專利名稱：殼多糖微粒及其醫(yī)療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼多糖微粒及其醫(yī)療用途，尤其是涉及治療變態(tài)反應(yīng)、得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的上調(diào)的疾病和得益于天然殺傷細(xì)胞(NK)活性的上調(diào)和/或干擾素-γ(IFN-γ)的分泌的疾病。
背景技術(shù)：
肺泡巨噬細(xì)胞是肺泡腔中數(shù)量最多的白細(xì)胞，對(duì)于肺的先天免疫系統(tǒng)很重要，可促進(jìn)吞噬細(xì)胞的清除和分泌細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子可促進(jìn)對(duì)吸入顆粒的有效細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述顆粒包括微生物和病原體。在吞噬作用過(guò)程中產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子是IL-12、TNF-α和IL-18。這些巨噬細(xì)胞因子隨后通過(guò)NK細(xì)胞和Th1淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ。IFN-γ與這些細(xì)胞因子協(xié)同作用，促進(jìn)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并下調(diào)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，尤其是IL-4和IL-5的產(chǎn)生，IL-4和IL-5是變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)介質(zhì)。
Shibata等人(1-4)的研究已表明，1-10μm可被吞噬細(xì)胞吞噬的殼多糖顆粒的口服遞送可導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)Th1細(xì)胞因子增加。這種效果對(duì)于顆粒有特異性，因?yàn)槿芙獾臍ざ嗵遣粫?huì)導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子的增加。這種效果也可以在涂以N-乙酰-D-葡糖胺的1μm聚苯乙烯微球體中重現(xiàn)，所述N-乙酰-D-葡糖胺是殼多糖的主要組分。在豚草變態(tài)反應(yīng)的鼠模型中(1)還證明了，口服殼多糖可向下調(diào)節(jié)血清IgE和肺嗜酸粒細(xì)胞增多。
Shibata等人還已開(kāi)發(fā)了變應(yīng)性氣道炎癥的小鼠模型，對(duì)小鼠口服殼多糖制劑(Shibata 2000)。在免疫接種之前和之間，給豚草致敏的小鼠每日口服殼多糖后發(fā)現(xiàn)豚草特異性IgE水平顯著降低了。在免疫接種14天后，采集細(xì)支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞，在用殼多糖治療后觀察到嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平減少。在免疫接種14天后，在組織學(xué)上確定肺的炎癥，在殼多糖治療組內(nèi)，支氣管周圍、血管周圍和整個(gè)肺的炎癥被抑制了。
當(dāng)將殼多糖預(yù)防性地施用給小鼠時(shí)，所述小鼠隨后施以豚草，IL-4、IL-5和IL-10的產(chǎn)量顯著減少了且很低，但可檢測(cè)到顯著水平的IFN-γ。
當(dāng)對(duì)C57BL6小鼠施以殼多糖時(shí)，殼多糖也具有預(yù)防效果，所述小鼠與BALB/c小鼠相比時(shí)，對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫/Th1應(yīng)答較高，但對(duì)變應(yīng)性應(yīng)答較低。
與那些僅用豚草刺激的小鼠相比，當(dāng)同時(shí)用豚草和殼多糖治療豚草致敏的小鼠時(shí)，其產(chǎn)生的IL-4、IL-5和IL-10水平顯著降低了。
然而，盡管Shibata等人公開(kāi)了殼多糖微粒的治療變態(tài)反應(yīng)的用途，但是該組合物作為補(bǔ)充物被口服，以在沒(méi)有復(fù)發(fā)性細(xì)菌性感染的情況下活化巨噬細(xì)胞和預(yù)防性地增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，所述復(fù)發(fā)性細(xì)菌性感染在工業(yè)化國(guó)家逐漸減少。
日本專利申請(qǐng)1997-0087986 A(Unitika Limited)公開(kāi)了脫乙酰殼多糖顆粒的用途，所述脫乙酰殼多糖為粉末、顆粒或纖維形式，以遞送至鼻粘膜。殼多糖顆粒的有效粒徑為20至250微米，被推薦用于治療發(fā)炎部位的變應(yīng)性癥狀如花粉癥。
美國(guó)專利5,591,441 9(醫(yī)學(xué)研究所)涉及顆粒組合物的用途，用于提供保護(hù)，防止微生物感染和生物學(xué)沖突劑。組合物經(jīng)靜脈內(nèi)遞送，用于使得體內(nèi)過(guò)氧化物水平短暫增加，以殺死微生物。
更普通地，現(xiàn)有的對(duì)于變態(tài)反應(yīng)的治療典型地涉及使用類固醇來(lái)抑制免疫系統(tǒng)。類固醇療法有不希望的副作用。合成藥物如類固醇的制造很昂貴，涉及復(fù)雜的工藝，其要求復(fù)雜的質(zhì)量控制和GMP標(biāo)準(zhǔn)來(lái)滿足Health and Safety Authorities的要求。鑒于這些因素，本領(lǐng)域在發(fā)現(xiàn)對(duì)于變態(tài)反應(yīng)的有效療法方面仍存在問(wèn)題。
綠膿假單胞菌，機(jī)會(huì)致病菌，是引起免疫減弱個(gè)體中危及生命的感染的主要原因，對(duì)依賴呼吸機(jī)支持的病人和許多其中肺功能降低及清除感染能力降低的疾病是主要危險(xiǎn)因素。每年，超過(guò)兩百萬(wàn)的病人因之死亡。關(guān)于與醫(yī)院相關(guān)的感染的發(fā)生率的報(bào)告將綠膿假單胞菌歸為三類最常見(jiàn)的致病菌之一(5)。綠膿假單胞菌也是在囊性纖維化病人中危及生命的慢性肺部感染的常見(jiàn)原因。最近的報(bào)告將綠膿假單胞菌列為最嚴(yán)重的耐受抗生素的細(xì)菌之一且是需要有效疫苗的細(xì)菌(6)。
肺炎鏈球菌是普遍存在的致病菌，可導(dǎo)致大部分的肺炎疾病(大葉性肺炎和支氣管肺炎)，是幼童、老人和免疫系統(tǒng)受損的人的疾病和死亡的主要原因之一，所述免疫系統(tǒng)受損來(lái)自于疾病如AIDS、或免疫抑制療法如骨髓移植。侵襲形式的鏈球菌感染，其中細(xì)菌散布于血液和其它器官，可導(dǎo)致非常嚴(yán)重的并發(fā)癥。據(jù)估計(jì)，在美國(guó)每年肺炎球菌疾病引起3000例腦膜炎、50,000例菌血癥、125,000個(gè)人住院和6,000,000例中耳炎。
對(duì)于耐受抗生素的肺炎鏈球菌菌株的出現(xiàn)的關(guān)注日益增加，并有大量關(guān)于新療法和疫苗的研究。
發(fā)明概述廣義上說(shuō)，本發(fā)明涉及殼多糖微粒(CMP)制劑的治療疾病的用途，通過(guò)將微粒經(jīng)鼻內(nèi)遞送到竇道和上呼吸道，例如使用鼻內(nèi)噴劑或通過(guò)吸入來(lái)針對(duì)例如肺內(nèi)的肺泡巨噬細(xì)胞而進(jìn)行治療。殼多糖微粒成分不同于那些現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的許多物質(zhì)，其粒徑典型地小于10μm。
巨噬細(xì)胞在肺的先天免疫系統(tǒng)內(nèi)具有重要控制功能，其能促進(jìn)吞噬細(xì)胞清除顆粒，將吸入的變應(yīng)原送至淋巴細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子以促進(jìn)對(duì)于吸入顆粒的有效的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述吸入顆粒包括微生物和變應(yīng)原物質(zhì)。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了殼多糖微粒的鼻內(nèi)遞送對(duì)于減少大量指征炎癥的參數(shù)尤其有效，從而提供了可替代類固醇治療的療法。
本文所公開(kāi)的研究來(lái)自于下面的發(fā)現(xiàn)，即殼多糖微粒的鼻內(nèi)遞送對(duì)于由煙曲霉(Atu)和Dermatophagoides pteronyssinus(Der p)引起的變態(tài)反應(yīng)的小鼠模型特別有效，它可降低外周血嗜酸粒細(xì)胞增多、血清總IgE、Afu-特異性IgGL、細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF和氣道反應(yīng)過(guò)度(AHR)的水平，以及增加細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平。殼多糖微粒的鼻內(nèi)預(yù)治療可有效地阻止在感染病原體的小鼠內(nèi)感染的進(jìn)展，所述病原體為綠膿假單胞菌或肺炎鏈球菌。另外，已證明CMP可增強(qiáng)活化的人白細(xì)胞的TNF-α和IFN-γ應(yīng)答。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供了殼多糖微粒(CMP)制劑在制備用于治療變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途，其中經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)遞送藥物。
在一個(gè)可供選擇的方面，本發(fā)明提供了治療患有變態(tài)反應(yīng)的病人的方法，該方法包括給病人施用治療有效量的殼多糖微粒制劑，其中CMP制劑經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)施用。
根據(jù)本發(fā)明，可治療的變態(tài)反應(yīng)的實(shí)施例包括季節(jié)性呼吸變態(tài)反應(yīng)，通常稱為枯草熱；對(duì)空氣變應(yīng)原，包括屋內(nèi)螨、真菌孢子、草花粉、樹(shù)花粉或動(dòng)物皮屑的變態(tài)反應(yīng)；可通過(guò)減少血清IgE和嗜酸粒細(xì)胞增多治療的變態(tài)反應(yīng)；哮喘；濕疹和食物過(guò)敏；皮炎如特應(yīng)性皮炎。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括殼多糖微粒成分和變應(yīng)原的組合物。這些組合物可用于治療變態(tài)反應(yīng)和變應(yīng)性癥狀，如過(guò)敏性休克，這與傳統(tǒng)的脫敏療法相關(guān)。已證明，口服IL-12可抑制過(guò)敏性反應(yīng)，因此施用變應(yīng)原和CMP組合物可有助于緩和在脫敏療法中出現(xiàn)的過(guò)敏反應(yīng)，所述脫敏療法用于形成對(duì)變應(yīng)原的耐受性。變應(yīng)原可容易地從食物中提取并是市售的，因?yàn)樗鼈冇糜谧儜B(tài)反應(yīng)的診斷和治療。本發(fā)明的這方面的一個(gè)具體應(yīng)用是治療食物過(guò)敏。常見(jiàn)食物變應(yīng)原的實(shí)例包括牛奶、小麥、麩質(zhì)、雞蛋、堅(jiān)果或貝類，本領(lǐng)域技術(shù)人員能用CMP組合物與這些食物配制以遞送給病人。
在可供選擇的方面，本發(fā)明提供了一個(gè)用于同時(shí)或按順序施用給病人的試劑盒，所述試劑盒包括a)殼多糖微粒成分，和b)變應(yīng)原。
涉及變態(tài)反應(yīng)治療的另一個(gè)具體實(shí)施方案是對(duì)于馬的治療，尤其是純種馬，其具有患變態(tài)反應(yīng)疾病如哮喘或復(fù)發(fā)性肺感染的傾向。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了殼多糖微粒(CMP)制劑在制備用于治療疾病的藥物的用途，所述疾病得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的上調(diào)，其中經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)施用藥物。
在可供選擇的方面，本發(fā)明提供了治療病人的方法，該病人患有得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的上調(diào)的疾病，所述方法包括給病人服用治療有效量的殼多糖微粒制劑，其中CMP制劑經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)施用。
因此，在本發(fā)明的這個(gè)方面，CMP組合物可用于增強(qiáng)個(gè)體的免疫系統(tǒng)。得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)上調(diào)的疾病包括微生物感染的治療，所述微生物感染包括細(xì)菌性感染、真菌性感染和病毒性感染，尤其是在易受損病人群體中，如老人、早產(chǎn)兒、嬰兒、進(jìn)行移植術(shù)的病人、免疫抑制的病人如化療病人、有機(jī)會(huì)性感染危險(xiǎn)的住院病人、使用呼吸機(jī)的病人、囊性纖維化病人和患有AIDS的病人。本發(fā)明具體可用于治療耳、鼻、咽喉和肺感染。
細(xì)菌性感染的具體實(shí)施例包括治療由微生物引起的感染，所述微生物包括例如綠膿假單胞菌、鏈球菌如肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷波桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、沙門菌、利斯特菌、分枝桿菌感染，其包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌分枝桿菌、寄生蟲(chóng)感染，包括利什曼原蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)。
由微生物感染，典型地由肺炎鏈球菌引起的一種疾病為復(fù)發(fā)性耳感染如中耳炎。這些疾病發(fā)生于兒童和成人，目前使用抗生素治療。使用本發(fā)明的殼多糖微粒組合物可有利于治療這些疾病，減少對(duì)抗生素的需求。
本發(fā)明的制劑可用于治療結(jié)核病，或者是治療已有的感染，或者是防止易受損病人組被感染。
微生物感染的其它實(shí)例包括細(xì)菌性肺炎，如呼吸機(jī)相關(guān)的肺炎和囊性纖維化相關(guān)的感染。
真菌性感染的實(shí)例包括例如在免疫抑制病人中所發(fā)生的真菌感染，如侵襲性肺曲霉病和侵襲性肺念珠菌病、卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎、球孢子菌感染和隱球菌感染。
根據(jù)本發(fā)明可治療的病毒性疾病的實(shí)例包括肺病毒性感染如呼吸性合胞病毒性細(xì)支氣管炎，尤其是在嬰兒和老人中所發(fā)生的感染、或流感病毒、或鼻病毒。許多研究已證明，在AIDS的進(jìn)展過(guò)程中，單核細(xì)胞不能分泌IL-2、IL-12和IFN-γ，使IL-4水平增加，這使得HIV病毒可以增殖。因此，利用CMP經(jīng)鼻內(nèi)或吸入的治療可通過(guò)恢復(fù)IL-12和IFN-γ水平來(lái)阻止HIV感染的進(jìn)展。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了殼多糖微粒(CMP)制劑在制備用于治療疾病的藥物用途，所述疾病可通過(guò)NK細(xì)胞活性的上調(diào)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌IFN-γ來(lái)治療，其中經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)遞送藥物。
在可供選擇的方面，本發(fā)明提供了治療病人的方法，所述病人患有可通過(guò)NK細(xì)胞活性的上調(diào)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌IFN-γ來(lái)治療的疾病，所述方法包括給病人服用治療有效量的殼多糖微粒制劑，其中CMP制劑經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)施用。
在本發(fā)明的這一方面，可治療的疾病的實(shí)例是癌癥，尤其是肺癌、肺腫瘤、或鼻-咽腫瘤。
優(yōu)選地，將上述藥物施用于人。利用CMP進(jìn)行鼻內(nèi)治療的優(yōu)選病人群體包括那些患有季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎和竇炎、或慢性呼吸性變態(tài)反應(yīng)如屋內(nèi)螨變態(tài)反應(yīng)的病人和正服用類固醇或抗組胺藥的病人。其它病人群體包括正在治療慢性肺疾病的住院病人，所述肺疾病包括感染和肺癌。
殼多糖是N-乙酰-D-葡糖胺的聚合物，具有類似于纖維素的結(jié)構(gòu)。自然界中有大量的多糖，其包括角質(zhì)，所述角質(zhì)來(lái)自蟹、蝦、龍蝦、烏賊和昆蟲(chóng)的外骨骼，以及真菌。這些或其它來(lái)源的殼多糖的任何一種可適于制備用于本發(fā)明的CMP制劑。
優(yōu)選地，殼多糖通過(guò)物理性方法成為顆粒而制得，所述物理性方法有例如超聲處理或研磨，所得顆粒直徑為小于50μm，更優(yōu)選小于40μm，還更優(yōu)選小于20μm，更優(yōu)選小于10μm，最優(yōu)選小于5μm。已發(fā)現(xiàn)由殼多糖微粒產(chǎn)生的效果具有尺寸依賴性，因此優(yōu)選殼多糖微粒的平均直徑小于10μm。殼多糖微粒的尺寸上限可通過(guò)不識(shí)別顆粒的巨噬細(xì)胞進(jìn)行功能性限定。殼多糖微粒的尺寸下限不太重要，但優(yōu)選顆粒的直徑為至少1μm。尺寸下限可通過(guò)溶解的因而也不能被巨噬細(xì)胞識(shí)別的殼多糖微粒來(lái)進(jìn)行功能性限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定顆粒尺寸和尺寸分布，例如使用流式細(xì)胞儀或顯微鏡?？晒┻x擇地或附加地，殼多糖微?？赏ㄟ^(guò)涂布載體顆粒來(lái)制備，例如由生物相容性材料如聚苯乙烯或膠乳與N-乙酰-D-葡糖胺、殼多糖或其片段形成具有上述尺寸的顆粒，這些成分包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)“殼多糖微粒成分”的范圍內(nèi)。
應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在組合物中，殼多糖微粒具有尺寸分布，典型地為正態(tài)分布，在微?？傮w中不是所有的微粒都必須滿足這些尺寸限制。然而，在形成CMP制劑的殼多糖微粒總體中，優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少99％的殼多糖顆粒的粒徑分布處于上述的限制范圍之內(nèi)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了遞送裝置，該裝置包括上述殼多糖微粒的儲(chǔ)存器和適于設(shè)置在病人口或鼻內(nèi)的遞送孔，其中病人可將遞送孔放在口或鼻內(nèi)以施用殼多糖微粒。在一些實(shí)施方案中，遞送裝置可包括位于儲(chǔ)存器和遞送孔之間的閥門，以便操縱該閥門來(lái)控制殼多糖微粒的遞送。通過(guò)吸入和/或推進(jìn)劑，微?？蛇M(jìn)入鼻內(nèi)到達(dá)竇道和上呼吸道，或通過(guò)口到達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞。裝置的特別優(yōu)選形式為包含CMP制劑和任選的載體的鼻用噴瓶，該噴瓶具有適于經(jīng)鼻內(nèi)遞送的頸。
除了殼多糖微粒之外，CMP制劑還可以包括一種或多種藥用可接受的賦形劑、載體、推進(jìn)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑或抗氧化劑、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)是無(wú)毒的，且不應(yīng)干擾活性成分的效能。
防腐劑通常包括在藥物組合物中以阻止微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)組合物的貯藏期限，并允許多用途包裝。防腐劑的實(shí)例包括苯酚、間甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸及其酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯化benzalconium、氯化benzethonium。防腐劑的用量典型地為約0.1％至1.0％(w/v)。
優(yōu)選地，以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”將藥物組合物施用至個(gè)體(視情況而定，盡管預(yù)防可看作治療)，這足夠?qū)€(gè)體產(chǎn)生有益效果，例如減輕變態(tài)反應(yīng)或其它疾病，或在可接受的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行預(yù)防。通常，這將產(chǎn)生有益于個(gè)體的有用治療活性?；衔锏膶?shí)際給藥量和給藥速率和時(shí)間段取決于待治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療處方如劑量等的確定，屬于普通醫(yī)療工作者和其它醫(yī)生的職責(zé)，其典型地考慮了待治療的疾病、個(gè)別病人的狀況、遞送部位、給藥方法和醫(yī)師已知的其它因素。上述技術(shù)和方案的實(shí)例可參見(jiàn)Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.(ed)，1980和Remington′sPharmaceutical Sciences，19th edition，Mack Publishing Company，1995。組合物的給藥劑量按每千克體重計(jì)優(yōu)選為約0.01至100mg活性化合物，更優(yōu)選為約0.5至10mg。舉例來(lái)說(shuō)，可使用鼻用遞送瓶來(lái)遞送4-8劑量的約0.25ml 5mg/ml CMP顆粒的溶液，達(dá)到上述目的。
現(xiàn)在參照附圖舉例但非限制性地描述本發(fā)明的實(shí)施方案。
附圖和表的概述

圖1顯示了對(duì)于Afu激發(fā)的小鼠的治療結(jié)果，其使用17μg CMP使外周血嗜酸粒細(xì)胞增多顯著下降(p＜0.05)。
圖2顯示了對(duì)于Der p和Afu激發(fā)的小鼠的治療結(jié)果，每日使用4劑量的25μg CMP使外周血嗜酸粒細(xì)胞增多顯著下降(p＜0.05)。
圖3顯示了，每天使用17μgCMP治療后，Afu激發(fā)的小鼠的血清總IgE的減少(p＜0.0005)。
圖4顯示了在每日用5劑量的17μg CMP治療和在一周后重新激發(fā)后，Afu激發(fā)的小鼠的血清總IgE的減少(p＜0.0005)。
圖5顯示了對(duì)于Der-p激發(fā)的小鼠的治療結(jié)果，每日用5劑量的25μg CMP治療，使血清總IgE顯著下降(p＜0.005)。
圖6顯示Afu特異性IgG1減少(p＜0.01)。
圖7顯示了在每日用5劑量的17μg CMP治療之后和在一周后重新用變應(yīng)原激發(fā)后，Afu特異性IgG1減少(p＜0.001)。
圖8顯示了在用Afu抗原重新激發(fā)的小鼠中，在用CMP治療后，氣道反應(yīng)過(guò)度減少(p＜0.01)。
圖9顯示在Afu抗原重新激發(fā)的小鼠中，在經(jīng)過(guò)4天的CMP治療后，AHR減少(p＜0.01)。
圖10顯示了在Derp抗原激發(fā)的小鼠中，在用CMP治療后，AHR減少，其對(duì)應(yīng)于乙酰甲膽堿的濃度增加。
圖11顯示了在抗原激發(fā)(Der-CMP(0)，p＜0.01)和4天后重新激發(fā)(Der-CMP(4)，p＜0.01)后，分別用25μg CMP治療3天后，AHR減少。
圖12顯示了在Der p抗原激發(fā)的小鼠中，在用不同劑量的CMP治療4天后，AHR的減少，對(duì)應(yīng)于乙酰甲膽堿的暴露。
圖13顯示了，在用CMP治療Afu致敏的小鼠后，其發(fā)炎和阻塞程度不同的肺切片。
圖14顯示了用CMP或參照物(PBS)預(yù)處理的小鼠存活率，其對(duì)應(yīng)于綠膿假單胞菌感染。
圖15顯示了從感染的鼠肺中清除肺炎鏈球菌所需的時(shí)間。
圖16顯示了在感染小鼠的血液中出現(xiàn)肺炎鏈球菌所需的時(shí)間。
圖17顯示了由CMP所導(dǎo)致的TNFα的產(chǎn)率的增加，TNFα由LPS激活的CD14單核細(xì)胞產(chǎn)生。
圖18顯示了由CMP所導(dǎo)致的TNFα的產(chǎn)率的增加，TNFα通過(guò)LPS激活的CD14/CD16的前炎癥單核細(xì)胞產(chǎn)生。
圖19顯示了由CMP所導(dǎo)致的IFNγ產(chǎn)量增加，所述IFN 來(lái)自于PMA/離子霉素刺激的人T淋巴細(xì)胞。
表1a說(shuō)明了在小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的增加，其對(duì)應(yīng)于使用CMP的治療，所述小鼠被Der p和Afu變應(yīng)原激發(fā)。
表1b說(shuō)明了在被Der p激發(fā)的小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子GM-CSF的增加，對(duì)應(yīng)于使用CMP的治療。
表1c說(shuō)明了細(xì)胞因子IL-4的熒光幾何平均數(shù)的下降，對(duì)應(yīng)于使用CMP的治療。
發(fā)明詳述材料和方法經(jīng)鼻內(nèi)遞送的殼多糖微粒代表一種新方法，刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性和促進(jìn)在發(fā)炎組織內(nèi)的抗炎應(yīng)答。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要在于上呼吸道的巨噬細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞可直接成為具有適當(dāng)尺寸的殼多糖微粒的靶，所述殼多糖微粒分別用鼻內(nèi)噴劑和吸入法來(lái)遞送。
已在小鼠體內(nèi)建立了兩種變態(tài)反應(yīng)模型，它們是致病性肺感染模型和細(xì)菌性感染模型。另外，已開(kāi)發(fā)了利用人單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的體外檢驗(yàn)，以驗(yàn)證本發(fā)明的效能。
在變態(tài)反應(yīng)模型中測(cè)量的參數(shù)為血清IgE和IgG1、外周血嗜酸粒細(xì)胞增多和AHR，它們?cè)贏fu和Der p變應(yīng)原的小鼠變態(tài)反應(yīng)模型中都顯著升高了，在用CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療后都顯著降低。在Der p的小鼠變態(tài)反應(yīng)模型中減少的細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平在用CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療后都增加了，而GM-CSF和IL-4的水平減少了。所提出的作用模式是，CMP與鼻粘膜和肺泡內(nèi)的巨噬細(xì)胞的甘露糖受體結(jié)合，這刺激巨噬細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IFN-α和IL-18，并逆轉(zhuǎn)了變應(yīng)原激發(fā)產(chǎn)生的IL-12的抑制，將其水平恢復(fù)到在無(wú)變應(yīng)性的小鼠中所觀測(cè)的水平。這導(dǎo)致NK細(xì)胞和Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。GM-CSF和IL-4的減少說(shuō)明從Th2到Th1的免疫應(yīng)答調(diào)變。實(shí)際上，所有這些細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ，促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞群體從Th2向Th1轉(zhuǎn)變。GM-CSF是Th2細(xì)胞因子，其促進(jìn)了嗜酸粒細(xì)胞的分化、活化和生存。所觀察到的血清IgE和嗜酸粒細(xì)胞增多的減少達(dá)到頂點(diǎn)，這是變態(tài)反應(yīng)的主要因素。
在致病性肺感染的小鼠模型中，在10天后測(cè)量用CMP預(yù)處理的小鼠的存活率，對(duì)應(yīng)于綠膿假單胞菌感染。與沒(méi)有用CMP預(yù)處理的小鼠相比，用CMP預(yù)處理的小鼠具有顯著提高的存活率。
在細(xì)菌性感染的小鼠模型中，在24小時(shí)內(nèi)，測(cè)量從感染小鼠的肺內(nèi)清除綠膿假單胞菌所需的時(shí)間。與PBS預(yù)處理的小鼠相比，用CMP預(yù)處理的小鼠的肺內(nèi)具有明顯(p＜0.001)低的細(xì)菌集落形成單位(cfu)。在48小時(shí)內(nèi)，測(cè)量在血液中綠膿假單胞菌出現(xiàn)所需的時(shí)間，在24小時(shí)(p＜0.005)和48小時(shí)，用CMP預(yù)處理的小鼠中的血液菌血癥明顯比用PBS預(yù)處理的小鼠低。
在人單核細(xì)胞中測(cè)量應(yīng)答LPS刺激的TNF-α的產(chǎn)量，在人T淋巴細(xì)胞中測(cè)量應(yīng)答PMA/離子霉素刺激的IFN-γ水平。在這兩個(gè)檢驗(yàn)中，CMP的添加增強(qiáng)了細(xì)胞因子產(chǎn)量。在人細(xì)胞中所觀測(cè)到的這個(gè)效果符合下面的概念，即CMP原單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過(guò)與甘露糖受體或其它糖類受體結(jié)合，然后發(fā)生CMP的噬菌作用。微生物制品如脂多糖(LPS)的活化可增強(qiáng)這些單核細(xì)胞的響應(yīng)，這是由吞噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子如IL-12調(diào)節(jié)的效果。CMP也可以促進(jìn)Th1淋巴細(xì)胞的活性，這符合下面的概念，即CMP促進(jìn)了Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
殼多糖微粒(CMP)懸浮液的制備通過(guò)超聲處理10mg/ml不含內(nèi)毒素的PBS的懸浮液，以最大功率處理20分鐘，每5分鐘用冰冷卻，從純化的殼多糖(Sigma-Aldrich，Poole，UK)制得殼多糖微粒。以1000xg將漿液離心分離10分鐘，除去大的顆粒，在4000xg下離心分離來(lái)收集微粒，再用PBS洗滌三次，除去所有溶解的殼多糖。上清液包含均勻的小顆粒懸浮物，這通過(guò)光學(xué)顯微鏡并使用具有50μm角尺的血球計(jì)來(lái)判斷，尺寸上相當(dāng)于1μm膠乳球體(Polysciences，Inc.，Warrington，Pennsylvania，USA)。直徑小于5μm的顆粒用Celltac血液分析器(Haematology Analyser)(Nihon Kohden，Inc.)來(lái)確定數(shù)量。我們發(fā)現(xiàn)，在制劑所包含的微粒中，99.9％的微粒直徑小于5μm，其濃度量級(jí)為1011/ml。通過(guò)Limulus Amebocyte LysateAssay(Bio Whittaker Co.)測(cè)量?jī)?nèi)毒素，其濃度為小于1EU/ml。
變態(tài)反應(yīng)的小鼠模型變應(yīng)原提取物在合成培養(yǎng)基(M199，Sigma Chemicals)中培養(yǎng)煙曲霉菌(Afu)，在37℃靜置培養(yǎng)一周。Arrunda等人證明了，Asp f1(一種主要的變應(yīng)原)的表達(dá)在一周后達(dá)到最大，并傾向于在較長(zhǎng)培育時(shí)間后減少(7)。通過(guò)加入0.1％硫柳汞經(jīng)12小時(shí)可殺死1周培養(yǎng)物。通過(guò)玻璃綿和最后通過(guò)0.45μm膜來(lái)過(guò)濾培養(yǎng)物，以除去所有的顆粒和可能的芽孢，然后用三種不同的緩沖液對(duì)水進(jìn)行透析。凍干透析液，得到棕色粉末。
對(duì)應(yīng)于Asp f1，在18kDa處出現(xiàn)一個(gè)主帶。對(duì)應(yīng)于Asp f2(37KDa)的帶也很明顯。18kDa的帶為N末端序列，其序列為ATWTCINQQLNP，對(duì)應(yīng)于Asp f1的N末端序列。
ELLSA也已驗(yàn)證了，1周培養(yǎng)物的過(guò)濾物(1wcf)可被Afu變應(yīng)性病人的人血清識(shí)別，所述人血清來(lái)自國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所(National Institute of Biological Standards and Control)。
標(biāo)準(zhǔn)化Dermatophagoicles pteronyssinus(Der p)提取物(Greer Labs，Lenoir，North Carolina，USA)，其包含10000變態(tài)反應(yīng)單位(AU)/ml，被稀釋到無(wú)菌的不含內(nèi)毒素的PBS中。
敏化作用用變應(yīng)原提取物(68 AU Der p；200μg Afu)與明礬的100μl無(wú)菌PBS溶液的混合物經(jīng)過(guò)每周4次i.p.注射而使C57BL/6雌性小鼠致敏。
變應(yīng)原激發(fā)和用CMP治療致敏小鼠用異氟烷麻醉，然后用50變態(tài)反應(yīng)單位的Der p提取物或10μg Afu變應(yīng)原提取物的PBS溶液經(jīng)鼻內(nèi)激發(fā)，然后在1-2小時(shí)后加入鼻內(nèi)劑量的PBS或CMP、或顆粒參照物(PC)的1μm聚苯乙烯小球的50μl溶液。在不同的實(shí)驗(yàn)中顯示了，經(jīng)鼻內(nèi)所施用的大約50％的FITC標(biāo)記的微球可在30分鐘后從肺內(nèi)恢復(fù)。
外周血嗜酸粒細(xì)胞從小鼠(n＝4-8/組)的尾部靜脈采集血液以評(píng)估嗜酸粒細(xì)胞。通過(guò)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置來(lái)測(cè)定總白細(xì)胞數(shù)，通過(guò)May-Grunwald-Giemsa染色的血涂片的區(qū)別計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定嗜酸粒細(xì)胞的比例。結(jié)果表示為106個(gè)細(xì)胞/ml。
血清IgE和Afu特異性IgG1通過(guò)夾層ELISA(BD PharMingen，Cowley，UK)，在來(lái)自1∶20的最大稀釋的連續(xù)稀釋血液中測(cè)量總血清IgE，得到數(shù)值，該數(shù)值根據(jù)小鼠IgE的標(biāo)準(zhǔn)曲線為線性。結(jié)果表示為μg/μl。通過(guò)ELISA使用涂有變應(yīng)原提取物的96孔板來(lái)測(cè)量抗原特異性IgG1。使用HRP標(biāo)記的抗鼠IgG1檢測(cè)抗體。結(jié)果表示為相對(duì)吸光度單位(OD450)。
細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色在治療后，小鼠用CO2窒息而無(wú)痛苦死亡，取出它們的脾，在PBS內(nèi)均化。過(guò)濾勻漿，用氯化銨細(xì)胞溶解劑(BD Pharmingen，Cowley，UK)溶解紅細(xì)胞，并用4％(v/v)低聚甲醛固定20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，該P(yáng)BS補(bǔ)充有3％熱的失活小牛胎兒血清和0.1％(w/v)疊氮化鈉(FSB)，在10％DMSO(v/v)的FSB溶液中重新懸浮，在-80℃保存。用Cytoperm洗滌緩沖劑(CPB，BD Biosciences，Cowley，UK)在4℃將細(xì)胞滲透處理15分鐘，在4℃培育30分鐘用CPB阻滯等分試樣的106個(gè)細(xì)胞，CPB補(bǔ)充以1％(v/v)大鼠IgG。用1μg PE-共軛的抗小鼠細(xì)胞因子單克隆抗體(BD Biosciences，Cowley，UK)給細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，所述抗體在4℃培育60分鐘。用CPB洗滌細(xì)胞，然后用FSB洗滌，并重新懸浮于500μl FSB。使用FACScan流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson，MountainView，California，USA)，利用CellQuest軟件來(lái)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。采集20000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在所有情況下脾細(xì)胞的平均FSC為100。門控染色細(xì)胞(FSC＞100，F(xiàn)L2＞100)，深度染色成計(jì)算PE(PE＞1000)的這些細(xì)胞的比例。結(jié)果表示為在消除未染色細(xì)胞背景熒光后深度染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，所述未染色細(xì)胞用大鼠IgG(％PE＞1000)培育。對(duì)于IL-4，在消除背景的情況下，測(cè)定染色細(xì)胞的幾何平均熒光(GMF)。
肺組織學(xué)在治療后，立即將各治療組的2-4個(gè)小鼠的肺固定于10％中性緩沖福爾馬林中，進(jìn)行獨(dú)立分析。將肺包埋于石蠟中、切片，并用蘇木精和伊紅(H&E)染色。對(duì)載玻片進(jìn)行支氣管周圍發(fā)炎的評(píng)估，評(píng)分等級(jí)為0-4，分別對(duì)應(yīng)于正常到嚴(yán)重的分?jǐn)?shù)(9)。
整個(gè)軀體的體積描記法在這項(xiàng)研究中，使用無(wú)限制的整個(gè)軀體的體積描記法(8)利用四室系統(tǒng)(Buxco，Sharon，Connecticut，USA)來(lái)測(cè)量AHR。首先將小鼠用鼻內(nèi)抗原激發(fā)，使其在2小時(shí)內(nèi)恢復(fù)，然后放入小室內(nèi)，對(duì)其呼吸監(jiān)測(cè)10分鐘。當(dāng)適應(yīng)后，對(duì)它們的基線應(yīng)答測(cè)量5分鐘。然后將小鼠置于煙霧狀PBS下，時(shí)間為1分鐘，然后逐漸增加乙酰甲膽堿(5、10、20、30、40mg/ml PBS)的劑量。每次記錄5分鐘應(yīng)答，每次之間有短暫的間隔，以使其返回基線。使用增強(qiáng)的呼氣停頓(Penh)的測(cè)量來(lái)定量確定響應(yīng)。每組包含4至8個(gè)小鼠。對(duì)于各組中的小鼠，當(dāng)平均百分比增長(zhǎng)至超過(guò)基線值時(shí)，測(cè)量Penh。在用乙酰甲膽堿激發(fā)后，將結(jié)果表示為Penh的平均增長(zhǎng)百分比。為了確定治療是否產(chǎn)生長(zhǎng)期效果，在治療結(jié)束4天后，將Der p實(shí)驗(yàn)小鼠單獨(dú)用變應(yīng)原提取物經(jīng)鼻內(nèi)重新激發(fā)。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果為4-8個(gè)小鼠/組的結(jié)果平均值，誤差范圍為±SEM。通過(guò)Student的雙側(cè)t-檢驗(yàn)，確定顯著性。當(dāng)p＜0.05時(shí)，接受顯著性。
致病性肺感染的小鼠模型用CMP進(jìn)行預(yù)處理和致病性激發(fā)用開(kāi)他敏/甲苯噻嗪麻醉NMRI雌性小鼠，每天用250μg/μl CMP治療，連續(xù)三天，或用20μl PBS治療，作為參照。在開(kāi)始時(shí)，用開(kāi)他敏/甲苯噻嗪麻醉小鼠，用2×106綠膿假單胞菌經(jīng)鼻內(nèi)激發(fā)。在10天后測(cè)量動(dòng)物存活率。
細(xì)菌性感染的小鼠模型肺炎鏈球菌制備從National Collection of Type Cultures，London，UK(NCTC 7466)得到2號(hào)血清型肺炎鏈球菌，D39菌株。鑒定出肺炎雙球菌，然后通過(guò)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、在血瓊脂板上的溶血、奧普托欣(乙基氫化叩卜林)敏化進(jìn)行感染。通過(guò)莢膜腫脹反應(yīng)來(lái)確定莢膜多糖血清類型。對(duì)于體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，培養(yǎng)肺炎球菌，并使其通過(guò)如上所述小鼠(10)，隨后在-70℃儲(chǔ)存。當(dāng)需要時(shí)，在室溫下溶解懸浮液，通過(guò)離心分離法采集細(xì)菌，然后在無(wú)菌PBS中重新懸浮。
小鼠的感染遠(yuǎn)系交配的雌性MF1小鼠，9周大，體重30-35g(Harlan Olac，Bichester，UK)，用2.5％(體積比)氟烷(AstraZeneca，Macclesfield，UK)與氧氣(1.5-2升/分鐘)輕微麻醉。將包含1×106cfu肺炎鏈球菌的50μlPBS應(yīng)用于小鼠的鼻孔。在感染后通過(guò)在血瓊脂板涂鋪來(lái)確定接種物。在感染后的每小時(shí)間隔中，將預(yù)選的小鼠組用5％(體積比)氟烷深度麻醉，然后用心臟穿刺術(shù)采集血液。在這一步驟后，用斷頸法立即殺死老鼠。取出肺，置于10ml無(wú)菌蒸餾水中，稱重，在Stomacher-Lab混合器(Seward Medical，London，UK)中均質(zhì)化。如前所述，測(cè)定在勻漿和血液中的活體數(shù)目(10)。通過(guò)莢膜腫脹反應(yīng)來(lái)確定2類多糖莢膜的存在。這些小鼠沒(méi)有可測(cè)量水平的2類抗體、3類抗體、抗肺炎球菌溶血素的抗體。
治療策略在第1、2、3天，給小鼠施以250μg CMP的50μl無(wú)菌PBS溶液，經(jīng)鼻內(nèi)給藥至麻醉的小鼠。在第3天，用肺炎鏈球菌經(jīng)鼻內(nèi)感染小鼠，以1小時(shí)間隔殺死小鼠。
人白細(xì)胞的細(xì)胞因子生成服用CMP對(duì)人單核細(xì)胞的作用從三個(gè)健康供體得到血液，加入10U/ml肝素，作為抗凝血?jiǎng)?。?0μg/ml布雷菲德菌素A(BFA)、來(lái)自細(xì)胞的蛋白質(zhì)分泌物抑制劑和衍生自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的5ng/ml LPS，加入或不加入0.1μg/mlCMP，培育0.6ml等分溶液。在37℃培育6小時(shí)。培育結(jié)束后，用氯化銨緩沖液溶解紅細(xì)胞，在FACS染色的緩沖液中重新懸浮。在用皂苷滲透細(xì)胞后，用熒光標(biāo)記的抗體給細(xì)胞表面標(biāo)記物CD14和CD16染色。在9倍的過(guò)量重組人TNF-α存在的情況下，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色，證明TNF-α染色的特異性。在對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行FACS分析后，控制CD14或CD14/CD16群體，在去除各種供體的背景染色后，所得結(jié)果為TNF-α染色的熒光強(qiáng)度平均值(MFI)。
CMP給藥對(duì)于人淋巴細(xì)胞的作用在37℃，在有或沒(méi)有0.1μg/ml CMP存在的情況下，用BFA和5ng/ml PMA以及0.25μM離子霉素培養(yǎng)來(lái)自兩個(gè)供體的血液等分試樣，培養(yǎng)時(shí)間為6小時(shí)。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，對(duì)T細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD2和IFN-γ染色。
結(jié)果實(shí)施例1用CMP對(duì)感染Afu的動(dòng)物的血液嗜酸粒細(xì)胞增多進(jìn)行治療的效果示于圖1。試驗(yàn)組接受4天的治療，在第5天進(jìn)行測(cè)量。樣本量為4-5只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果說(shuō)明，用CMP治療導(dǎo)致血液嗜酸粒細(xì)胞增多水平降至約0.3×106/ml，相比之下，用PBS治療的試驗(yàn)動(dòng)物的血液嗜酸粒細(xì)胞增多水平為約0.7×106/ml。
實(shí)施例2用CMP對(duì)感染Der p和Afu的動(dòng)物的外周血嗜酸粒細(xì)胞增多進(jìn)行治療的效果示于圖2。試驗(yàn)組每日用Afu或Der p提取物經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用4個(gè)每日劑量的25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。Der-PC表示用膠乳小球的顆粒參照物治療的致敏小鼠。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。在Der p模型中，外周血嗜酸粒細(xì)胞增多減少了36％，在Afu模型中，外周血嗜酸粒細(xì)胞增多減少了58％。
實(shí)施例3圖3表示用CMP對(duì)感染Afu的小鼠的血清IgE水平的治療結(jié)果的比較。試驗(yàn)組接受5天的治療，3天后對(duì)采集的血液進(jìn)行測(cè)量。樣本量為4-5只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果說(shuō)明，在用CMP(Afu-殼多糖)經(jīng)鼻內(nèi)治療3天后，血清IgE水平小于5μg/ml IgE，相比之下，用PBS(Afu-PBS)治療的致敏小鼠的血清IgE水平為24μg/ml IgE。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。
實(shí)施例4圖4表示用CMP治療感染Afu的小鼠的血清IgE水平的效果。試驗(yàn)組每日用Afu提取物經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后5個(gè)每日劑量的17μgCMP(A-CMP1)經(jīng)鼻內(nèi)治療，或者在1小時(shí)后用PBS(A-PBS1)經(jīng)鼻內(nèi)治療。在下一周，單獨(dú)用3個(gè)日劑量的變應(yīng)原提取物經(jīng)鼻內(nèi)重新感染小鼠，重新測(cè)量血液IgE水平(A-PBS2、A-CMP2)。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果說(shuō)明，血清IgE顯著降低(p＜0.0005)，在一周后用變應(yīng)原重新感染，仍能保持(p＜0.0005)。
實(shí)施例5圖4顯示了用CMP治療感染Der p的小鼠的血清IgE水平的效果。試驗(yàn)組每日用Der p提取物經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用5個(gè)每日劑量的PBS(DerPBS)、25μg CMP(DerCMP)或25μg膠乳小球的顆粒參照物(DerPC)經(jīng)鼻內(nèi)治療。PBS表示在1小時(shí)后用PBS治療的未致敏小鼠。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。在治療的4天后測(cè)得，用5個(gè)每日劑量的25μg CMP治療使總血清IgE顯著下降(p＜0.005)。
實(shí)施例6圖6顯示了用CMP或PBS治療感染Afu的小鼠的血清IgG1水平的效果比較。試驗(yàn)組每日用PBS或25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)感染和處理5天，3天后對(duì)采集的血液進(jìn)行測(cè)量。樣本量為4-5只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。用Afu變應(yīng)原提取物經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療的致敏動(dòng)物(Afu-CMP)顯示，其血清IgG1水平的下降量為用PBS治療的致敏動(dòng)物(Afu-PBS)的四倍。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。
實(shí)施例7圖7顯示了用CMP治療感染Afu的小鼠的Afu特異性血清IgG1水平的效果。試驗(yàn)組每日用Afu提取物經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用5個(gè)每日劑量的17μg CMP(A-CMP)或1小時(shí)后用PBS(A-PBS)經(jīng)鼻內(nèi)治療。在下一周，單獨(dú)用3個(gè)每日劑量的變應(yīng)原提取物經(jīng)鼻內(nèi)重新感染小鼠，重新測(cè)量血液IgG1水平(A-PBS2、A-CMP2)。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果表明，Afu特異性IgG1的顯著降低(p＜0.01)，在一周后用變應(yīng)原重新感染后其仍能保持(p＜0.01)。
實(shí)施例8圖8顯示了變應(yīng)原重新感染對(duì)于感染Afu的小鼠的AHR的作用。試驗(yàn)組用Afu變應(yīng)原經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用PBS(Afu-PBS)或20μgCMP(Afu-CMP)經(jīng)鼻內(nèi)每日治療，重復(fù)4天。小鼠重新單獨(dú)感染變應(yīng)原，測(cè)量AHR，以應(yīng)答用30mg/ml的霧狀乙酰甲膽堿產(chǎn)生的刺激。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果表明，用CMP治療的動(dòng)物的AHR顯著降低了(p＜0.01)。這些小鼠顯示，當(dāng)感染乙酰甲膽堿后，對(duì)于參照小鼠，其Penh僅增加了110％，相比之下，PBS治療的小鼠增加了240％。
實(shí)施例9圖9顯示了相應(yīng)于20mg/ml霧狀乙酰甲膽堿激發(fā)，感染Afu的小鼠的氣道反應(yīng)過(guò)度。試驗(yàn)組用4個(gè)每日劑量的PBS或25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)給藥。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。在CMP治療的組內(nèi)觀察到AHR的顯著降低(p＜0.01)。用膠乳小球的顆粒對(duì)照物進(jìn)行的治療(A-PC)沒(méi)有減少AHR。
實(shí)施例10圖10顯示了用Der p感染的治療組對(duì)于霧狀乙酰甲膽堿的劑量反應(yīng)。治療組首先用Der p提取物進(jìn)行鼻內(nèi)感染，然后用PBS(Der-PBS)或25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療，重復(fù)4天。在感染/治療過(guò)程結(jié)束的4天后，用Der p重新感染小鼠。相應(yīng)于不同劑量的霧狀乙酰甲膽堿，測(cè)量AHR。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。樣本量為4-8只小鼠/組。誤差范圍為±SEM。結(jié)果表明，對(duì)于所有測(cè)試的乙酰甲膽堿濃度，AHR都降低了。
實(shí)施例11圖11顯示了，相應(yīng)于霧狀乙酰甲膽堿，用Der p感染的小鼠的AHR。治療組用25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療3天，在此之前用變應(yīng)原感染(Der p(0))，在用變應(yīng)原感染后，再用4個(gè)每日劑量的2μg CMP治療結(jié)束的4天后，重新單獨(dú)用變應(yīng)原感染(4))。PBS表示用PBS治療的未致敏小鼠。結(jié)果表示為Penh增加，在治療的第四天(Der-CMP(0)，p＜0.001)及在治療四天后重新感染后(Der-CMP(4)，p＜0.001)，AHR顯著降低。
實(shí)施例12圖12顯示了用CMP治療的Der p(H＝Der p)致敏小鼠的AHR。試驗(yàn)組用四種不同劑量的CMP(5-40μg)治療4天。在第4天，用Der p感染小鼠，1至2小時(shí)后用CMP治療，或用來(lái)自于25μg/ml的懸浮液(Psn)的CMP上清液治療，其不含任何CMP，作為參照治療。在與100mg/ml的霧狀乙酰甲膽堿接觸1.5分鐘后，測(cè)量AHR。P表示用未致敏小鼠。結(jié)果表明，所有劑量的CMP具有相等的效能，說(shuō)明在這個(gè)模型中，等于先前試驗(yàn)中所使用劑量五分之一的劑量可用于防止變應(yīng)性應(yīng)答。
實(shí)施例13圖13顯示了用蘇木精和伊紅染色的肺片斷，說(shuō)明了用CMP治療Afu致敏小鼠后，氣道的發(fā)炎和阻塞程度的不同。用PBS治療的變應(yīng)原激發(fā)的小鼠的支氣管周圍發(fā)炎的平均得分為2.5，相比之下，也用變應(yīng)原激發(fā)的CMP治療的小鼠的得分為1。這表示變應(yīng)原引發(fā)的發(fā)炎減少了60％。用PBS治療的非致敏小鼠的得分為0。圖13a顯示了用PBS治療后正常小鼠的肺，圖13b顯示了用PBS治療后變應(yīng)性肺，圖13c顯示了每日4個(gè)用劑量的25μg CMP鼻內(nèi)治療后的變應(yīng)性肺。
實(shí)施例14表1a顯示了在Der-p和Afu感染的小鼠內(nèi)治療對(duì)于IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平的作用。試驗(yàn)組施以4個(gè)每日劑量的變應(yīng)原提取物，然后用25μg CMP經(jīng)鼻內(nèi)治療，或用聚苯乙烯微球作為非特異性顆粒對(duì)照物(PC)。通過(guò)測(cè)量高度染色的細(xì)胞的比例來(lái)評(píng)估細(xì)胞因子產(chǎn)生的活性，所述細(xì)胞對(duì)于被藻紅蛋白標(biāo)記的相應(yīng)的抗細(xì)胞因子的抗體為陽(yáng)性。結(jié)果顯示為±SEM。在Der p模型中，IL-12顯著增加了77％(Der-CMP，p＜0.005)，在Afu模型中，IL-12增加了43％(Afu-CMP)。顆粒對(duì)照組的IL-12水平?jīng)]有增加。在Der p模型中，TNF-γ顯著增加了41％(Der-CMP，p＜0.05)，在Afu模型中，TNF-γ增加了22％(Afu-CMP)。在Der p模型中，TNF-α顯著增加了44％(Der-CMP，p＜0.05)，在Afu模型中，TNF-α增加了22％(Afu-CMP，p＜0.05)，在Der p激發(fā)的小鼠中治療對(duì)于GM-CSF水平的作用顯示于表1b。用40μg CMP治療小鼠。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞儀測(cè)量GM-CSF。用CMP進(jìn)行的治療相對(duì)于單獨(dú)用PBS進(jìn)行的治療使GM-CSF顯著(p＜0.05)降低，接近非變應(yīng)性自然小鼠中的水平。比較IL-4染色的脾細(xì)胞的幾何平均熒光(GMF)(表1c)，顯示在Der p模型中有34％的降低(Der-CMP)，而在Afu模型中有27％的降低(Afu-CMP)。在顆粒參照組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何降低。
實(shí)施例15圖14顯示了用CMP對(duì)于綠膿假單胞菌感染的小鼠的預(yù)處理效果。小鼠先用2×100綠膿假單胞菌經(jīng)鼻內(nèi)感染，然后用250μg CMP的PBS溶液經(jīng)鼻內(nèi)預(yù)處理3天。10天后測(cè)量動(dòng)物存活率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，合并所得結(jié)果。在變應(yīng)原感染1天后，40％的對(duì)照治療小鼠已經(jīng)死亡，而相比之下，CMP治療的小鼠具有100％的存活率。在變應(yīng)原感染3天后，70％的對(duì)照治療小鼠已經(jīng)死亡，而相比之下，CMP治療的小鼠具有80％的存活率。在感染多達(dá)10天后沒(méi)有看到這些存活率的變化。
實(shí)施例16圖15顯示了250μm CMP對(duì)于小鼠的清除肺炎鏈球菌的預(yù)處理效果。從0至12小時(shí)，在PBS和CMP治療的小鼠之間沒(méi)有觀察到差別；但是在24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，CMP治療的小鼠的肺內(nèi)具有顯著低的細(xì)菌cfu(p＜0.001)。
實(shí)施例17圖16顯示了250μm CMP對(duì)于感染小鼠血液中肺炎鏈球菌出現(xiàn)的預(yù)處理效果。在12小時(shí)點(diǎn)沒(méi)有觀察到細(xì)菌，在24小時(shí)(p＜0.005)和48小時(shí)，血液細(xì)菌顯著變少，說(shuō)明CMP在12至24小時(shí)內(nèi)在肺內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)作用。
實(shí)施例18圖17顯示了0.1μg/ml CMP對(duì)于在LPS活化的CD14人單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α產(chǎn)量的影響。僅用0.1μg/ml CMP培育的單核細(xì)胞的TNF-α產(chǎn)率非常小。但是，與僅由LPS刺激的細(xì)胞相比，用0.1μg/ml CMP并補(bǔ)充以5ng/ml的LPS作為單核細(xì)胞活化劑的血液培育可使得CD14+單核細(xì)胞內(nèi)的TNF-α產(chǎn)量顯著(p＜0.001)增加。
實(shí)施例19圖18顯示了0.1μg/ml CMP對(duì)于在LPS活化的CD14/CD16的前發(fā)炎人單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α產(chǎn)量的影響。在沒(méi)有CMP或LPS培育的前發(fā)炎單核細(xì)胞內(nèi)TNFα產(chǎn)量很小。當(dāng)與僅用LPS刺激的細(xì)胞相比時(shí)，用0.1μg/ml CMP并補(bǔ)充以5ng/ml的LPS的培育可導(dǎo)致TNFα產(chǎn)量增加至約350MFI。
實(shí)施例20圖19顯示了通過(guò)0.1μg/ml CMP產(chǎn)生的由PMA/離子霉素刺激的人T淋巴細(xì)胞的IFN-γ的產(chǎn)量。加入CMP使得了IFN-γ的產(chǎn)量提高了20％，所述IFN-γ來(lái)自于體外培養(yǎng)的PMA/離子霉素刺激的CD2+T淋巴細(xì)胞。結(jié)果表明，CMP能夠促進(jìn)Th1淋巴細(xì)胞的活性或增殖。
表1a)

b)

c)

參考文獻(xiàn)本文提到的參考文獻(xiàn)均清楚地引入本文以供參考。
1.Shibata et al，J.Immunol.，1641314-1321，20002.Shibata et al，J.Immunol.，1614283-8，19983.Shibata et al，Infection and Immunity，65(5)1734-1741，19974.Shibata et al，J.Immunol.，1592462-2467，19975.Horan et al，Mor.Mortal.Wkly.Rep.CDC Surveill.Summ.，3517ss-29ss，1986.
6.Davies J.，Nature，383219-220，1996.
7.Arruda et al，J.Immunol.，1493354-9，19928.Hamelmann et al，Am.J.Respir.Crit.Care Med.156766-775，19979.Sur et al，J.Immunol.，1626284-6293，199910.kadioglu et al.Infect.Immun.2492-501.2000.
權(quán)利要求
1.殼多糖微粒制劑(CMP)在制備用于治療變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途，其中經(jīng)鼻內(nèi)或吸入來(lái)遞送藥物，且殼多糖微粒的平均直徑小于10μm。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中變態(tài)反應(yīng)是季節(jié)性呼吸變態(tài)反應(yīng)；空氣變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)；可通過(guò)減少血清IgE和嗜酸粒細(xì)胞增多治療的變態(tài)反應(yīng)；哮喘；濕疹；食物過(guò)敏；皮炎；或通過(guò)變態(tài)反應(yīng)脫敏作用來(lái)治療的變態(tài)反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中空氣變應(yīng)原為屋內(nèi)螨、真菌孢子、草花粉、樹(shù)花粉或動(dòng)物皮屑。
4.如權(quán)利要求2所述的用途，其中皮炎為特應(yīng)性皮炎。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其中殼多糖微粒成分用于變態(tài)反應(yīng)脫敏作用，且另外包括變應(yīng)原。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中變應(yīng)原為食物變應(yīng)原。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中食物變應(yīng)原存在于牛奶、小麥、麩質(zhì)、雞蛋、堅(jiān)果、或貝類中。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其中藥物用于治療動(dòng)物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中動(dòng)物為馬，以及變態(tài)反應(yīng)為哮喘或與復(fù)發(fā)性肺感染有關(guān)。
10.殼多糖微粒(CMP)制劑在制備用于治療疾病的藥物中的用途，其中所述疾病得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的上調(diào)，其中經(jīng)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入來(lái)施用藥物，且殼多糖微粒的平均直徑小于10μm。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的上調(diào)的疾病為細(xì)菌性感染、真菌性感染或病毒性感染。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述感染為耳、鼻、咽喉或肺感染。
13.如權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物用于治療處于發(fā)生感染危險(xiǎn)中的病人。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中處于危險(xiǎn)中的病人為老人、早產(chǎn)兒、嬰兒、手術(shù)移植的病人、免疫抑制的病人、化療的病人、處于機(jī)會(huì)性感染危險(xiǎn)中的住院病人、使用呼吸機(jī)的病人、囊性纖維化病人或AIDS病人。
15.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述疾病為由綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鏈球菌(Streptococcus)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、肺炎克雷波桿菌(Klebsiellapneumoniae)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yershinia enteocolitica)、沙門菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、分枝桿菌(Mycobacteria)引起的細(xì)菌性感染，或寄生蟲(chóng)感染。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中鏈球菌為肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)或無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)。
17.如權(quán)利要求15所述的用途，其中分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、或麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)。
18.如權(quán)利要求15所述的用途，其中寄生蟲(chóng)感染為由利什曼原蟲(chóng)(Leishmania)和血吸蟲(chóng)(Schistosoma)引起的感染。
19.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述疾病為細(xì)菌性肺炎如呼吸機(jī)相關(guān)的肺炎或囊性纖維化相關(guān)的感染。
20.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述疾病為中耳炎。
21.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中真菌性感染為侵襲性肺曲霉病和侵襲性肺念珠菌病、卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎(Pneumocystiscarinii)或球孢子菌(Coccidioides)或隱球菌(Crytococcus)感染。
22.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述疾病為肺病毒性感染。
23.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中病毒性感染是由呼吸道合胞病毒細(xì)支氣管炎、流感病毒、鼻病毒或人體免疫缺陷病毒(HIV)的感染所引起的。
24.殼多糖微粒制劑在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病得益于NK細(xì)胞活性的上調(diào)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌IFN-γ，其中經(jīng)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入來(lái)施用藥物，且殼多糖微粒的平均直徑小于10μm。
25.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述疾病為癌。
26.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述疾病為肺癌、肺腫瘤、或鼻-咽腫瘤。
27.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述疾病為慢性肺疾病。
28.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物被預(yù)防性地施用。
29.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中殼多糖微粒的平均直徑小于5μm。
30.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中殼多糖微粒的平均直徑為至少1μm。
31.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中殼多糖微粒來(lái)自蟹、蝦、龍蝦、烏賊和昆蟲(chóng)的外骨骼和真菌。
32.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中通過(guò)聲波處理或研磨純化的殼多糖得到殼多糖微粒。
33.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中通過(guò)用N-乙酰-D-葡糖胺、殼多糖或其片段來(lái)涂布載體顆粒得到殼多糖微粒。
34.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中給病人施用藥物的治療有效量按每千克體重計(jì)為0.01至100mg活性化合物。
35.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中將藥物施用給人。
36.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中殼多糖微粒制劑包括一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體、推進(jìn)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑或抗氧化劑。
37.施用如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的殼多糖微粒的遞送裝置，所述裝置包括a)平均直徑小于10μm的殼多糖微粒的儲(chǔ)存器；b)適于設(shè)置在病人口或鼻內(nèi)的遞送孔；和c)在儲(chǔ)存器和遞送孔之間的閥門，以便操縱該閥門來(lái)控制殼多糖微粒的遞送。
38.一種包括殼多糖微粒成分和變應(yīng)原的組合物，其中殼多糖微粒的直徑小于10μm。
39.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述變應(yīng)原為食物變應(yīng)原。
40.如權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述食物變應(yīng)原存在于牛奶、小麥、麩質(zhì)或雞蛋中。
41.一種包括殼多糖微粒成分和變應(yīng)原的組合物，其中殼多糖微粒的直徑小于10μm以用于醫(yī)學(xué)治療方法中。
42.一種用于同時(shí)或按順序施用給病人的試劑盒，所述試劑盒包括a)殼多糖微粒成分，其中殼多糖微粒的直徑小于10μm；和b)變應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了殼多糖微粒成分及其在治療疾病如變態(tài)反應(yīng)、感染和癌中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/35GK1543338SQ02816027
公開(kāi)日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月16日
發(fā)明者彼得·斯特朗, 彼得 斯特朗 申請(qǐng)人:醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)