專利名稱：含交聯(lián)顆粒的多孔基體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顆粒材料的基體。更具體而言，本發(fā)明涉及可用于醫(yī)學(xué)，包括獸醫(yī)學(xué)的顆粒材料的基體。
已知顆粒材料基體在醫(yī)學(xué)中被用作組織骨架，但是本發(fā)明的基體既可以用作組織骨架，又可以用作藥物或其他治療試劑的遞送系統(tǒng)。
許多專利申請描述了使用凝膠或溶膠，特別是水凝膠作為組織骨架。例如，WO 00/23054描述了聚乙烯醇微球體在血管閉塞或栓塞中的應(yīng)用。WO 99/15211和WO 00/64977描述了水凝膠作為組織骨架的應(yīng)用。將水凝膠植入患者以為了支持組織生長和/或修復(fù)。
水凝膠作為組織骨架的應(yīng)用是有問題的，因為盡管凝膠本身可以充分填充它們所插入的空腔，但是它們的擴散性差，同樣，提供給凝膠的藥物、營養(yǎng)物或其他因子不能充分?jǐn)U散通過凝膠。該問題當(dāng)活細(xì)胞接種于凝膠時更加惡化，因為營養(yǎng)物的差的擴散性可能導(dǎo)致未成熟細(xì)胞死亡，導(dǎo)致治療失敗。與凝膠骨架有關(guān)的另一個問題是用于穩(wěn)定或固化凝膠的交聯(lián)方法，特別是在原位進(jìn)行時，可能損傷截留細(xì)胞。
基于不溶于水的聚合物的骨架也是本領(lǐng)域已知的，例如，WO99/25391描述了聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)作為組織再生，特別是骨組織再生的聚合物骨架的應(yīng)用。聚合物被加工成多孔結(jié)構(gòu)。像水凝膠一樣，不溶于水的聚合物是為了支持組織生長和/或修復(fù)而被植入患者體內(nèi)的。
但是，這種不溶于水聚合物的缺點在于它們僅能填充開口形狀的空腔，而且使材料定型的方法還不完善。此外，在用細(xì)胞接種的骨架中，接種是效率差的(很少的孔被細(xì)胞填滿)或者細(xì)胞在接種過程中被結(jié)構(gòu)所損傷，并且周圍的組織細(xì)胞也可能被植入程序所損害。
WO 99/11196描述了顆?；w作為組織骨架的應(yīng)用，這種顆粒具有內(nèi)部交聯(lián)以穩(wěn)定顆粒結(jié)構(gòu)。在WO 99/11196中所述的交聯(lián)是在顆粒內(nèi)部，因此它能穩(wěn)定顆粒。但是，在顆粒之間沒有交聯(lián)，即顆粒-顆粒交聯(lián)，來穩(wěn)定基體本身沒有描述。因此，WO 99/11196描述的交聯(lián)是顆粒內(nèi)交聯(lián)，而非顆粒間交聯(lián)。
所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種能夠克服與已知基體相關(guān)的問題的基體，即，這種基體能夠使物質(zhì)擴散通過基體，可以符合所需的形狀而不損傷可能接種其中的任何細(xì)胞，而且也不損傷任何已經(jīng)接種于其中的細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供了一種開放式的顆粒材料多孔基體，在醫(yī)學(xué)上，包括獸醫(yī)學(xué)中用于或用在靶組織上，該基體包含相互交聯(lián)的顆粒從而在顆粒間形成多孔。
本發(fā)明基體的優(yōu)勢在于由于顆粒間的交聯(lián)使基體穩(wěn)定，使得孔結(jié)構(gòu)被很好地劃定界限(define)。即，基體中每個顆粒都是和一個或多個其他顆粒相交聯(lián)的。
多孔的存在使得基體可以被接種細(xì)胞以用于組織再生，或者使藥物、營養(yǎng)物或其他治療劑能夠擴散穿過基體。作為選擇，基體或其中的每個顆?？梢允墙?jīng)過表面設(shè)計的，以吸引和/或保留細(xì)胞或肽片段，從而形成用于組織再生的細(xì)胞外基體。例如，基體可以具有保留于其上的相關(guān)肽片段以將細(xì)胞吸引和保留到基體上或基體內(nèi)。
本發(fā)明還提供一種流體組合物，該流體組合物含顆粒材料和交聯(lián)劑，在靶組織中或靶組織上引入到交聯(lián)劑時所述顆粒交聯(lián)形成基體。
有利地，顆粒，和任何其它將遞送給患者的試劑，和交聯(lián)劑在向患者給藥之前或給藥過程中混合，且基體是在原位形成的，從而符合目標(biāo)物或遞送位點的形狀。優(yōu)選地，顆粒和交聯(lián)劑是同時對者給藥，理想地它們被共同遞送到目標(biāo)物或遞送位點。
顆粒和交聯(lián)劑可以通過不經(jīng)腸給藥、局部給藥或口服遞送給藥。優(yōu)選顆粒是通過共注射到內(nèi)部靶位點和局部地到外部位點來遞送。
共注射遞送到內(nèi)部靶位點的一個優(yōu)點是向靶位點引入基體對被治療的患者侵略性是最小的。
基體可以被用作新組織生長用的骨架，或者它可以用作藥物、疫苗、激素(包括避孕激素)、酶、營養(yǎng)物或其他治療試劑或因子的遞送系統(tǒng)或植入物。根據(jù)應(yīng)用，所用顆粒一般為1nm～1mm，優(yōu)選為100nm～500μm。優(yōu)選使用納米級的顆粒作為遞送系統(tǒng)或植入物，而使用微米級的顆粒作為組織骨架。但是，這并不意味著本發(fā)明限于這些大小/用途選擇，因為植入物的一些應(yīng)用可能需要微米級大小的顆粒，例如，避孕用的或用于腫瘤治療的子宮內(nèi)植入物，而且一些作為組織骨架的應(yīng)用可能需要納米級顆粒，例如在脊柱或腦內(nèi)。
優(yōu)選顆粒是硬的或固體顆粒，盡管本發(fā)明的范圍不排除固體和半固體混合物或者軟顆粒。軟顆粒，例如脂質(zhì)體，可以用于本發(fā)明，但是現(xiàn)有的脂質(zhì)體技術(shù)還不能制造出足夠堅固的顆粒，以產(chǎn)生用于本發(fā)明設(shè)想用途所需的強度。但是，可以使用硬顆粒和脂質(zhì)體的混合物，優(yōu)選脂質(zhì)體分散穿過基體，在那兒向周圍的組織并經(jīng)由基體釋放物質(zhì)，例如抗生素。
例如，顆?？梢允怯商烊换蚝铣傻木酆衔镏瞥傻?，聚合物例如絲、彈性蛋白、殼多糖、脫乙酰殼多糖、多(α-羥基酸)，特別是聚乳酸或多羥基乙酸、聚酸酐或聚原酸酯?？梢允褂枚嗔u基酸的聚合物，所述多羥基酸包括多羥基丁酸，乳酸，羥基乙酸和s-己酸，聚酸酐，聚原酸酯，聚磷腈，多磷酸酯，聚己酸內(nèi)酯或者用這些聚合物的單體制備的共聚物(參見，例如WO 95/03357中所述的方法)。
顆粒可以是至少部分中空的或者是吸附劑(adsorbent)以使顆粒能夠攝取需要在靶位點釋放的物質(zhì)。例如，如果希望向靶位點持續(xù)緩慢地遞送物質(zhì)，顆?？梢孕纬赡z囊，其中填充或充滿物質(zhì)，該物質(zhì)或者通過擴散緩慢地釋放，或者通過機體自然代謝過程隨著顆粒的破裂而釋放出來。能夠保護物質(zhì)免于機體作用從而延遲或持久釋放物質(zhì)是有利的，例如生長促進(jìn)劑或腫瘤抑制劑是需要緩慢釋放的，或者，例如在延遲釋放情況下，表示“停止”信號的物質(zhì)核，例如形態(tài)發(fā)生蛋白，被包埋在顆粒里，只有在預(yù)定的降解期之后才被釋放出來。
優(yōu)選顆粒是和將要在靶位點釋放的物質(zhì)共同形成的。在最優(yōu)選的實施方案中，使用的是多-層技術(shù)，使物質(zhì)團塊(bolus or boli)包埋于顆粒中。
作為選擇，可以將顆粒涂上打算立即或在非常短時間內(nèi)釋放的物質(zhì)，例如用于防止靶位點感染的抗生素，或者細(xì)胞受體的整聯(lián)蛋白目標(biāo)或其他目標(biāo)配體以促進(jìn)周圍的細(xì)胞附著在基體上。特別優(yōu)選至少基體的外部是這樣涂布的。
可以位于顆粒內(nèi)部或表面上的物質(zhì)實例包括表皮生長因子(EGF)，神經(jīng)生長因子，胰島素樣生長因子(IGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-P，以及相關(guān)的生長因子，例如骨形成蛋白(BMPs)，細(xì)胞因子包括干擾素，白細(xì)胞介素，單核細(xì)胞趨化性蛋白-1(MCP-1)，雌激素，睪酮，激酶，化學(xué)激酶(chemokinase)，葡萄糖或其他糖類，氨基酸，多巴胺，富含胺的寡肽，例如在諸如纖連蛋白和層粘連蛋白的粘著蛋白中發(fā)現(xiàn)的肝素結(jié)合域，其他胺類三苯氧胺，順鉑(cis-platin)，肽和某些類毒素。上面所列的名單是為了進(jìn)行說明，而沒有任何限制意義。如上所述，任何物質(zhì)，例如藥物，激素，酶，營養(yǎng)物或其他治療試劑或因子或它們的混合物都可以在顆粒內(nèi)部或顆粒上。
顆?？梢允怯缮锟山到獠牧现瞥傻?。此處所用的術(shù)語“生物可降解材料”意圖指在所需應(yīng)用的可接受時間內(nèi)溶解或分解或打斷的材料，該可接受的時間小于或約5年，優(yōu)選為1小時～5年，更優(yōu)選1天～1年，理想地是一星期～一年。
盡管也可以使用其他方法，但用如下方法可以很便利地測量溶解或降解速率暴露于pH6.0～8.0、溫度為25℃～37℃，例如pH7.0、30℃的生理鹽水中。應(yīng)當(dāng)理解樣品的大小和形狀可能對降解速率有一些影響，優(yōu)選測試樣品具有和將要實際使用的那些相似的形狀和大小。對于經(jīng)歷表面侵蝕的生物可降解材料而言，大小和形狀的影響是顯著的。這些材料僅從表面開始侵蝕(降解)，因此任何顆粒表面積都將決定生物材料的清除速率。表面侵蝕聚合物包括聚酐和聚(原酸酯)類聚合物。大多數(shù)其他生物可降解的聚合物都是整體侵蝕(bulk eroding)(即，降解發(fā)生于整個聚合物物品，而不僅在表面發(fā)生)，包括乳酸和羥基乙酸基聚酯類。
優(yōu)選顆粒是由生物相容的材料制成的。此處所用的術(shù)語“生物相容的”是用于定義不是不可接受的免疫原性的、變應(yīng)原的或毒素的材料和其降解產(chǎn)物。理想的顆粒既是生物可降解的，又是生物相容的。
合適的合成生物可降解聚合物在下列表中陳述
1、聚酯類，包括聚(乳酸)聚(羥基乙酸)乳酸和羥基乙酸的共聚物乳酸、羥基乙酸和聚乙二醇的共聚物聚(E-己內(nèi)酯)聚(3-羥基丁酸酯)聚(對-二噁烷酮)聚(富馬酸亞丙酯)2、聚(原酸酯)，包括多元醇/雙烯酮乙縮醛加成聚合物(如Heller ACS SymposiumSeries 567，292-305，1994所述的)3、聚酐類，包括聚(癸二酸酐)(PSA)聚(羧基雙羧基苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)聚[雙(對-羧基苯氧基)甲烷](PCPM)SA、CPP和CPM9的共聚物，如Tamada和Langer在Journal ofBiomaterials Science Polymer Edition，3，315-353，1992和Domb在Handbook of Biodegradable Polymers(Domb A.J.和Wiseman R.M.編輯，Harwood Academic Publishers)第8章中所述的。
4、聚(氨基酸)5、聚(假氨基酸)(包括James和Kohn在Controlled Drug DeliveryChallenges and Strategies，American Chemical Society，WashingtonDC389-403頁中所述的那些)6、聚磷腈類，包括聚[(二氯)磷腈]的衍生物聚[(有機)磷腈]Schacht在Biotechnology and Bioengineering，52，102-108，1996中所述的聚合物。
在優(yōu)選實施方案中使用的是聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)聚酯類。這些聚合物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)為非腸道給藥。因為PLGA在初始階段是通過非酶水解而降解的，因此體內(nèi)降解速率可以根據(jù)體外數(shù)據(jù)預(yù)測。PLGA降解成乳酸和羥基乙酸，這些機體內(nèi)天然存在的物質(zhì)。
帶氨基酸的共聚物可以這樣合成，例如(用)羥基乙酸和甘氨酸，或者乳酸和賴氨酸(Barrera等(1993)J Am Chem Soc115，11010-11011和Cook等(1997)J Biomed Mat Res 35，513-523)。這些可用于固定其他分子，例如通過賴氨酰s-氨基部分。這些聚合物可用來用共價鍵將肽結(jié)合到表面上。例如，如上面參考文件中所述的，可以用1，1’-羰基-二咪唑(CDI，Aldrich)作為連接劑將肽結(jié)合到聚(乳酸-共-賴氨酸)上。
通過控制乳酸和羥基乙酸的摩爾比及共聚物的分子量，可以獲得不同的降解模式。聚L-丙交酯的體外降解時間為幾個月至幾年。降解時間長是因為它的結(jié)晶度高，從而保護聚合物不被水滲透。聚乙交酯的降解時間為一到幾個月，而聚-D，L-丙交酯是無定形的，降解時間為一至幾個月。D，L PLGA的體外降解時間為幾個星期至幾個月。隨著羥基乙酸比例的升高，降解速率也加快。s-己酸的均聚物可以在植入后2-3年內(nèi)保持完整狀態(tài)。
應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)聚合物中摻入其他分子時，聚合物的降解時間可能改變。
PLA-PEG-生物素是一種具有產(chǎn)生親水表面區(qū)域的兩親性質(zhì)的、生物相容的、生物可降解的固體聚合物，是本發(fā)明實施方案中特別優(yōu)選的。
帶聚亞烷基二醇的共聚物，例如PEG，降低了所見炎癥的程度。含聚亞烷基二醇的共聚物比不含聚亞烷基二醇的共聚物優(yōu)選。聚亞烷基二醇還有助于減少非特異蛋白的吸收。為了保證從機體中排出，PEG的分子量應(yīng)當(dāng)為約300～20,000道爾頓。對于含具有聚亞烷基二醇的生物可降解組分的共聚物，其水解速率也增加了。
本發(fā)明可以使用其他表面活性劑，但是某些表面活性劑涂在顆粒上會使交聯(lián)劑不能充分結(jié)合到顆粒上。例如，當(dāng)使用生物素作為交聯(lián)劑時，使用PVA在PLA上作為表面活性劑將會妨礙生物素結(jié)合到顆粒表面上，因而將不會發(fā)生交聯(lián)。
如此，應(yīng)當(dāng)選擇相匹配的交聯(lián)劑和表面活性劑。
在目前優(yōu)選的一個實施方案中，使用的是PEG，據(jù)發(fā)現(xiàn)PEG一般在顆粒內(nèi)部，而不是作為涂層，這樣使涂在顆粒上阻礙交聯(lián)劑結(jié)合副作用的可能性最小化。
有利之處還在于PEG在制造過程中使顆粒表面穩(wěn)定。
交聯(lián)劑可以是任何已知的非細(xì)胞毒性或非抑制細(xì)胞的交聯(lián)劑。一個優(yōu)選的交聯(lián)劑是生物活性配體。理想的交聯(lián)劑是“錨-連接物-標(biāo)記物”體系類型的(如專利申請PCT/GB99/001921中所述的，其內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)，其中連接物可以特異性地且高選擇性地和存在于一個顆粒上的錨分子和存在于另一個顆粒上的標(biāo)記物分子相互作用。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明這一方面所要求的所述特異性分子相互作用可以發(fā)生于顆粒表面組分和生物活性配體分子(例如，可以是融合分子，例如具有生物活性結(jié)構(gòu)域和與顆粒表面的所述組分相互作用的結(jié)構(gòu)域的分子)之間。作為選擇，例如，如上所述的，它可以發(fā)生于顆粒表面組分和連接物分子之間，和/或所述連接物分子和生物活性配體分子或所結(jié)合的標(biāo)記物之間。
還應(yīng)當(dāng)理解只有生物活性配體分子通過一種特異性分子相互作用結(jié)合到所述顆粒表面上是必需的；其他任何一種所涉及的分子相互作用不需要為特異性分子相互作用。但是，應(yīng)當(dāng)明白如果每個配體分子參與了多于一個的所述分子相互作用是優(yōu)選的，然后多于一個的所述分子相互作用可以是特異性分子相互作用。因此，顆粒表面和連接物之間以及所述連接物和標(biāo)記物之間的相互作用可以是，但不必都是特異性分子相互作用。連接物可以包含多于一個組分，使得組分的一條鏈將配體連接到顆粒表面；每個相互作用可以是，但不必都是特異性分子相互作用。
應(yīng)當(dāng)理解連接物分子可以是，例如能夠和多于一個分子或者多于一種類型的分子形成特異性分子相互作用。例如，連接物可以和錨分子有特異性分子相互作用，還可以和標(biāo)記物分子有特異性分子相互作用；錨和標(biāo)記物分子可以是相同的化學(xué)本體，例如生物素，也可以不同。
優(yōu)選交聯(lián)是此前所述的錨-連接物-標(biāo)記物類型的。顆粒和交聯(lián)劑之間的連接可以是任何類型的，但是優(yōu)選強鍵合類型。這種鍵合可以在特異性分子相互作用發(fā)生以后自發(fā)形成，或者它需要催化劑。應(yīng)當(dāng)理解這種鍵合可以是在參與特異性分子相互作用的分子間形成的，例如在錨分子和連接物分子之間，或者形成于其他分子之間，例如在生物活性配體和存在于所述顆粒表面的分子之間，所述分子表面沒有和配體形成特異性分子相互作用。優(yōu)選該鍵是共價鍵，或者至少鍵強度或鍵能處于共價鍵級別。但是，根據(jù)所結(jié)合的分子的特性或者應(yīng)用種類或靶組織，使用離子鍵、靜電相互作用或氫鍵也是同等有效的。
在特別優(yōu)選的實施方案中，錨和標(biāo)記物是生物素，而連接物是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。生物素的化合價是1，而鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白為4。生物素和鏈霉抗生物素/抗生物素蛋白結(jié)合的Kd為約10-15M。這種結(jié)合遠(yuǎn)強于許多共價相互作用，例如抗體/抗原相互作用。因此該體系提供了極高的親合力和長期持久的結(jié)合。
在最優(yōu)選的實施方案中，錨和標(biāo)記物都是生物素，而連接物是抗生物素蛋白。優(yōu)選該體系是因為生物素和抗生物素蛋白都是細(xì)胞相容的連接物，并且因為抗生物素蛋白和生物素之間的結(jié)合是非共價的，但其強度超過分子識別類型的其他相互作用。
有利地，抗生物素蛋白的四個結(jié)合位點使得生物素可以在基體內(nèi)將另一物質(zhì)遞送至靶位點。例如生物素化的蛋白或糖等。
方便地，基體還可以和周圍組織交聯(lián)起來?？呻S意采用相同的交聯(lián)反應(yīng)和交聯(lián)劑。
其他的交聯(lián)策略包括使用帶電顆?；蚓酆衔?，丙烯酸酯交聯(lián)，以及在顆粒表面涂上生物聚合物。
例如，可以使用帶電聚合物通過靜電相互作用，使微粒彼此之間吸附、吸收、捕獲、誘捕、結(jié)合或粘著。在這種方法中可以使用諸如聚天冬氨酸和聚賴氨酸的聚合物。
可以這樣使用丙烯酸酯交聯(lián)合成PLA-PEG-丙烯酸酯顆粒，在引發(fā)劑存在下用UV光使它們彼此交聯(lián)。
顆?？梢酝ㄟ^其表面涂料彼此交聯(lián)。例如，如果顆粒涂有凝膠或粘性涂料，例如藻酸鹽、瓊脂糖或血纖維蛋白，則可以利用凝膠性質(zhì)或粘性將顆粒彼此交聯(lián)，例如分別利用鹽、溫度或凝血因子例如因子XIIIa使藻酸鹽、瓊脂糖或血纖維蛋白通過膠凝作用產(chǎn)生附著力。
理想的情況是在間隔化合物存在下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。間隔化合物可以是任何親水性間隔化合物，例如葡聚糖或諸如聚乙二醇(PEG)的聚烷基二醇。所要求的間隔化合物的濃度根據(jù)所需基體孔的大小而變化。
一般根據(jù)基體的功能來選擇孔的大小?？梢酝ㄟ^顆粒大小和形狀、顆粒濃度和交聯(lián)的特性，例如通過改變在錨-連接物-標(biāo)記物型連接中使用的連接物數(shù)量，來控制孔的大小。
在本發(fā)明第二種實施方案中，將基體接種上細(xì)胞，并使用基體作為組織再生用的骨架。
在該實施方案中，理想的孔大小為細(xì)胞直徑的1～25倍，以便能夠接種足夠多的活細(xì)胞?？梢詫⒖椎拇笮募?xì)胞直徑的25倍開始向下減小，使其符合實際應(yīng)用需要。有利之處在于基體是在原處形成的，減少了在接種過程中對細(xì)胞的損害，因為細(xì)胞不是像現(xiàn)有技術(shù)那樣被物理插入基體的，而是在細(xì)胞周圍形成基體。按照這種方式，更多的用于接種基體的細(xì)胞保持存活用于組織再生。
目前，應(yīng)該理解本發(fā)明的基體可以用于任何組織，活的、正在壞死的或死組織，包括骨和軟骨組織。可以使用接種基體的組織實例有脊椎盤(spinal disc)再生，自體軟骨細(xì)胞植入，脊髓修復(fù)，向腦遞送細(xì)胞，特別是用于治療阿爾茨海默氏病和帕金森氏癥，肝再生，骨關(guān)節(jié)炎，骨腔充填，軟組織增大例如在泌尿系統(tǒng)(urology)或乳房切除術(shù)后非強制性的乳房增大，體外受精胚胎的植入，糖尿病患者(diabetes mellitus)的胰腺再生，或者需要血管形成或血管發(fā)生的組織的再生或修復(fù)。
基體可以接種任何類型的細(xì)胞，但是特別優(yōu)選供體細(xì)胞軟骨細(xì)胞、來自機體其他部分或來自胚胎的干細(xì)胞，以及來自機體其他部分的重新程序化的細(xì)胞例如將脂肪細(xì)胞重新程序化以成為軟骨細(xì)胞。
在使用基體來遞送藥物或類似物時，優(yōu)選將顆粒任選地和間隔劑制成混懸液，并制備抗生物素蛋白的單獨的溶液。將混懸液和抗生物素蛋白一起使用在需處理的區(qū)域，而基體就在原處形成并硬化。當(dāng)混懸液和溶液被一起注射時，優(yōu)選它們在靶區(qū)域彼此介入。但是，可以使用雙管注射器針頭使兩者彼此介入。
向基體接種細(xì)胞時，可以將細(xì)胞和顆粒，以及任選的間隔劑一起混合在將要引入抗生物素蛋白的單一混懸液中。將細(xì)胞混懸液引入抗生物素蛋白的方式如上所述。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于醫(yī)學(xué)，包括獸醫(yī)學(xué)在內(nèi)的開放式多孔顆粒材料基體的形成方法，該方法包含如下步驟制備顆粒材料的混懸液，單獨制備交聯(lián)劑溶液，并將顆?；鞈乙涸诎薪M織中或靶組織上原位引入到交聯(lián)劑溶液。
作為選擇，可以用顆粒和交聯(lián)劑的混懸液，以及顆粒的單獨混懸液，將這兩種混懸液在靶組織中或靶組織上原位彼此引入來形成基體。
因此，本發(fā)明還提供一種用于醫(yī)學(xué)，包括獸醫(yī)學(xué)在內(nèi)的開放式多孔顆粒材料基體的形成方法，該方法包含如下步驟制備顆粒材料和交聯(lián)劑的混懸液，制備單獨的顆粒混懸液，并將懸浮的顆粒和交聯(lián)劑在靶組織中或靶組織上原位引入到懸浮的顆粒中。
當(dāng)想在基體上接種細(xì)胞時，可以將細(xì)胞加入到任一混懸液中或者兩個混懸液中。但是，優(yōu)選不要將細(xì)胞加到僅含抗生物素蛋白的混懸液中。
顆粒材料和交聯(lián)劑如上所述。
混懸液和溶液可以順序或同時彼此引入，優(yōu)選快速連續(xù)依次施用，理想地，同時引入混懸液和溶液。
本發(fā)明的第四方面提供了用本發(fā)明的基體治療人或動物體的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種治療動物的方法，該方法包括引入一種開放式多孔顆粒材料基體，這種基體是通過在需要治療的動物靶組織中或靶組織上一起施用原位彼此引入的顆粒材料混懸液和交聯(lián)劑混懸液而形成的。
優(yōu)選基體如上所述。
可用本發(fā)明方法治療的疾病或病癥包括，但決不局限于阿爾茨海默氏病，帕金森氏癥，骨關(guān)節(jié)炎，燒傷，脊椎盤萎縮，癌癥，肝萎縮和其他肝疾病，骨腔充填，骨折的再生或恢復(fù)，糖尿病，輸尿管或膀胱重建，子宮膀胱的脫垂，IVF治療，肌肉消耗(muscle wasting)病癥，腎萎縮，器官重建和整容手術(shù)。
本發(fā)明的最后一方面提供用于將基體遞送到靶位點的裝置，該裝置包含一個多管室注射器，每個管通向一個公共的(common)流出孔(discharegaperture)。任選地，在公共流出孔上附著皮下注射器針頭。優(yōu)選在本發(fā)明的遞送本發(fā)明基體的方法中使用這種注射器。
下面將僅參照如下附圖、作為例子來描述本發(fā)明的實施方案，這些附圖中

圖1顯示了測定抗生物素蛋白飽和的PLA-PEG-生物素納米顆粒和生物素-PEG溶液結(jié)合的表面胞質(zhì)基因組共振實驗；圖2顯示了不含抗生物素蛋白的PLA-PEG-生物素微粒[A]&說明聚集的綴合羅丹明的抗生物素蛋白的[B]，[C]是說明多孔性的組裝骨架的SEM圖像；圖3顯示了在金字塔形模具中形成的基體；圖4顯示了俘獲的HOS細(xì)胞(含細(xì)胞跟蹤器)在交聯(lián)骨架內(nèi)的共焦圖像；圖5是顯示活細(xì)胞和基體攝取Alamar藍(lán)的圖表；圖6顯示了CAM培養(yǎng)7天后多孔骨架的原位顯微照片。
實施例1制備微粒如Cannizzaro，S.M.等在A novel biotinylated degradable polymer forcell-interactive applications.Biotechnology and Bioengineering 1998；58529～535所述來制備聚合物PLA-PEG-生物素。然后，制造微粒。簡言之，將500mg PLA-PEG-生物素溶解在20ml二氯甲烷(DCM)中，得到25ml/ml的溶液。將PVA(250000 Mw)[88％水解的]溶解到ELGA水(0.25g溶解到250ml)，得到0.1％w/v溶液。然后用5ml Gilson吸液管將PLA-PEG-生物素溶液加到均質(zhì)化的PVA溶液中。在5000rpm下再均質(zhì)化該混合物10分鐘，然后攪拌過夜使DCM蒸發(fā)并形成微粒。納米顆粒是如上所述地、用9％PVA溶液在5000rpm下勻漿和5mg/ml的PLA-PEG-生物素溶液來制備的。
PVC濃度 攪拌速率 平均大小(％，w/w)(轉(zhuǎn)速/分鐘)(微米)1500 9.90.1 3500 5.25000 2.11500 3.213500 1.95000 1.71500 1.493500 0.65000 0.25實施例2微粒和抗生物素蛋白的交聯(lián)使用表面胞質(zhì)基因組共振分析來證實微粒能夠和抗生物素蛋白交聯(lián)(圖1)。
SPR設(shè)備(Ortho Clinical Diagnostics，Chalfont，St-Giles，UK)采用Kretschmann結(jié)構(gòu)，使用780nm波長的單色激光源。玻璃載玻片一側(cè)有50nm的銀層。將每個載玻片在0.1mg/ml N-([6-生物素酰胺基-]己基-)-3’-[2’-吡啶基硫代]丙酰胺的TFE溶液中浸泡，進(jìn)行生物素化?？股锼氐鞍?1.5×10-7M)，生物素-PEG(3350)-生物素(1×10-6M)樣品溶液。用過量抗生物素蛋白來飽和PLA-PEG-生物素顆粒(250nm)，然后利用離心洗滌。然后在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中制備抗生物素蛋白飽和的顆粒(1.5×10-7M)。為了使基線讀數(shù)穩(wěn)定，首先用磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.4)沖洗生物素-HPDP官能化的表面100s。然后用抗生物素蛋白溶液(1.5×10-7M)流經(jīng)生物素化的載玻片而獲得抗生物素蛋白官能化的表面。再用磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.4)沖洗表面除去過量的鏈霉抗生物素。在實驗的下一階段，讓生物素-PEG(3350)-生物素(1×10-6M)流經(jīng)樣品表面，隨后用緩沖液沖洗，除去未結(jié)合的生物素-PEG(3350)-生物素。然后讓抗生物素蛋白飽和的納米顆粒(1.5×10-7M)流經(jīng)表面，隨后用緩沖液沖洗。至于對照實驗，在注射了抗生物素蛋白和生物素-PEG-生物素之后，用非飽和的PLA-PEG-生物素納米顆粒(1.5×10-7M，250nm)取代抗生物素蛋白飽和的納米顆粒注射進(jìn)去。另一個對照組涉及在實驗時間內(nèi)僅注射抗生物素蛋白。流速為0.24mL/min，結(jié)果至少重復(fù)8次。檢測SPR角隨時間的變化情況，單位為毫度角(mDA)，其中1mDA＝0.001°。
實施例3微粒的聚集將微粒水混懸液加到抗生物素蛋白溶液中。聚集導(dǎo)致顆粒大小的增加，并用光學(xué)顯微鏡記錄。
參見圖2，該圖顯示了10微米PLA-PEG-生物素微粒[A]和[B]的顯微圖像，其中[A]不含抗生物素蛋白，[B]含用于說明聚集的綴合羅丹明的抗生物素蛋白(abiding)，[C]說明了組裝的骨架的多孔性。
實施例43D結(jié)構(gòu)的形成將PLA-PEG-生物素微粒和抗生物素蛋白溶液一起注射到金字塔形模具中。所得結(jié)構(gòu)是獨立式骨架(圖3)。
實施例5細(xì)胞-骨架復(fù)合物的形成細(xì)胞培養(yǎng)實驗將HOS細(xì)胞培養(yǎng)在Dulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，補充10％胎牛血清(FCS)，2mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素B(抗生素/抗真菌劑)。將細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃、富含5％CO2環(huán)境中孵育。每2～3天用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA的PBS溶液從組織培養(yǎng)瓶中分出，消化細(xì)胞一次，再接種。
通過在11μlDMSO中重組物質(zhì)和將該溶液加入到鋪滿組織培養(yǎng)物培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞和Cell TrackerTM綠色CMFDA(5-氯甲基熒光素二乙酸酯)熒光染料(分子探針)孵育45分鐘。然后更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)細(xì)胞1小時。接著進(jìn)行胰蛋白酶消化和再懸浮，離心細(xì)胞并再次懸浮在DMEM中。將約1百萬細(xì)胞放入50％抗生物素蛋白飽和的PLA-PEG-生物素微?；旌衔镏?，并加入25％生物素-PEG-生物素，來聚集微粒并捕獲細(xì)胞。用共焦顯微鏡檢測骨架。
參見圖4，該圖顯示了捕獲的HOS細(xì)胞(含細(xì)胞跟蹤器)在交聯(lián)骨架內(nèi)的共焦圖像(深灰色/黑色區(qū)域顯示其反射系數(shù))(細(xì)胞用淺灰色顯示)。
實施例6注射形成聚合物/細(xì)胞復(fù)合物骨架制備0.5％濃度的瓊脂糖凝膠。將使用了25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白飽和的PLA-PEG-生物素微粒的骨架和1×106HOS細(xì)胞注射到瓊脂糖凝膠中。作為對照，將25％生物素-PEG-生物素、50％PLA-PEG-生物素微粒(不含抗生物素蛋白)和1×106HOS細(xì)胞注射到瓊脂糖凝膠中。另一對照是注射使用了25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白飽和的PLA-PEG-生物素微粒的骨架，不注射細(xì)胞。
對捕獲在骨架內(nèi)的HOS細(xì)胞進(jìn)行Alamar藍(lán)分析，并證實捕獲細(xì)胞是存活的。用組織培養(yǎng)物塑膠(plastic)和不含細(xì)胞的骨架作為空白對照從每個樣品中取出100μl樣品，放入96孔板中，輕輕搖動5分鐘。使用平板讀數(shù)器在530Ex、590Emm、靈敏度為50的條件下進(jìn)行測量(見圖5)。
實施例7尿囊絨膜(CAM)培養(yǎng)將受精卵在37℃下潮濕環(huán)境中在Multihatch自動孵育器(BrinseaProducts，Sandford，UK)中孵育10～18天。第10天時，取出卵，在殼上切1cm2的方塊。將骨架直接逐滴注射到10日齡雞胚胎的CAM上，再繼續(xù)孵育7天。此外，從18天雞胚胎上切除股骨，在股骨中間造一個楔形節(jié)段性缺損，向其中注射骨架來填充缺損部位。然后將股骨/骨架外植塊放到CAM上，并在37℃下，如前詳細(xì)的15所述的再培養(yǎng)7天。然后收獲外植塊，斬首處死雞胚胎。然后在組織化學(xué)分析之前，將骨架和外植塊樣品用95％乙醇固定，加工成石蠟，并制備5μm切片。切片用Alcian藍(lán)/Sirius紅和堿性磷酸酶染色，如下證明其蛋白聚糖、膠原蛋白和酶活性i)堿性磷酸酶活性樣品用Sigma堿性磷酸酶試劑盒(no.85)染色。
ii)Alcian 藍(lán)/Sirius紅樣品用Weigert蘇木精，alcian藍(lán)(1％乙酸溶液)和sirius紅(飽和苦味酸溶液)染色。
如圖6所見，骨架在原位保持著聚集狀態(tài)，并被來自CAM的血管廣泛入侵(箭頭)(放大×20)。b)用alcian藍(lán)和sirius紅染色的a)石蠟切片(5μm)表明CAM向內(nèi)生長且基體由CAM組織合成(放大×50)。c)是雞股骨缺損內(nèi)骨架在CAM上培養(yǎng)7天后的原位顯微照片?？梢杂^察到在股骨和骨架上和周圍(箭頭，S)來自CAM的血管侵入(與藍(lán)紙對比)(放大×10)。骨架是用25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白飽和的PLA-PEG-生物素微粒產(chǎn)生的，并被放入股骨缺損上。將外植塊-骨架構(gòu)建體放在CAM中培養(yǎng)7天。d)將來自c)的股骨楔形缺損中骨架的石蠟切片染色，用于堿性磷酸酶活性?？梢杂^察到CAM組織和結(jié)合在骨架上的切開的骨(B)邊緣的堿性磷酸酶活性(放大×50)。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)學(xué)上在體內(nèi)在靶組織中或在靶組織上使用的開放式顆粒材料多孔基體，所述基體包含彼此交聯(lián)的顆粒從而在基體內(nèi)將孔劃定界限。
2.權(quán)利要求1的基體，其中所述顆粒為1nm～1mm。
3.權(quán)利要求1的基體，其中所述顆粒為100nm～500μm。
4.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述顆粒是由天然的或合成的聚合物或其混合物形成的。
5.權(quán)利要求4的基體，其中所述顆粒是從絲、彈性蛋白、殼多糖、脫乙酰殼多糖、多(α-羥基酸)，聚酸酐、聚原酸酯或其混合物形成的。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的基體，其中所述多羥基酸選自多羥基丁酸，乳酸，聚乳酸，羥基乙酸，多羥基乙酸或s-己酸。
7.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述顆粒是中空的或者是吸附劑。
8.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述基體包含將要在靶位點處或靶位點上釋放的物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的基體，其中一些顆粒包含包埋于所述顆粒中的物質(zhì)團塊，用于在所述靶位點釋放。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的基體，其中所述物質(zhì)是藥物，激素，酶，營養(yǎng)物或其他治療試劑或因子或者其混合物。
11.權(quán)利要求8～10任一項的基體，其中所述物質(zhì)選自表皮生長因子(EGF)，神經(jīng)生長因子，胰島素樣生長因子(IGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-P，和相關(guān)的生長因子，骨形成蛋白(BMPs)，細(xì)胞因子包括干擾素，白細(xì)胞介素，單核細(xì)胞趨化性蛋白-1(MCP-1)，雌激素，睪酮，激酶，化學(xué)激酶，葡萄糖，糖類，氨基酸，多巴胺，富含胺的寡肽，肝素結(jié)合域，粘著蛋白，纖連蛋白和層粘連蛋白，胺類，三苯氧胺，順鉑，肽和類毒素。
12.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述顆粒是生物可降解的。
13.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述顆粒是生物相容的。
14.權(quán)利要求13的基體，其中所述顆粒是從下述物質(zhì)形成的聚(乳酸)，聚(羥基乙酸)，乳酸和羥基乙酸的共聚物，乳酸、羥基乙酸和聚乙二醇的共聚物，聚(E-己內(nèi)酯)，聚(3-羥基丁酸酯)，聚(對-二噁烷酮，聚(富馬酸亞丙酯)，聚(原酸酯)，多元醇/雙烯酮乙縮醛加成聚合物，聚(癸二酸酐)(PSA)，聚(羧基雙羧基苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)，聚[雙(對-羧基苯氧基)甲烷](PCPM)，SA、CPP和CPM的共聚物，聚(氨基酸)，聚(假氨基酸)，聚磷腈類，聚[(二氯)磷腈]的衍生物和聚[(有機)磷腈]或者其混合物。
15.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述顆粒是從PEG共聚物形成的。
16.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述交聯(lián)劑是生物活性配體。
17.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述交聯(lián)劑是“錨-連接物-標(biāo)記物”類型。
18.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述交聯(lián)劑包含生物素和抗生物素蛋白。
19.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述交聯(lián)可在原位發(fā)生。
20.前述權(quán)利要求1～15任一項的基體，其中所述交聯(lián)被化學(xué)影響。
21.權(quán)利要求20的基體，其中所述交聯(lián)受表面電荷、表面涂層或者丙烯酸酯交聯(lián)的影響。
22.前述權(quán)利要求任一項的基體，其中所述基體被接種細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的基體，其中所述孔大小為所述細(xì)胞直徑的1～25倍。
24.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的基體，其中所述基體被接種供體細(xì)胞軟骨細(xì)胞、干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、重新程序化的體細(xì)胞，或者重新程序化以成為軟骨細(xì)胞的脂肪細(xì)胞。
25.權(quán)利要求22～24任一項的基體在治療脊椎盤再生，自體軟骨細(xì)胞植入，脊髓修復(fù)，向腦遞送細(xì)胞，治療阿爾茨海默氏病和帕金森氏癥，肝再生，骨關(guān)節(jié)炎，骨腔充填，軟組織增大，泌尿系統(tǒng)，乳房增大，體外受精胚胎的植入，糖尿病患者的胰腺再生，或者需要血管形成或血管發(fā)生的組織的再生或修復(fù)中的應(yīng)用。
26.一種形成權(quán)利要求1～24任一項的基體的方法，該方法包含步驟制備顆粒材料的混懸液，單獨制備交聯(lián)劑的溶液，并將所述混懸的顆粒在靶組織中或靶組織上原位引入到所述交聯(lián)劑。
27.一種形成權(quán)利要求1～24任一項的基體的方法，該方法包含步驟制備顆粒材料和交聯(lián)劑的混懸液，制備單獨的顆粒的混懸液，和將所述混懸的顆粒和交聯(lián)劑在靶組織中或靶組織上原位引入到所述混懸的顆粒。
28.用于形成前述權(quán)利要求任一項的基體的裝置，所述裝置包含具有多個管室的注射器，每個管通向一個公共的流出孔。
29.一種流體組合物，其包含顆粒材料和交聯(lián)劑，借此，在使用時，當(dāng)在靶組織中或靶組織上引入到所述交聯(lián)劑時，所述顆粒交聯(lián)形成交聯(lián)的基體。
30.一種參照圖1～5并如圖1～5所舉例說明的實質(zhì)上如上所述的基體。
31.一種參照圖1～5并如圖1～5所舉例說明的實質(zhì)上如上所述的形成基體的方法。
32.參照圖1～5并如圖1～5所舉例說明的實質(zhì)上如上所述的基體的應(yīng)用。
全文摘要
描述了一種醫(yī)學(xué)上在體內(nèi)用在靶組織中或靶組織上的開放式顆粒材料多孔基體及其應(yīng)用，所述基體包含顆粒，所述顆粒彼此交聯(lián)從而在那里劃定孔間的界限。
文檔編號A61K47/36GK1543339SQ02816104
公開日2004年11月3日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者凱文·莫里斯·謝克謝費, 阿里·卡里姆吉·塞勒姆, 凱文 莫里斯 謝克謝費, 卡里姆吉 塞勒姆 申請人:諾丁漢大學(xué)