其選擇通常包括單一試劑烷化劑化學(xué)療法、不含蒽環(huán)霉素(anthracycline)的低強度聯(lián)合化學(xué)治療和全身放射療法。這些治療B細胞淋巴瘤的傳統(tǒng)方法由于毒性副作用而常常限制其效用。定向于放射性核素、毒素，或這些癌性細胞的其他治療劑的單克隆抗體的用途提供了可選擇的方法以用于限制自藥物所產(chǎn)生的副作用和對正常組織的損害，其被認為是單克隆抗體療法。
其單克隆抗體本身可以提高患者對癌癥的免疫反應(yīng)。同其他癌癥一樣在對淋巴瘤的抗體治療中也看到了一些抗癌作用。單克隆抗體也可用于其它方法。這些抗體可與化學(xué)治療藥劑結(jié)合并聯(lián)合用藥。本方法允許自化學(xué)治療的化學(xué)藥品和自抗體的免疫反應(yīng)接近細胞。并且，當(dāng)通過單克隆抗體使細胞削弱時化學(xué)治療會更有效。另外，單克隆抗體療法可與放射治療相聯(lián)合。對于本方法，單克隆抗體含有諸如放射性碘的放射性物質(zhì)，其對準(zhǔn)和破壞癌細胞。本方法允許有毒細胞接收大量放射線而正常組織僅接收相當(dāng)少的放射線。同樣，也證實了示蹤的放射性同位素在診斷某種類型癌癥上有用。另外，單克隆抗體也可以與其他形式的生物反應(yīng)改性劑(BRM)或毒素相聯(lián)合。當(dāng)連接的抗體同癌細胞結(jié)合時，他們立即釋放這些物質(zhì)給腫瘤，藉此希望破壞癌細胞。
單克隆抗體療法已經(jīng)顯示有希望治療某些類型的淋巴瘤，例如非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)。幾種單克隆抗體已可用或者處于試驗階段，例如RituxanTM(IDECPharmaceuticals公司，抗-CD20抗體)、BexxarTM(Corixa/GlaxoSmithKline，配屬于NHL治療的含有放射性碘131的抗-CD20抗體)和OncolymTM(PeregrinePharmaceuticals公司，含有碘131放射性同位素的抗-HLA-Dr10抗體)?？梢酝ㄟ^注射人類癌細胞到老鼠和允許此鼠科動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對癌細胞的特異蛋白質(zhì)的抗體來制成單克隆抗體。采集制成抗體的細胞并同長生細胞(immortal cell)進行融合以形成雜交細胞。這些雜交細胞產(chǎn)生大量的與治療癌癥細胞的特異蛋白質(zhì)相結(jié)合的純單克隆抗體。就B細胞淋巴瘤而言，以上所討論的抗體定向于蛋白質(zhì)CD20。這種形式治療的一個優(yōu)勢在于CD20不表達于前B細胞淋巴瘤，而僅表達于成熟的B細胞。
因此，不斷地需要供診斷和治療該疾病的新穎方法，尤其是高度表達于前B細胞淋巴瘤細胞的抗原。本發(fā)明提供了這樣的抗原，一種最近經(jīng)確定的B細胞特異蛋白-BLSA。我們發(fā)現(xiàn)BLSA特定地表達于B細胞并且在包括前B細胞淋巴瘤的B細胞淋巴瘤細胞系中經(jīng)受刺激。因此BLSA是供診斷和治療包括諸如NHL和彌散大B細胞淋巴瘤(BLBCL)的惡性B細胞疾病的新目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明定向于診斷和治療B細胞介導(dǎo)的疾病，包括但不限于B細胞淋巴瘤，例如低級別/小囊非霍杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中等級別/卵泡細胞NHL、中等級別彌散NHL、高級別免疫母細胞NHL、高級別免疫母細胞(inimunoblastic)NHL、高級別小無裂細胞NHL、巨大腫塊NHL、彌散大B細胞淋巴瘤(BLBCL)、淋巴漿細胞淋巴瘤和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥。這些異常B細胞疾病的治療可以單獨或者與通常使用的治療組合來完成，例如細胞素、放射線療法、骨髓去除治療和化學(xué)療法。
本發(fā)明的一個方面包括其定向于供治療B細胞淋巴瘤或其他B細胞介導(dǎo)的疾病的BLSA的疫苗的生產(chǎn)和投用。
本發(fā)明的另一方面包括對體內(nèi)蛋白質(zhì)的BLSA表達進行編碼以在患者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的核苷酸構(gòu)造，或者產(chǎn)生用于形成多克隆或單克隆抗體的蛋白質(zhì)抗原。本發(fā)明也包括用于控制BLSA表達的核苷酸構(gòu)造。這些核苷酸序列可以是表達載體、反意義構(gòu)造、結(jié)合體或含有片斷的表位的形式。
本發(fā)明的另一方面包括提供與B細胞淋巴瘤特異抗原(BLSA)相互作用的化合物。這種相互感應(yīng)可用于診斷BLSA的存在和其存在可同患者發(fā)展B細胞調(diào)節(jié)疾病的存在或可能性之間的相互關(guān)系。此相互感應(yīng)可用于治療經(jīng)診斷為患有B細胞介導(dǎo)的疾病的病人，這是通過利用相互感應(yīng)殺死該細胞或者當(dāng)用其他療法治療時使該細胞易于死亡而實現(xiàn)的。其他的化合物包括與BLSA相結(jié)合來控制其表達和/或作用的小分子。
本發(fā)明的另一方面包括篩選與BLSA相互作用的促效劑或拮抗劑。
本發(fā)明的另一方面包括用于使病人對B細胞淋巴瘤或其他B細胞介導(dǎo)的疾病免疫的方法和在這些方法中有用的抗原構(gòu)造。
本發(fā)明其他和另外的目的、特點和優(yōu)勢對于熟悉此技術(shù)的人來說是很顯然的。
具體實施例方式
定義術(shù)語“B細胞淋巴瘤特異抗原”或“BLSA”的意思是具有SEQ ID NO1所顯示的序列的多肽或者其天然存在的變異體。
術(shù)語“B細胞淋巴瘤”的意思是一個或多個B細胞介導(dǎo)的疾病，其特征為存在BLSA和特別地存在升高水平的BLSA。
術(shù)語“變異體”的意思是在一個或多個氨基酸上不同于BLSA(包括變型、替代、插入和刪除)，及具有同BLSA相同或相似的生物學(xué)功能的氨基酸序列。
術(shù)語“促效劑”的意思是促進、增加或刺激BLSA的正常功能或其表達的任一分子。一種類型的促效劑是以模仿包括抗體或抗體片斷的BLSA的配位體的形式來與其相互作用。
術(shù)語“拮抗劑”的意思是阻塞、阻止、抑制或壓制BLSA的正常功能及其表達的任一分子。一種類型的拮抗劑是干擾BLSA同包括抗體或抗體片段的配位體之間的相互作用的分子。另一類型的拮抗劑是抑制原有BLSA活化受體的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄的反意義核苷酸。
文中所用的術(shù)語“反意義”是指任何包含互補于特異DNA或RNA序列的核苷酸序列的組合物。所用的術(shù)語“反意義鏈”是關(guān)于互補于“意義”鏈的核酸鏈。反意義分子包括肽核酸并且可通過任何包含合成或轉(zhuǎn)錄的方法來產(chǎn)生。一旦引入到一個細胞，互補的核苷酸就與由細胞產(chǎn)生的正常序列相互結(jié)合而形成復(fù)式并阻塞轉(zhuǎn)錄或翻譯。名稱“負”有時用于指反意義鏈，而“正”有時用于指意義鏈。
術(shù)語“剔除”是指至少一份經(jīng)單細胞、選定細胞或哺乳動物的所有細胞的內(nèi)生基因(例如BLSA)解碼的多肽表達的部分或完全減少。該哺乳動物可能是具有一方經(jīng)破壞的內(nèi)生基因的等位基因的“雜合剔除”或者具有雙方經(jīng)破壞的內(nèi)生基因的等位基因。
術(shù)語“抗體片段”是抗體的一部份，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等。不考慮結(jié)構(gòu)，抗體片段同經(jīng)完整抗體確認的相同的抗原相結(jié)合。例如，抗BLSA單克隆抗體片斷與BLSA的一個表位相結(jié)合。術(shù)語“抗體片段”也包括任何合成或遺傳的工程蛋白，其通過與特異抗原相結(jié)合以形成復(fù)合體而起到與抗體一樣的作用。例如，抗體片斷包括由輕鏈可變區(qū)域組成的分離的片斷、由重鏈和輕鏈組成的“Fv”片斷、其輕鏈和重鏈可變區(qū)域由肽連接器(“sFv蛋白質(zhì)”)連接的重組單鏈多肽分子及由模仿超變量區(qū)域的氨基酸殘基所組成的最小識別單元。
本發(fā)明不限于文中所述的特殊的方法論、方案、細胞系、載體和反應(yīng)物，因為這些可能發(fā)生變化。另外，本文所用術(shù)語僅為描述特殊實施例的目的而并不是要限制本發(fā)明的范圍。除非上下文另有明確規(guī)定，那么文中和附加的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一(a)”“一(an)”“該(the)”均包括復(fù)數(shù)基準(zhǔn)，例如可參考“一種宿主細胞”包含多個此類宿主細胞。
除非另有定義，文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語及任何縮略語具有與本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常理解相同的含義。盡管與文中所述相似或等同的任何方法和物質(zhì)均可用于實施本發(fā)明，但是優(yōu)選的方法、裝置和物質(zhì)在文中有所描述。
文中所提及的所有專利和出版物以法律所允許的程度并入本文，其目的是描述和揭示蛋白質(zhì)、酶、載體、宿主細胞和所報告的可能同本發(fā)明一起使用的方法論。然而，本文決不可解釋為承認本發(fā)明無權(quán)通過先前發(fā)明來提前公開此揭示。
發(fā)明本發(fā)明提供B細胞淋巴瘤疫苗、BLSA特異抗體和診斷工具。BLSA的核酸序列描述于SEQ ID NO 1且氨基酸序列描述于SEQ ID NO2。
B細胞淋巴瘤疫苗的活性成分是B細胞淋巴瘤-特異抗原BLSA或其至少具有一個表位的片斷。與抗原結(jié)合的B細胞淋巴瘤可通過自細胞、組織、淋巴瘤本身的提純而獲得或利用重組技術(shù)來合成。因為BLSA是人類中原有的蛋白質(zhì)，因此BLSA的疫苗構(gòu)造可包括，例如T細胞表位或其他超過宿主對抗原的免疫耐受性的抗原助劑。
BLSA特異抗體可通過常見方法來制備，例如Kohler和Milstein(Nature)(London，256495，1975年)所揭示的細胞與細胞融合以產(chǎn)生單克隆抗體，但是可以是多克隆或單克隆的，包括嵌合的、人源化的、人類的、去免疫的、雙特異的及異質(zhì)結(jié)合的抗體?？贵w也可以重組制備?？贵w可投用于治療或用于診斷工具。在補體控制溶菌中這些抗體自身用作治療的目的，或者與毒素偶合或者與治療半族分子相偶合，例如蓖麻蛋白、細胞素。
診斷工具包括監(jiān)測宿主中與淋巴瘤相關(guān)的標(biāo)記物的分析和工具以便于跟蹤疾病過程、確定具有初期無癥狀階段的疾病的病人，或者監(jiān)控治療效用。
至此已經(jīng)概括敘述了本發(fā)明，可通過參考本文所包括的更詳細描述和某些僅用來說明且無意限制(除非另有說明)的特定實例而對此做更深入的理解。
診斷工具我們發(fā)現(xiàn)用于篩選或診斷患有B細胞淋巴瘤的病人的新目標(biāo)物。BLSA極高度表達于B淋巴瘤及特別是顯示于前B細胞淋巴瘤。(參看下文的表1和2)單克隆抗體的淋巴瘤的免疫表型特征研究證明對于組織診斷是有價值的附屬物且有利于理解某些淋巴瘤的種類。探測不同抗原的單克隆抗體已用于或建議用于許多研究目及用于人類和動物中白血病和淋巴瘤的診斷研究。所采用的技術(shù)包括(但不限于)1.白血球表型識別，利用流式細胞計數(shù)儀、免疫熒光法、免疫酶技術(shù)或免疫電子顯微鏡方法。
2.白血球分離技術(shù)，包括流式細胞計數(shù)儀和篩選。
3.淋巴瘤的識別和分級。
4.動物和人類中淋巴瘤的放射免疫影像。
5.動物和人類中淋巴瘤的放射免疫治療。
6.在試驗?zāi)Ｐ秃腿祟惣膊≈邪籽蚍只⒊墒旌凸δ艿难芯俊?br> 可用標(biāo)記物給抗體或抗原做記號而通過在本技術(shù)中已為我們所知的方法的變化來探測經(jīng)診斷的抗原-抗體反應(yīng)。通常所用的標(biāo)記物為色原體，例如熒光染料、酶、放射性及不透射線的化合物。熒光染料是吸收放射線的染料，例如紫外光，此染料經(jīng)受紫外光而激活且結(jié)果為發(fā)射可見光?？捎米鳂?biāo)記物的熒光染料可以與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵且具有以帶有不同于組織的顏色的可見光譜的高熒光發(fā)射。通常所用的熒光染料為熒光素異硫氰酸鹽(FITC)和三甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)。
使用熒光染料標(biāo)記物作標(biāo)記的抗體的方法通常稱為免疫熒光方法。在所謂的“直接方法”中用熒光染料標(biāo)記的抗體應(yīng)用于制備包含相應(yīng)抗原。在“間接方法”中抗原用相應(yīng)的未標(biāo)記的抗體進行處理，且合成的抗原-抗體復(fù)合物利用經(jīng)由熒光染料做標(biāo)記的動物類免疫球蛋白的抗體來進行處理，該動物類提供第一步所用的未標(biāo)記抗體。在診斷免疫學(xué)中，含有抗原的基質(zhì)可用患者的血清來培養(yǎng)，然后用熒光染料標(biāo)記的小鼠、小兔或小羊?qū)θ祟惷庖咔虻鞍椎目贵w來培養(yǎng)。間接方法提供更高的靈敏性。為了探測螢光免疫檢驗法樣品，可使用經(jīng)普通透射光顯微鏡簡單更改的熒光顯微鏡。若有必要，可通過顯微鏡照相術(shù)來記錄結(jié)果。
在與基質(zhì)相互作用時如果形成可檢測沉淀劑或可視發(fā)射，則酶也可用于標(biāo)記。在經(jīng)酶標(biāo)記的抗體輔助下免疫酶過程可用于定位抗原。已采用幾種酶作為標(biāo)記物，例如辣根過氧化酶和堿性磷酸酶。廣泛使用通過由酶結(jié)合的抗體來探測抗原的的方案稱為酶結(jié)合免疫吸收分析法(ELISA)，其可以直接方法或夾層形式進行。
可使用任一廣泛所知的放射性核素作為放射性標(biāo)記物。合適的放射性核素包括Tc-99m、I-123、In-111、In-113m、Ga-67或其他合適的γ-發(fā)射體。可通過常見技術(shù)使放射性核素同單克隆抗體相結(jié)合。例如，可利用“S.Mills sup.123I-Radiolabeling of Monoclonal Antibodies for In Vivo Procedures，Hybridoma5，265-275(1986)”中所述的氯胺T方法來完成碘酸鹽。此技術(shù)可用于引起碘酸鹽提供不透射線抗體或連接于放射線核素，例如I-125或I-131。其他的放射線核素可通過用苯甲基EDTA或DPTA結(jié)合過程的螯合作用而與抗體相結(jié)合。其他合適的技術(shù)包括碘化法(iodogen method)，其展示于M.Pimm等人的“In VivoLocalization of Anti-Osteogenic Sarcoma 791T Monoclonal Antibody，Int.J.Cancer.30，75(1982)”；及含有放射性碘化鈉的直接碘酸鹽。
適合于為抗體對抗體進行標(biāo)記的不透射線物質(zhì)包括碘化合物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物等。特殊的不透射線物質(zhì)的實例包括鋇、泛影葡胺、乙硫磷化油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他(iocetamic)酸、碘達酸、碘帕醇、碘多卡(iodoxamic)酸、碘古拉酸(iogulamide)、碘海醇(iohexol)、碘異酞醇、碘番酸、碘潑西(ioprocemic)酸、碘西法酸、碘蘇拉酸(iosulamide)、甲葡胺、碘蘇米(iosumetic)酸、碘他蘇酸(iotasul)、碘四酸、碘他拉酸、碘托西酸、碘克沙酸、碘卡唑(ioxotrizoic)酸、ipodate、甲葡胺、甲泛葡酸、甲基三元影酸、丙碘酮和氯化亞鉈。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用來顯現(xiàn)病變的方法。一種用來顯現(xiàn)以某些淋巴瘤為特征的病變的方法可包含以下步驟獲得BLSA特異的單克隆抗體；對該抗體進行標(biāo)記；用獲得自哺乳動物的生物樣品接觸該經(jīng)標(biāo)記的抗體及顯現(xiàn)該標(biāo)記。為達到此目的，可對抗BLSA抗體進行標(biāo)記。合適的標(biāo)記物包括，例如放射性同位素示蹤、不透射線物質(zhì)和磁共振增強物質(zhì)。放射性同位素示蹤和不透射線物質(zhì)在上面已有所討論。定位于表達抗體的組織中的用于表達標(biāo)記的合適技術(shù)在該技術(shù)中已為人所知。例如，如果標(biāo)記物是γ-發(fā)射放射性核素，那么合適的表達技術(shù)包括γ照相機和單光子發(fā)射計算機體層成像(SPECT)技術(shù)。如果抗體經(jīng)不透射線物質(zhì)進行標(biāo)記，那么可應(yīng)用射線成像現(xiàn)象。其他合適的技術(shù)包括軸向計算層析成像技術(shù)(CAT)掃描、熒光透視法和常見的X射線成像。
可探測或增強磁共振成像設(shè)備效果的物質(zhì)也可以與抗體相結(jié)合。合適的常見磁共振增強化合物包括釓、銅、鐵和鉻。這些金屬原子可以常見有機金屬螯合物的形式來制備，其后與抗體結(jié)合。前述方法連同其他免疫診斷常規(guī)技術(shù)一起揭示于標(biāo)準(zhǔn)實驗課本。參看例如Rose，N.R.和Pierluigi E.B.的“in Methods inImmunodiagnosis，第二版，John Wiley&Sons出版，紐約，奇切斯特，布里斯班，多倫多，1980年；Current Protocols in Molecular Biology，Green PublishingAssociates和Wiley-Interscience，1987年”。
本發(fā)明也提供用于檢測患者中嚴重級別BLSA存在的方法。該方法對于確定病人是否患有B細胞淋巴瘤、對于監(jiān)測疾病的進展和階段或者監(jiān)測疾病治療的效果是有用的。方法包括自患者采集樣品；暴露樣品至同BLSA相互作用的分子及檢測BLSA與該分子之間存在的相互作用或測定所形成產(chǎn)物的量。
此樣品可為含有B細胞的生物液體或組織，包括血液。通過任何廣泛所知的方式來采集樣品，例如，活體解剖或自患者簡單抽血。
與BLSA相互作用的分子可為，例如小分子蛋白質(zhì)、肽、抗體、寡核苷酸或配位體。優(yōu)選的分子是與BLSA特定結(jié)合的抗體。分子與BLSA之間的相互租用可通過任何為人所知的方式來檢測，例如熒光測定法、化學(xué)發(fā)光、ELISA、FACS分析和固相RIA等。當(dāng)該分子為與BLSA相結(jié)合的抗體時，較優(yōu)的檢測方法為ELISA。
檢測BLSA表達水平的方法包含PCR的測定，例如實時定量PCR。此方法可利用寡核苷酸引物來進行，例如FCAGAGCCCCCAGCTAGAGATC(SEQ ID NO 3)RGTGCAGCAGAGCTGGAAGC (SEQ ID NO 4)FGCAGTGGCATCTTCCAGAGC (SEQ ID NO 5)RCAGATGCTGTTTCTGGGATCC(SEQ ID NO 6)FGATCAGAGTGCAGGGTGCTTC(SEQ ID NO 7)RGGATTCAATGTGGGAGGTGC (SEQ ID NO 8)FGTGAGGGACCTGTCTGCACTG(SEQ ID NO 9)RAGTCATCCTCCGTGTGGCA (SEQ ID NO 10)FGAATTCCAGATCCCCACAGCT(SEQ ID NO 11)RACACCAGTATGACCCGGAGTG(SEQ ID NO 12)FCGGGCCTAACAGGGAATTCT (SEQ ID NO 13)RCCCGCTGTCTGCCTTTTGTA (SEQ ID NO 14)FCCTCCCACATTGAATCCAGC (SEQ ID NO 15)RGAGCAGTTCCTGGAGCAGCT (SEQ ID NO 16)FTGTGAGGGACCTGTCTGCAC (SEQ ID NO 17)
RAGGTCATCCTCCGTGTGGCA(SEQ ID NO 18)FGGCTGATCCTCCAAGGTCC (SEQ ID NO 19)RACCAGCAGGTCCCCTTCAA (SEQ ID NO 20)由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通過為人所知的技術(shù)經(jīng)其他引物組可易于確定。本方法也包括通過比較患者與正常組織之間的表達水平來測定BLSA的相對表達。
本發(fā)明也包括診斷套組，其包含例如，對BLSA的特異抗體或者用于檢測BLSA表達水平的引物。
促效劑和拮抗劑在另一方面，本發(fā)明提供與BLSA特定結(jié)合及抑制或激活其表達或作用的促效劑和拮抗劑。促效劑和拮抗劑類型包括(但不限于)多肽、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核苷酸、有機分子、生物有機分子、肽模擬物、藥物試劑及其代謝物和轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控序列。
在一具體實施例中，促效劑和拮抗劑是反意義寡核苷酸或其他的核酸構(gòu)造，該構(gòu)造用于調(diào)控BLSA編碼核酸分子的功能，并最終調(diào)控所產(chǎn)生BLSA的量。通過提供特定地與一個或多個BLSA編碼核酸雜交的反意義化合物來完成該過程。寡聚化合物同其目標(biāo)核酸的特定雜交干擾正常核酸功能。受干擾DNA的功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。受干擾的RNA功能包括所有生命機能，例如，RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、RNA剪接以產(chǎn)生一個或多個mRNA式樣及由RNA參與或促進的催化活性。對目標(biāo)核酸功能的總體影響是BLSA表達的控制。在本發(fā)明的上下文中，“控制”意思是基因表達上的增加(刺激)或減少(抑制)。在本發(fā)明的上下文中，抑制是優(yōu)選的基因表達控制形式且mRNA是優(yōu)選目標(biāo)。確定BLSA的反意義化合物的“目標(biāo)”包括為發(fā)生反意義相互作用而在該基因內(nèi)測定一個位點或多個位點以致于達到所希望的結(jié)果，例如蛋白質(zhì)表達的檢測或控制。優(yōu)選的基因內(nèi)位點是BLSA開放閱讀框(ORF)的翻譯起始或中止密碼子的周圍區(qū)域。該反意義技術(shù)的方法論有所揭示，例如，在“Crooke STBasic Principles of antisensetechnology.In Antisense Drug Technology-Principles，Strategies andApplications.Crooke ST編，紐約Marcel Dekker公司；20011-28”。
在另一具體實施例中，拮抗劑可以是通過RNA干擾(RNAi)途徑的小分子干擾RNA(siRNA)，其對BLSA利用短(大概21~23bp)雙鏈RNA來分解從而噪音抑制其表達。雙重siRNA可根據(jù)文獻所述的原則來設(shè)計(Elbashir，SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K和Tuschl T.(2001).Duplexes of 21-nucleotideRNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature411，494-498)，及以諸如病毒介導(dǎo)策略的多樣形式來使用(Xia，H.等(2002)siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.Nature Biotechnology201006)。
促效劑和拮抗劑可以是特定結(jié)合于BLSA的抗體且影響其生物作用和/或功能，例如激發(fā)或抑制BLSA的產(chǎn)生。抗體可以是多克隆或單克隆抗體但是優(yōu)選的為單克隆抗體。
促效劑抗體用于預(yù)防或治療以相比無疾病情形的相當(dāng)?shù)偷腂LSA表達水平為特征的疾病。拮抗劑抗體用于預(yù)防或治療以對比無疾病情形的相當(dāng)高的BLSA表達水平為特征的疾病。
促效劑、拮抗劑和本發(fā)明的方法可用于治療各種B細胞淋巴瘤，包括低級別/卵泡細胞非霍杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中等級別/卵泡細胞NHL、中等級別彌散性NHL、高級別免疫母細胞NHL、高級別淋巴母細胞NHL、高級別小無裂細胞NHL、巨大腫塊NHL和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很清楚由于改變分類體系而該等淋巴瘤經(jīng)常會有不同的名稱，且患有在不同名稱下分類的淋巴瘤的病人可能也受益于本發(fā)明的組合治療方式。
例如，由歐洲和美國病理學(xué)者提議的最新分類提議叫做修訂的歐美淋巴瘤(REAL)分類。此分類體系確認了其他周邊B細胞腫瘤中的套細胞淋巴瘤和邊緣細胞淋巴瘤，且將某些分類分成基于細胞學(xué)的級別，即小細胞、混合的大小細胞和大細胞。可以理解所有經(jīng)分類的淋巴瘤可以受益于本發(fā)明的組合治療。
美國國立癌癥研究院(NCI)依次將某些REAL分類劃分成臨床上更有用的“無痛”或“惡性”淋巴瘤標(biāo)示。無痛淋巴瘤包括分成細胞學(xué)“級別”的卵泡細胞細胞淋巴瘤；彌散性小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞白血病(CLL)、淋巴漿細胞類囊腫/Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、邊邊緣區(qū)域淋巴瘤和毛細胞白血病。惡性淋巴瘤包括彌散性混合及大細胞淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤/彌散性小無裂細胞淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤和與艾滋病相關(guān)的淋巴瘤。該等淋巴瘤也可以受益于本發(fā)明的組合治療方式。
非霍杰金氏淋巴瘤已以基于包括低級別、中度級別及高級別淋巴瘤的其他疾病特征的“級別”為基礎(chǔ)進行分類。低級別淋巴瘤通常以節(jié)疾病出現(xiàn)，且經(jīng)常無痛或者慢性發(fā)展。中度及高級別疾病通常以帶有節(jié)外巨大腫瘤的極度惡性疾病而存在。中度和高水平疾病同低水平NHL一樣，可以受益于本發(fā)明的組合治療方式。
BLSA特異性抗體也可以直接與其他殺死患病細胞的化合物結(jié)合，使得患病細胞更易于致死，例如噬菌作用，或者導(dǎo)致患病細胞經(jīng)受下垂。抗體可以可操作性地與以下藥物結(jié)合，例如，化學(xué)療法藥劑；放射療法藥劑；諸如血管生成素(angiopoietin)、血管抑素(angiostatin)、血管抑制素(vasculostatin)、血管生成抑制因子(canstatin)或腫瘤抑制基因(maspin)的抗血管新生藥劑；細胞死誘發(fā)劑；類固醇；抗代謝物；蒽環(huán)霉素；長春生物堿；抗微管蛋白藥劑，例如秋水仙堿、紅豆杉醇、長春花堿、長春新堿、vindescine；及combretastatin；抗生素；細胞素；烷基化劑或凝結(jié)劑；可以殺死或抑制淋巴瘤細胞的成長與細胞分裂的細胞毒素或細胞抑制劑或抗細胞劑；衍生自植物或菌類或細菌的毒素，例如細胞細胞A鏈、脫糖基化蓖麻細胞A鏈；鈍化蛋白質(zhì)或α-帚曲菌素或gelonin或曲霉素或局限曲霉素的核蛋白體；核糖核酸酶；表鬼臼脂素或白喉毒素或假單胞菌外毒素。
BLSA促效劑或拮抗劑的劑量依特殊哺乳動物及疾病的年齡、大小和特性而不同。有經(jīng)驗的技術(shù)人員能夠確定基于以上因素的劑量。促效劑和拮抗劑可以與疾病一致的治療方式來投用，例如單劑或分天分劑來改善疾病狀況或者經(jīng)過延長時間的定期劑量來預(yù)防過敏癥或哮喘病。
促效劑和拮抗劑可以任何可接受的方式投用予哺乳動物，包括通過注射、利用插入等。因為注射和插入容許對投用時間及劑量水平的精確控制因此是優(yōu)先的選擇。促效劑和拮抗劑優(yōu)先選擇以皮下投用，但是也可以通過靜脈、肌肉或腹膜內(nèi)注射，或者通過皮下插入。
當(dāng)通過注射投用時，可由包含任何生物相容且同促效劑及拮抗劑相容的載體的可注射配方來將促效劑和拮抗劑投予哺乳動物，例如不同的媒介物、佐劑、添加劑和稀釋劑。諸如不具有非揮發(fā)性熱源物的水、無菌水及制菌水的水溶液媒介物也適合用于形成可注射溶液。除這些形式的水之外，也可以使用一些其他的水溶液媒介物。該等包括可殺菌的等壓注射組合物，例如氯化鈉、林格氏溶液、葡萄糖、葡萄糖及氯化鈉和乳酸化林格氏溶液。非水媒介物，例如棉花子油、麻油或花生油及酯，例如異丙基豆蔻酸酯，也可以用作組合物的溶劑體系。另外，可添加包括抗菌劑、防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑的各種添加劑來提高組合物的穩(wěn)定性、無菌性及等滲壓性。然而，依據(jù)本發(fā)明所用的任一媒介物、稀釋劑或添加劑必需生物相容且同促效劑和拮抗劑相容。
抗體和抗體的產(chǎn)生在另一方面，本發(fā)明提供與本發(fā)明BLSA相結(jié)合的抗體及產(chǎn)生此抗體的方法，包括起天然BLSA促效劑和拮抗劑作用的抗體。在一實施例中，該方法包括在為人所知的產(chǎn)生抗原的抗體(包括多克隆和單克隆)的方案中利用分離的BLSA或其抗原片斷作為產(chǎn)生與本發(fā)明BLSA結(jié)合的抗體的抗原。在另一實施例中，該方法包括利用表達重組BLSA的宿主細胞作為抗原。在又一實施例中，此方法包括利用含有以表達BLSA的BLSA基因的DNA表達載體來作為產(chǎn)生抗體的抗原。
有經(jīng)驗的技術(shù)人員熟知產(chǎn)生抗體的方法，其抗體包括多克隆的、單克隆的、單價的、人源化的的、人類的、雙特異的和異質(zhì)結(jié)合的抗體。
多克隆抗體多克隆抗體可在哺乳動物中通過單獨注射免疫原或含佐劑的組合物而產(chǎn)生。通常，在哺乳動物中利用一個或多個皮下的或腹膜內(nèi)的注射來注射免疫原。免疫原可包括相關(guān)的多肽或含有該多肽及在接受免疫的哺乳動物中的另一已知為可致免疫的多肽的融合蛋白。免疫原也可包括表達重組載體的細胞或含有BLSA基因的DNA表達載體。此類致免疫蛋白質(zhì)的實例包括(但不限于)鑰孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺素和大豆胰島素抑制劑。佐劑的實例包括(但不限于)Freund氏完全佐劑、MPL-TDM佐劑(單磷酰基油脂A，合成的海藻糖雙棒狀霉菌酸酯)及CpG相關(guān)的寡核苷酸?？捎伤鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員在無不當(dāng)試驗方法之下選擇免疫方案。
單克隆抗體單克隆抗體可通過雜交瘤方法來產(chǎn)生，例如其Kohler和Milstein在Nature，256495(1975)中有所描述。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他合適的宿主哺乳動物經(jīng)免疫原進行免疫從而引出可產(chǎn)生或有能力產(chǎn)生可特定地與免疫原結(jié)合的抗體的淋巴細胞?；蛘撸馨图毎稍隗w內(nèi)進行免疫。免疫原通常包括與多肽相關(guān)的或含有此多肽的融合蛋白質(zhì)。一般情況下，如果想要得到人類起源細胞，則使用周圍的血淋巴細胞(“PBLs”)。如果想得到非人類哺乳動物起源細胞，則使用脾細胞和淋巴結(jié)細胞。然后使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)來使長生細胞系與淋巴細胞相融合以形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59-103頁(Academic Press，1986))。長生細胞系通常是經(jīng)轉(zhuǎn)換的哺乳動物細胞，特別是嚙齒動物、?；蛉祟惖墓撬枇黾毎Ｍǔ２捎美鲜蠡蛐∈蠊撬枇黾毎?。雜交瘤細胞可在合適的最好含有一個和多個抑制未經(jīng)融合長生細胞生長或存活的物質(zhì)的培養(yǎng)媒介中進行培養(yǎng)。例如，如果親本細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HGPRT)，那么雜交瘤方法的培養(yǎng)媒介通常會包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT媒介)。HAT媒介阻止HGPRT所缺細胞的成長。
優(yōu)選的長生細胞系是可操作性地融合、維持由所選抗體產(chǎn)生細胞時其抗體的穩(wěn)定的高表達水平且對媒介敏感(例如HAT媒介)的細胞。更優(yōu)選的長生細胞系是骨髓瘤細胞系，例如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，其獲自Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，Calif.USA；及獲自American TypeCulture Collection，Rockville，Md.USA的SP2/0或X63-Ag8-653細胞系。對于人類骨髓瘤和人-鼠雜合骨髓瘤細胞系在人類單克隆抗體的產(chǎn)生上的使用也曾有所描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonalantibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，紐約，1987年))。小鼠骨髓瘤細胞系NSO也可以使用(European Collectionof Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。所屬領(lǐng)域人員已知，人類骨髓瘤和鼠-人雜合骨髓瘤細胞系也可以用于產(chǎn)生人類單克隆抗體。
然后用于培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)媒介經(jīng)分析來用于對應(yīng)相關(guān)多肽的單克隆抗體的存在。擇優(yōu)地，由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過免疫沉淀或體內(nèi)結(jié)合分析來測定，例如放射線免疫分析(RIA)或結(jié)合酶的免疫吸收劑分析(ELISA)。該等技術(shù)和分析在所屬領(lǐng)域是為人所知的。例如，抗體的結(jié)合親合力可通過Scatchard analysis of Munson and Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)來測定。
在所想要的雜交瘤細胞經(jīng)確認后，其克隆體可通過限制稀釋程序進行亞克隆且通過普通方法進行生長。適用于此目的的培養(yǎng)介質(zhì)包括Duibecco改良的Eagle媒介及RPMI-1640媒介?；蛘撸诓溉閯游镏衅潆s交瘤細胞可在體內(nèi)如腹水一樣生長。
分離由亞克隆所分泌的單克隆抗體或者通過常見免疫球蛋白提純程序來自培養(yǎng)媒介或腹水流體進行提純，例如蛋白質(zhì)A瓊脂糖、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、滲析或親合色譜法。
單克隆抗體也可通過重組DNA法來產(chǎn)生，例如其在美國專利第4,816,567號中有所描述。本發(fā)明的單克隆抗體編碼DNA可利用常見程序容易地進行分離和定序，例如利用具有與鼠科抗體重及輕鏈編碼基因特定結(jié)合的能力的寡核苷酸探針(Innis M.等，In″PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications″，Academic，San Diego，CA(1990)，Sanger，F(xiàn).S等.Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))。文中所述的雜交瘤細胞作為該DNA的首選來源。一旦DNA得以分離，則放置于表達載體。然后使載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞，例如猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞。DNA可以進行改性，例如，通過用人類重及輕鏈不變區(qū)域編碼序列來替代類似鼠序列或者通過使免疫球蛋白編碼序列共價連接至非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。此非免疫球蛋白多肽可用于替代抗體的不變區(qū)域或者用于替代抗體的抗原組合位點的可變區(qū)域而獲得嵌合二價抗體。
利用免疫球蛋白輕鏈及改性重鏈的重組表達可產(chǎn)生單價抗體。通常在Fc區(qū)域的任一點切斷此重鏈以阻止重鏈交聯(lián)。或者，相應(yīng)的半胱氨酸殘基可用另一個氨基酸殘基來替代或者進行刪除以阻止交聯(lián)。類似地，在體外的方法可用來產(chǎn)生單價抗體。利用已知的方法，抗體致菌分解可用于產(chǎn)生優(yōu)先為Fab片斷的抗體片斷。
可利用McCafferty等人的Nature 348552-554(1990)中所述的技術(shù)由抗體噬菌體庫產(chǎn)生抗體及抗體片斷。在Clackson等人的Nature 352624-628(1991)和Marks等的J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述了分別利用噬菌體庫進行鼠及人抗體的分離。隨后的出版物既描述了以組合感染和在體內(nèi)的重組作為策略來構(gòu)建巨大的噬菌體庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.212265-2266(1993))，也描述了通過鏈改組來產(chǎn)生高親合力(nM范圍)人類抗體(Marks等，Bio/Technology 10779-783(1992))。因此，對于分離單克隆抗體而言，這些技術(shù)是傳統(tǒng)單克隆雜交瘤技術(shù)的可行替代。DNA同樣可以進行改性，例如，通過用人類重鏈及輕鏈不變區(qū)域編碼序列來替代類似的鼠序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或者通過使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列進行共價結(jié)合。通常，這些非免疫球蛋白多肽用來替代抗體的不變區(qū)域，或者其用來替代抗體的組合位點抗原的可變區(qū)域以獲得嵌合的二價抗體，該抗體包含一具有抗原特異性的組合位點抗原或另一具有不同抗原特異性的組合位點抗原。
也可利用耗電融合而不是化學(xué)融合來產(chǎn)生抗體以形成雜交瘤。此技術(shù)已成功確定。，也可以轉(zhuǎn)移B細胞以使其長生，例如利用Epstein Barr Virus，或者轉(zhuǎn)移基因“Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibodyof Predetermined Specificity”(“Monoclonal Antibodies”，Zurawaki，V.R.等，Kennett R.H.編，Plenum Press，N.Y.1980，第19-33頁)來代替融合。
人源化的抗體可利用Winter in Jones等人在Nature，321522-525(1986)、Riechmann等人在Nature，332323-327(1988)和Verhoeyen等人在Science，2391534-1536(1988)中所述的方法來產(chǎn)生人源化的抗體。人類化可通過用嚙齒動物CDRs或CDR序列替代人類抗體相應(yīng)序列來完成。通常，人源化的抗體具有一種或多種自非人類來源引入的氨基酸?！叭祟惢笨贵w是嵌合抗體，其中實質(zhì)上通過自非人類樣品的相應(yīng)序列僅替代了不完整的人類可變區(qū)域。實際上，人源化的抗體通常是人類抗體，其中某些CDR殘基和可能的某些FR殘基由來自嚙齒動物抗體類似位點的殘基所替代。非人(例如鼠或牛)抗體人類化形式為嵌合免疫球蛋白；免疫球蛋白鏈；免疫球蛋白片斷，例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2或者其他的含有衍生自非人類免疫球蛋白的極小序列的抗體的抗原結(jié)合序列。人源化的抗體包括人類免疫球蛋白(可接受抗體)，其中來自接受體的互補確定區(qū)域(CDR)的殘基由來自非人類樣品(供體抗體)的CDR的殘基所替代，諸如具有所想要的特異性、親合力及包容力的小鼠、老鼠或小兔。有時，人類免疫球蛋白的Fv框架殘基是由相應(yīng)的非人類殘基所替代。人源化的抗體既包含未在可接受抗體也未在所引入CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。大體上，人源化的抗體實質(zhì)上包含所有或至少一個或通常兩個可變區(qū)域，其中對應(yīng)于非人類免疫球蛋白的全部或大致全部CDR區(qū)域以及全部或大致全部FR區(qū)域是人類免疫球蛋白一致序列。人源化的抗體最優(yōu)包括至少一部份通常屬于人類免疫球蛋白的免疫球蛋白不變區(qū)域(Fc)。
人類抗體可利用各種所屬領(lǐng)域已知的技術(shù)來產(chǎn)生，例如，在Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)中所描述的噬菌體顯示庫。人類單克隆抗體可利用在Cole等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R. Liss，p.77(1985)及Boemer等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)中所述的技術(shù)來產(chǎn)生?；蛘?，可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，其在免疫時在內(nèi)生免疫球蛋白產(chǎn)物存在的情況下可產(chǎn)生完整清單人類抗體。此轉(zhuǎn)基因小鼠獲得自California，F(xiàn)remont的Abgenix公司和NewJersey，Annandale的Medarex公司。據(jù)描述在嵌合及種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區(qū)域(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致了內(nèi)生抗體產(chǎn)物的完全抑制。在此種系突變小鼠中，人類種系免疫球蛋白基因排列的轉(zhuǎn)換將會引起在抗原激發(fā)之上的人類抗體產(chǎn)生。參看例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.733(1993)及Duchosal等，Nature 355258(1992)。人類抗體也可衍生自噬菌體顯示庫(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14309(1996))。
雙特異性抗體雙特異性抗體可通過兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的重組共同表達來產(chǎn)生，其中兩重鏈具有不同的特異性。雙特異性抗體是單克隆的，最好是人類或人源化的具有對至少兩個不同抗原的結(jié)合特異性的抗體。在本發(fā)明中，結(jié)合特異性之一是對于BLSA且另一個是對于任意其他抗原，優(yōu)選為細胞表層受體或受體亞組。由于免疫球蛋白重鏈及輕鏈的任意分類，所以這些雜交瘤產(chǎn)生十個不同抗體的潛在混合物。然而，這些抗體中僅一個具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。修正分子的回收和提純通常通過色譜法來完成。
帶有所希望結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)域(抗體-抗原結(jié)合位點)可融合至免疫球蛋白不變區(qū)域序列。該融合優(yōu)選地是采用免疫球蛋白重鏈不變區(qū)域，其包含至少部分鉸鏈、CH2及CH3區(qū)。較優(yōu)地，含有輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈不變區(qū)(VH1)存在于至少一個融合中。將免疫球蛋白重鏈和(若須要)免疫球蛋白輕鏈編碼DNA插入至單獨的表達載體中且共同轉(zhuǎn)染至適當(dāng)?shù)乃拗鳈C體。用于產(chǎn)生雙特異性抗體的合適技術(shù)在Suresh等Methods in Enzymology，121210(1986)中有所描述。
異質(zhì)結(jié)合的抗體異質(zhì)結(jié)合的抗體可通過已知的蛋白質(zhì)融合方法而產(chǎn)生，例如通過將抗體的胺基接合至另一個抗體或其他多肽的硫醇基。若需要，可利用已知方法引入硫醇基。例如，包含抗體或抗體片斷的免疫毒素和多肽毒素可利用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來產(chǎn)生。為此目的而適用于的合適試劑的實例包括亞胺基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰胺。這些抗體可用于使免疫體系細胞對準(zhǔn)不需要細胞或用于治療HIV感染。
多核苷酸在另一方面，本發(fā)明提供含有選擇由以下序列組成的群組的核苷酸序列的分離的多核苷酸SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的變體；SBQ ID NO1片段；具有選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO2的變體及SEQ ID NO2片斷所組成的群組的核苷酸序列的多肽編碼核苷酸序列。
本發(fā)明的分離的多核苷酸優(yōu)先是為BLSA的譯碼序列。在本發(fā)明的另一方面，多核苷酸用于產(chǎn)生在可與BLSA特定結(jié)合且抑制或刺激BLSA的表達和作用的促效劑及拮抗劑抗體的生成過程中起抗原作用的BLSA。在本發(fā)明的另一方面，多核苷酸可用作DNA免疫技術(shù)的疫苗。所述的將多核苷酸用于BLSA表達的各種其他方法也在期待中。
載體和宿主細胞另一方面，本發(fā)明提供包含有本發(fā)明BLSA編碼核苷酸序列的載體及包含此載體的宿主細胞。
宿主細胞的實例可以是哺乳動物的細胞(例如CHO細胞)、原核細胞(例如E.coli)或酵母細胞(例如釀酒酵母)。另外提供了產(chǎn)生脊椎動物融合多肽的過程且其包括在合適條件下培養(yǎng)適于脊椎動物融合表達的宿主細胞及自細胞培養(yǎng)物中進行回收。
疫苗治療由免疫系統(tǒng)在自異質(zhì)區(qū)分自身時的機能不良所引起疾病的理想方式是通過刺激此系統(tǒng)引出自保護免疫性，且因此當(dāng)需要該反應(yīng)時抑制其自身有毒反應(yīng)。此任務(wù)可通過利用DNA疫苗接種來完成。DNA接種是疫苗和免疫療法發(fā)展的一種方法。DNA疫苗是為產(chǎn)生體液和細胞免疫反應(yīng)而表達體內(nèi)的抗原的一種新穎方法。已證明此技術(shù)在獲得不僅對異質(zhì)抗原及腫瘤，而且對自身抗原(例如T細胞受體基因或自身細胞素)的免疫性上是成功的。由于DNA接種疫苗引出細胞和體液對給定構(gòu)造的產(chǎn)物的兩種反應(yīng)，因此其在根除患病細胞上是非常有效的方法?；虮磉_盒在活宿主的直接注射可將若干細胞轉(zhuǎn)移至用于產(chǎn)生經(jīng)引入基因產(chǎn)物的工廠。這些經(jīng)傳送的基因的表達具有重要的免疫學(xué)結(jié)論且可導(dǎo)致宿主對新穎的經(jīng)表達抗原的特異免疫激活。該免疫的獨特方法能夠克服基于抗原的傳統(tǒng)方法的缺點且提供安全、有效的預(yù)防性及治療性疫苗。宿主正常細胞(非造血的)能夠表達和呈現(xiàn)免疫體系的腫瘤抗原。經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞顯示在其細胞表層的抗原片斷和I類或II類主組織相容性復(fù)合基因(MHCI、MHCII)。該MHCI顯示起到了細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)求救信號的作用，其發(fā)送可破壞經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞的CTL。CTL對腫瘤退化是重要的。一般而言，當(dāng)細胞變性病毒感染宿主正常細胞時，該病毒蛋白經(jīng)內(nèi)生處理且由MHC分子在細胞表層或碎片中得到呈現(xiàn)。由正常細胞感染和表達的外來的限定的核酸能夠模擬病毒感染。
文中所述的在載體上經(jīng)編碼的致免疫融合多肽包括T細胞表位部分及B細胞表位部分。在載體上經(jīng)編碼的T細胞表位部分包含廣范圍或“通用”輔助T細胞表位，其結(jié)合抗原呈現(xiàn)多位點(例如2、3、4、5、6或更多)種類II主組織相容性復(fù)合基因(MHC)分子且能與T細胞抗原受體一起形成三元復(fù)合物，例如MHC抗原T細胞受體。通過“非內(nèi)生蛋白”意思是不是內(nèi)生于即將進行處理的個體的蛋白質(zhì)。這些用作致免疫融合多肽的T細胞表位部分的非內(nèi)生蛋白或其片斷包括破傷風(fēng)類毒素；白喉毒素；II類主組織相容性復(fù)合基因相關(guān)的不變鏈；流感血球凝集素T細胞表位；鎖孔血藍蛋白(KLH)；來自已知的疫苗(包括百日咳疫苗、Bacile Calmette-Guerin(BCG)肺結(jié)核疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗及提純的結(jié)核菌素蛋白衍生物(PPD))的蛋白質(zhì)；及合成的肽，其結(jié)合呈現(xiàn)多個II類組織相容性分子位點的抗原，例如包含Alexander等人(Immunity，1751-761(1994))所述的天然氨基酸。當(dāng)結(jié)合至BLSA的B細胞表位部分時，T細胞表位部分啟動致免疫融合多肽來破壞耐受性以產(chǎn)生同內(nèi)生BLSA反應(yīng)的抗體。通過“破壞耐受性”意思是強迫有機體支持對例如內(nèi)生BLSA的蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，有機體通常不具有致免疫性。
DNA疫苗近來顯示是一種對不同傳染性疾病的免疫的有前途的方法。Michel，ML等人、Huygen，K等人和Wang，B等人。含有微生物抗原基因的裸露DNA的傳送可以引發(fā)宿主中的抗原特異免疫反應(yīng)。由基于DNA的疫苗所引發(fā)的抗原特異免疫反應(yīng)已經(jīng)顯示某些有前途的結(jié)果。Wolff，J.A.等人。進來研究已經(jīng)證實使用DNA介導(dǎo)疫苗來使CEA和MUC-1免疫的潛在可行性。Conry，R.M.等人及Graham，R.A.等人。
相比現(xiàn)場減弱病毒免疫而言，基于DNA的接種疫苗已經(jīng)顯示出對抗原表達、毒性及致病性的較高控制程度。上述用于DNA疫苗的醫(yī)藥學(xué)上可接受載體的構(gòu)造、操作和用途及上述傳送媒介物在Dow等人的標(biāo)題為“gene therapy for T cellregulation”的第5,705,151號美國專利中有詳細描述，其涉及抗癌治療且因此就像在文中全面提及一樣以引用的方式來并入本文。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于使病人對B細胞淋巴瘤或其他B細胞介導(dǎo)的疾病免疫的方法，其包括給病人注射BLSA或其致免疫片斷。同其他治療法一樣，BLSA或致免疫片斷可單獨或與合適的佐劑和/或其他抗原一起組合注射。
通常，用主組織相容性復(fù)合基因(MHC)分子使抗原呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)，即MHCI類和MHCII類分子。內(nèi)生或自身抗原，例如就像BLSA一樣的腫瘤抗原，通常必定是MHCI類分子且呈現(xiàn)給細胞毒素的T細胞(“CTL”)。外生抗原，例如病毒抗原，通常必定是MHCII類分子且呈現(xiàn)給與B細胞相互作用以產(chǎn)生抗體的T細胞。
經(jīng)II類途徑呈現(xiàn)的抗原，即MHCII類限制抗原或II類抗原，由T細胞認可且激活T細胞。該等經(jīng)激活的T細胞引起對II類抗原的完全免疫反應(yīng)。因為自身抗原通常不通過MHCII類方式來呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)，因此免疫體系不將這些抗原作為異質(zhì)且不對此抗原形成完全免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，與其他指定用于刺激或操縱免疫反應(yīng)的抗原一起同時(simultaneously)或同時期(contemporaneously)注射BLSA。優(yōu)選地，使BLSA作為包含BLSA抗原及其他指定抗原的構(gòu)造的一部分來進行注射以引發(fā)細胞免疫反應(yīng)。該等其他抗原經(jīng)指派用于增強對T細胞的抗原呈現(xiàn)且引發(fā)對抗原更有效的免疫反應(yīng)，例如由于BLSA不被免疫系統(tǒng)認做異質(zhì)抗原因此通常引發(fā)不完全免疫反應(yīng)。
通常，BLSA與II類抗原一起組合注射。由免疫系統(tǒng)認做可引發(fā)弱的或不完全免疫反應(yīng)的自身抗原的其它抗原與BLSA抗原一起經(jīng)MHCII類途徑來刺激免疫反應(yīng)，此有助于幫助確保BLSA抗原將被免疫系統(tǒng)作為可引發(fā)完全免疫系統(tǒng)反應(yīng)的異質(zhì)抗原來處理。優(yōu)選地，BLSA抗原和II類抗原是一構(gòu)造的一部份，其中該等抗原是部分單分子。另一方面，本發(fā)明提供一種含有BLSA抗原和單分子中的另一抗原的構(gòu)造。較優(yōu)地，另一抗原為II類抗原。
表達載體可利用廣泛所知技術(shù)來制備含有多肽編碼核苷酸序列的重組表達載體。表達載體包括與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控核苷酸序列(例如衍生自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因)可操作性結(jié)合的核苷酸序列。調(diào)控序列實例包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱基因、增強基因、mRNA核蛋白體結(jié)合位點及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始及中止的適當(dāng)序列。當(dāng)調(diào)控序列在功能上涉及合適多肽的核苷酸序列時，核苷酸序列是“可操作性結(jié)合的”。因此，如果此啟動子核苷酸序列控制核酸核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄那么啟動子核苷酸序列與BLSA序列進行可操作性結(jié)合。
通常由復(fù)制起源及用以確認轉(zhuǎn)換的選擇基因所授予的在復(fù)制所想要宿主細胞中所復(fù)制的能力可以另外并入表達載體。
此外，非自然地與BLSA相關(guān)聯(lián)的適當(dāng)信號肽編碼序列可并入表達載體。例如，信號肽(分泌引導(dǎo)段)的核苷酸序列可以框架形式與多肽序列融合以使得多肽最初作為包含信號肽的融合蛋白質(zhì)來翻譯。在預(yù)定的宿主細胞中起作用的信號肽增強適當(dāng)多肽的細胞外分泌。在自細胞的分泌多肽時，信號肽可以自多肽裂開。
宿主細胞用于BLSA表達的合適宿主細胞包括原核生物、酵母、古生物和其他真菌細胞。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用的合適克隆和表達載體已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，例如Pouwels等人的Cloning VectorsA LaboratoryManual，Elsevier，New York(1985)。載體可以是質(zhì)粒載體、單個或雙鏈?zhǔn)删w載體或者單個或雙鏈RNA或DNA病毒載體。通過廣泛所知的用于將RNA或DNA引至細胞的技術(shù)，可將這些載體引入至細胞來作為多核苷酸，優(yōu)選為DNA。就噬菌體和病毒性載體來說，也可以且優(yōu)選地通過廣泛所知的用于感染和轉(zhuǎn)換的技術(shù)來將該等載體引入至細胞以作為封裝的或膜包裹的病毒。病毒性載體可以是完全復(fù)制或不完全復(fù)制。在較后面的案例中，病毒傳播通常僅會在補體宿主細胞中發(fā)生。非細胞翻譯體系也可以利用衍生自當(dāng)前DNA構(gòu)造的RNA來產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中用作宿主細胞的原核生物包括格蘭氏陰性或格蘭氏陽性有機體，例如E.coli或Bacilli。在原核宿主細胞中，多肽可包括促進其中重組多肽表達的N末端甲硫氨酸殘基。N-端Met可切割自經(jīng)表達的重組BLSA多肽。通常用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括β-內(nèi)酰胺酶及乳糖啟動子體系。
用在原核宿主細胞中的表達載體大概包括一個或多個表型可選擇的標(biāo)記物基因。例如，一個表型可選擇的標(biāo)記基因是提供抗生素或供應(yīng)自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)編碼基因。對原核宿主細胞有用的表達載體的實例包括衍生自市面有售的質(zhì)粒的基因，例如克隆載體pBR322(ATCC 37017)。pBR322包含用于氨芐西林及四環(huán)素抗性的基因且因此提供簡單方式來識別經(jīng)轉(zhuǎn)換細胞。為了利用pBR322構(gòu)建表達載體，可將適當(dāng)啟動子及DNA序列插入至pBR322載體。其他市面有售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)和pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA)系列載體((Studier，F(xiàn).W.，J.Mol.Biol.21937(1991)；Schoepfer，R.Gene 12483(1993))。
通常用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括T7(Rosenberg，A.H.，Lade，B.N.，Chui，D-S.，Lin，S-W.，Dunn，J.J.和Studier，F(xiàn).W.(1987)Gene(Amst.)56，125-135)、β-內(nèi)酰胺酶(penicillinase)、乳糖啟動子系(Chang等Nature 275615，(1978)和Goeddel等，Nature 281544，(1979))、色氨酸(trp)啟動子系(Goeddel等，Nucl.Acids Res.84057，(1980))和tac啟動子(Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，p.412(1982))。
在本發(fā)明中用作宿主細胞的酵母包括來自類酵母菌的酵母，Pichia、K.Actinomycetes及Kluyveromyces。酵母載體經(jīng)常包括來自于2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制序列起源、自發(fā)復(fù)制序列(ARS)、啟動子區(qū)域、多聚酰苷化序列、轉(zhuǎn)錄中止序列和可選擇的標(biāo)記物基因。對酵母載體合適的啟動子序列包括，其中，金屬硫因的啟動子；3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或者其他的糖酵解酶(Holland等，Biochem.174900，(1978))，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸酯磷酸酯脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸鹽、脫羧酶、磷酸磷酸果糖激酶、葡糖激酶-6-磷酸酯異構(gòu)酶、3-磷酸磷酸甘油酸鹽變位酶、丙酮酸鹽激酶、丙糖磷酸酯異構(gòu)酶、磷酸葡糖激酶葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。用于酵母表達的另外合適載體和啟動子在Fleer等人的“Gene，107285-195(1991)”中有進一步描述。適用于酵母及酵母轉(zhuǎn)換方案的其他啟動子和載體在所屬領(lǐng)域已為人所知。
酵母轉(zhuǎn)換方案已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。一個方案由Hinnen等人在“Proceedings of National Academy of Science USA，751929(1978)”中有所敘述。Hinnen方案在可選擇的培養(yǎng)基中選擇Trp.sup.+轉(zhuǎn)換體，其中可選擇的培養(yǎng)基由0.67％酵母氮原、0.5％酷蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10μg/ml腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶組成。
在所屬領(lǐng)域已知的哺乳動物或昆蟲宿主細胞也可以用于表達重組BLSA，例如用來在昆蟲細胞中產(chǎn)生異種蛋白質(zhì)的桿狀病毒(Luckow和Summers，Bio/Technology 647(1988))或用于哺乳動物表達的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用于哺乳動物宿主細胞表達載體的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控序列可以自病毒基因組來切離。通常所用的啟動子序列及增強序列來自多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)及人類細胞巨化病毒。由SV40病毒基因組所衍生的DNA序列可用于提供其他遺傳原理以用于在哺乳動物宿主細胞中結(jié)構(gòu)基因序列的表達，例如SV40起源、早期及晚期啟動子、增強因子、剪接及多聚酰苷化位點。病毒性早期及晚期啟動子特別有用，因為兩者都可作為也包含病毒性起源復(fù)制的片斷而易于自病毒性基因組得到。用于哺乳動物宿主細胞的例證性表達載體已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。
當(dāng)受益時，BLSA可作為具有與融合判斷結(jié)合的BLSA的融合蛋白來表達。融合片段經(jīng)常輔助予蛋白質(zhì)提純，例如，通過準(zhǔn)許融合蛋白質(zhì)由親合色譜法進行分離及提純。融合蛋白質(zhì)可通過培養(yǎng)經(jīng)融合核酸序列轉(zhuǎn)換的重組細胞來產(chǎn)生，該核酸序列對包括與蛋白質(zhì)羧基和/或氨基末端相結(jié)合的片斷的蛋白質(zhì)進行編碼。首選的融合片斷包括(但不限于)谷胱甘肽-S-移轉(zhuǎn)酶、β-半乳糖苷酶、有能力與二價金屬離子結(jié)合的多組胺酸片段及麥芽糖結(jié)合蛋白。
表達和回收根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)分離和提純的BLSA可通過上述重組表達體系來產(chǎn)生。該方法包括在重組條件下用含有多肽編碼核苷酸序列的表達載體來培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)換的宿主細胞以促進多肽的表達。然后視所采用的表達體系的不同而自培養(yǎng)基或細胞提取物回收多肽。正如技術(shù)人員所知，提純重組多肽的程序?qū)⒏鶕?jù)以下因素而有所變化所用宿主細胞類型及重組多肽是否分泌至培養(yǎng)基。當(dāng)采用分泌重組多肽的表達體系時，可首先濃縮培養(yǎng)基。濃縮步驟之后，濃縮物可應(yīng)用作提純基質(zhì)，例如凝膠過濾介質(zhì)?；蛘撸刹捎藐庪x子交換樹脂，例如具有懸掛二乙氨乙基(DEAE)基的基體或基質(zhì)?；w可能是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或者其他蛋白質(zhì)提純中的常用類型。此外，可以采用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種含有硫代丙基或羧甲基的不溶基體。另外，可采用一個或多個采用疏水RP-HPLC介質(zhì)(例如具有懸掛甲基或其他脂肪族基團的硅膠)反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟、離子交換HPLC(例如具有懸掛DEAE或硫代丙基(SP)基或者疏水交互HPLC(例如具有懸掛苯基、丁基或其他疏水基團的硅膠)的步驟以進一步提純蛋白質(zhì)。各種組合的某些或全部前述提純步驟已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知且可用于提供分離和提純的重組多肽。
產(chǎn)生于細菌培養(yǎng)的重組多肽通常由宿主細胞的初期破裂、離心分離、自細胞小球的提取物離子(若為不溶多肽)或者自上層液(若可溶多肽)，接著由一次或多次分離、鹽析、離子交換、親合提純或尺寸排除色譜步驟來進行分離。最后，RP-HPLC可用作決定性的提純步驟。微生物細胞可通過任一常規(guī)方法來破壞，包括冰凍-解凍循環(huán)、聲裂法、機械破裂或使用細胞溶解試劑。
促效劑和拮抗劑的篩選在另一方面，本發(fā)明提供用于確定BLSA促效劑和拮抗劑的篩選方法。篩選方法包括使BLSA暴露至潛在的BLSA促效劑/BLSA拮抗劑和測定潛在的BLSA促效劑/BLSA拮抗劑是否與BLSA相結(jié)合。如果BLSA促效劑/BLSA拮抗劑與BLSA相結(jié)合，則存在重大推測當(dāng)在體內(nèi)給病人投用和暴露予天然BLSA時，潛在的BLSA促效劑/BLSA拮抗劑實際上其促效劑或拮抗劑的作用。作為一種促效劑/拮抗劑而言，通過此方法所識別的BLSA促效劑和BLSA拮抗劑的特征為可使能夠產(chǎn)生細胞素的細胞暴露至該促效劑/拮抗劑且測定相對于非暴露細胞的細胞素的產(chǎn)生。促效劑可增強細胞素產(chǎn)生；拮抗劑可削弱細胞素產(chǎn)生。另一篩選方法包括用含有BLSA DNA結(jié)合序列的報道基因構(gòu)造來轉(zhuǎn)染細胞。優(yōu)選地，潛在的促效劑/拮抗劑是有機化合物或多肽，其包括抗體。篩選方法對于識別起預(yù)防或治療疾病的藥物作用的化合物是有用的，特別是以相比于無疾病情況下相當(dāng)?shù)突蛳喈?dāng)高的細胞素產(chǎn)生為特征的疾病。
BLSA表達調(diào)控在另一方面，本發(fā)明提供一種通過對BLSA編碼DNA或RNA多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯進行干擾而阻塞或調(diào)控細胞BLSA表達的方法。此方法包括使可以表達BLSA的細胞暴露于干擾BLSA編碼DNA或RNA的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子。此分子可以是有機分子、生物有機分子、反意義核苷酸、RNAi核苷酸或核糖酶。
在一優(yōu)選實施例中，其方法包括通過使細胞暴露予反意義的或者與BLSA DNA或調(diào)節(jié)BLSA表達的DNA形成三元螺旋的多核苷酸來阻塞或調(diào)控細胞BLSA表達。細胞以充足的量暴露予反意義多核苷酸或三元螺旋成形的多核苷酸以致于抑制或調(diào)節(jié)BLSA活化受體的表達。同時，本發(fā)明提供一種通過給動物投用反意義或與BLSA編碼DNA或與調(diào)節(jié)BLSA編碼DNA表達的DNA形成三元螺旋多核苷酸來阻塞或調(diào)控動物中BLSA表達的方法。給動物投用充足的量的反意義多核苷酸或三元螺旋成形的多核苷酸以致于抑制或調(diào)節(jié)動物中BLSA的表達。優(yōu)選地，反意義多核苷酸或三元螺旋成形多核苷酸為DNA或RNA多核苷酸。
用來使細胞暴露予反意義多核苷酸和將反意義多核苷酸投用予動物的方法在所屬領(lǐng)域已為人熟知。在一個首選的方法中，利用所知方法使多核苷酸并入細胞基因組且允許其在細胞內(nèi)進行表達。經(jīng)表達的反意義多核苷酸與為BLSA譯碼的多核苷酸相結(jié)合且干擾其轉(zhuǎn)錄或翻譯。
疾病誘因診斷在另一方面，本發(fā)明提供一種診斷病人顯現(xiàn)由BLSA未調(diào)節(jié)表達所引起疾病的誘因的方法。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在某些病人細胞、組織或體液中BLSA的存在和增加的量表明病人易于感染上某些免疫疾病。在一具體實施例中，其方法包括自病人采集已知b-CELLS的含有細胞、組織或體液樣品，分析組織或體液以得到組織中BLSA水平及在組織或體液中所檢測BLSA水平的基礎(chǔ)上來預(yù)測病人對某些免疫疾病的誘因。在另一實施例中，其方法包括自病人采集已知含有確定的BLSA水平的細胞、組織或體液樣品，分析組織分析組織或體液以得到組織中BLSA水平及基于組織或體液中相比于對正常細胞、組織或體液所建立的已確定或已測試水平的BLSA量的變化來預(yù)測病人對某些免疫疾病的誘因。確定的BLSA水平可能是基于文獻而知的或者是通過測量正常細胞、組織或體液中的量而預(yù)先決定的。具體地說，某些組織或體液中BLSA水平的確定準(zhǔn)許在患者中免疫疾病的特定及初期檢測，最好在疾病發(fā)生前?？衫帽痉椒ㄔ\斷的免疫疾病包括(但不限于)文中所述的免疫疾病。在首選的實施例中，組織和體液是周圍血液、周圍血液白血球、生檢組織，例如肺或皮膚生檢及關(guān)節(jié)液體和組織。
疾病預(yù)防和治療BLSA促效劑或拮抗劑的劑量依據(jù)特定哺乳動物和疾病的年齡、大小及特性而變化。熟練的技術(shù)人員可就基于這些因素而確定劑量。促效劑或拮抗劑可以與疾病一致的治療方式來投用，例如單一或幾天幾劑以用來改善疾病情況或經(jīng)延長時間的周期劑量以用來預(yù)防過敏癥或哮喘。
促效劑和拮抗劑可以任一可接受的方式來投用予哺乳動物，包括通過注射，利用植入等。注射和植入為首選的，因為兩者容許用于投用時間和劑量水平的精確控制。促效劑和拮抗劑首選不經(jīng)腸道進行投用。文中所用不經(jīng)腸道投用意思是由靜脈、肌肉和腹膜內(nèi)的注射或由皮下植入。
當(dāng)通過注射投用時，促效劑和拮抗劑可以含有任一生物相容及促效劑和抵抗行相容的載體的可注射形式投用予哺乳動物，其載體例如，各種媒介物、佐劑、添加劑及稀釋劑。液態(tài)媒介物，例如不具有非揮發(fā)性熱源物的水、無菌水和制菌水也適用于形成可注射溶液。除了所說形式水外，幾種其他液態(tài)媒介物也可以使用。其包括可殺菌的等壓注射組合物，例如氯化鈉、林格氏溶液、葡萄糖及氯化鈉和乳酸化林格氏溶液。無水媒介物例如棉花子油、麻油或花生油及和酯例如異丙基豆蔻酸酯也可以用作組合物的溶劑體系。另外，可加入不同添加劑以提高含有微生物抗菌劑、防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩沖劑的組合物的穩(wěn)定性、無菌性及等滲壓性。然而，根據(jù)本發(fā)明所用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑必需生物可溶且與促效劑和拮抗劑相容。
BLSA多肽診斷本發(fā)明的抗體也可用于供檢測在特定細胞、組織或體液或其成份中所表達BLSA的診斷方法。此方法包括使細胞、組織或體液或其成份暴露于本發(fā)明的抗體且測定細胞、組織或體液或其成份是否與抗體結(jié)合。與抗體結(jié)合的細胞、組織或體液或其成份作為含有BLSA的細胞、組織或體液來診斷。利用了所屬領(lǐng)域已知的各種方法，例如競爭性結(jié)合分析、直接或間接夾層分析及在異質(zhì)或同質(zhì)階段實施的免疫沉淀反應(yīng)分析。
剔除動物在另一部分，本發(fā)明提供一種包含在其抑制或阻止生物學(xué)功能BLSA蛋白質(zhì)表達的內(nèi)生BLSA基因中具有雜合或純合破損基因組的剔除動物。優(yōu)選地，本發(fā)明的剔除動物在其內(nèi)生BLSA基因具有純合破損。本發(fā)明首選的剔除動物是小鼠?？衫檬炀毤夹g(shù)工人已知技術(shù)而容易制成剔除小鼠。基因破損可以幾種方式來完成，包括引入止碼子至多肽譯碼序列的任一部分從而導(dǎo)致生物鈍化多肽；引入突變至啟動子或其他調(diào)控序列從而抑制或阻止多肽表達；插入外生序列至基因從而鈍化基因及自基因刪除序列。
幾種技術(shù)可用于引導(dǎo)特定DNA序列至哺乳動物細菌系和實現(xiàn)所說序列穩(wěn)定傳遞(轉(zhuǎn)基因)到每一個后代。最常用的技術(shù)是直接顯微注射DNA至受精卵母細胞原核。衍生自這些卵母細胞的小鼠和其他動物將是以約10至20％的頻率的轉(zhuǎn)殖締造者，其整個增殖引起不同的轉(zhuǎn)殖小鼠系列。尤其是像小鼠這樣的動物，經(jīng)由胚胎操作和顯微注射而產(chǎn)生轉(zhuǎn)殖動物的方法在所屬領(lǐng)域已變得常見，例如美國專利第4,736,866號、第4,870,009號和第4,873,191號及Hogan，B.的Manipulatingthe Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。類似的方法用于產(chǎn)生其他轉(zhuǎn)殖動物。
胚胎干細胞(“ES細胞”)技術(shù)可用于建立帶有特定刪除基因的剔除小鼠(和其他動物)。在體外培養(yǎng)和遺傳學(xué)改性的全能性胚胎干細胞經(jīng)聚集或顯微注射至小鼠胚胎以產(chǎn)生能傳送所說遺傳改性給其后代的嵌合小鼠。通過定向增殖可以得到缺乏此基因的小鼠。幾種另外的方法可用于產(chǎn)生遺傳學(xué)改性動物，例如，細胞質(zhì)內(nèi)精子注射技術(shù)(ICSI)可用于轉(zhuǎn)殖小鼠產(chǎn)生。此方法需要顯微注射精母細胞首領(lǐng)至未受精卵母細胞的細胞質(zhì)，刺激卵母細胞的受精及隨后的植入前胚胎的適當(dāng)細胞分裂的激活。所得小鼠胚胎轉(zhuǎn)移至假孕受體雌性體。雌性體產(chǎn)生小鼠幼仔。ICSI用于轉(zhuǎn)殖細胞產(chǎn)生中時，用含有所希望DNA分子(轉(zhuǎn)基因)的溶液來孵化正面朝上懸浮的精子或精母細胞。此與擔(dān)當(dāng)異質(zhì)DNA載體媒介物的(一旦顯微注射)精子相互作用。一旦DNA在卵母細胞內(nèi)部結(jié)合至基因組，則產(chǎn)生轉(zhuǎn)殖小鼠。本方法提供比迄今利用傳統(tǒng)原核顯微注射方案所獲得的更高的轉(zhuǎn)殖小鼠產(chǎn)量(80％以上)。
基因治療由于BLSA高度表達于幾種人類異常的B型白血病細胞系中，因此可用作對于不同類型B細胞白血病(例如Burkitts氏淋巴瘤和免疫母細胞B細胞淋巴瘤等)的基因治療區(qū)域?；蛑委熆稍隗w外或體內(nèi)應(yīng)用且BLSA可定目標(biāo)在DNA、RNA或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平上。例如，BLSA特異寡脫氧核苷酸可用于形成帶有嘌呤富余雙鏈DNA序列的三元螺旋以致于在癌細胞內(nèi)鈍化BLSA基因。在RNA水平上，可利用反意義技術(shù)以阻止BLSA的傳送及翻譯，其通過提供互補RNA分子(例如，Collins，J.，Herman，P.，Schuch，C.和Babgy G.(1992))c-myc反意義寡核苷酸來抑制Colo320結(jié)腸細胞的克隆成形能力。Journal of Clinical Investigation891523-1527；Ebbinghouse，S.，Gee，J.，Rodu，B.，Mayfield，C.和Miller，D.(1993)Triplex formation inhibits HER2/neu transcription invitro.Journal of Clinical Investigation 922433-2439。
實例通過以下其優(yōu)選具體實施例的實例，本發(fā)明可進一步得到闡述，盡管應(yīng)當(dāng)理解所述實例僅為說明的目的而引用且除非另有明確說明，所述實例不限制本發(fā)明的范圍。
實例1BLSA的識別通過利用免疫球蛋白(Ig)區(qū)域的隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model)(HMM)來搜索人類EST數(shù)據(jù)從而識別BLSA。HMM首先由自113個確定Ig區(qū)域排列而建立且利用程序HMMER進行校準(zhǔn)(S.R.Eddy.Profile hidden Markov models.Bioinformatics 14755-763，1998)。從Pfam(第6.6版，http//pfam.wustl.edu/)數(shù)據(jù)庫獲得HMM且用于搜索人類ESR數(shù)據(jù)。為減少Ig HMM搜索時間，我們自290萬公共EST序列產(chǎn)生了共計189,623個EST contigs/一致序列，其利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)進行儲存和組織。
利用允許程序自動操作的特有軟件系統(tǒng)執(zhí)行本操作。簡單的說，產(chǎn)生了含有全部人類EST contigs快速格式化文件，然后為與Ig HMM匹配而通過程序estwisedb(http//www.sanger.ac.uk/Software/Wise2)進行搜索。對所得結(jié)果進行處理和計算，且選擇所估算的E值原始分數(shù)界限以使假陰性和假陽性速率都最小化。選擇555 EST contigs進行進一步分析。全部555 EST contigs與采集自所有種類的非多余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行碰撞。自所得采樣數(shù)篩選所感興趣的選擇物，其基于序列新穎性和對Ig區(qū)域的序列相似性。為了每一個含有選擇物的Ig區(qū)域，實施一系列in silico表征，其包括基因組中位置和與相鄰序列關(guān)系的分析，單基因(UniGene)簇注解，編碼區(qū)域的識別和驗證，來自于區(qū)域是或包括EST的多重來源和在不同組織及細胞系中所表達的多重來源的證據(jù)。共挑選10個選擇物以進行進一步試驗表征。
實例2 BLSA的分子克隆和表征利用Daudi細胞系cDNA作為模板通過PCR將預(yù)定的BLSA譯碼區(qū)克隆至位于含有3’V5和His tag序列的框架中的pCR3.1-Topo載體(Invitrogen)。然后使用供表達的Lipofectamine 2000使GDNA瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞。通過使3×105細胞于100μl的ddH2O中再懸浮，且在加入等體積2X樣品負載緩沖劑之后于98℃加熱5分鐘來制備完整細胞蛋白質(zhì)樣品。在15％的SDS-PAGE中分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至膜。經(jīng)加標(biāo)記的BLSA蛋白質(zhì)由使用抗V5 mAb的免疫印記法(Western blot)檢測為~50kD蛋白質(zhì)帶。此蛋白質(zhì)帶不存在于僅用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細胞中。
實例3 BLSA mRNA表達的定量實時PCR分析兩組寡核苷酸引物(5’-GTGAACCCTTCCACCTGATTGT(SEQ ID NO 21)和5’-GACCTTGGAGGATCAGCCAGT(SEQ ID NO 22；5’-CGGGCCTAACAGGGAATTCT(SEQ ID NO 23)和5’-CCCGCTGTCTGCCTTTTGTA(SEQ ID NO 24))利用Primer Express 2.0(Applied Biosys公司)從BLSA核苷酸序列來挑選以上兩組引物且經(jīng)合成并用于實時PCR反應(yīng)以測量BLSA的表達。分離RNA以便于測量BLSA在以下細胞中的表達水平Daudi，Burkitt氏淋巴瘤細胞系；Ramos，B淋巴細胞Burkitt氏淋巴瘤；Raji，B淋巴細胞Burkitt氏淋巴瘤細胞系；SKO-007，骨髓瘤細胞系；HL-60的Clone 15，急性前髓細胞白血病細胞系；JM1，前B淋巴母細胞淋巴瘤細胞系；REH，祖B急性淋巴細胞白血病細胞系；THP-1，急性單核細胞白血??；HMC-1，未成熟人類肥大細胞系；HUVEC，原代人類血管內(nèi)皮細胞；原代B細胞；CD34+原代粒子細胞；原代嗜堿細胞；嗜中性白細胞；單核細胞；和HPB-ALL，T細胞白血病細胞系。
根據(jù)生產(chǎn)商說明書用ABI Prism 7900(Applied Biosystems公司)序列檢測系統(tǒng)執(zhí)行實時定量PCR(Taqman)。來自以上所指示細胞的等量單個RNA在反應(yīng)中用作PCR模板以得到界限周期(Ct)，且利用來自18S RNA的已知Ct使得此Ct規(guī)格化以得到ΔCt。為了比較在不同細胞系中BLSA的基因表達相對水平，通過利用最低表達水平作為基礎(chǔ)來計算ΔΔCt值，然后將其轉(zhuǎn)換為真實倍數(shù)表達差異值。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLSA mRNA高度表達于B細胞淋巴瘤細胞系Daudi、Ramos和Raji，及前B淋巴瘤細胞中，指定為JM1。在祖B細胞REH和在原代B細胞中發(fā)現(xiàn)極低的表達水平。在HPB-ALL、THP-1、周圍淋巴細胞、單核細胞、人類內(nèi)皮細胞、CD34+祖代粒子細胞、肥大細胞、嗜堿細胞和嗜中性白細胞中的表達水平可以忽略(參看表1和2)。
表1 BLSA在細胞系組I中的相對表達(真實倍數(shù)差異)

表2 BLSA在細胞系組II中的相對表達(真實倍數(shù)差異)


實例4抗BLSA單克隆抗體的產(chǎn)生利用基因槍(Gene Gun)以BLSA編碼質(zhì)粒來使小鼠免疫，從而產(chǎn)生抗BLSA單克隆抗體。個體抗BLSA單克隆抗體的特點在于利用重組BLSA蛋白質(zhì)的ELISA和Western印記。
實例5 BLSA蛋白質(zhì)在B細胞淋巴瘤細胞系中的表達為了確定BLSA是否表達于B細胞淋巴瘤細胞系，我們執(zhí)行免疫熒光實驗。簡單地說，25,000個細胞在玻璃載片上細胞離心并進行風(fēng)干。在室溫下用Carnoy’sFix(60％乙醇、30％氯仿和10％乙酸)來固定細胞，且用PBS洗滌三次。于冰存在下用封鎖溶液(1％馬血清、1％TRITON X-100、2％小兔血清、1％BSA和在PBS中的1％山羊血清)預(yù)封細胞30分鐘且在室溫下用抗BLSA mAb(1ug/ml在PBS中1％的BSA)孵化30分鐘。然后洗滌細胞三次并在室溫下用以1∶100稀釋的山羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC(Jackson Immuno Lab)孵化30分鐘。洗滌細胞、風(fēng)干且用載片蓋覆蓋。利用熒光顯微鏡檢測熒光著色并用Snap-Shot軟件記錄結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在B細胞淋巴瘤Daudi、人類前B淋巴母細胞CRL10423和1569中檢測到了BLSA，但是在T細胞系Jurkat或肥大細胞系HMC-1中未檢測到(表3)。
表3免疫熒光法著色

序列表<110>Tanox，Inc.
Wang，Shen-WuHu，GuanghuiLi，YuchengYao，Zhengbin<120>用于診斷和治療B細胞惡性腫瘤的B細胞淋巴瘤特異抗原<130>TNX01-10<150>US 60/337,542<151>2001-11-02<160>24<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2181<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ggcacgaggg atgcaaggag atgagacagt tagatttact tcctcttttc taatctgaga60ggtttcatgt tgaagaaaat cagtgttggg gttgcaggag acctaaacac agtcaccatg120aagctgggct gtgtcctcat ggcctgggcc ctctaccttt cccttggtgt gctctgggtg180gcccagatgc tactggctgc cagttttgag acgctgcagt gtgagggacc tgtctgcact240gaggagagca gctgccacac ggaggatgac ttgactgatg caagggaagc tggcttccag300gtcaaggcct acactttcag tgaacccttc cacctgattg tgtcctatga ctggctgatc360ctccaaggtc cagccaagcc agtttttgaa ggggacctgc tggttctgcg ctgccaggcc420tggcaagact ggccactgac tcaggtgacc ttctaccgag atggctcagc tctgggtccc480cccgggccta acagggaatt ctccatcacc gtggtacaaa aggcagacag cgggcactac540cactgcagtg gcatcttcca gagccctggt cctgggatcc cagaaacagc atctgttgtg600
gctatcacag tccaagaact gtttccagcg ccaattctca gagctgtacc ctcagctgaa660ccccaagcag gaagccccat gaccctgagt tgtcagacaa agttgcccct gcagaggtca720gctgcccgcc tcctcttctc cttctacaag gatggaagga tagtgcaaag cagggggctc780tcctcagaat tccagatccc cacagcttca gaagatcact ccgggtcata ctggtgtgag840gcagccactg aggacaacca agtttggaaa cagagccccc agctagagat cagagtgcag900ggtgcttcca gctctgctgc acctcccaca ttgaatccag ctcctcagaa atcagctgct960ccaggaactg ctcctgagga ggcccctggg cctctgcctc cgccgccaac cccatcttct1020gaggatccag gcttttcttc tcctctgggg atgccagatc ctcatctgta tcaccagatg1080ggccttcttc tcaaacacat gcaggatgtg agagtcctcc tcggtcacct gctcatggag1140ttgagggaat tatctggcca ccagaagcct gggaccacaa aggctactgc tgaatagaag1200taaacagttc atccatgatc tcacttaacc accccaataa atctgattct ttattttctc1260ttcctgtcct gcacatatgc ataagtactt ttacaagttg tcccagtgtt ttgttagaat1320aatgtagtta ggtgagtgta aataaattta tataaagtga gaattagagt ttagctataa1380ttgtgtattc tctcttaaca caacagaatt ctgctgtcta gatcaggaat ttctatctgt1440tatatcgacc agaatgttgt gatttaaaga gaactaatgg aagtggattg aatacagcag1500tctcaactgg gggcaatttt gccccccaga ggacattggg caatgtttgg agacattttg1560gtcattatac ttggggggtt gggggatggt gggatgtgtg tgctactggc atccagtaaa1620tagaagccag gggtgccgct aaacatccta taatgcacag ggcagtaccc cacaacgaaa1680aataatctgg cccaaaatgt cagttgtact gagtttgaga aaccccagcc taatgaaacc1740ctaggtgttg ggctctggaa tgggactttg tcccttctaa ttattatctc tttccagcct1800cattcagcta ttcttactga cataccagtc tttagctggt gctatggtct gttctttagt1860tctagtttgt atcccctcaa aagccattat gttgaaatcc taatccccaa ggtgatggca1920ttaagaagtg ggcctttggg aagtgattag atcaggagtg cagagccctc atgattagga1980ttagtgccct tatttaaaaa ggccccagag agctaactca cccttccacc atatgaggac2040gtggcaagaa gatgacatgt atgagaacca aaaaacagct gtcgccaaac accgactctg2100tcgttgcctt gatcttgaac ttccagcctc cagaactatg agaaataaaa ttctgttgtt2160tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2181<210>2<211>359<212>PRT<213>智人<400>2Met Lys Leu Gly Cys Val Leu Met Ala Trp Ala Leu Tyr Leu Cer Leu
1 5 10 15Gly Val Leu Trp Val Ala Gln Met Leu Leu Ala Ala Ser Phe Glu Thr20 25 30Leu Gln Cys Glu Gly Pro Val Cys Thr Glu Glu Ser Ser Cys His Thr35 40 45Glu Asp Asp Leu Thr Asp Ala Arg Glu Ala Gly Phe Gln Val Lys Ala50 55 60Tyr Thr Phe Ser Glu Pro Phe His Leu Ile Val Ser Tyr Asp Trp Leu65 70 75 80Ile Leu Gln Gly Pro Ala Lys Pro Val Phe Glu Gly Asp Leu Leu Val85 90 95Leu Arg Cys Gln Ala Trp Gln Asp Trp Pro Leu Thr Gln Val Thr Phe100 105 110Tyr Arg Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Pro Gly Pro Asn Arg Glu Phe115 120 125Ser Ile Thr Val Val Gln Lys Ala Asp Ser Gly His Tyr His Cys Ser130 135 140Gly Ile Phe Gln Ser Pro Gly Pro Gly Ile Pro Glu Thr Ala Ser Val145 150 155 160Val Ala Ile Thr Val Gln Glu Leu Phe Pro Ala Pro Ile Leu Arg Ala165 170 175Val Pro Ser Ala Glu Pro Gln Ala Gly Ser Pro Met Thr Leu Ser Cys180 185 190Gln Thr Lys Leu Pro Leu Gln Arg Ser Ala Ala Arg Leu Leu Phe Ser195 200 205Phe Tyr Lys Asp Gly Arg Ile Val Gln Ser Arg Gly Leu Ser Ser Glu210 215 220Phe Gln Ile Pro Thr Ala Ser Glu Asp His Ser Gly Ser Tyr Trp Cys225 230 235 240Glu Ala Ala Thr Glu Asp Asn Gln Val Trp Lys Gln Ser Pro Gln Leu245 250 255Glu 1le Arg Val Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala Pro Pro Thr Leu260 265 270Asn Pro Ala Pro Gln Lys Ser Ala Ala Pro Gly Thr Ala Pro Glu Glu275 280 285Ala Pro Gly Pro Leu Pro Pro Pro Pro Thr Pro Ser Ser Glu Asp Pro290 295 300Gly Phe Ser Ser Pro Leu Gly Met Pro Asp Pro His Leu Tyr His Gln305 310 315 320Met Gly Leu Leu Leu Lys His Met Gln Asp Val Arg Val Leu Leu Gly325 330 335His Leu Leu Met Glu Leu Arg Glu Leu Ser Gly His Gln Lys Pro Gly340 345 350Thr Thr Lys Ala Thr Ala Glu355<210>3<211>21
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>3cagagccccc agctagagat c21<210>4<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>4gtgcagcaga gctggaagc 19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>5gcagtggcat cttccagagc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>6cagatgctgt ttctgggatc c21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>BLSA的引物序列<400>7gatcagagtg cagggtgctt c21<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>8ggattcaatg tgggaggtgc 20<210>9<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>9gtgagggacc tgtctgcact g21<210>10<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>10agtcatcctc cgtgtggca 19<210>11<211>21<212>dna<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列
<400>11gaattccaga tccccacagc t21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>12acaccagtat gacccggagt g21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>13cgggcctaac agggaattct 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>14cccgctgtct gccttttgta 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>15cctcccacat tgaatccagc 20
<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>16gagcagttcc tggagcagct 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>17tgtgagggac ctgtctgcac 20<210>18<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>18agtcatcctc cgtgtggca 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>19ggctgatcct ccaaggtcc 19<210>20<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>20accagcaggt ccccttcaa 19<210>21<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>21gtgaaccctt ccacctgatt gt 22<210>22<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>22gaccttggag gatcagccag t21<210>23<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>BLSA的引物序列<400>23cgggcctaac agggaattct 20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>BLSA的引物序列<400>24cccgctgtct gccttttgta 20
權(quán)利要求
1.一種與B細胞特異抗原(BLSA)(SEQ ID NO 2)相結(jié)合的分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中該分子是促效劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中該分子是拮抗劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的分子，其中該分子是抗體、肽、配位體、小分子或寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子，其中該分子是抗體或其結(jié)合片斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體是單克隆的、嵌合的、人類的、人源化的、雙特異性的或是異質(zhì)結(jié)合體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體片斷，其中該片斷是F(ab′)2、F(ab)2、Fab′和Fab。
8.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的分子和生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或添加劑的組合物。
9.一種用于治療B細胞介導(dǎo)的疾病的方法，其包括投用根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該B細胞介導(dǎo)的疾病是B細胞淋巴瘤。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該B細胞介導(dǎo)的疾病是選自由下列各病組成的群組卵泡細胞淋巴瘤、彌散性小淋巴細胞淋巴瘤或慢性淋巴細胞白血病、淋巴類漿細胞或Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、邊緣區(qū)淋巴瘤和毛細胞白血病。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該B細胞介導(dǎo)的疾病是選自由下列各病組成的群組彌散性大細胞淋巴瘤、Burkit氏淋巴瘤或彌散性小無裂細胞淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤和與艾滋病相關(guān)的淋巴瘤。
13.一種用于治療B細胞淋巴瘤的疫苗，其包括含有選自由下列各序列組成的群組的胺基序列的多肽SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的變體和SEQ ID NO2的片斷，其中該肽含有至少一個表位。
14.一種用于治療B細胞淋巴瘤的疫苗，其包括通過含有選自由下列各序列組成的群組的核苷酸序列的分離的多核苷酸來編碼的多肽SEQ ID NO1；SEQ IDNO1的變體和SEQ ID NO1的片斷，其中該肽含有至少一個表位。
15.一種使病人對B細胞淋巴瘤或其它B細胞介導(dǎo)的疾病免疫的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的疫苗。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其另外包括與佐劑相結(jié)合同時或相繼地給患者施用疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其另外包括與第二抗原相結(jié)合同時或相繼給病人施用疫苗。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該第二抗原是II類抗原。
19.一種包含表達BLSA的核酸序列或其致免疫片斷的DNA結(jié)構(gòu)，其可操作性地與引物相結(jié)合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的結(jié)構(gòu)，其另外包括II類抗原。
21.一種對應(yīng)于權(quán)利要求15所述的方法而產(chǎn)生的分離的抗體。
22.一種在哺乳動物中誘發(fā)對BLSA的免疫反應(yīng)的方法，其包括投用包含編碼BLSA的DNA分子的組合物，所述DNA分子可操作性地與控制所述DNA分子表達的調(diào)控序列相結(jié)合，其中BLSA表達于所述細胞且對BLSA產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
23.一種包含至少一個引導(dǎo)細胞毒素T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)的表位的BLSA肽。
24.一種在哺乳動物中誘發(fā)對BLSA免疫反應(yīng)的方法，其包括投用細胞毒素T細胞(CTL)誘導(dǎo)的肽。
25.一種在哺乳動物中誘發(fā)對BLSA免疫反應(yīng)的方法，其包括投用表達以細胞毒素T淋巴細胞(CTL)誘導(dǎo)的BLSA肽的載體。
26.一種包括表達以細胞毒素T淋巴細胞(CTL)誘導(dǎo)的BLSA肽的載體的宿主細胞。
27.一種通過投用降低B細胞淋巴瘤細胞中BLSA翻譯速率的組合物來抑制BLSA表達方法，其包括使細胞暴露于與所述RNA類或與對此RNA類編碼的DNA雜交的反意義核酸或反意義核酸仿制品。
28.一種篩選具有調(diào)控BLSA表達的能力的試劑的方法，其包括步驟(a)使包括BLSA編碼基因的細胞在充足的條件下與選擇試劑進行接觸以準(zhǔn)許調(diào)控自BLSA基因所轉(zhuǎn)錄的mRNA水平；(b)分離mRNA；(c)比較檢測的mRNA量與在選擇試劑存在情況下所檢測的量，且因此確定選擇試劑調(diào)控BLSA表達的能力。
29.一種篩選具有與BLSA結(jié)合的能力的試劑的方法，其包括步驟(a)使BLSA在充足的條件下與選擇試劑進行接觸以準(zhǔn)許結(jié)合；(b)檢測BLSA/試劑復(fù)合物的存在。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，其中該選擇試劑存在于小分子組合庫。
31.一種通過干擾BLSA編碼DNA或RNA多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯來阻塞或調(diào)控細胞BLSA表達的方法，其包括使能夠表達BLSA的細胞暴露于分子墊，該方法干擾了BLSA編碼DNA或RNA多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該分子是其干擾BLSA編碼DNA或RNA多核苷酸的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的反意義分子、RNAi分子或核糖酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該分子是干擾BLSA編碼DNA或RNA多核苷酸的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的反意義核苷酸。
34.一種用于診斷病人患上由BLSA無調(diào)節(jié)表達所引起的B細胞介導(dǎo)的疾病的誘因的方法，其包括自病人采集細胞、組織或體液樣品；分析組織或體液中BLSA的存在；及在組織或體液中BLSA表達水平的基礎(chǔ)上來預(yù)測病人對B細胞疾病2的誘因。
35.一種用于診斷病人患上由BLSA無調(diào)節(jié)表達所引起的B細胞介導(dǎo)的疾病的誘因的方法，其包括自病人采集已知含有確定BLSA水平的細胞、組織或體液樣品；分析組織或體液以得到組織中BLSA的量；及基于在組織或體液中相比于對正常細胞、組織或體液所建立的定義或測試水平的BLSA量的變化來預(yù)測病人患上某些免疫疾病的誘因。
35.一種用于預(yù)防或治療哺乳動物中BLSA蛋白質(zhì)介導(dǎo)的疾病的方法，其包括給哺乳動物投用疾病預(yù)防或治療劑量的BLSA促效劑或拮抗劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該BLSA促效劑或拮抗劑是抗體。
37.一種用于產(chǎn)生與BLSA結(jié)合的抗體的方法，其包括一種選擇自由下列各方法組成的群組的方法用分離的BLSA或其片斷作為抗原；用表達重組BLSA的宿主細胞作為抗原；及用含有BLSA基因的DNA表達載體來表達作為抗原的BLSA以產(chǎn)生抗體。
38.一種利用權(quán)利要求37所述的方法而產(chǎn)生的抗體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的抗體，其選自由以下各物組成的群組多克隆的、單克隆的、人源化的、人類的、雙特異性的和異質(zhì)結(jié)合的抗體。
40.一種檢測在特定細胞、組織或體液中所表達BLSA的診斷方法，其包括使細胞、組織或抗體或其成份暴露于權(quán)利要求38所述的抗體；且測定細胞、組織和抗體或其成份是否與抗體相結(jié)合。
41.一種用于自重組細胞培養(yǎng)物、污染物和天然環(huán)境來分離和提純BLSA的方法，其包括使含有BLSA和污染物的組合物暴露于能夠與BLSA結(jié)合的抗體；允許該BLSA與抗體進行結(jié)合；自污染物分離該抗體-BLSA復(fù)合物；且自復(fù)合物回收該BLSA。
42.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該抗體是權(quán)利要求38所述的抗體。
43.一種轉(zhuǎn)殖剔除動物，其基因組包括在其內(nèi)生BLSA基因中的雜合或純合分裂，該內(nèi)生BLSA基因抑制或阻止生物學(xué)功能性BLSA蛋白質(zhì)的表達。
44.一種用來顯現(xiàn)以某些淋巴瘤為特征的病變的方法，其包括下述步驟獲得對BLSA特異的單克隆抗體；對所述抗體進行標(biāo)記；使所述標(biāo)記過的抗體與獲得自哺乳動物的生物樣品相接觸；且顯現(xiàn)所述標(biāo)記。
45.一種用于檢測細胞中BLSA水平的方法，其包括實施定性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
46.一種用于檢測細胞中BLSA的方法，其包括實施免疫熒光法著色。
全文摘要
本發(fā)明提供疫苗、抗體及診斷工具以用于診斷和/或治療B細胞介導(dǎo)的疾病，尤其是B細胞淋巴瘤。
文檔編號A61K48/00GK1630529SQ02821951
公開日2005年6月22日 申請日期2002年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者S·W·王, G·胡, Y·李, Z·姚 申請人:唐城公司