專利名稱：診斷和/或治療劑的改進(jìn)或與其相關(guān)的改進(jìn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷和/或治療活性劑，更具體地說涉及滲入了在體內(nèi)與位點(diǎn)和/或結(jié)構(gòu)相互作用或?qū)ζ渚哂杏H和性的組分(這樣增強(qiáng)了體內(nèi)特定部位的診斷圖象和/或治療)的診斷和/或治療活性劑。本發(fā)明特定的目標(biāo)是用于超聲造影的診斷劑，其在下文中稱作為導(dǎo)向超聲造影劑。
眾所周知超聲造影包含具潛在價值的診斷工具，例如用于脈管系統(tǒng)的研究中，特別是在心動描記法，以及組織微脈管系統(tǒng)中。已提出利用各種造影劑來增強(qiáng)所獲得的聲學(xué)圖象，包括固體微粒懸液，乳化的液滴，氣泡和包裹的氣體或液體。通常認(rèn)為低密度造影劑(其容易壓縮)就它們所產(chǎn)生的聲學(xué)反散射而言特別有效，因此相當(dāng)大的興趣表現(xiàn)在制備包含氣體和產(chǎn)生氣體的系統(tǒng)中。
也已知含氣體的造影介質(zhì)在磁共振(MR)造影中有效，例如作為易感性造影劑，其可減少M(fèi)R信號強(qiáng)度。含氧的造影介質(zhì)也代表潛在有用的順磁MR造影劑。
此外，在X-光造影領(lǐng)域中觀察到氣體(如二氧化碳)可用作為陰性口服造影劑或血管內(nèi)造影劑。
已提出將放射性氣體(例如惰性氣體的放射性同位素，如氙)用于閃爍照相中例如血液池造影。
人們認(rèn)為導(dǎo)向超聲造影劑包含(i)能夠與超聲波輻射相互作用產(chǎn)生可檢測信號的報道物組分；(ii)在體內(nèi)與特殊的導(dǎo)向點(diǎn)和/或結(jié)構(gòu)(例如病理學(xué)的特定細(xì)胞或區(qū)域)具有親和性一種或多種載體；(iii)一種或多種連接所說的報道物和載體的接頭(在它們不直接相連時)。
造影劑所要結(jié)合的分子和/或結(jié)構(gòu)在下文中被稱為靶。為了在體內(nèi)所選擇的區(qū)域/結(jié)構(gòu)獲得特定圖象或治療效應(yīng)，在本區(qū)域/結(jié)構(gòu)中必須存在和可利用有效的靶。理想的是僅在目的區(qū)域中得以表達(dá)，但通常在體內(nèi)其它位置也有表達(dá)，這產(chǎn)生可能的背景問題。靶可以是確定的分子種類(如靶分子)或未知的分子或復(fù)合結(jié)構(gòu)(如靶結(jié)構(gòu))，它們存在于待造影和/或治療的區(qū)域中，且能夠特異性地或選擇性地結(jié)合給定的載體分子。
載體附在或連接到報道物組分上，從而使這些部分結(jié)合到待造影和/或治療的區(qū)域/結(jié)構(gòu)上。載體可特異性地結(jié)合到所選擇的靶上，或者它僅選擇性地結(jié)合，對少量其它分子/結(jié)構(gòu)也具有親和性，這又產(chǎn)生了可能的背景問題。
僅具有與導(dǎo)向的超聲造影劑有關(guān)的有限的現(xiàn)有技術(shù)的例子。例如US-A-5531980涉及這些系統(tǒng)，在這些系統(tǒng)中所說的報道物包含一種空氣或氣體微泡(其由至少部分呈薄片狀的一種或多種形成膜的表面活性劑所穩(wěn)定化)的含水懸液，所說的表面活性劑結(jié)合在一種或多種載體(其包含″為特異導(dǎo)向目的所設(shè)計的生物活性物質(zhì)″)上。據(jù)述微泡不直接由表面活性劑物質(zhì)進(jìn)行包裹，但卻摻入到裝有液體的脂質(zhì)體(其穩(wěn)定化微泡)內(nèi)。位于脂質(zhì)體的薄片狀的表面活性劑物質(zhì)如磷脂將不可避免地呈現(xiàn)一種或多種脂質(zhì)雙層形式，親脂的尾部″背-對-背″而親水的頭部分別位于內(nèi)部和外部(參見例如Schneider，M.藥物導(dǎo)向中關(guān)于″作為藥物載體的脂質(zhì)體10年的研究″，Nyon，瑞士，3-5，1984年10月，Buri，P.和Gumma，A.(Ed)，Elsevier，Amsterdam 1984)，這是很有利的。
EP-A-0727225描述了導(dǎo)向的超聲造影劑，其中報道物包含一種具有足夠水蒸氣壓力的化學(xué)藥品，這樣在施用對象的體溫下它的組分為氣體。該化學(xué)藥品與表面活性劑或白蛋白載體有關(guān)，包括作為載體的蛋白質(zhì)-，肽-或糖-基質(zhì)的細(xì)胞粘著分子配體。在這些造影劑中的報道物組分對應(yīng)于WO-A-9416739中所描述的相轉(zhuǎn)變膠體系統(tǒng)；現(xiàn)在認(rèn)識到這樣施用相轉(zhuǎn)變膠體可以導(dǎo)致微泡的產(chǎn)生，微泡的生長無法控制，有可能達(dá)到引起潛在的危險的栓塞(例如心血栓和腦血栓)的程度(參見例如Schwarz，回波造影進(jìn)展[1994(3)]，pp 48-49)。
WO-A-9320802提出，可利用連接在組織特異性配體(如抗體，肽，外源凝集素等等)上的聲象反射單層脂質(zhì)體增強(qiáng)組織-特異性超聲圖象。故意挑選沒有氣體的脂質(zhì)體，這樣沒有基于氣體的超聲造影劑的有利的回波性質(zhì)。此外本技術(shù)的一些參考文獻(xiàn)，例如在血纖蛋白，血栓，動脈硬化癥區(qū)域的導(dǎo)向中，見出版物Alkanonyuksel，H.等，制藥科學(xué)雜志(1996)85(5)，486-490；J.Am.Coll.Cardiol.(1996)27(2)Suppl A，298A；循環(huán)，68科學(xué)會議，Anaheim 1995，11，13-16。
也有關(guān)于超聲造影劑的一些出版物，其順便談到可利用單克隆抗體作為載體但沒有給出重要的實(shí)際細(xì)節(jié)和/或包含報道物的物質(zhì)，這些物質(zhì)可被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收，因此可增強(qiáng)器官(如肝)圖象-參見，例如WO-A-9300933，WO-A-9401140，WO-A-9408627，WO-A-9428874，US-A-5088499，US-A-5348016和US-A-5469854。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了由形成膜的表面活性劑物質(zhì)單分子層所穩(wěn)定化的充氣微泡在導(dǎo)向的診斷和/或治療劑中是非常有用的報道物。這樣，例如，這些單層薄膜的彈性和柔性可實(shí)質(zhì)上增強(qiáng)與脂質(zhì)體系統(tǒng)相關(guān)的報道物的回波性(echogenicity)，其中脂質(zhì)體系統(tǒng)包含脂質(zhì)雙層或多個這樣的雙層結(jié)構(gòu)。這樣可保證利用低劑量的報道物材料達(dá)到較高的超聲波造影效應(yīng)，且具有必然的安全優(yōu)點(diǎn)。
這樣根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了可導(dǎo)向的診斷和/或治療活性劑，例如超聲造影劑，該造影劑包含在含水載液(例如可注射的載液)中的報道物的懸液，其中所說的報道物包含由形成膜的表面活性劑物質(zhì)單分子層穩(wěn)定化的充氣微泡，所說的試劑還包含至少一種載體。
本文中術(shù)語″單分子層″指兩親型表面活性劑部分在氣液界面之間形成的單分子層或類似于所謂的Langmuir-Blodgett膜，其中兩親物的親脂部分朝氣相排列而親水部分與水相相互作用。
如WO-A-9729783所示，人們相信在帶電荷的磷脂膜之間的靜電排斥可促進(jìn)在微泡載液界面處形成穩(wěn)定和穩(wěn)定化的單分子層。相對于包括一個或多個脂質(zhì)雙層的充氣脂質(zhì)體來說，人們認(rèn)為這些單層薄膜的彈性和柔性可增強(qiáng)按照本文所揭示的本發(fā)明的產(chǎn)物的回波性。用于穩(wěn)定化這些含微泡的水懸浮液所利用的磷脂的量低至在每個微泡周圍形成表面活性劑單分子層所必需的量，所形成的類膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化微泡以防萎陷或融合。人們認(rèn)為在低磷脂濃度時，不會獲得具有類脂質(zhì)體表面活性劑的雙分子層的微泡。
本發(fā)明的一個有利的實(shí)施方案是基于另外的發(fā)現(xiàn)，即與靶粘著的有限性是診斷和/或治療活性劑的一種非常有用的性質(zhì)，該性質(zhì)是利用臨時逗留而非穩(wěn)定化結(jié)合到靶上的載體產(chǎn)生的。這些試劑(不是穩(wěn)定化保持在特異性位點(diǎn)的那些試劑)可以例如借助它們與內(nèi)皮細(xì)胞的瞬時相互作用有效地顯示沿脈管內(nèi)皮細(xì)胞層延緩流速的形式。在超聲造影劑提供的增強(qiáng)的回波性(其與血流量有關(guān))的情況下，這些藥劑可集中于血管壁上，這沒有解剖學(xué)上的特性。因此，它們可增強(qiáng)毛細(xì)管系統(tǒng)的造影(包括微膠管系統(tǒng))，并且利于區(qū)分正常和不充分散布的組織(例如在心臟中)，并且也對視覺結(jié)構(gòu)(如Kupffer細(xì)胞，血栓，及動脈硬化癥損傷)有用或?qū)σ曈X新生血管和發(fā)炎組織區(qū)有用。本發(fā)明特別適于使發(fā)生于位于組織壞死區(qū)域中的正常血管中的變化造影。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通過一定的方式將一種或多種載體附在或包含在報道物內(nèi)，使得載體不容易暴露在靶或靶接受體上。因此可利用另一種方法暴露出載體，例如在施用之后使造影劑暴露在外部超聲波下，以改變包括載體的部分的擴(kuò)散力來增加組織的特異性。
任何生物相容的氣體均可存在于報道物內(nèi)，本文所使用的術(shù)語″氣體″包括在正常的人體溫37℃下實(shí)質(zhì)上或完全為氣體形式(包括水蒸氣)的任何物質(zhì)(包括混合物)。因此這些氣體包括例如，空氣；氮?dú)?；氧氣；二氧化碳；氫氣；惰性氣體(如氦，氬，氙或氪)；硫氟化物(如六氟化硫)，二硫十氟化物或三氟甲基硫五氟化物；六氟化硒；可有可無的鹵代硅烷如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量的碳?xì)浠衔?例如包含多達(dá)7個碳原子的)，例如烷(如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷或戊烷)，環(huán)烷(如環(huán)丙烷，環(huán)丁烷或環(huán)戊烷)，烯(如乙烯，丙烯，丙二烯或丁烯)，或炔(如乙炔或丙炔)；醚(如二甲醚)；酮；酯；低分子量鹵代碳?xì)浠衔?例如包含多達(dá)7個碳原子的)；或任何上述的混合物。有利的是在鹵代氣體中的至少一些鹵原子為氟原子；這樣，生物相容的鹵代碳?xì)浠衔餁怏w例如可選自下列，溴氯二氟甲烷，氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，溴三氟甲烷，氯三氟甲烷，氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，氯三氟乙烯，氟乙烯，乙基氟化物，1，1-二氟乙烷，以及全氟碳，例如全氟烷烴，如全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷(例如全氟-N-丁烷，或與其它異構(gòu)體的混合物，如全氟-異-丁烷)，全氟戊烷，全氟己烷及全氟壬烷；全氟烯烴，如全氟丙烯，全氟丁烯(例如，全氟丁-2-二烯)和全氟丁二烯；全氟炔烴如全氟丁-2-炔烴；及全氟環(huán)烷如全氟環(huán)丁烷，全氟甲基環(huán)丁烷，全氟二甲基環(huán)丁烷，全氟三甲基環(huán)丁烷，全氟環(huán)戊烷，全氟甲基環(huán)戊烷，全氟二甲基環(huán)戊烷，全氟環(huán)己烷，全氟甲基環(huán)己烷，以及全氟環(huán)壬烷。其它鹵代氣體包括氯代甲烷，氟化(例如全氟化)酮如全氟丙酮，和氟化(例如全氟化)醚如全氟二乙醚。由于認(rèn)識到在血流內(nèi)包含這些氣體的微泡的高穩(wěn)定性，因此尤為優(yōu)選利用全氟化的氣體，例如六氟化硫和全氟碳，如全氟丙烷，全氟丁烷和全氟戊烷。
由于按照本發(fā)明的報道物單位內(nèi)的形成膜的表面活性劑單分子層可以穩(wěn)定化所產(chǎn)生的微泡以防無限生長，因此氣體可包括如丁烷，環(huán)丁烷，N-戊烷，異戊烷，新戊烷，環(huán)戊烷，全氟戊烷，全氟環(huán)戊烷，全氟己烷或包含一種或多種在處理或加工溫度下為液態(tài)而在體溫下為氣體的這樣的氣體的混合物，如在上述WO-A-9416739所描述的。
在原則上，任何適當(dāng)?shù)哪ば纬杀砻婊钚詣┒伎捎糜谛纬砂鼩怏w的單分子層，包括非聚合和非可聚合的形成壁的表面活性劑物質(zhì)，例WO-A-9521631所描述的；聚合物表面活性劑物質(zhì)，如WO-A-9506518中所描述的；和磷脂，如WO-A-9211873，WO-A-9217212，WO-A-9222247，WO-A-9428780，WO-A-9503835或WO-A-9729783所描述的。根據(jù)本發(fā)明，試劑中的形成膜的表面活性劑有75％摻入到氣液界面的單分子層是有利的，實(shí)質(zhì)上完全摻入更優(yōu)選。
有效的磷脂的典型代表例子包括卵磷脂(如磷脂酰膽堿)，例如天然的卵磷脂如蛋黃卵磷脂或大豆卵磷脂和合成或半合成的卵磷脂如二肉桂酰磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿或甘油二硬脂酰磷脂酰膽堿；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；心磷脂；鞘磷脂；任何上述的氟化類似物；任何上述的混合物和其它類脂類的混合物如膽固醇。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)利用主要(如至少75％)包含單獨(dú)帶有凈電荷的分子的磷脂是特別有利的，尤其是本質(zhì)上用作為報道物唯一的兩親性組分時，這些磷脂有利于某些參數(shù)(如產(chǎn)物穩(wěn)定性和聲學(xué)性質(zhì))。出于理論考慮希望沒有結(jié)合，人們相信在帶電荷的磷脂膜之間的靜電排斥力可促進(jìn)在氣液界面處形成穩(wěn)定的單分子層(如上所述)，并且相對于包括一個或多個脂質(zhì)雙層的充氣脂質(zhì)體來說，這些單層薄膜的彈性和柔性可增強(qiáng)按照本發(fā)明的報道物的回波性。
利用帶電荷的磷脂也可提供具有有利性質(zhì)的報道物，例如，穩(wěn)定性，分散性以及無需依賴于添加劑(如另外的表面活性劑和/或粘度增強(qiáng)劑)的抗凝聚性，由此可保證施用(通過注射將造影劑施用到受試者體內(nèi))的組分量最小。這樣，例如，由于靜電排斥，微泡帶電荷的表面能使聚集作用最小或或阻止聚集作用。
在制備和/或使用條件下，要求至少75％，優(yōu)選為所有的磷脂物質(zhì)(其用于本發(fā)明活性劑中的報道物)由帶凈電荷的分子組成，其中該電荷可以是正電荷或優(yōu)選地為負(fù)電荷。帶正電荷的磷脂的代表包括磷脂酸如二棕櫚酰磷脂酸，或帶氨基醇(如羥乙基乙二胺)二硬脂酰磷脂酸的酯。帶負(fù)電荷的磷脂的例子包括天然存在的(例如大豆或蛋黃衍生物)，半合成的(例如部分或完全氫化)和合成的磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸和心磷脂。這些磷脂的脂?；ǔＣ總€含約14-22個碳原子，如在棕櫚酰和硬脂?；?。依據(jù)本發(fā)明，這樣帶電荷的磷脂的溶解形式也有用，術(shù)語″溶解″表示僅包括一個脂酰基的磷脂，優(yōu)選地以酯鍵連接到甘油基部分的1-位置碳原子上。這種帶電荷磷脂的溶解形式若與帶兩個脂?；膸щ姾闪字嗷旌蟿t更利于應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，磷脂酰絲氨酸為活性劑中所利用的優(yōu)選磷脂，并優(yōu)選地構(gòu)成其主要部分，例如其磷脂含量至少80％，例如85-92％。雖然出于理論考慮希望沒有結(jié)合，則在鄰近絲氨酸部分的羧基和氨基之間的離子橋利于這種報道物系統(tǒng)的穩(wěn)定性。優(yōu)選的磷脂酰絲氨酸包括飽和(例如氫化或合成)天然磷脂酰絲氨酸和合成的二硬脂酰磷脂酰絲氨酸，二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸和花生烯酸酰磷脂酰絲氨酸。
其它潛在有用的類脂類包括磷脂酰膽胺或其與一種或多種下述類脂類的混合物，如磷脂酸，棕櫚酸，硬脂酰胺，棕櫚酰胺，膽固醇，二烴基甘油，鞘氨甘油脂，合成類脂類如N，N-二甲基-N-十八基-1-十八銨氯化物或溴化物(DODAC，DODAB)，和/或馬來酸二烷基酯。
另外有效的類脂類(其可用來制備包含氣體的造影劑)包括了脂肪酸，硬脂酸，棕櫚酸，2-N-十六烷基硬脂酸，油酸，和其它具酸的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)通過形成胺化合鍵偶連在具有一個或多個氨基的氨基酸上；所形成的脂修飾的氨基酸(例如二棕櫚酰絲氨酸或二硬酯酰2，3-二氨基丙酸)是功能間隔元件(其具有與一個或多個載體分子綴合的偶連位點(diǎn))接合的有用的前體。
另一些有用的穩(wěn)定劑包括脂肽(包含連接在肽接頭部分的脂質(zhì))，其中所說的肽連接物部分適于偶連一個或多個載體分子。尤其優(yōu)選包括帶正電荷的肽接頭元件(例如包含兩個或多個賴氨酸殘余物)，它們能通過與報道物的微泡(其由帶負(fù)電荷的磷脂或其它表面活性劑膜穩(wěn)定化)的靜電作用錨定。
另一個本發(fā)明的實(shí)施方案包括具有一個或多個可與位于細(xì)胞表面的受體分子發(fā)生非特異性反應(yīng)的基團(tuán)的功能性微泡。例如，微泡(包括巰基組分)通過二硫化物交換反應(yīng)可結(jié)合到細(xì)胞表面的受體上。該反應(yīng)的可逆的性質(zhì)意味著那種微泡流可通過改變氧化還原環(huán)境來控制。同樣地，具有膜的功能微型氣泡(其膜包含活化的酯如N-羥基丁二酰亞胺酯)可用來與位于細(xì)胞表面的多態(tài)性分子的氨基進(jìn)行反應(yīng)。
以前所提出的基于磷脂的微泡包含的造影劑(例如WO-A-9409829所描述的)經(jīng)常由接觸磨碎的表面活性劑進(jìn)行制備，例如將凍干粗制的脂質(zhì)體或凍干的或噴干的磷脂溶液與空氣或其它氣體接觸，然后與含水載體接觸，攪拌以產(chǎn)生微泡懸液，該微泡懸液必須在制備后不久就施用。然而，該操作也有不利之處，即必須使所有攪拌能量都用于產(chǎn)生所需的微泡的分散，而且微泡的大小與分布規(guī)模都依賴所用的能量，因此在實(shí)踐上不利于控制。
另一方面，若在適當(dāng)?shù)陌砻婊钚詣?例如磷脂)的水介質(zhì)中產(chǎn)生分散的微泡而制備根據(jù)本發(fā)明的報道物或活性劑則是很有利的，如果需要，可以事先將其中所說的水介質(zhì)高壓滅菌或以其它方式滅菌，然后(優(yōu)選在洗滌和/或大小分級分離這樣形成的微泡之后)低壓凍干(例如在一種或多種冷保護(hù)劑/冷凍保護(hù)劑存在下)分散物，以產(chǎn)生干燥產(chǎn)物，該產(chǎn)物在水溶液中容易重構(gòu)產(chǎn)生均勻的具有再生性的微泡的彌散物。這一方法的具體細(xì)節(jié)見WO-A-9729783，本文以參考形式并入了WO-A-9729783的內(nèi)容；能除去不大小的氣泡和過量的表面活性劑物質(zhì)的能力使該方法實(shí)質(zhì)上優(yōu)于如前面WO-A-9409829所述的那些方法及現(xiàn)有技術(shù)，如WO-A-9608234(該方法是通過在注射前振蕩不同的磷脂和粘度增強(qiáng)劑(如丙二醇和甘油)的懸液在位點(diǎn)上產(chǎn)生小泡)可用上述方法來產(chǎn)生具非常窄范圍的分子大小的報道物的微泡，例如超過90％(例如至少95％，優(yōu)選98％)的微泡的平均體積直徑為1-7μm并且不到5％(例如不超過3％，優(yōu)選不超過2％)的微泡的平均體積直徑超過7μm。洗滌步驟則確保報道物完全沒有不需要的組分(諸如過量類脂類或粘度增強(qiáng)劑)。按本方法制備的包含報道物的活性劑具有下列優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)造影劑材料的優(yōu)點(diǎn)由于所有表面活性劑物質(zhì)均作為單分子層充分參與了微泡的固定化，因此大大增強(qiáng)了每劑量的回波性。狗體內(nèi)超聲波檢驗(yàn)表明，上述制備的超聲造影劑雖僅靜脈內(nèi)注射了0.1-1μg的微泡/kg體重，卻以15dB從心肌層增加反向散射信號強(qiáng)度。
由于該活性劑可以使所注射的磷脂的劑量可低至0.1-10μg/kg體重(如1-5μg/kg)的量，因此同樣可提高體內(nèi)的安全性。這樣低水平表面活性劑的利用可明顯減少可能的毒副作用，因而具有實(shí)質(zhì)上的優(yōu)點(diǎn)。
由于人們通常認(rèn)為當(dāng)利用包含具有對位點(diǎn)的親和性的載體的產(chǎn)品時，相當(dāng)?shù)土康膱蟮牢飳⒃谒璧奈稽c(diǎn)積累，因此高的效應(yīng)/劑量比對于導(dǎo)向應(yīng)用也特別有利。因此，與所熟知的可導(dǎo)向的超聲造影劑相比，按照本發(fā)明的優(yōu)選報道物在所需位點(diǎn)明顯提高造影作用。利用超聲波，這種高效性可有效地使單個微型氣泡可視，其靈敏度接近閃爍照相(雖然閃爍照相照片的圖形分辨率不高，但在導(dǎo)向定向中可能為目前最有用的技術(shù))的靈敏度或比其具潛在地更高的靈敏度。
基于磷脂酰絲氨酸上的活性劑的特殊優(yōu)點(diǎn)是他們的生物相容性；在動物試驗(yàn)中入靜脈注射(以正常造影劑量進(jìn)行注射，共10次)了基于磷脂酰絲氨酸的造影劑的膠塊(其按上述方法制備)的狗，并未發(fā)現(xiàn)任何急性毒性作用如血壓變化或心率變化。
由于帶電荷的磷脂含有功能基如羧基或氨基，若需要，它們使得易于以連接單位連接載體，因此這些磷脂也是有優(yōu)勢的。注意，在微泡產(chǎn)生之前，其它官能團(tuán)也可通過包含所需功能基的脂質(zhì)與形成膜的表面活性劑相混合而摻入到系統(tǒng)內(nèi)。
本發(fā)明中一般地沒必要在活性劑中加入添加劑，如乳化劑和/或粘度增強(qiáng)劑(這些普遍用于現(xiàn)有許多造影劑的制作中)。如上所述，在保證施用給授受者體內(nèi)的組分?jǐn)?shù)量最小，及保證活性劑的粘度盡可能低方面均有優(yōu)點(diǎn)。然而，由于制備活性劑通常包括上述的冷凍干燥步驟，因此最好包含冷凍保護(hù)劑或填充劑，例如醇(如脂肪族醇如T-丁醇)；多羥基化合物(如甘油)；糖(例如食糖如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或環(huán)糊精，或多糖如葡聚糖)；或聚乙二醇(如聚乙二醇)。優(yōu)選利用生理學(xué)易耐受的糖如蔗糖。
如上述所制備冷凍干燥的產(chǎn)品在水中尤其容易重構(gòu)，其僅需要輕微地攪拌如輕輕用手振蕩幾秒鐘。所產(chǎn)生的微泡大小是均勻的具有再生性的，并且不依賴于用于振蕩的能量，實(shí)踐上按在初始微泡分散狀態(tài)下所形成的微泡的大小決定；這一大小參數(shù)驚人地實(shí)質(zhì)上維持在冷凍的和重構(gòu)產(chǎn)物中。這樣，既然通過操作參數(shù)(如方法，速度，以及攪拌的持續(xù)時間)易于控制在初始分散化中的微泡的大小，因而容易控制最后的微泡大小。
已證實(shí)冷凍干燥產(chǎn)物在周圍環(huán)境條件之下至少可穩(wěn)定存儲幾個月。通過水中重構(gòu)所產(chǎn)生的微泡彌散物可穩(wěn)定保存至少8小時，至于在注射前干燥的產(chǎn)物重構(gòu)，也可保證相當(dāng)?shù)娜嵝浴?br> 在目前超聲成像設(shè)備的最小檢測水平上，這些優(yōu)選報道物的高效使得可利用比通常更小的小泡而仍然很好地產(chǎn)生超聲造影作用。較小的小泡具有潛在的優(yōu)點(diǎn)如減少血管阻塞，循環(huán)時間更長，接近靶的能力更大，及在肺臟或其它非靶器官積累更低，并且它們的利用和包含它們的活性劑共同構(gòu)成本發(fā)明另外的特性。
也可利用這些更小的小泡來開發(fā)小泡簇增強(qiáng)超聲造影作用的效應(yīng)。理論上知道，在總體積為V的稀釋分散液中，特定小泡數(shù)量的超聲造影效應(yīng)會隨著小泡聚集形成一個更大的氣相(總體積相同仍為V)而增加。因此，可利用直到它們聚集才顯示超聲造影效應(yīng)的小泡(由于非導(dǎo)向點(diǎn)的靶分子密度低，所以聚集作用優(yōu)先發(fā)生在靶區(qū)域)。小泡也可用于熔合，例如通過與靶相互作用而引起的小泡間的結(jié)合，以增強(qiáng)在靶區(qū)域中造影效應(yīng)。如果報道物(其還具有在特異性位點(diǎn)引起逗留的載體)具有能與其它小泡的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的未反應(yīng)的連接物的部分，則可引起小泡間交聯(lián)和隨之的群聚集。
在本發(fā)明的上下文中，報道物單位通常仍然附在載體上。然而，在一類導(dǎo)向方法中(有時稱為″前導(dǎo)向″)，單獨(dú)施用載體(通常為單克隆抗體)；其后施用偶連了能特異結(jié)合前導(dǎo)向載體分子的組分的報道物(若前導(dǎo)向載體是抗體，則報道物偶連免疫球蛋白結(jié)合分子，如蛋白質(zhì)A或抗免疫球蛋白抗體)。本方案的優(yōu)點(diǎn)是有時間消除不結(jié)合靶的載體分子，充分減少在過量報道物-載體綴合物的情況下相關(guān)的背景問題。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中包括一種組合制劑，該制劑包含i)包含對所選擇靶具有親和性的前導(dǎo)向載體的第一可施用組合物；和ii)包含權(quán)利要求1的活性劑的第二可施用組合物，其中所說的活性劑包含對所說的前導(dǎo)向載體具有親和性的載體。
優(yōu)選的所說的前導(dǎo)向載體是單克隆抗體。在本發(fā)明的上下文中，涉及具有一個特異性載體的前導(dǎo)向作用，隨后是偶連了另一個載體和組分(該成分結(jié)合第一個載體上)的報道物單位。
在本發(fā)明的上下文中，例如在導(dǎo)向區(qū)域(如心肌)血液灌流速率的估價中，按要求測量速率，從此結(jié)合靶的造影劑被取代或釋放。該過程可通過施用具有從靶處取代或釋放造影劑能力的另外的載體和/或其它物質(zhì)，以這種可控制的方式進(jìn)行。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中包括一種組合制劑，該制劑包含i)包含權(quán)利要求1的活性劑的第一可施用組合物；和ii)包含可從所說活性劑的靶中取代或釋放該活性劑的物質(zhì)的第二可施用組合物。
按照本發(fā)明能被利用的超聲波圖象形式包括兩維和三維的圖象技術(shù)如B-方式圖象(例如利用信號膜的時間-變化振幅，該振幅產(chǎn)生于噴射脈沖的基頻，產(chǎn)生于其子諧函數(shù)或高諧函數(shù)或產(chǎn)生于所噴射的脈沖和這些諧函數(shù)的總數(shù)或它們的不同頻率，優(yōu)選由基頻或其第二個諧函數(shù)產(chǎn)生的圖象)，彩色Doppler圖象和Doppler的振幅圖象，及后兩者與上述任何形式相結(jié)合的圖象。按照本發(fā)明，由導(dǎo)向單層-穩(wěn)定化的微球體驚人地獲得極佳的第二個諧函數(shù)信號。為減少運(yùn)動的影響，借助于合適的同步技術(shù)(例如使接受者處于ECG或呼吸運(yùn)動)，收集了組織(如心臟或腎)的連續(xù)的圖象。測量共振頻率或頻率吸收(其可鎖住或阻礙微泡)方面的變化利于造影劑的檢測。
本發(fā)明提供了與載體-介導(dǎo)的產(chǎn)物對所需位點(diǎn)的定向作用相結(jié)合的治療性藥物的傳送工具。″治療性″或″藥物″表示一種對活人或非人動物特定疾病有益的藥劑。雖然在例如WO-A-9428873和WO-A-9507072中已提出了將超聲造影劑和藥物組合，但這些產(chǎn)品缺乏與位點(diǎn)具特異親和性的載體，因此在藥物釋放前或釋放期間，在所需位點(diǎn)的特異性保持相對較弱。
按照本發(fā)明所利用的治療化合物可在微泡內(nèi)部被包裹，或附著在或摻入到穩(wěn)定化膜上。這樣，治療化合物可通過例如共價或離子鍵與膜部分連接，或在體內(nèi)混合到穩(wěn)定化材料中(尤其如果藥物與膜材料的極性或溶解性類似時)則可阻止它在體內(nèi)作用之前滲漏產(chǎn)物。在施用后，僅僅通過與血液的濕接觸就可啟動藥物的釋放，或在其它內(nèi)部或外部影響下(例如通過酶或利用超聲波催化的分解方法)啟動藥物的釋放。在超聲造影劑方面，利用外部超聲波使氣體包含的微顆粒破裂是眾所周知的現(xiàn)象(如WO-A-9325241中所描述的)；藥物釋放速率的變化取決治療應(yīng)用的類型，及通過轉(zhuǎn)換器所利用的超聲波能量的具體量。
利用合適的連接劑(如本文所描述的)可將治療劑共價連接在包裹的膜表面。例如，如上所述，可首先制備磷脂或脂肽的衍生物(藥物通過可被生物降解的共價鍵或連接物結(jié)合在這些衍生物上)，然后將這些衍生物摻入到制備報道物的材料中。
適于本發(fā)明的藥物傳送組合物的典型治療劑包括任何已知治療藥物或其活性類似物(含有巰基，其在氧化條件下連接在含巰基的微泡上從而形成二硫化物基團(tuán))。與一個載體或多個載體相結(jié)合的這些藥物/載體-修飾的微泡可在靶組織上積累；施用還原劑(如谷胱甘肽還原劑)可使在靶細(xì)胞附近的導(dǎo)向的微泡釋放藥物分子，增加藥物的局部濃度，并增強(qiáng)它的治療效應(yīng)。此外，也可在沒有治療藥物的情況下先制備該組合物，然后在使用前將治療藥物連接到或涂在微泡上；這樣，例如，治療藥物可加至含水介質(zhì)的微泡的懸液中，并振蕩使治療藥物附著或粘附在微泡上。
其它的給藥系統(tǒng)包括與導(dǎo)向載體相結(jié)合的載體-修飾的帶有脂肽結(jié)構(gòu)(包括聚-L-賴氨酸或聚-D-賴氨酸鏈)的磷脂膜。在應(yīng)用于受體-介導(dǎo)的給藥方法特別重要的應(yīng)用于基因治療/反義技術(shù)中時，微泡載體通過與陽離子聚賴氨酸的靜電作用濃縮在DNA及RNA上。本方法具有用于導(dǎo)向傳送的一種或多種載體不直接連接在聚賴氨酸載體組分上的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)橹|(zhì)鏈的存在，聚賴氨酸鏈更牢固地錨定在微泡膜上。利用超聲波增加輸送的效應(yīng)非常明顯。
此外，游離的聚賴氨酸鏈?zhǔn)紫扔伤幬锘蜉d體分子修飾，然后縮合在導(dǎo)向微泡的陰性表面上。
按照本發(fā)明的有用的藥物的代表性例子(不限于這些例子)包括抗腫瘤劑如長春新堿，長春花堿，長春堿酰胺，白消安，苯丁酸氮芥，螺旋鉑氨，順式鉑氨，炭鉑氨，氨甲蝶呤，阿霉素，絲裂霉素，博來霉素，阿糖胞苷，阿糖腺嘌呤，巰基嘌呤，米托坦，甲芐肼，更生霉素(放線菌素D)，道諾紅菌素，阿霉素鹽酸鹽，紅豆杉醇，鄒霉菌素，氨魯米特，雌莫司汀，氟他胺，亮丙瑞林，乙酸孕甾酮，三苯氧胺，睪內(nèi)酯，腈環(huán)氧雄烷，安吖啶(M-AMSA)，天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)，依托泊苷，干擾素a-2a和2b，血液產(chǎn)品如血卟啉或前面的衍生物；生物效應(yīng)修飾劑如胞壁酰肽；殺真菌劑諸如酮康唑，制霉菌素，灰黃霉素，氟胞嘧啶，雙氯苯咪唑或兩性霉素B；激素或激素類似物如生長激素，促黑激素，雌二醇，二丙酸倍氯米松，倍他米松，可的松乙酸鹽，地塞米松，9-去氟膚輕松，氫化可的松，甲基強(qiáng)的松龍，對氟米松乙酸鹽，強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松，氟羥脫氫皮質(zhì)醇或9-氟皮質(zhì)醇乙酸鹽；維生素如氰鈷胺素或樹脂樣素；酶如堿性磷酸酶或錳超氧物歧化酶；抗過敏劑如amelexanox；組織抑制因子如單克隆抗體與其Fab片段，合成肽，后調(diào)節(jié)組織因子表達(dá)的非肽及化合物；血小板抑制劑如GPIa，GPIb和GPIIb-IIIa，ADP受體，凝血酶受體，遺傳性假血因子，前列腺素，阿斯匹林，噻氯匹定，clopigogrel以及reopro；凝聚蛋白質(zhì)靶抑制劑諸如FIIa，F(xiàn)Va，F(xiàn)VIIa，F(xiàn)VIIIA，F(xiàn)IXa，F(xiàn)Xa，組織因子，肝素，水蛭素，hirulog，argatroban，DEGR-rFVIIa及膜聯(lián)蛋白V血纖蛋白形成抑制劑和纖維蛋白溶解增強(qiáng)劑如T-PA，尿激酶，纖溶酶，鏈激酶，rt-纖溶酶原激活物以及r-葡萄球菌激酶；抗血管生成因子如甲羥孕酮，戊聚糖多聚硫酸酯，蘇拉明，紅豆杉醇，鎮(zhèn)靜劑，制管張素，干擾素-α，金屬蛋白酶抑制劑，血小板因子4，促生長素抑制素，血小板反應(yīng)蛋白；循環(huán)藥物如普萘洛爾；代謝潛在劑如谷胱甘肽；抗癌物如P-對氨基水楊酸，異煙肼，卷曲霉素硫酸鹽，環(huán)外壁外層，乙胺丁醇，乙硫異煙胺，吡嗪酰胺，利福平或鏈霉素硫酸鹽；抗病毒如無環(huán)鳥苷，金剛胺，疊氮胸苷，病毒唑或腺嘌呤阿糖苷；血管擴(kuò)大劑如硫氮酮，硝苯吡啶，異搏定，赤蘚醇四硝酸酯，異山梨醇乙二醇二硝酸酯，硝化甘油或季戊四醇四硝酸酯；抗菌素如達(dá)普宋，氯霉素，新坶素，氯氨芐頭孢菌素，羥氨芐頭孢菌素，先鋒霉素IV號，頭孢環(huán)己烯，紅霉素，氯林肯霉素，林可霉素，羥氨芐青霉素，氨芐青霉素，氨芐青霉素碳酯，羧芐青霉素，雙氯青霉素，環(huán)青霉素，吡氯苯唑西林，縮酮氨芐青霉素，2，6-二甲氧基苯青霉素，萘夫西林素，青霉素，多粘菌素或四環(huán)素；消炎藥如二氟苯水楊酸，異丁苯丙酸，吲哚美辛，甲氯芬那鹽，甲滅酸，萘普生，苯基保泰松，吡氧噻嗪，四苯酰吡咯乙酸，阿斯匹林或水楊酸鹽；抗原生動物劑如氯喹，滅滴靈，奎寧或葡甲胺銻酸鹽；治風(fēng)濕藥如青霉胺；麻醉劑如樟腦鴉片酊；鴉片劑如可待因，嗎啡或鴉片；強(qiáng)心苷如脫乙?；ㄑ蟮攸S甙C(強(qiáng)心藥)，毛地黃毒苷，地高辛，毛地黃苷或毛地黃；神經(jīng)肌肉阻滯劑如阿曲庫銨甲磺酸鹽，三乙可碘化拉加明，己芴溴銨，碘二甲箭毒，泮庫溴銨，琥珀酰膽鹼氯化物，氯化管箭毒堿或維庫溴銨；鎮(zhèn)靜劑如異戊巴比妥，異戊巴比妥鈉，阿頗巴比妥鈉，布他巴比妥鈉，水合氯醛，乙氯基戊烯炔醇，烴己蟻胺，氟西泮鹽酸鹽，苯乙哌啶酮，甲氧異丙嗪鹽酸鹽，美賽卜朗，咪達(dá)唑侖鹽酸鹽，仲醛，戊巴比妥，西可巴比妥鈉，仲丁烯丙巴比妥，羥基安定或三唑侖；局部麻醉劑如布比卡因，氯普魯卡因，依替卡因，利度卡因鹽酸鹽，卡波卡因，普魯卡因或四卡因；一般的麻醉劑如氟哌利多，甲芐咪酯，具有氟哌利多的芬太尼檸檬酸鹽，氯胺酮鹽酸鹽，美索比妥鈉鈉或硫噴妥鹽及藥學(xué)上可接受的鹽(例如酸性鹽(如鹽酸鹽或氫溴酸鹽)或堿鹽如(鈉鹽，鈣鹽或鎂鹽))或其衍生物(例如醋酸鹽)。其它治療劑的例子包括遺傳物質(zhì)如核酸，RNA，及天然或合成的DNA(包括重組體RNA和DNA)。DNA編碼的一定蛋白質(zhì)可用于治療許多不同類型疾病的。例如，腫瘤壞死因子或白介素-2基因可用于治療早期癌；胸苷激酶基因可用于治療卵巢癌或人腦瘤；白介素-2基因可用于治療神經(jīng)細(xì)胞瘤，噁性黑素瘤或腎癌；白介素-4基因可用于治療癌。
通過疏水作用與微泡膜相連接的藥物的親脂衍生物，其作為微泡的一部分或從微泡釋放之后(例如通過超聲波使之釋放)可產(chǎn)生治療效應(yīng)。若藥物不具有所需物理性質(zhì)，則可插入親脂基使藥物錨定在膜上。插入親脂基的優(yōu)選方式是其不影響分子的體內(nèi)潛能或釋放活性藥物時親脂基被切除。可用各種化學(xué)手段插入親脂基，其中所用方法取決于藥物分子中可供使用的官能團(tuán)。利用藥物分子中官能團(tuán)(其能與適當(dāng)?shù)墓倌芑H脂化合物進(jìn)行反應(yīng))可產(chǎn)生共價偶聯(lián)。親脂部分的例子包括分支和無支鏈的烷基鏈，環(huán)化合物，芳香族殘余物，和稠合芳香族和非芳香族的環(huán)系統(tǒng)。一些實(shí)例中，親脂組分由合適的官能化類固醇組成，如膽固醇或相關(guān)化合物。特別適于衍生物的官能團(tuán)的例子包括親核基團(tuán)如氨基，羥基和硫氫基。適于任何藥物的親脂衍生物(其含有硫氫基)，如甲巰丙脯酸方法包括直接烷基化(如在堿性條件下的烷基鹵代)與硫羥酸酯作用(其通過與活化的羧酸反應(yīng)而產(chǎn)生)。任何具有羧基官能團(tuán)(例如氨酰心安或苯丁酸氮芥)藥物衍生物的代表例子包括通過分別與胺類和醇(它們具有合適的物理性能)連接而形成的酰胺和酯。優(yōu)選的具體例包括膽固醇通過形成可降解的酯鍵而附著在治療化合物上的方法。
本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用涉及血管生成，其是通過現(xiàn)有血管分支而形成新血管的。本過程主要刺激可以是組織中細(xì)胞營養(yǎng)不足及供氧不充分(缺氧)。細(xì)胞所作出的反應(yīng)是分泌血管生成因子，其中有許多因子；一個例子是內(nèi)皮生長因子。這些因子起始蛋白水解酶(這些蛋白水解酶水解基底膜的蛋白質(zhì))及抑制因子(限制這些有害酶的作用)的分泌。連接失敗和血管生成因子受體的信號的共同影響是引起內(nèi)皮細(xì)胞移動，成倍增加，和重新排列，并最后在新脈管周圍合成基底膜。
當(dāng)瘤達(dá)到毫米大小時，為保持生長速率，瘤必須開始血管生成。由于血管生成伴隨內(nèi)皮細(xì)胞和其環(huán)境的特征變化，因此該過程是治療干涉的一個有用的靶。伴隨血管生成的轉(zhuǎn)變對診斷也十分有用，優(yōu)選例子為噁性疾病，但在發(fā)炎和各種炎癥有關(guān)的疾病中該概念也很有用。這些因子涉及心肌梗塞部分的血管再形成，狹窄區(qū)在短時間內(nèi)釋放時其才能發(fā)生。
一些與血管生成相關(guān)的已知受體/靶見下表。利用本文的導(dǎo)向原則，在使用中通過大多數(shù)藥物中的圖象藥征可檢測血管生成。增強(qiáng)造影的超聲波能具有另外的優(yōu)點(diǎn)，其造影介質(zhì)是被限定在血管內(nèi)部的一種小球。即使發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞類型有靶抗原，該小球狀也獨(dú)自連接在內(nèi)皮細(xì)胞上。
根據(jù)本發(fā)明所謂的藥物前體也可用于活性劑中。這樣，可使藥物發(fā)生衍生化作用，以改變它們的理化性質(zhì)，并且適于進(jìn)入報道物；稱這些藥物為藥物前體，它們通常在切割衍生化基團(tuán)后重新生成活性藥物形式時才有活性。
通過對病理學(xué)區(qū)域?qū)虺錃馕⑴?其含有藥物前體激活酶)，可以獲得導(dǎo)向酶的圖像，使微泡適當(dāng)?shù)貙?dǎo)向到病理學(xué)域并且同時從非靶域消失可視化成為可能。按本方法，可確定將藥物前體注射給個體患者的最佳時間。
另一個可替方案是在系統(tǒng)中相同的微泡中摻合藥物前體，藥物前體-激活酶和載體，其中藥物前體僅在一些外部刺激之后才被活化。這些刺激可能是，例如，上述的腫瘤特異性蛋白酶或通過外部超聲波使微泡破裂(在所需導(dǎo)向后)。
按照本發(fā)明，可使治療藥物容易地傳送到病變或壞死的區(qū)域，例如心臟，一般的脈管，及肝，脾，腎以及其它區(qū)域如淋巴系統(tǒng)，體腔或腸胃系統(tǒng)。
按照本發(fā)明的產(chǎn)品可在體內(nèi)或體外送遞導(dǎo)向治療藥物。在下文中，產(chǎn)品可用于體外系統(tǒng)，如不同的疾病的診斷試劑盒或在血液或組織樣品中不同的組分鑒定的試劑盒。在體外，本發(fā)明利用與那些用于連接某些血液組分或細(xì)胞粘附聚合物微粒(例如單分散磁性的微粒)相類似的技術(shù)將它們從樣品中分離出來，其利用在本發(fā)明的活性劑中報道物單位的低密度并通過浮選法和再次洗滌而分離包含氣體的材料。
通過共價或非共價手段可使報道物單位偶連在所需載體(和/或治療藥物)上，通常包括與一個或多個位于報道物和/或載體和/或任何插入的連接基團(tuán)/間隔元件上的官能團(tuán)的相互作用。為達(dá)到本目的所采用的化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)的例子包括氨基，羥基，硫氫基，羧基，和羰基，以及糖基，鄰位二醇基，硫醚基，2-氨基醇基，2-氨基硫基，胍基，咪唑基和酚基。
因此利用連接劑(包含能與這些官能團(tuán)反應(yīng)的組分)可產(chǎn)生報道物和載體之間的共價連接?？膳c硫氫基反應(yīng)的反應(yīng)性部分的例子包括X-CH2CO-(其中X＝Br，Cl或I)類型的α-鹵代乙?；衔?，它們對硫氫基具有特殊的反應(yīng)性，但其也可用來修飾咪唑基，硫醚基，酚基及氨基(如Gurd，F(xiàn).R.N酶學(xué)方法(1967)11，532所述)。對于硫氫基，也考慮選擇N-馬來酰亞胺的衍生物，但其在一定的條件之下在連接氨基上也有用。如Kitagawa，T.等在化學(xué)藥物信息(1981)29，1130中所述，N-馬來酰亞胺可摻入到使報道物與載體綴合的連接系統(tǒng)中，或如Kovacic，P.等美國化學(xué)學(xué)會(1959)81，1887所描述的可用作穩(wěn)定化小泡的聚合物交連劑。如Traut，R.等在生物化學(xué)(1973)12，3266所描述的，反應(yīng)劑如2-亞氨基硫醇鹽(其可通過轉(zhuǎn)化氨基而引入硫醇基)在通過形成二硫鍵進(jìn)行連接時可作為硫基反應(yīng)劑。由于可通過在載體與報道物間的二硫化物交換來進(jìn)行連接，因此這些引入反應(yīng)性二硫化物鍵至載體或報道物的反應(yīng)劑是很有用的，這些反應(yīng)劑的例子包括Ellman試劑(DTNB)，4，4’-二硫化物基團(tuán)二吡啶，甲基-3-N-2-吡啶基二硫化物(見Kimura，T.等(1982)122，271)。
能與氨基反應(yīng)的反應(yīng)性組分的例子包括烷化和酰化試劑。代表性烷化試劑包括i)α-鹵代乙酰基化合物，其在缺少反應(yīng)性巰基的情況下對氨基具有特異性，其類型為X-CH2CO-(其中X＝Br，Cl或I)，如Wong，Y-H.H.生物化學(xué)(1979)24，5337所描述的；ii)N-馬來酰亞胺衍生物，其可通過加入環(huán)羰基進(jìn)行Michael類型反應(yīng)或?；饔枚c氨基反應(yīng)(如Smyth，D.G.等美國化學(xué)學(xué)會雜志(1960)82，4600和生物化學(xué)雜志(1964)91，589所描述的；iii)芳基鹵化物，如反應(yīng)性硝基芳香鹵化物；iv)烷基鹵化物，如McKenzie，J.A.等在蛋白化學(xué)雜志(1988)7，581中所描述的；v)能與氨基形成希夫堿的醛和酮，所形成的加成產(chǎn)物通常通過還原反應(yīng)而被穩(wěn)定化從而形成穩(wěn)定的胺；Vi)環(huán)氧化物衍生物，如表氯醇和bisoxiranes，其能與氨基，硫氫或酚羥基進(jìn)行反應(yīng)；vii)含氯的S-三嗪衍生物，其極易與親核試劑(如氨基，硫基及羥基)反應(yīng)；viii)基于上述詳述的S-三嗪化合物的氮丙啶，例如Ross，W.C.癌研究進(jìn)展(1954)2，1所描述的，其通過開環(huán)與親核試劑如氨基進(jìn)行反應(yīng)；ix)方形酸二乙酯，如Tietze，L.F.Chem.Ber.(1991)124，1215中所述；以及X)α-鹵烷基醚，其與通常的烷基鹵化物相比是更具反應(yīng)性的烷化劑(由于醚氧原子所造成的活化)，例如Benneche，T.等藥物化學(xué)雜志(1993)28，463所描述的。
與氨基反應(yīng)的酰化劑的代表包括i)異氰酸鹽和異硫氰酸鹽，特別是芳香族衍生物，其分別形成穩(wěn)定的脲及硫脲衍生物，并已用于蛋白質(zhì)交聯(lián)，如Schick，A.F.等生物化學(xué)雜志(1961)236，2477所述；ii)磺?；然?，其可將熒光報道物基團(tuán)導(dǎo)入至連接物中，已由Herzig，D.J.等生物聚合物(1964)2，349描述；iii)酸性鹵化物；iv)活性酯，如硝基苯酯或N-羥基琥珀酰酯；v)酸性酸酐，如混合的，對稱的或N-羧基酸酐；VI)其它形成酰胺鍵有用的試劑，如Bodansky，M.等肽合成原理(1984)Springer-Verlag所述；vii)酰基疊氮化物，例如其中疊氮化物基是通過利用亞硝酸鈉由預(yù)先形成的酰肼衍生物產(chǎn)生的，例如Wetz，K.等分析生物化學(xué)(1974)58，347所述；viii)連接在聚合物上的吖內(nèi)酯(如雙丙烯酰胺)，例如Rasmussen，J.K.反應(yīng)聚合物(1991)16，199中所述；以及ix)亞氨基酯，其與氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的脒，例如Hunter，M.J.和Ludwig，M.L.美國化學(xué)學(xué)會雜志(1962)84，3491中所述。
羰基(如醛官能團(tuán))在一定pH下可與弱蛋白質(zhì)堿進(jìn)行反應(yīng)，這樣親核蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)被質(zhì)子化。弱堿包括1，2-氨基硫醇，如位于N-末端半胱氨酸殘余物中的那些，它們與醛基選擇地形成穩(wěn)定的5員噻唑烷環(huán)，如Ratner，S.等美國化學(xué)學(xué)會雜志(1937)59，200中所述。也可利用其他的弱堿基如苯基腙，見Heitzman，H.等美國國家科學(xué)院院報(1974)71，3537。
醛和酮也可以與苯胺類反應(yīng)形成希夫堿，該堿可以通過還原氨基化而被有利地穩(wěn)定化。烷氧氨基部分易與酮和醛類進(jìn)行反應(yīng)而產(chǎn)生穩(wěn)定的烷氧基胺，如Webb，R.等在生物軛合物化學(xué)(1990)1，96中所述。
能與羧基反應(yīng)的反應(yīng)部分的例子包括重氮化合物(如重氮基乙酸乙酯和重氮基乙酰胺)，它們具有高特異性產(chǎn)生酯基的反應(yīng)力，例如Herriot R.等在蛋白化學(xué)進(jìn)展(1947)3，169中所描述的。也可采用羧酸修飾的試劑如碳化二亞胺，其通過形成O-?；褰又纬甚０锋I而進(jìn)行反應(yīng)；連接反應(yīng)可通過添加胺促進(jìn)或?qū)е轮苯拥妮d體-受體偶聯(lián)。有用的水溶性碳化二亞胺包括1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺(CMC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)，例如Zot，H.G.和Puett，D.在生物化學(xué)雜志(1989)264，15552中所描述的。其他有用的羧酸修飾試劑包括異噁唑鎓衍生物如Woodwards試劑K；氯仿鹽，如p-X硝基苯氯仿鹽；羰二咪唑，如1，1′-羰二咪唑；和N-烷氧羰基二氫喹啉，如N-(乙氧羰基)-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉。
其它有用的反應(yīng)部分包括鄰二酮如P-亞苯基二乙二醛(其可用來與胍基反應(yīng)，如Wagner等在核酸研究(1978)5，4065中所描述的)；以及重氮鹽(其可進(jìn)行親電子取代反應(yīng)，如Ishizaka，K.和Ishizaka T.在免疫學(xué)雜志(1960)85，163中所描述的。在酸性溶液中，通過用亞硝酸鈉處理芳基二胺易于制備雙重氮化合物。將報道物和/或載體中的官能團(tuán)(如果需要)在反應(yīng)前轉(zhuǎn)化成其它官能團(tuán)(例如為了賦與另外的反應(yīng)性或選擇性)是有利的。對于該目的有用的方法的例子包括利用試劑(如二羧酸酸酐)將胺類轉(zhuǎn)變成羧酸；利用試劑(如N-乙酰高半胱氨酸硫酮，S-乙酰氫硫基琥珀酸酸酐，2-亞氨基thiolane或含巰基的琥珀酰基衍生物)將胺轉(zhuǎn)變成硫醇；利用試劑(如α-鹵代醋酸鹽)將硫醇轉(zhuǎn)變成羧酸；利用試劑(如乙胺或2-溴乙胺)將硫醇轉(zhuǎn)變成胺類；利用試劑(如碳化二亞胺接著利用二胺)將羧酸轉(zhuǎn)變成胺類；利用試劑(如甲苯磺酰氯化物接著用硫代乙酸鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)酯并用乙酸鈉其使水解成巰基)將醇轉(zhuǎn)變成硫醇基。
酶作為無長度的連接劑可使載體與報道物相連接；這樣，例如，轉(zhuǎn)葡糖苷酶，過氧化物酶以及黃嘌呤氧化酶可用來連接產(chǎn)物。通過形成酰胺鍵，反向蛋白酶解也可用于連接。
例如，通過多賴氨酰官能團(tuán)化的報道物和多谷氨?；倌軋F(tuán)化的載體之間的靜電相互作用，或通過以穩(wěn)定金屬復(fù)合物形式的螯合作用或通過高親和性的結(jié)合作用(如抗生物素蛋白/生物素結(jié)合)可形成載體報道物的非共價連接。通過電荷相互作用，非共價涂布在帶負(fù)電荷膜表面的聚賴氨酸也增加微泡對細(xì)胞的非特異性親和性。
此外，可將載體連接在已知結(jié)合磷脂的蛋白質(zhì)上。在許多實(shí)例中，磷脂單一分子可連接在蛋白質(zhì)(如移位酶)上，而其它蛋白質(zhì)可連接在主要由磷脂頭基組成的表面上，這樣這些蛋白質(zhì)可用于載體連接到磷脂小球上；這樣的蛋白質(zhì)的一個例子是β2-糖蛋白I(Chonn，A.Semple，S.C.和Cullis，P.R.，生物化學(xué)雜志(1995)270，25845-25849)。已描述了磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白，如Igarashi，K.等生物化學(xué)雜志270(49)29075-29078；因此可利用具有這樣的磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白的載體軛合物將載體連接至包裹的微泡上。若已知結(jié)合蛋白的氨基酸序列，則可合成或分離磷脂結(jié)合部分，并且用于與載體綴合，這樣避免了位于分子其它地方的生物活性。
通過對微球體結(jié)合分子的分子文庫進(jìn)行直接篩選，獲得特異性結(jié)合到小球表面(或″膜″)上的分子也是可能的。例如，顯示小肽的噬菌體文庫可用于這樣的選擇。將小球和噬菌體顯示文庫簡單混合，并且洗脫結(jié)合在飄浮小球上的噬菌體，從而進(jìn)行選擇。若需要，可在″生理?xiàng)l件″下(例如在血液中)進(jìn)行選擇，以除去與血液組分交叉反應(yīng)的肽。這種類型的選擇方法的優(yōu)點(diǎn)是僅僅選擇了不發(fā)生小球去穩(wěn)定作用的結(jié)合分子(由于僅僅連接了完整飄浮小球的結(jié)合分子將升至頂端)。也可在選擇過程期間加入某種″力″(例如壓力)以確保不選擇去穩(wěn)定作用的結(jié)合部分。此外可在剪切條件下進(jìn)行選擇，例如首先讓噬菌體與小球進(jìn)行反應(yīng)，然后在流動的條件下讓小球經(jīng)過涂布了抗噬菌體抗體的表面。用該方法選擇出可以抵抗體內(nèi)剪切條件的結(jié)合體是可能的。將本方法所鑒別的結(jié)合部分可連接(通過化學(xué)綴合方法或肽合成方法，或在DNA-水平上的載體分子重組)到載體上，以構(gòu)成用以使任何載體分子連接到小球上的通用工具。
包含或偶連了肽，脂-寡糖或脂肽連接物(其含有能居中插入膜的元件)的載體也可以使用。Leenhouts，J.M.等Febs Letters(1995)370(3)，189-192描述了一個實(shí)例。對某些應(yīng)用，也可利用由已知膜插入錨/信號所組成的非生物活性分子作為載體，其例子為Na，k-ATP酶，α-亞單位的H1疏水節(jié)段(Xie，Y.和Morimoto，T.生物化學(xué)雜志(1995)270(20)，11985-11991所描述的)。錨基團(tuán)也可以是脂肪酸或膽固酸。
利用抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白也可產(chǎn)生連接，這些物質(zhì)具有四個與生物素高親和性的結(jié)合位點(diǎn)。如果載體和報道物兩者均被生物素酰化，則可利用抗生物素蛋白使載體綴合在報道物上。例子參見Bayer，E.A.和Wilchek，M.生物化學(xué)分析方法(1980)26，1。這一方法也可擴(kuò)展至包括報道物與報道物的連接，該方法可增強(qiáng)小泡之間的聯(lián)系，并隨之增加潛在的回波性。此外，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可直接連接在報道物微型顆粒的表面。
利用雙特異性免疫球蛋白的雙官能團(tuán)性質(zhì)可形成非共價偶聯(lián)。這些分子可特異地結(jié)合兩個抗原，而連接它們。例如，可利用雙特異的IgG或化學(xué)合成的雙特異F2(ab)′2片段作為連接劑。已報道了異雙官能團(tuán)的雙特異性的抗體可連接兩個不同的抗原，例如Bode，C.等生物化學(xué)雜志(1989)264，944和Staerz，U.D等美國國家科學(xué)院院報(1986)83，1453中所描述的。同樣，任何包含兩個或多個抗原決定簇的報道物和/或載體(例如Chen，Aa等美國病理學(xué)雜志(1988)130，216所描述的)可通過抗體分子交叉連接，并形成交連的且具有增加的回波性的多泡集合體。
按照本發(fā)明所利用的連接劑一般來說以某種程度的特異性引起報道物與載體或報道物與報道物的連接，并且也用于一個或多個治療活性劑的連接。
一些實(shí)例中，認(rèn)為在相同的分子中包括PEG組分使之作為綴合(其為與一個載體或多個載體或直接與報道物的綴合)中的穩(wěn)定物很有利，其中PEG不充當(dāng)間隔子。
如果需要，按照本發(fā)明可利用所謂無長度的連接劑(其可直接使兩個反應(yīng)化學(xué)基形成共價連接而無須介入另外的連接物如在酰胺鍵形成時利用碳化二亞胺或酶)作為引起報道物與載體非共價連接的試劑(如生物素/抗生物素蛋白系統(tǒng))和引起疏水或靜電作用的試劑。
然而，最常見的是連接劑包括由間隔元件連接的兩個或多個反應(yīng)部分(如上述)。間隔子的存在可使雙官能團(tuán)的接頭在分子內(nèi)或兩個不同分子之間與特異性官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，在這兩個組分之間形成鍵，并在報道物與載體的綴合物中引入外部的接頭來源的物質(zhì)。在連接劑中的反應(yīng)部分可相同(同雙官能團(tuán)試劑)或不同(異雙官能團(tuán)試劑或幾個不同的反應(yīng)部分的存在的試劑，異多官能團(tuán)劑)，這樣提供了試劑的多樣性，可使任何化學(xué)物種之間(分子內(nèi)或分子間)形成共價結(jié)合。
由連接劑引入的外部物質(zhì)的性質(zhì)對終產(chǎn)物的導(dǎo)向能力與總穩(wěn)定性具有重要意義。這要求引入不穩(wěn)定的連接物，如其包含間隔臂(其可被生物降解或化學(xué)性質(zhì)敏感或其摻入了酶促切割位點(diǎn))。此外該間隔子可包含聚合組分，例如充當(dāng)表面活性劑并增強(qiáng)小泡穩(wěn)定性。該間隔子也可含有反應(yīng)性部分，例如象上述增強(qiáng)表面交聯(lián)作用的部分，或它含有示蹤元件，如熒光探針，旋轉(zhuǎn)標(biāo)記或放射性材料。
由于易于將造影元件諸如X光造影劑，光造影探針，旋轉(zhuǎn)標(biāo)簽或放射性單位摻入到或連接在報道物單位上，因此按照本發(fā)明的造影劑在所有造影藥劑中均有用。
間隔元件典型地由脂肪族鏈構(gòu)成，這些鏈可有效地隔離連接物中的反應(yīng)部分，其間距為5和30。它們也可包括大分子結(jié)構(gòu)如PEG，這些結(jié)構(gòu)在生物技術(shù)和生物藥物應(yīng)用中引起人們的重視(參見例如MiltonHarris，J.編″聚(乙二醇)化學(xué)生物技術(shù)和生物藥物應(yīng)用″Plenum出版社(1992)。PEG在大多數(shù)溶劑中(包括水中)可溶，并且在含水的環(huán)境中每個乙二醇片段與兩個或三個水分子結(jié)合而高度水化；這可阻止在PEG-修飾表面的其它聚合物或蛋白質(zhì)的吸附。已知PEG無毒不會損害活性蛋白質(zhì)或細(xì)胞，而共價連接的PEG為非免疫原性和非抗原性的。此外，PEG易于修飾和結(jié)合其它分子而對他們化學(xué)性質(zhì)只有小的影響。由PEG和其共聚物，包括嵌段共聚物如PEG-聚氨基甲酸乙酯和PEG-聚丙烯的許多用途可明顯看到它們有利的溶解性和生物性質(zhì)。
按照本發(fā)明所利用的PEG間隔子的合適分子量為，例如，120道爾頓和20千道爾頓之間。
網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞攝取微粒的主要機(jī)理是血液中的血漿蛋白質(zhì)的調(diào)理作用；這些標(biāo)記外源微粒，然后其被RES吸收。按照本發(fā)明所利用的PEG間隔元件的生物性質(zhì)可以用于以一種與PEGylate脂所觀察到的相似方式增加造影劑循環(huán)時間(參見如Klibanov，A.L.等FEBSletters(1990)268，235-237和Blume，G.和Cevc，G.生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1990)1029，91-97)。利用結(jié)合在PEG間隔末端的抗體可增加興趣區(qū)域的連接效力(參見例如Maruyama，K.等生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1234，74-80和Hansen，C.B.等生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，133-144)。
在一些例子中，認(rèn)為包括PEG組分使之作為綴合(其為與一個載體或多個載體或直接與報道物的綴合)中的穩(wěn)定物是很有利的，其中PEG不充當(dāng)間隔子。
其它間隔元件的代表包括結(jié)構(gòu)型多糖類，如聚半乳糖醛酸，糖胺聚糖，肝素，纖維素及海洋多糖類如藻酸鹽，脫乙酰殼多糖和角叉菜膠；儲存型多糖類如淀粉，糖原，葡聚糖以及氨基葡聚糖；多聚氨基酸和其甲基和乙基酯(在賴氨酸，谷氨酸以及天冬氨酸的均聚物和共聚物中)；和多肽，低聚糖和低核苷酸，它們可含或不含酶切割位點(diǎn)。
一般來說，間隔元件含有可切除的基團(tuán)如，鄰二醇，偶氮，砜，酯，硫酯或二硫鍵基團(tuán)。包含下式的可生物降解的亞甲基二酯或二酰胺(如下式所示)的間隔元件也可使用-(Z)m.Y.X.C(R1R2).X.Y.(Z)n-[其中X和Z選自-O-，-S-，和-NR-(其中R是氫或有機(jī)基團(tuán))；各Y是羰基，硫羰基，砜基，磷?；蝾愃频乃嵝纬苫鶊F(tuán)m和n各自是0或1；R1和R2都是氫，有機(jī)基團(tuán)或-X.Y.(Z)m-基，或一起形成二價的有機(jī)基]；如在WO-A-9217436中所討論的，這樣的基團(tuán)在酯酶的存在下易于被生物降解，例如在體內(nèi)，但在缺少這些酶的情況下保持穩(wěn)定。因此可將它們與治療劑連接而使其慢慢釋放。
由于聚(N-(2-羥乙基)異丁烯酰胺與細(xì)胞和組織相互作用的程度低，因此其可作為有用的間隔材料(參見例如Volfova，I.Rihova，B.和V.R.和Vetvicka，P.生物作用復(fù)合聚合物(1992)7，175-190)。對主要由密切相關(guān)的2-羥丙基衍生物所組成的類似聚合物的研究表明，其被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)變成細(xì)胞內(nèi)含物至相當(dāng)?shù)偷某潭?參見Goddard，P.Williamson，I.，Bron，J.，Hutchkinson，L.E.，Nicholls，J.和Petrak，K.生物作用復(fù)合聚合物(1991)6，424.)。
其它潛在有用的聚合間隔物質(zhì)包括i)異丁烯酸甲酯與甲基丙烯酸的共聚物；其具腐蝕性(參見Lee，P.I.藥理學(xué)研究(1993)10，980)，且該羧化物取代基與天然聚合物相比造成更高的溶脹度；ii)具有可被生物降解的聚酯的聚甲基丙烯酸酯的嵌段共聚物(參見例如San Roman，J.和Guillen-Garcia，P.生物材料(1991)12，236241 Biomaterials中)；iii)氰基丙烯酸鹽，如2-氰基丙烯酸酯的聚合物，這些可被生物降解，并且以小顆粒的形式用于選擇性藥物傳送(參見Forestier，F(xiàn).，Gerrier，P.，Chaumard，C.，Quero，A.M.，Couvreur，P.和Labarre，C.抗菌化學(xué)治療雜志(1992)30，173-179)；iv)聚乙烯醇，其為水溶性，并且一般認(rèn)為是生物相容的(參見例如Langer，R.調(diào)控釋放雜志(1991)16，53-60)；v)馬來酐與乙烯基甲基醚的共聚物，已有人指出其具有生物腐蝕性(參見Finne，U.，Hannus，M.和Urtti，藥理學(xué)雜志(1992)78.237-241)；
VI)聚乙烯吡咯烷酮(例如用分子量不到約25,000的)，其可經(jīng)腎迅速過濾(參見Hespe，W.，Meier，A.M.和Blankwater，Y.M.Arzeim.-Forsch.藥物研究(1977)27，1158 1162)；yii)短-鏈脂肪族羥基酸的聚合物和共聚物，如乙醇酸，乳酸，丁酸，頡草酸及己酸(參見例如Carli，F(xiàn).Chim.Ind.(米蘭)(1993)75，494-9)，包括摻合芳香族羥基酸以增加它們降解速率的共聚物(參見Imasaki，K.，Yoshida，M.，F(xiàn)ukuzaki，H.，Asano，M.，Kumakura，M.，Mashimo，T.，Yamanaka，H.和Nagai.T.藥理學(xué)雜志(1992)81，3138)；viii)由乙二醇和對苯二甲酸單位交替組成的聚酯，例如DacronR，其不能被降解但具高度生物相容性；ix)包括脂肪族羥基酸聚合物的可被生物降解片斷的嵌段共聚物(參見例如Younes，H.，Nataf，P.R.，Cohn，D.，Appelbaum，Y.J.，Pizov，G.和Uretzky，G.生物材料人造細(xì)胞人造器官(1988)16，705-719)，例如在與聚氨基甲酸乙酯的結(jié)合中(參見Kobayashi，H.，Hyon，S.H.和Ikada，Y.“水溶和可被生物降解的聚合物前體”-生物藥物材料研究(1991)25，14811494)；x)聚氨基甲酸乙酯，已知其在移植中具有很好的耐受性，并且其能與柔性的“軟”片段相結(jié)合，例如包括聚(四亞甲基乙二醇)，聚(丙二醇)或聚(乙二醇)和芳香族″硬″片段，例如包括4，4-亞甲基二(亞苯基異氰酸鹽)(參見例如Ratner，B.D.，Johnston，A.B.合Lenk，T.J。生物藥物材料研究應(yīng)用藥物材料(1987)21，59-90；Sa Da Costa，V.等細(xì)胞界面科學(xué)雜志(1981)80，445-452和Affrossman，S.等臨床材料(1991)8，2531；xi)聚(1，4-二氧六環(huán)-2-酮類)，由于其可水解性的酯鍵，可認(rèn)為是可被生物降解的酯(參見例如Song，C.X.，Cui，X.M.和Schindler，A.Med.Biol.Eng.Comput.(1993)31，S147-150)，并且這些包含增強(qiáng)它們的吸收性的乙交酯單位(參見Bezwada，R.S.，Shalaby，S.W.和Newman，H.D.J.農(nóng)業(yè)的和合成的聚合物生物降解力和利用(1990)(Glass，J.E.和Swift，G.編輯)，167-174-ACS專題研討系列，#433，華盛頓D.C.，美國-美國化學(xué)學(xué)會；xii)聚酐，如具有雙(4-羧基-苯氧基)丙烷的癸二酸(辛二酸)共聚物，在兔研究(參見Brem，H.，Kader，A.，Epstein，J.I.，Tamargo，R.J.，Domb，A.，Langer，R.和Leong，K.W.癌治療研討會(1989)5，55-65)和大鼠研究(參見Tamargo，R.J.，Epstein，J.I.，Reinhard，C.S.，Chasin，M.和Brem，H.生物藥物雜志(1989)23，253266)中已闡明該共聚物在腦中可用于藥物的控釋且沒有明顯毒性作用；xiii)包含鄰-酯基的可被生物降解的聚合物，其可在體內(nèi)控制藥物釋放(參見Maa，Y.F.和Heller，J.控制藥物釋放(1990)14，21-28)；以及xiv)聚膦嗪，其為交互的磷和氮原子所組成的無機(jī)聚合物(參見Crommen，J.H.，Vandorpe，J.和Schacht，E.H.控制藥物釋放(1993)24，167-180)下表列出了可進(jìn)行蛋白修飾(其可用于制備按照本發(fā)明的可導(dǎo)向的試劑)的連接劑。異雙官能團(tuán)連接劑
備注(1)＝可可碘化的；(2)＝熒光劑同雙官能團(tuán)連接劑
生物素?；瘎?
備注DPPE＝二棕櫚酰磷脂酰基乙醇胺；LC＝長鏈蛋白修飾劑
其它有用的蛋白質(zhì)修飾作用包括通過神經(jīng)氨酸酶，內(nèi)糖苷酶或高碘酸的部分或完全的去糖苷化作用(由于去糖苷化經(jīng)常導(dǎo)致肝，脾，巨噬細(xì)胞等等攝取得更少，而蛋白質(zhì)的新-糖基化經(jīng)常導(dǎo)致肝與巨噬細(xì)胞的攝取增加)；及通過解蛋白切割的截短化作用(其可導(dǎo)致大小減少及在循環(huán)中的半衰期更短)；以及陽離子化，參見例如Kumagi等生物化學(xué)雜志(1987)262，15214-15219；Triguero等美國國家科學(xué)院院報(1989)86，4761-4765；Pardridge等藥理學(xué)治療雜志(1989)251，821-826和Pardridge和Boado，F(xiàn)ebs Lett.(1991)288，30-32。
按照本發(fā)明可用于可導(dǎo)向的試劑的載體包括下列
i)抗體，其可用作為許多靶的載體，并且具有有利性質(zhì)，如十分高的特異性，高親和性(如果需要)，按照需要還可具有修飾親和性等等?？贵w是否具生物活性取決于特定的載體/靶的結(jié)合?？墒褂贸Ｒ?guī)和基因工程抗體，后者使得可以通過工程使抗體符合特殊需要，例如就親和性和特異性而言。人抗體的利用對避免抗載體分子的可能的免疫反應(yīng)可能是優(yōu)選的。另一類有用的抗體包括所謂的二-和多-特異性抗體，即如在一個抗體分子中具有對兩個或多個不同抗原的特異性的抗體。這些抗體可以例如促進(jìn)小泡簇的形成，并且也可以用于各種治療目的，例如向靶攜帶有毒部分。雙特異性抗體的各方面見McGuinness，B.T.國家生物技術(shù)(1996)14，1149-1154；George，A.J.等免疫學(xué)雜志(1994)152，1802-1811；Bonardi等癌研究(1993)53，3015-3021；和French，R.R..等癌研究(1991)51，2353-2361。
ii)細(xì)胞粘著分子，它們的受體，細(xì)胞因子，生長因子，肽激素及其片段。這些載體依賴于與靶分子受體的正常生物蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，因此在許多情況下在靶結(jié)合上時產(chǎn)生生物效應(yīng)，并且是生物活性的；這對載體(其導(dǎo)向蛋白多糖)相對而言沒有意義。
iii)細(xì)胞粘著分子，細(xì)胞因子，生長因子和肽激素的非肽興奮劑/拮抗劑或非生物活性的受體粘合劑。該類別可以包括這些非生物活性載體，它們既非興奮劑也非拮抗劑，但是具有有價值的導(dǎo)向能力。
iv)通過Watson-Crick或其它堿基-配對類型與DNA或RNA結(jié)合的低核苷酸和修飾的低核苷酸。由于細(xì)胞破壞的結(jié)果是DNA通常僅在細(xì)胞外空間存在，那么這樣的低核苷酸(其通常是非生物活性的)在例如向壞死區(qū)域的導(dǎo)向中可以是有用的，所說的區(qū)域與許多不同的病理狀態(tài)有關(guān)。低核苷酸也可與特異性DNA-或RNA-結(jié)合蛋白相結(jié)合，例如轉(zhuǎn)錄因子(其經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞或活化免疫細(xì)胞或活化內(nèi)皮細(xì)胞中得以高度超量表達(dá))。混合文庫可以用來選擇這些特異性結(jié)合到任何可能靶分子上的低核苷酸，因此其可用作為導(dǎo)向的載體。
v)DNA-結(jié)合藥物可以與低核苷酸表現(xiàn)相同，但是其若被細(xì)胞攝取則具有生物活性/或毒副作用。
vi)蛋白酶底物/抑制劑。許多病理狀態(tài)牽涉到蛋白酶。許多酶解物/抑制劑是非肽物質(zhì)，但至少在抑制劑的情況下經(jīng)常具生物活性。
vii)通過功能性選擇與待造影的區(qū)域/結(jié)構(gòu)相結(jié)合的分子(在體外，來自體內(nèi)或在體內(nèi))，則無須了解確切的分子靶即可由混合文庫產(chǎn)生載體分子。
viii)各種小分子，包括已知結(jié)合到各種生物受體上的生物活性化合物。這些載體或它們的靶可以用于與相同的靶結(jié)合產(chǎn)生非生物活性的化合物。
ix)結(jié)合氨基葡糖聚糖側(cè)鏈(如乙酰肝素硫酸鹽)，包括大分子的氨基葡糖聚糖-結(jié)合部分的蛋白質(zhì)或肽，其與氨基葡糖醛酮聚糖結(jié)合不導(dǎo)致生物效應(yīng)。在紅細(xì)胞上沒有發(fā)現(xiàn)蛋白多糖，該細(xì)胞除去不需要的在這些細(xì)胞上的吸附。
如下列出了有利于導(dǎo)向超聲造影的其它肽載體和其脂肽動脈硬化噬斑的結(jié)合肽如YRALVDTLK，YAKFRETLEDTRDRMY和RALVDTEFKVKQEAGAK；血栓結(jié)合蛋白如NDGDFEEIPEEYLQ和GPRG，血小板結(jié)合蛋白如PLYKKIIKKLLES；縮膽囊素，促α-黑素細(xì)胞激素，熱穩(wěn)定腸毒素1，血管活性腸肽，以及來源于第三重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的合成α-M2肽和其用于腫瘤導(dǎo)向的類似物。
根據(jù)包含這些載體的本發(fā)明，下表列出了各種可以導(dǎo)向到特殊類型的靶的載體，并且描述了用于可導(dǎo)向的診斷和/或治療劑的區(qū)域。
蛋白質(zhì)和肽載體-抗體
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包含細(xì)胞因子/生長因子/肽激素和其片段的載體
各種蛋白質(zhì)和肽載體
包含細(xì)胞因子/生長因子/肽激素/細(xì)胞粘著分子受體的非肽興奮劑/拮抗劑或非生物活性接頭的載體
包含抗血管生成因子的載體
包含血管生成因子的載體
不同于所識別的血管生成因子(已知其對血管生成有關(guān)的受體具有親和性)的載體分子
與血管生成有關(guān)的受體/靶
低核苷酸載體
修飾的低核苷酸載體
核苷和核苷酸載體
包含DNA-結(jié)合藥物的受體
包含蛋白酶底物的受體
包含蛋白酶抑制劑的受體
來自混合文庫的載體
碳水化合物載體
(糖)脂載體
小分子載體
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實(shí)施例1聚-L-賴氨酸-涂布的磷脂酰絲氨酸-包裹的微泡與內(nèi)皮細(xì)胞粘著作用將聚-L-賴氨酸(8mg)(其分子量為115kDa)溶解在水中(400μ1)。在室溫下，將(40μl)新近再分散的磷脂酰絲氨酸-包裹的全氟丁烷的微泡在水中或聚-L-賴氨酸溶液(400μl)中溫育15分鐘。Zeta潛在測量方法確認(rèn)聚-L-賴氨酸-涂布的微泡帶正電，而未涂布的小泡帶負(fù)電。利用培養(yǎng)皿中所培育的人內(nèi)皮層細(xì)胞并用以上描述的微泡進(jìn)行細(xì)胞粘著性研究，未涂布的微泡作為對照。溫育后內(nèi)皮細(xì)胞的顯微鏡檢查表明更多數(shù)量的聚-L-賴氨酸-涂布的微泡與內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合(與未涂布的微泡相比)。
實(shí)施例2-包含磷脂酰絲氨酸和RGDC-Mal-PEG3400-DSPF的充氣微泡
a)Boc-NH-PEG3400-DSPE(t-丁基氨基甲酸酯聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成，添加DSPE(二硬脂磷脂酰乙醇胺)(31mg，Sygena Inc.)至Boc-NH-PEG3400-SC((t-丁基氨基甲酸酯聚(乙二醇)琥珀?；被姿狨?(150mg)的氯仿(2ml)溶液中，接著加入三乙胺(33μl)。41℃攪拌10分鐘，混合物形成清晰的溶液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑并用乙腈(5ml)萃取殘余物。冷卻所獲得的分散物至4℃并離心，隨后將溶液與不溶物分離，并且蒸發(fā)至干。由核磁共振確認(rèn)所形成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
b)H2N-PEG3400-DSPE(氨基聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成在室溫下，將Boc-NH-PEG3400-DSPE(167mg)在二噁烷(5ml)和4M鹽酸中攪拌2.5小時。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并用三氯甲烷(1.5ml)萃取殘余物，并用水(2×1.5ml)洗滌。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相。TLC(氯仿/甲醇/水13∶5∶0.8)產(chǎn)生Rf＝0.6的標(biāo)題產(chǎn)物；由核磁共振確認(rèn)該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)(其是陽性的茚三酮)。
c)Mal-PEG3400-DSPE(3-馬來酰亞胺丙酸鹽聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成將四氫呋喃(0.2ml)中的N-琥珀?；?3-馬來酰亞胺丙酸鹽聚(5.6mg，0.018mmol)的溶液添加至H2N-PEG3400-DSPE(65mg，0.012mmol)中(其溶解在四氫呋喃(1ml)和0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.5(2ml)中)。加熱反應(yīng)混合物至30℃，接著對反應(yīng)物進(jìn)行TCL，隨后蒸發(fā)溶劑。
d)RGDC-Mal-PEG3400-DSPE的合成將溶于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的Mal-PEG3400-DSPE(0.010mmol)添加至肽RGDC(0.010mmol)中。如果必要加熱反應(yīng)混合物至37℃，接著對反應(yīng)物進(jìn)行TCL，隨后蒸發(fā)溶劑。
e)磷脂酰絲氨酸包裹的充氣微泡和RGDC-Mal-PEG3400-DSEE的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙烯二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以0.1M最適pH7.5的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行交換。將肽RGDC(其溶解在0.1M最適pH7.5的磷酸鈉緩沖液中)加入經(jīng)洗滌的微泡上，然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上。再次洗滌操作。
f)磷脂酰絲氨酸包裹的充氣微泡和RGDC-Mal-PEG3400-DSEE的另一制備方法往磷脂酰絲氨酸(5mg)中加入溶于水中的5％丙烯二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以0.1M最適pH7.5的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行交換。將RGDC-Mal-PEG3400(其溶解在0.1M最適pH7.5的磷酸鈉緩沖液中)加入經(jīng)洗滌的微泡上，然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上。在RGDC-Mal-PEG3400摻入到微泡膜內(nèi)后，再次洗滌操作。
實(shí)施例3-磷脂酰絲氨酸，磷脂酰膽堿和生物素-氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇包裹的充氣微泡a)Z-Ala-膽固醇(3-O-(-丙氨酰)膽固醇)的合成將膽固醇(4mmol)，Z-丙氨酸(5mmol)和二甲基氨基吡啶(4mmol)溶解在二甲基甲酰胺/四氫呋喃中(20ml+5ml)，并加入二環(huán)已基碳化二亞胺。在環(huán)境溫度下，攪拌反應(yīng)混合物過夜。過濾掉二環(huán)己基脲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑。用三氯甲烷溶解殘余物，過濾掉不溶解的二環(huán)己脲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物置于二氧化硅膠柱上，以甲苯石油醚洗脫Z-Ala-膽固醇(20∶2)，接著用甲苯乙醚洗脫(20∶2)。含有標(biāo)題化合物的組分被結(jié)合住，并且旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。核磁共振確認(rèn)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
b)Ala-膽固醇(3-O-L-丙氨酰)-膽固醇的合成將膽固醇(0.48mmol)置于四氫呋喃(20ml)和冰乙酸(3ml)中，并在5％鈀存在的情況下在炭上氫化2小時。過濾反應(yīng)混合物，并在真空中濃縮。
c)Boc-NH-PEG3400-Ala-膽固醇的合成將Ala-膽固醇加至氯仿中的Boc-NH-PEG3400-SC(t-丁基氨基甲酸酯聚(乙二醇)琥珀?；被姿狨?溶液中，接著加入三乙胺。41℃下攪拌懸浮液10分鐘。層析法純化粗制品。
d)H2N-PEG3400-Ala-膽固醇的合成在環(huán)境溫度下，將Boc-NH-PEG3400-Ala-膽固醇置于二噁烷中的4M鹽酸中攪拌2.5小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用三氯甲烷溶解殘余物，并且以水洗滌。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)相至干。層析純化粗制品。
e)生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇的合成將四氫呋喃中的N-羥基琥珀酰亞胺酯加入至生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇(其溶于四氫呋喃及0.1M最適pH7.5的磷酸鈉緩沖液(2ml)中)溶液中。加熱反應(yīng)混合物至30℃，接著對反應(yīng)物進(jìn)行TCL，隨后蒸發(fā)溶劑。
f)磷脂酰絲氨酸，磷脂酰膽堿和生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿(總量為90-99.9摩爾％)和生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以0.1M最適pH 7.5的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行交換，并再次洗滌。
g)磷脂酰絲氨酸，磷脂酰膽堿和生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇包裹的充氣微泡的另一制備方法往磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用水進(jìn)行交換。將溶于水中的生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇加入到經(jīng)洗滌的微泡上，幾小時后將微泡置于轉(zhuǎn)板上。在生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇摻入到微泡膜內(nèi)后，再次洗滌操作。
實(shí)施例4-包含磷脂酰絲氨酸，磷脂酰膽堿和生物素酰氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇和藥物膽固醇的充氣微泡a)藥物-膽固醇的合成將(4mmol)膽固醇(其是具有酸基團(tuán)的藥物)和(4mmol)二甲基氨基吡啶溶解在二甲基甲酰胺/四氫呋喃(20ml+5ml)中，并加入二環(huán)已基碳化二亞胺。在環(huán)境溫度下反應(yīng)混合物攪拌過夜。過濾掉二環(huán)己基脲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑。層析純化標(biāo)題化合物。
b)磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、生物素氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇和藥物膽固醇包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿(總量為90-99.9摩爾％)和生物素酰氨基己酸鹽-PEG3400-Ala-膽固醇(如實(shí)施例3制備)和藥物-膽固醇(總量為10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。
實(shí)施例5-磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡a)硫醇化-抗-CD34抗體的制備如Hansen.C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239，133-134中所描述的，可使抗-CD34抗體硫醇化。
b)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如實(shí)施例2制備)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行交換，并且硫醇化的抗體與微泡進(jìn)行偶聯(lián)，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在藥物藥理學(xué)雜志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239 133-134。然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上幾個小時，并洗滌。對所產(chǎn)生的微泡進(jìn)行流動細(xì)胞計數(shù)分析(使用熒光標(biāo)記的第二抗體)以確認(rèn)抗-CD34抗體與小泡的連接情況。利用一定數(shù)量表達(dá)CD34的細(xì)胞和另一些不表達(dá)CD34的細(xì)胞，通過顯微觀察來研究小泡與表達(dá)CD34的細(xì)胞的特異結(jié)合能力。
實(shí)施例6-與充氣微泡相連接的生物素生物素可通過許多不同的方法與微泡連接，例如通過Corley，P.和Loughrey，H.C.(1994)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1195，149-156中所描述的類似方法。通過流動細(xì)胞計數(shù)法分析所形成的小泡，例如利用熒光的鏈霉抗生物素蛋白來檢測生物素與小泡的連接情況。此外可利用放射性或酶-標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白來分析生物素的連接情況。
實(shí)施例7-以二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和生物素-DPPE包裹的充氣微泡添加溶于水中的4％丙二醇-甘油(4ml)至二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(22.6mg)(DSPS)內(nèi)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。加入4％丙二醇-甘油中的生物素-DPPE(1.5mg)的含水分散物(1ml)，并將樣品放在轉(zhuǎn)板上1-2小時。將懸液(0.8ml)裝進(jìn)小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。小瓶振蕩45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心7分鐘后，浮游物質(zhì)用水進(jìn)行交換，并再次洗滌兩次。利用蒸發(fā)光散射檢測器，正相HPLC表明微泡的膜含有4摩爾％生物素-DPPE。通過Coulter計數(shù)器測量，微泡的平均粒徑是4μm。采用3.5MHz寬帶變送器的超聲波透射測量法，表明小于2mg/ml的微粒分散物給出大于5dB/cm的聲束衰減作用。
實(shí)施例8-以二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和生物素?；目贵w(其與鏈霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共價結(jié)合)包裹的充氣微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成利用琥珀酐使NH2-PEG3400-DSPE(如同實(shí)施例2中所制備的)羧化，例如利用Nayar，R.和Schroit，A.J.在生物化學(xué)(1985)24，5967-71中所描述的類似方法。
b)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。此外，也可按照實(shí)施例2(f)制備微泡。
c)鏈霉抗生物素蛋白與經(jīng)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的偶聯(lián)利用水溶性碳二亞胺，通過標(biāo)準(zhǔn)連接方法將鏈霉抗生物素蛋白與微泡膜上的Succ-PEG3400-DSPE共價結(jié)合。在反應(yīng)期間將樣品置于轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用水進(jìn)行交換，并再次洗滌。通過與某些標(biāo)記物的結(jié)合情況可分析所連接的鏈霉抗生物素蛋白的官能度，例如熒光標(biāo)記的生物素，生物素酰化抗體(用熒光標(biāo)記的第二抗體來檢測)或生物素?；蜔晒饣蚍派湫詷?biāo)記的低核苷酸。通過熒光顯微觀察或閃爍計數(shù)進(jìn)行分析。
d)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和生物素(其與鏈霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共價結(jié)合)包裹的充氣微泡的制備在含有生物素?；d體(例如生物素?；贵w)的溶液中溫育實(shí)施例8(c)中的微泡。將涂上一層載體的微泡按照上述方法洗滌。
實(shí)施例9-以二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和生物素?；牡秃塑账?其與鏈霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共價結(jié)合)包裹的充氣微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成利用琥珀酐使NH2-PEG3400-DSPE(如同實(shí)施例2中所制備的)羧化，例如利用Nayar，R.和Schroit，A.J.在生物化學(xué)(1985)24，5967-71中所描述的類似方法。
b)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。此外，也可按照實(shí)施例2(f)制備微泡。
c)鏈霉抗生物素蛋白與經(jīng)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的偶聯(lián)利用水溶性碳二亞胺，通過標(biāo)準(zhǔn)連接方法可將鏈霉抗生物素蛋白與微泡膜上的Succ-PEG3400-DSPE共價結(jié)合。在反應(yīng)期間將樣品置于轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用水進(jìn)行交換，并再次洗滌。通過與某些標(biāo)記物的結(jié)合情況可分析所連接的鏈霉抗生物素蛋白的官能度，例如熒光標(biāo)記的生物素，生物素?；?用熒光標(biāo)記的二抗來檢測)或生物素?；蜔晒饣蚍派湫詷?biāo)記的低核苷酸。通過熒光顯微觀察或閃爍計數(shù)進(jìn)行分析。
d)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和生物素化的低核苷酸(其與鏈霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共價結(jié)合)包裹的充氣微泡的制備在含有生物素?；秃塑账岬娜芤褐袦赜龑?shí)施例9(c)中的微泡。將涂布低核苷酸的微泡按照上述方法洗滌。例如，利用熒光標(biāo)記的與小泡相連接的低核苷酸或通過所連接低核苷酸與被標(biāo)記(熒光或放射性)的互補(bǔ)低核苷酸進(jìn)行雜交，來檢測低核苷酸與小泡的結(jié)合情況。例如，通過小泡與被穩(wěn)定化的含有與所連接低核苷酸互補(bǔ)的DNA序列的結(jié)合情況來分析攜帶低核苷酸的微泡的官能度。例如，可利用與核糖體DNA(其中每單倍體基因組有多個拷貝)互補(bǔ)的低核苷酸和與癌基因(例如大鼠的癌基因每個單倍體基因組有一個拷貝)互補(bǔ)的低核苷酸。
實(shí)施例10-磷脂酰和葉酸-PEG3400-Succ-DSPE包裹的充氣微泡a)葉酸-PEG3400-Succ-DSPE的制備按照Lee.R.J.和Low.P.S.在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1233，134-144中所描述的方法，合成葉酸-PEG3400-Succ-DSPE。
b)二硬脂酰磷脂酰絲氨酸和葉酸-PEG3400-Succ-DSPE包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和葉酸-PEG3400-Succ-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。此外，也可按照實(shí)施例2(e)或2(f)制備微泡。例如，通過顯微觀察研究含有葉酸微泡與表達(dá)不同水平葉酸受體的細(xì)胞的結(jié)合情況，可分析葉酸的連接情況。
實(shí)施例11-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-E-選擇蛋白-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡a)硫醇化-抗-CD34抗體的制備按照Hansen，C.B.等在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，133-144所描述的方法，可產(chǎn)生硫醇化-抗-CD34抗體。
b)硫醇化-抗-ICAM-1抗體的制備按照Hansen，C.B.等在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，133-144所描述的方法，可產(chǎn)生硫醇化-抗-ICAM-1抗體。
c)硫醇化-抗-E-選擇蛋白抗體的制備按照Hansen，C.B.等在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，
133-144所描述的方法，可產(chǎn)生硫醇化-抗-E-選擇蛋白抗體。
d)經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-cD34-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-E-選擇蛋白-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如實(shí)施例2制備)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行交換，并且將來自實(shí)施例11(a)，11(b)，和11(c)中的抗體與微泡進(jìn)行偶聯(lián)，例如，按照Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在藥物藥理學(xué)雜志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239133-134中所述的方法。然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上幾個小時，并洗滌。
實(shí)施例12-與經(jīng)磷脂酰絲氨酸包裹的充氣微泡相連接的肽FNFRLKAGOKIRFGAAAWEPPRARI合成含有磷脂酰絲氨酸-結(jié)合和肝素-結(jié)合片段的肽FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI。添加肽至磷脂酰絲氨酸包裹的全氟丁烷微泡中，并充分混合。
實(shí)施例13-與經(jīng)磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺包裹的充氣微泡共價連接的纖連蛋白a)微泡的制備稱取DSPS(25mg)和DSPE(5.0mg)置于清潔小瓶內(nèi)，并加入5ml 1.4％丙烯醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物至80℃ 5分鐘，然后冷卻樣品至室溫，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，并用蒸餾水洗滌微泡兩次，然后懸浮在0.1M硼酸鈉鹽緩沖液(pH9)中。
b)纖連蛋白的修飾將5ml 0.01M pH8 Hepes緩沖液中的纖連蛋白(1.0mg)加入到0.1mmol交聯(lián)劑SDBP中?；旌衔镌诒吓嘤?小時。
c)微泡修飾。
往(b)中的蛋白溶液中加入(a)微泡懸液，并在室溫下，轉(zhuǎn)板上溫育2小時。通過使微泡飄浮而除去未反應(yīng)的材料，然后用0.1M pH9硼酸鈉鹽緩沖液替換原有溶液。重復(fù)該過程三次。
d)體外分析。
體外分析測定微泡詳見實(shí)施例21。觀察到細(xì)胞上漸漸積累了被結(jié)合的微泡。
實(shí)施例14-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰膽固醇包裹的充氣微泡a)3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰膽固醇(DC-chol)的合成(Farhood.H.Gao.X.Barsoum.J和Huancr.L.分析生物化學(xué)225.89-93(1995))在室溫下，往溶于二氯甲烷中的2-二甲基氨基乙胺(19.4mg，24∶1，0.22mmol)和三乙胺(310μl，2.23mmol)經(jīng)攪拌的溶液(3ml)中慢慢地加入0.22mmol溶于1，4-二噁烷中的膽固醇氯甲酸乙酯(100mg)的溶液。當(dāng)反應(yīng)完全，蒸發(fā)混合物至干，用閃爍層析法(CHCl3/MeOH，4∶1)純化殘余物。獲得一種白色固體，得到105mg(95％)。用核磁共振和MALDI檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)。
b)微泡分散物的制備通過稱取DSPS(4.5mg)和(DC-chol)(0.5mg)到2ml小瓶內(nèi)，從90％磷脂酰絲氨酸和10％(DC-chol)的混合物制備含有全氟丁烷的單層包裹的微泡。添加0.8ml丙二醇/甘油(4％)水溶液。80℃加熱混合物5分鐘并振蕩。然后冷卻溶液至室溫，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中以4450擺/分鐘振蕩小瓶45秒，并置于轉(zhuǎn)板上。樣品在2000rpm下離心洗滌5分鐘。用注射器除去浮游物質(zhì)，并加入蒸餾水至相同的量。再一次以全氟丁烷沖洗液面上空間，并且將樣品繼續(xù)置于轉(zhuǎn)板上直到出現(xiàn)均相。重復(fù)一次洗滌過程實(shí)施例15-磷脂酰絲氨酸和WEPPRARI-PE包裹的充氣微泡在1∶1的二噁烷和0.02M pH8.0 HEPES緩沖液的混合物中，將磷脂酰乙醇胺(PE)與等摩爾量的交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺酰-2，3-二溴丙酸鹽進(jìn)行反應(yīng)。冰上培育2小時后，加入等摩爾量的結(jié)合肝素的肽WEPPRARI，通過加入0.2M四硼酸二鈉鹽使pH增至9，并在室溫下繼續(xù)溫育2小時。用層析儀純化反應(yīng)產(chǎn)物。從80-95％磷脂酰絲氨酸和5-20％肽取代PE的混合物制備含有全氟丁烷的單層包裹的微泡。
實(shí)施例16-磷脂酰絲氨酸和滅活的人類凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡a)人凝血酶的滅活在37℃下將人凝血酶置于溶于0.05M pH8.0 HEPES緩沖液中的20％摩爾過量的D-Phe-L-Pro-L-Arg-氯甲基酮中溫育30分鐘而使其滅活。
b)磷脂酰絲氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如實(shí)施例9所制備的)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。此外，也可按照實(shí)施例2(f)制備微泡。
c)經(jīng)磷脂酰絲氨酸和滅活的人類凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE包裹的充氣微泡利用水溶性的碳二亞胺標(biāo)準(zhǔn)連接方法，使人類滅活凝血酶與實(shí)施例16(b)中的微泡上的Succ-PEG3400-DSPE共價結(jié)合。反應(yīng)期間將樣品放置在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)以水進(jìn)行交換，并再次洗滌。
實(shí)施例17-具有氨甲蝶呤和激活藥物前體的酶的充氣微泡a)通過肽接頭與充氣微泡結(jié)合的氨甲蝶呤一些文獻(xiàn)充分描述了用于使氨基酸與抗癌藥物氨甲蝶呤(MTX)相連接的方法(參見如Huennekens，F(xiàn).M.(1994)，TIBTECH 12，234-239和本文的參考)。利用相同的技術(shù)，可使肽代替單個氨基酸與MTX連接。該肽由可與微泡表面的MTX相連接的接頭構(gòu)成。一類該接頭包括通式結(jié)構(gòu)(MTX)-F-K/R-X-R-Z-C的肽，其中X是任意氨基酸，Z是疏水氨基酸。該接頭的特定例子是(MTX)-F-K-L-R-L-C。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如實(shí)施例2)，可利用Cys-殘余物中的SH-基使MTX-肽與微泡(例如由磷脂酰絲氨酸和Mal-PEG3400-DSPE組成)連接。期望該種類的接頭由酶如組織蛋白酶B切開，其中組織蛋白酶B經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞的外部和表面選擇性得以過量表達(dá)(Panchal，R.G.等(1996)，Nat.生物技術(shù)14，852-856)。這樣，在腫瘤中將選擇地釋放潛在的前藥(MTX)-F-K/R-X-R。通過羧肽酶(其可內(nèi)源性地存在于腫瘤中，或如通過腫瘤-相關(guān)抗體被導(dǎo)向到腫瘤)，該前藥可進(jìn)一步被激活成活性藥物MTX(參見下文)。
b)與充氣微泡表面共價連接的激活前藥的酶激活前藥的酶的例子是羧肽酶(CPA)，例如通過利用3400Da兩端都含有N-羥基琥珀酸胺基的聚(乙二醇)鏈，可使羧肽酶與經(jīng)磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺混合物包裹的微泡的表面相連接(Perron，M.J.和Page，M.Br.癌雜志73，281-287)；其中所說的微泡可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備。含有CPA的微泡可通過在含有CPA微泡中摻入合適的導(dǎo)向載體導(dǎo)向到病理學(xué)區(qū)域。此外，例如通過上述方法，也可將CPA直接與載體(例如抗體)連接。在后一個例子中，可使CPA-載體的連接物與微泡表面相結(jié)合，見Hansen，C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239133-134。Huennekens，F(xiàn).M.(1994)TIBTECH 12，234-239描述了許多可作為前藥-酶對的例子。
實(shí)施例18-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前藥3′，5′-O-二棕櫚酰-5-氟代-2′-脫氧尿苷包裹的充氣微泡a)硫醇化-抗-CEA-抗體的制備按照Hansen，C.B.等在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，133-144所描述的方法，產(chǎn)生硫醇化-抗-CEA-抗體。
b)經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前藥3′，5′-O-二棕櫚酰-5-氟代-2′-脫氧尿苷包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)，Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如實(shí)施例2制備)以及抗癌前藥3′，5′-O-二棕櫚酰-5-氟代-2′-脫氧尿苷(Mori，A.等(1995)癌化學(xué)療法藥理學(xué)35，447-456)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行交換，并使抗體與微泡進(jìn)行偶聯(lián)，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在藥物藥理學(xué)雜志(1984)36465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239 133-134所描述的方法。然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上幾個小時，并洗滌。
實(shí)施例19-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前藥N-三氟乙酰-阿霉素-14-纈草酸鹽包裹的充氣微泡a)硫醇化-抗-CEA-抗體的制備按照Hansen，C.B.等在生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(1995)1239，133-144所描述的方法，產(chǎn)生硫醇化-抗-CEA-抗體。
b)經(jīng)磷脂酰絲氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前藥N-三氟乙酰-阿霉素-14-纈草酸鹽包裹的充氣微泡的制備往磷脂酰絲氨酸(90-99.9摩爾％)，Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如實(shí)施例2制備)以及抗癌前藥N-三氟乙酰-阿霉素-14-纈草酸鹽(Mori，A.等(1993)藥理學(xué)研究10，507-514)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加熱分散物至不超過80℃ 5分鐘，然后冷卻至環(huán)境溫度。接著將分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)內(nèi)，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后將樣品放在轉(zhuǎn)板上。離心后，浮游物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行交換，并使抗體與微泡進(jìn)行偶聯(lián)，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在藥物藥理學(xué)雜志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報1239 133-134。然后將微泡置于轉(zhuǎn)板上幾個小時，并洗滌。
實(shí)施例20-使用方法冷凍干燥0.01M pH7.4磷酸緩沖液可得到含有磷脂酰絲氨酸-包裹微泡的活性劑，其中微泡的包裹膜摻入進(jìn)了滅活的人類凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE。將產(chǎn)物再次分散在無菌水中，并且靜脈內(nèi)注射進(jìn)懷疑有靜脈血栓癥的患者的腿靜脈內(nèi)。用標(biāo)準(zhǔn)超聲波技術(shù)檢查腿。與周圍組織相比，通過增強(qiáng)作用的造影劑使血栓定位。
實(shí)施例21-摻入了含有肝素硫酸鹽結(jié)合肽(KRKR)和纖連蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的DSPS的充氣微泡的制備以及生物評估該實(shí)施例針對導(dǎo)向微泡，該微泡含有以線型順序排列的多肽載體。
a)含有肝素硫酸鹽結(jié)合肽(KRKR)的脂肽和纖連蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Ile-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成脂肽。在連接之前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸與棕櫚酸。置于TFA(其含有％5苯酚，5％EDT，5％茴香醚和5％水)中2小時可從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)小份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得16mg純化的物質(zhì)(分析性HPLC，梯度70-100％B其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測--UV260和熒光，Ex280，Em350--產(chǎn)物保留時間＝19.44分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物期望預(yù)期值M+H為2198，實(shí)測值2199。
b)具有含有肝素硫酸鹽結(jié)合肽(KRKR)和纖連蛋白肽(WOPPRARI)的多特異性脂肽的DSPS的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和(a)中的脂肽(0.5mg)并分別置于兩個小瓶內(nèi)，每一個小瓶內(nèi)加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩小瓶)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，轉(zhuǎn)動過夜。用去離子水洗滌所形成的微泡，并用Coulter計數(shù)器[大小1-3微米(87％)，3-5微米(11.5％)]和聲學(xué)衰減作用(最大衰減作用頻率3.5MHz)進(jìn)行分析。在120mm Hg時微泡處于穩(wěn)定狀態(tài)。MALDI質(zhì)譜分析可確認(rèn)摻入進(jìn)DSPS微泡的脂肽，如下約將0.05-0.1ml微泡懸液轉(zhuǎn)移到清潔小瓶內(nèi)，并添加0.05-0.1ml甲醇。對懸液超聲處理30秒，并用MALDI MS分析溶液。正電方式給出M+H為2200(脂肽預(yù)期值值為2198)。
c)具有含有肝素硫酸鹽結(jié)合肽(KRKR)和纖連蛋白肽(WOPPRARI)的多特異性脂肽的DSPS的充氣微泡的體外研究在流動條件下與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合在260ml Nunc培養(yǎng)瓶中用1640 RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)來源于正常臍帶的人內(nèi)皮細(xì)胞系ECV 304(ATCC CRL-1988)，其中培養(yǎng)基添加了L-谷氨酰胺(200mM)，青霉素/鏈霉素(10,000U/ml和10,000μg/ml)和10％胎牛血清。細(xì)胞以1∶5至1∶7分流比再次培養(yǎng)直至達(dá)到匯合。滅菌直徑為22mm的涂布-玻璃，并放置在12孔培養(yǎng)平板的底部，隨后將0.5ml含有血清的完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞鋪在平板上。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合時，將蓋玻片放置在習(xí)用由玻璃平板上所雕刻的溝組成的流腔室上，其中在玻璃平板上放置具有細(xì)胞的蓋玻片，并且細(xì)胞面對溝以形成流通道。在37℃，利用蠕動泵使(b)中所制備的微泡從貯液槽穿過流腔室并返回至貯液槽中。調(diào)整流量以便模擬生理相關(guān)剪切速率。流腔室放置在顯微鏡下，直接觀察微泡和細(xì)胞之間的相互作用。安裝在顯微鏡上面的照相機(jī)與顏色視頻打印機(jī)和探測器連接。微泡以一定的速率(其依賴于流量)在細(xì)胞上逐漸積累。若進(jìn)一步增加流量，細(xì)胞開始從蓋玻片上脫離，但是仍然與微泡結(jié)合。不攜帶載體的對照小泡不粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上，在最小限度流量條件下就從腔室中消失。
d)狗體內(nèi)實(shí)驗(yàn)例1)用戊巴比妥麻醉一只22kg的雜種狗，并給其機(jī)械地通風(fēng)。通過中線胸骨切開術(shù)打開胸腔，移走前心包膜，并在心臟和ATL HDI-3000超聲波掃描器的P5-3轉(zhuǎn)導(dǎo)物之間插入30mm膠化的聚二氧化硅氧橡膠間隔元件。放置掃描器是為了在每次結(jié)束-心縮期，通過所延遲的EGC觸發(fā)形成間歇的短軸圖象。靜脈內(nèi)大丸劑的迅速注射凈量為2ml的(b)中的微泡；3秒鐘后，看見形成圖象的右心室含有造影材料，隔3秒后，左心室也被裝滿造影材料，觀察到瞬時衰減作用陰影(其使左心室的后部分看得不清楚)。在心肌層中可看到明亮度得到實(shí)質(zhì)性的增加；并且當(dāng)衰減作用陰影平息時，心臟遠(yuǎn)側(cè)部分中的左心室也可觀察到這一增強(qiáng)作用。在最初所注射的試劑排出后，用超聲波掃描器進(jìn)行連續(xù)，高讀框速率，高輸出力的成象作用(已知其為一種在圖象組織區(qū)域中破壞超聲造影劑微泡的方法)。幾秒后，調(diào)整掃描器到初始狀態(tài)。然后心肌變暗，并靠近基值。移動圖象片段至新位置再次出現(xiàn)造影作用；移動片段至初始位置再一次形成靠近基線的組織明亮度。
例2)[比較]利用上述相同的方法，注射按照上述(b)相同方式所制備的凈量為2ml的微泡(但其在制備中不包括任何脂肽)。心肌回聲增強(qiáng)作用遠(yuǎn)無例1中所觀察的強(qiáng)烈且更短。在左心室衰減作用完成時，幾乎心肌造影作用完全消失，且沒有觀察到例1中所提到的左心室后部分心肌回聲增強(qiáng)現(xiàn)象。
實(shí)施例22-DSPS(其含有硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-PE)包裹的充氣微泡的制備a)DSPS和PE-PEG3400-Mal包裹的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg，3.9mmol)和實(shí)施例50中的PE-PEG3400-Mal(0.5mg)并分別置于兩個清潔小瓶內(nèi)，每一個小瓶內(nèi)加入1ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩小瓶)，然后用4.5微米的濾器過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，并用去離子水洗滌所形成的微泡三次。
b)抗-CD34抗體的硫醇化往溶解了0.3mg抗-CD34抗體的0.5ml pH7磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中添加0.3mg Traut試劑，并在室溫下攪拌溶液1小時。從NAP-5柱上的修飾蛋白質(zhì)分離出過量的試劑。
c)硫醇化-抗-CD34抗體與DSPS(其包含DSPE-PEG2000-MAL)包裹充氣微泡的綴合添加0.5ml(b)所制備的硫醇化抗體至(a)中微泡的等分試樣中，并使綴合反應(yīng)在轉(zhuǎn)板上進(jìn)行30分鐘。2000rpm下離心5分鐘，接著除去浮游物質(zhì)。以水進(jìn)一步洗滌微泡三次。
d)用FITC-綴合的第二抗體檢測包裹在微泡內(nèi)的抗體添加0.025ml FITC-綴合的山羊-抗-小鼠抗體至(c)中微泡的懸液中，室溫下將混合物置于轉(zhuǎn)板上暗處溫育30分鐘。2000rpm下離心5分鐘，接著除去浮游物質(zhì)。以水進(jìn)一步洗滌微泡三次。微泡懸液的流動細(xì)胞計數(shù)分析表明98％具熒光性。
實(shí)施例23-含有硫醇化-抗-CD62-MAL-PEG2000-PE的DSPS包裹的充氣微泡的制備利用與實(shí)施例22中所描述的相同的方法制備含有抗-CD62抗體的微泡。
實(shí)施例24-含有硫醇化-抗-ICAM-1-MAL-PEG2000-PE的DSPS包裹的充氣微泡的制備利用與實(shí)施例22中描述的相同的方法制備含有抗-ICAM-1抗體的微泡。
實(shí)施例25-經(jīng)DSPS和硫醇化-抗-CD62-Mal-PEG2000-PE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG2000-PE包裹的充氣微泡的制備本例子旨在制備用于導(dǎo)向超聲造影的多抗體載體的微泡。
a)DSPS和PE-PEG2000-Mal包裹微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和實(shí)施例2(a)中的PE-PEG2000-Mal(0.5mg)并分別置于清潔小瓶內(nèi)，每一個小瓶內(nèi)加入1ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米的濾器過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并用蒸餾水洗滌所形成的微泡三次。
b)抗-CD62和抗-ICAM-L抗體的硫醇化往溶解了0.3mg抗-CD62抗體和0.3mg抗-ICAM-L抗體的PBS磷酸緩沖鹽溶液(0.5ml pH7)中添加Traut試劑，并在室溫下攪拌溶液1小時。從NAP-5柱上的修飾蛋白質(zhì)分離出過量的試劑。
c)硫醇化的抗-CD62和抗-ICAM-L抗體與DSPS和DSPE-PEG2000-Mal包裹的微泡的綴合添加0.5ml(b)所制備的硫醇化抗體混合物至(a)中微泡的等分試樣中，并使綴合反應(yīng)在轉(zhuǎn)板上進(jìn)行30分鐘。2000rpm下離心5分鐘，接著除去浮游物質(zhì)。以水進(jìn)一步洗滌微泡三次。
PEG間隔元件長度可變化為包括長鏈(例如PEG3400及PEG5000)或短鏈(例如PEG600或PEG800)。此外，第三抗體如硫醇化-抗-CD34抗體也有效。
實(shí)施例26-含有DSPS(其由聚絲氨酸非共價涂布)和融合肽(其包含PS-結(jié)合組分和纖連蛋白肽序列FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI)的導(dǎo)向充氣微泡a)PS-結(jié)合/纖連蛋白片段融合肽FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI的合成利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Ile-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該肽。在連接之前用HBTU預(yù)活化所有氨基酸。置于TFA(其含有％5苯酚，5％EDT，和5％水)中2小時可從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到302mg粗品。以9ml/分鐘的流量及20-40％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份25mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得10mg純化的物質(zhì)(分析型HPLC，梯度20-50％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測--UV214和260nm，產(chǎn)物保留時間＝12.4分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2856，實(shí)測值2866。
b)含有DSPS(其由聚絲氨酸非共價涂布)和PS-結(jié)合/纖連蛋白片段的融合肽FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI)的導(dǎo)向充氣微泡的制備稱取DSPS(5mg)和聚-L-賴氨酸(0.2mg)和上述(a)中的肽(0.2mg)加入清潔小瓶內(nèi)。小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并離心所形成的微泡(1000rpm下3分鐘)。用水，PBS和水充分洗滌后，利用MALDI MS檢查終溶液以檢測聚賴氨酸和肽含量。在終溶液中未觀察到任何多肽物質(zhì)。然后加入乙腈，超聲處理破壞微泡。利用MALDI MS分析所形成的溶液以檢測聚賴氨酸和PS-結(jié)合/纖連蛋白融合肽。結(jié)果如下MALDI預(yù)期值 MALDI實(shí)測值聚-L-賴氨酸 786，914， 790，919，1042，1170 1048，1177DSPS-結(jié)合肽 2856 2866PS-結(jié)合/纖連蛋白融合肽中所包含的間隔元件(-GGG-)也可用其它間隔元件如PEG2000或聚丙氨酸(-AAA-)代替。也可采用前導(dǎo)向的形式，首先DSPS-結(jié)合/纖連蛋白片段融合肽通過纖連蛋白肽的結(jié)合與細(xì)胞連接，接著施用PS微泡，其隨后與PS-結(jié)合肽相結(jié)合。
實(shí)施例27-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和生物素-PEG3400-丙氨酰-膽固醇包裹的及鏈霉抗生物素蛋白/生物素基-內(nèi)皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纖蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能團(tuán)化的充氣微泡本例子旨在制備導(dǎo)向超聲波微泡，其中鏈霉抗生物素蛋白用作為生物素?；瘓蟮牢锖洼d體之間的接頭。
a)生物素-PEG3400-b-丙氨酸膽固醇的合成往3ml溶解了膽固醇-b-丙氨酸鹽酸鹽(如實(shí)施例59所述)(15mg，0.03mmol)的三氯甲烷/濕甲醇(2.6∶1)溶液中添加三乙胺(42ml，0.30mmol)。室溫下攪拌混合物10分鐘，并滴加溶于1，4-二噁烷(1ml)中的生物素-PEG3400-NHS(100mg，0.30mmol)。室溫下攪拌混合物3小時，并蒸發(fā)至干，通過急驟層析法純化殘余物至析出白色晶體，產(chǎn)率為102mg(89％)。由MALDI-MS和NMR證實(shí)結(jié)構(gòu)。
b)生物素化的內(nèi)皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)的合成利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Trp(Boc)-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該肽。在連接之前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸。置于TFA(其含有5％茴香醚和5％水)中2小時可從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到75mg粗品。以9ml/分鐘的流量及30-80％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份20mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得2mg純化的組分(分析性HPLC，梯度30-80％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測--UV214nm--產(chǎn)物保留時間＝12.6分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1077，實(shí)測值1077。
c)生物素基-血纖蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的合成利用上述(b)所描述的類似方案，合成和純化該肽。通過HPLC和MALDI鑒定純化產(chǎn)物。
d)磷脂酰絲氨酸和生物素-PEG3400-丙氨酸膽固醇包裹的多特異性充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和(a)中的生物素-PEG3400-丙氨酸膽固醇(0.5mg)置于清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩小瓶)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，并振蕩過夜。用去離子水洗滌微泡懸液幾次，通過Coulter計數(shù)器和聲學(xué)衰減作用進(jìn)行分析。
e)用熒光素-標(biāo)記的鏈霉抗生物素基蛋白和(b)和(c)的生物素蛋白的綴合往(d)所制備的微泡添加溶解在PBS(1ml)中的綴合熒光素的鏈霉抗生物素蛋白(0.2mg)。室溫下將小泡放置在轉(zhuǎn)板上3小時。用水充分洗滌后，通過熒光顯微技術(shù)進(jìn)行分析，在1ml PBS(其含有分別來自(b)和(c)的生物素基-內(nèi)皮-1肽(0.5mg)和生物素基-血纖蛋白-抗聚合肽(0.5mg))溫育微泡2小時。充分洗滌微泡以除去非綴合的肽。
實(shí)施例28-經(jīng)磷脂酰絲氨酸和生物素-DPPE(它們用來產(chǎn)生鏈霉抗生物素蛋白與生物素基-內(nèi)皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纖蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)混合物的“夾心”形式)包裹的充氣微泡a)含有生物素的微泡的制備將磷脂酰絲氨酸(5mg)和生物素-DPPE(0.6mg)置于清潔小瓶內(nèi)，并加入1ml溶于水中的5％丙二醇-甘油溶液。加熱分散物5分鐘至80℃，然后冷卻樣品至環(huán)境溫度。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，接著加帽混合器振蕩小瓶45秒。離心后，除去浮游物質(zhì)，用水充分洗滌微泡。
b)經(jīng)磷脂酰絲氨酸和生物素-DPPE包裹的充氣微泡與鏈霉抗生物素蛋白及生物素基-內(nèi)皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纖蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)混合物的綴合按照實(shí)施例27詳述的方法。
實(shí)施例29-DSPS(其通過肝素硫酸鹽結(jié)合肽/纖連蛋白肽/RGD肽和熒光素官能化)的含PFB氣體的充氣微泡a)含有RGD序列和熒光素報道物基因的脂肽的合成(其中熒光素報道物基團(tuán)二棕櫚酰-Lys-Lys-Lys-Lys[乙酰-Arg-Gly-Asp-Lys(熒光素)]Gly.OH
利用商業(yè)銷售的氨基酸藥筒，按照實(shí)施例21(a)中所述合成該脂肽。將該脂肽置于TFA(其含有％5水，％5苯酚，5％EDT)中2小時使其從樹脂上切割下來。真空中蒸發(fā)粗制品后，用二乙醚沉淀并研制粗制品。以9ml/分鐘的流量及60-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得10mg純化的組分(分析型HPLC，梯度60-100％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測--UV260--產(chǎn)物保留時間＝20-22分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1922，實(shí)測值為1920。
b)含有肝素硫酸鹽結(jié)合序列和纖連蛋白肽的脂肽的合成如實(shí)施例21中所述進(jìn)行合成和純化c)DSPS(其通過肝素硫酸鹽結(jié)合肽/纖連蛋白肽/乙?；鵕GD肽和熒光素官能化)的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg，3.9mmol)和(a)中的脂肽(0.5mg，0.2mmol)和(b)中的脂肽(0.5mg)分別置于兩清潔小瓶內(nèi)，每小瓶內(nèi)加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩小瓶)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并振蕩過夜。如實(shí)施例21(b)所述，用去離子水洗滌所形成的微泡幾次，并通過Coulter計數(shù)器進(jìn)行分析。顯微鏡下觀察微泡，可看見1-5微米大小小泡。而且微泡具熒光性。
實(shí)施例30-含有DSPS(其通過CD71 FITC-標(biāo)記的抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行了共價修飾，而且摻入了具有對內(nèi)皮細(xì)胞的親和性的脂肽)的充氣微泡本例子針對制備多載體導(dǎo)向超聲波劑。
a)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽(2-n-十六烷基硬脂?；?Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2)的合成利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Trp(Boc)-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成下面所顯示的肽。 在連接之前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和-n-十六烷基硬脂酸。置于TFA(其含有5％EDT，和5％水)中2小時可從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過50分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得10 mg純化的組分(分析型HPLC，梯度90-100％B(其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水)檢測--UV214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2369，實(shí)測值為2373。
b)含有DSPS(其摻入了內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽和PE-PEG3400-Mal)的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和(a)中的脂肽(0.5mg)及實(shí)施例50的PE-PEG3400-Mal(0.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并用蒸餾水洗滌所形成的微泡三次。
c)FITC-標(biāo)記的抗-運(yùn)鐵蛋白受體的抗體的硫醇化室溫下FITC-標(biāo)記的CD71抗-運(yùn)鐵蛋白受體Ab(其溶于PBS中100mg/ml，0.7ml)與Traut試劑(0.9mg)反應(yīng)1小時。從NAP-5柱上的修飾蛋白質(zhì)分離出過量的試劑。
d)硫醇化的FITC-標(biāo)記的抗-運(yùn)鐵蛋白受體的抗體與含有DSPS(其摻入了內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽和PE-PEG3400-Mal)的充氣微泡的綴合添加上述(c)中的蛋白質(zhì)組分(共2ml)0.5ml等分試樣至(b)中的微泡中，室溫下置于轉(zhuǎn)板上綴合反應(yīng)10分鐘。1000rpm下離心3分鐘后，除去蛋白質(zhì)溶液，接著分別與1ml和0.5ml蛋白質(zhì)溶液等分試樣重復(fù)兩次(或多次)綴合反應(yīng)。以蒸餾水洗滌微泡四次，并用流動細(xì)胞計數(shù)和顯微觀察分析樣品，以檢測抗體的存在情況。觀察到92％以上具熒光性。
附

圖1闡述了DSPS陰性對照微泡(左曲線)與綴合了CD71 FITC-標(biāo)記的抗-運(yùn)鐵蛋白抗體的小泡(右曲線)的流動細(xì)胞計數(shù)對比情況，該圖表明92％的群體具熒光性。
如實(shí)施例21(b)所述，通過MALDI質(zhì)譜法確認(rèn)脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況。
實(shí)施例31-包括DSPS，內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)向脂肽和含甲巰丙脯酸的分子的充氣微泡本例子旨在制備結(jié)合了導(dǎo)向和治療應(yīng)用的超聲波藥劑。
a)由甲巰丙脯酸官能團(tuán)化的脂肽的合成 利用人工氮泡裝置，從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。利用DIC預(yù)激活通過Lys側(cè)-鏈連接溴乙酸以作為對稱的酸酐。將DMF中所溶解的甲巰丙脯酸利用DBU(作為堿)引入固-相。置于TFA(其含有5％EDT，和5％水和5％乙甲基硫化物)中2小時可從樹脂上同時移走肽及去側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過60分鐘)一份10mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得2mg純化的組分(分析型HPLC，梯度70-100％B(超過20分鐘)，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測--UV214nm--保留時間＝26分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物測得M+H為1265與預(yù)期值相同。
b)具有內(nèi)皮細(xì)胞親和性的脂肽(二棕櫚酰-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH2)的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上由Rink酰胺樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接之前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，和5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到160mg粗品。以9ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份35mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得20mg純化的組分(分析型HPLC，梯度70-100％B其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測--UV214和260nm--產(chǎn)物保留時間＝16分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2050，實(shí)測值為2055。
c)包括DSPS，內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)向脂肽和含甲巰丙脯酸的分子(其用于藥物輸送)的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)及(b)的產(chǎn)物(0.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩小瓶)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，然后振蕩1小時，接著用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI MS證明，在終溶液未檢測到任何水平的原材料。如同實(shí)施例21(b)中所描述的，利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(a)和(b)的產(chǎn)品摻入到微泡內(nèi)的情況。
d)包括DSPS，內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)向脂肽和含甲巰丙脯酸的分子(其用于治療應(yīng)用)的充氣微泡的體外研究利用實(shí)施例21(c)中的體外分析法，檢查在流動條件下的細(xì)胞結(jié)合情況。微泡依據(jù)流量在細(xì)胞上逐漸積累。若進(jìn)一步增加流量，細(xì)胞開始從蓋玻片上脫離，但是仍然與微泡結(jié)合。不攜帶載體的對照小泡不粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上，在最小限度流量條件下就從腔室中消失。
實(shí)施例32-包含DSPS(攜有細(xì)胞膜親和性螺旋肽脂肽)和肽抗生素多粘菌素B硫酸鹽的充氣微泡的制備本例子旨在制備含有多肽載體(其具有組合的導(dǎo)向和治療應(yīng)用)的微泡。
a)含有細(xì)胞膜親和性螺旋肽的脂肽(十六烷基硬脂?；?Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2)的合成如實(shí)施例30(a)制備該脂肽。
b)多-特異性充氣微泡的制備稱取DSPS(5.0mg)和(a)的脂肽(0.3mg)及多粘菌素B硫酸鹽(0.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超聲處理混合物3分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，1000rpm下離心所形成的微泡3分鐘。用水充分洗滌這些微泡，直到用MALDI MS在浮游物質(zhì)中不能檢測到多粘菌素或脂肽。顯微觀察表明小泡大小分布在所需的1-8微米范圍間。添加甲醇(0.5ml)至所洗滌的小泡中(約0.2ml)，并將混合物放置在超聲波水浴器中2分鐘。通過MALDI MS分析，發(fā)現(xiàn)所形成的清溶液中含有脂肽和多粘菌素B硫酸鹽(預(yù)期值1203，實(shí)測值1207)。
實(shí)施例33-包含DSPS(其摻入了包含IL-1結(jié)合受體序列的脂肽而且經(jīng)含有藥物氨甲蝶呤的分支結(jié)構(gòu)修飾微泡。
本例子旨在制備包含用于導(dǎo)向/治療應(yīng)用的多載體的導(dǎo)向微泡。
a)含有白細(xì)胞介素-1受體結(jié)合肽的脂肽(二棕櫚酰-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala.OH)的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Ala-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接之前利用HBTU預(yù)活化所有氨基氨基酸和棕櫚酸。置于TFA(其含有5％水，5％茴香醚，5％苯酚，5％EDT)中2小時從樹脂上同時移走肽和側(cè)-鏈保護(hù)基，并得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份30mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得4mg純化的組分(分析型HPLC，梯度90-100％B(其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水)檢測--UV214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2083，實(shí)測值為2088。
b)含有巰基組分的分支氨甲蝶呤核心結(jié)構(gòu)的合成 在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)Tentagel樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成氨甲蝶呤結(jié)構(gòu)。將其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽并去側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用，得到160mg粗品。以9ml/分鐘的流量及10-30％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份30mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥純化組分后，獲得4mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度5-50％B(其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水)檢測--UV214nm--產(chǎn)物保留時間＝9.5分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1523，實(shí)測值為1523。
c)多特異性充氣微泡的制備稱取DSPS(5.0mg)和實(shí)施例64(a)的含有巰基的脂肽(0.5mg)及(a)的脂肽(0.2mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超聲處理混合物3-5分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，1000rpm離心所形成的微泡3分鐘，隨后棄去浮游物質(zhì)。
d)氨甲蝶呤支化結(jié)構(gòu)于硫醇化微泡的綴合將上述(b)氨甲蝶呤結(jié)構(gòu)(0.5mg)溶解在PBS中，pH8.0。然后添加溶液至(c)的含有巰基的微泡中，使二硫鍵反應(yīng)進(jìn)行16小時。用PBS和水充分洗滌小泡后，通過顯微觀察和MALDI MS分析小泡。
在體內(nèi)可減少氨甲蝶呤結(jié)構(gòu)與微泡相連接的二硫鍵從而釋放游離的藥物分子，那么該微泡與腫瘤特異性載體相結(jié)合則構(gòu)成給藥系統(tǒng)。利用生理可接受還原劑如谷胱甘肽可引起藥物釋放。
實(shí)施例34-涂布聚-L-賴氨酸復(fù)合的熒光素-標(biāo)記的DNA片段(其來自質(zhì)粒pBR322)的充氣微泡的制備本例子旨在制備用于基因治療/反義應(yīng)用的微泡。如實(shí)施例21所述，通過用載體修飾的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步涂布微泡膜可獲得特異性導(dǎo)向能力。
a)DSPS-包裹的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液，超聲處理混合物2分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃。加熱后即用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器中振蕩小瓶45秒。然后用去離子水洗滌所形成的微泡一次，隨后棄去浮游物質(zhì)。然后將微泡再懸浮在0.5ml水中。
b)制備聚-L-賴氨酸/DNA復(fù)合物并裝載到DSPS-包裹的微泡上在裝有1mg聚-L-賴氨酸(70-150kD)的清潔小瓶中加入0.1ml溶解在TE緩沖液(10mM tris-HCl，pH8)中的熒光素-標(biāo)記的質(zhì)粒pBR322的消化物。加水使溶液總量為0.6ml，并調(diào)整pH為8。使復(fù)合進(jìn)行1小時，之后添加0.05ml聚賴氨酸-DNA溶液至上述(a)的微泡懸液中。1小時后，顯微觀察表明小泡具熒光性，并確認(rèn)了DNA的存在。
實(shí)施例35-含有分支核心肽(其含有Dabsylated-動脈硬化塊-結(jié)合序列)和RGDS的充氣微泡的制備本例子旨在制備在其表面具有用于用含巰基的載體(其具有導(dǎo)向/給藥和藥物釋放功能)修飾的巰基的微泡。
a)分支肽Dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-leu-Lys-Lys(NH2-Arg-Cys-Asp-Ser)-Gly-Cys.OH的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)Tentagel樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸。將其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到160mg粗品。以9ml/分鐘的流量及10-60％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝乙腈)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份30mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得2.5mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度10-50％B超過20分鐘，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測--UV214和435nm--產(chǎn)物保留時間＝21分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2070，實(shí)測值為2073。
b)含有巰基的充氣微泡的制備如實(shí)施例64(a)所述進(jìn)行制備。
c)硫醇化微泡與多特異性肽通過形成二硫鍵的氧化性連接棄去上述(b)的微泡的浮游物質(zhì)，并換上(1mg)溶解在0.7ml稀氨溶液(pH8)中(a)的dabsyl-肽溶液。往該溶液中加入含有6mg鉀高鐵氰鹽的貯存液(其溶解在2ml水中)。將小瓶放置在轉(zhuǎn)板上，讓巰基氧化反應(yīng)進(jìn)行2小時。然后以水充分洗滌小泡，直到通過HPLC和MALDI檢測證明浮游物質(zhì)無dabsyl-肽，利用水溶性的還原劑三-(2-羧乙基)-膦通過還原二硫鍵來檢測微泡-結(jié)合肽。還原后，通過HPLC和MALDI檢測發(fā)現(xiàn)浮游物質(zhì)含有游離的dabsyl-肽。
也可采用其它生理上可接受的還原劑如還原谷胱甘肽來啟動釋放。
實(shí)施例36-經(jīng)DSPS和生物素-PEG3400乙酰磷脂?；掖及钒⑼ㄟ^生物素，寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和生物素化纖維蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能團(tuán)化的充氣微型氣泡的制備a)生物素-PEG3400乙酰磷脂酰乙醇胺的合成室溫下，攪拌溶解在氯仿/甲醇中的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(21.00mg，0.03mmol)，生物素-PEG3400-CO2-NHS(100mg，0.03mmol)和三乙胺(42μl，0.03mmol)混合物的溶液(3∶1)2小時。在減壓條件下蒸發(fā)溶劑，用閃爍色譜處理殘余物(二氯甲烷/甲醇/水，40∶8∶1)。獲得黃色樹膠狀的產(chǎn)物(112mg，94％)，并通過NMR和MALDI-MS鑒定結(jié)構(gòu)。
b)熒光素-綴合的鏈酶抗生素蛋白與充氣微泡的結(jié)合如上述實(shí)施例所述，通過混合DSPS和生物素-PEG3400乙酰磷脂?；掖及分苽涑錃馕⑴?。將微泡懸液分成0.2ml等分試樣，并如下表所示加入熒光素-連結(jié)鏈霉抗生物素蛋白。環(huán)境溫度下在轉(zhuǎn)板上溫育樣品15-30分鐘，接著在PBS中通過洗滌除去過量的蛋白質(zhì)。用流動細(xì)胞計數(shù)和Coulter計數(shù)器分析樣品。結(jié)果總結(jié)在下表中。
結(jié)果
c)涂布鏈酶抗生素蛋白的微泡與寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和生物素化的血纖蛋白-抗-聚合肽生物素-GPRPPERHOS的綴合離心上述第6份等分試樣微粒，并用1ml pH7.5 PBS緩沖液(其包含實(shí)施例27中(b)和(c)的0.2mg生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和0.2mg生物素-GPRPPERHQS)取代上清液。溫育24小后，用PBS和水充分洗滌這些微粒。
利用該方法將其它生物素?；妮d體或治療劑與涂布鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白微泡相連結(jié)。
實(shí)施例37-經(jīng)DSPS包裹并通血栓導(dǎo)向脂肽和溶解血栓酶組織纖溶酶原激活物官能團(tuán)化的充氣微型氣泡的制備本例子涉及制備含有治療溶解血栓劑的血栓導(dǎo)向超聲造影劑。
a)血栓親和性脂肽(棕櫚酰-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上由Rink酰胺樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸與棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到80mg粗品。用制備性HPLC純化一份20mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得6mg純化物質(zhì)。利用MALDI質(zhì)譜法和分析HPLC進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物。
b)具有硫-SMPB的組織纖溶酶原激活物的修飾添加水使0.1ml含有0.1mg t-PA的碳酸銨緩沖液體積達(dá)0.2ml。往該溶液中添加0.4mg硫-SMPB(其溶解在0.05ml DMSO中)。將蛋白質(zhì)溶液在室溫下放置45分鐘，隨后用Superdex 200柱進(jìn)行純化。用PBS洗脫產(chǎn)物，并收集經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)組分。
b)經(jīng)DSPS/血栓結(jié)合脂肽和含有硫的脂肽包裹的充氣微型氣泡的制備以及與經(jīng)修飾的組織纖溶酶原激活物的綴合稱取DSPS(5.0mg)和0.5mg(a)的脂肽和實(shí)施例64(a)的含硫脂肽加入到清潔小瓶內(nèi)。小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液，超聲處理混合物2分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃。加熱后即用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒。然后用去離子水洗滌所形成的微泡兩次。隨后棄去浮游物質(zhì)，換上1ml(b)的蛋白質(zhì)溶液等分試樣。綴合反應(yīng)進(jìn)行1小時。離心微泡，用另外1ml蛋白質(zhì)溶液替換浮游物質(zhì)。重復(fù)溫育步驟直到用完所有蛋白質(zhì)溶液。然后用水充分洗滌微泡并用Coulter計數(shù)器進(jìn)行分析。如實(shí)施例21(c)用流腔室分析檢驗(yàn)微泡。發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛋白質(zhì)修飾的微泡與那些只含有脂肽/DSPS或DSPS的小泡相比結(jié)合得更多。
在體內(nèi)和體外血栓形成模型中，估價該微泡的導(dǎo)向/治療/超聲波活性。
實(shí)施例38-含有DSPS(攜有含細(xì)胞膜親和性螺旋肽的脂肽)的充氣微泡的制備該例子旨在制備包含細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)向肽載體的導(dǎo)向微泡。
a)包含細(xì)胞膜親和性螺旋肽的脂肽的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上由Rink酰胺樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和2-n-十六烷基硬脂酸。將其置于含有5％水TFA中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到520mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份30mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得10mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度90-100％B超過20分鐘，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測--UV214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2369，實(shí)測值為2375。
b)充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超聲處理混合物3-5分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，在1000rpm下離心所形成的微泡3分鐘。然后用去離子水洗滌這些微泡直到MALDI-MS不能檢測到任何脂肽。接著進(jìn)行Coulter計數(shù)，聲學(xué)衰減以及壓力穩(wěn)定性研究。添加甲醇(0.5ml)至所洗滌的小泡中(約0.2ml)，并將混合物放置在超聲波水浴器中2分鐘。通過MALDI MS分析，發(fā)現(xiàn)所形成的清溶液中含有該脂肽。
c)體外和在體內(nèi)試驗(yàn)這些微泡在體外和在體內(nèi)的特征類似于實(shí)施例21中所制備的微泡。
實(shí)施例39-磷脂酰絲氨酸和生物素?；陌某錃馕⑴輆)脂肽二棕櫚酰-賴氨酰-色氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰-(生物素酰)甘氨酸的合成利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Gly-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得14mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 260和熒光，Ex280，Em350--產(chǎn)物保留時間＝22分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1478，實(shí)測值為1471。
b)包含DSPS(摻入(a)的生物酰化脂肽序列)的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽分別加入到兩個清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)分別加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并振蕩過夜。然后用去離子水洗滌所形成的微泡幾次，并進(jìn)行Coulter計數(shù)，聲學(xué)衰減分析。按下述過程利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)脂肽摻入到DSPS微泡內(nèi)的情況將約50-100ml微泡轉(zhuǎn)移到清潔小瓶內(nèi)，并加入50-100ml水。超聲處理混合物30秒，并點(diǎn)在清潔靶培養(yǎng)皿(把1ml+0.5ml ACH基質(zhì))上。正性方式M+H為1474，脂肽預(yù)期值為1478。
實(shí)施例40-包含DSPS(攜有含非生物活性白細(xì)胞介素-1結(jié)合受體肽的脂肽)的多特異性充氣微泡的制備本例子旨在制備包含導(dǎo)向于IL-1受體(其不引起信號傳感或阻止IL-1結(jié)合)的非生物活性肽載體的導(dǎo)向微泡。
a)含有非生物活性白細(xì)胞介素-1受體結(jié)合肽的脂肽的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Ala-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％水，5％茴香醚，5％苯酚，5％EDT)中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份30mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得4mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度90-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2083，實(shí)測值為2088。
b)充氣微型氣泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽加入到清潔小瓶內(nèi)，小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超聲處理混合物3-5分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻混合物至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，在1000rpm下離心所形成的微泡3分鐘。然后用去水洗滌這些微泡直到MALDI-MS不能檢測到任何脂肽。添加甲醇(0.5ml)至所洗滌的小泡中(約0.2ml)，并將混合物放置在超聲波水浴器中2分鐘。通過MALDIMS分析，發(fā)現(xiàn)所形成的清溶液中含有該脂肽(預(yù)期值為2083，實(shí)測值為2088)實(shí)施例41-用于導(dǎo)向超聲波造影的包含DSPC，DSPS和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽的全氟丙烷微泡的制備添加0.5mg實(shí)施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPC∶DSPS(3∶1)(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液內(nèi)。加熱混合物5分鐘至80℃，然后用4.5微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻混合物至室溫并用全氟丙烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，并且置于轉(zhuǎn)板上5分鐘。在2000rpm下離心樣品5分鐘，并棄去浮游物質(zhì)換上蒸餾水。再一次用全氟丙烷氣體沖洗液面上空間，并將樣品置于轉(zhuǎn)板上直至出現(xiàn)均相。再次洗滌操作。對所形成的超聲造影劑進(jìn)行Coulter計數(shù)分析，聲學(xué)衰減測量及對外壓的抗性分析以確定其特征。如實(shí)施例21所詳述的方法，用體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合在細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例42-用于導(dǎo)向超聲波造影的包含DSPC，DSPS和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽的含六氟化硫微泡的制備添加0.5mg實(shí)施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPC∶DSPS(3∶1)(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液內(nèi)。加熱混合物5分鐘至80℃，并振蕩。冷卻混合物至環(huán)境溫度并用六氟化硫氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并且置于轉(zhuǎn)板上5分鐘。在2000rpm下離心樣品5分鐘，并棄去浮游物質(zhì)換上蒸餾水。再一次用六氟化硫氣體沖洗液面上空間，并將樣品置于轉(zhuǎn)板上直至出現(xiàn)均相。再次洗滌操作。
對所形成的超聲造影劑進(jìn)行Coulter計數(shù)分析，聲學(xué)衰減測量及對外壓的抗性分析。如實(shí)施例21所詳述的方法，用體外分析法試驗(yàn)微泡。
實(shí)施例43-用于導(dǎo)向超聲波造影的包含DSPG和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽的充氣微泡的制備添加0.5mg實(shí)施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液內(nèi)。加熱混合物5分鐘至80℃并振蕩。冷卻混合物至環(huán)境溫度并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并且置于轉(zhuǎn)板上5分鐘。2000rpm離心樣品5分鐘，并棄去浮游物質(zhì)換上蒸餾水。再一次用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，并將樣品置于轉(zhuǎn)板上直至出現(xiàn)均相。再次洗滌操作。對所形成的超聲造影劑進(jìn)行Coulter計數(shù)分析，聲學(xué)衰減測量及對外壓的抗性分析確定其特征。如實(shí)施例21a所詳述的方法，用體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合在細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例44-用于導(dǎo)向超聲波造影的包含DSPG和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽的含全氟丙烷的微泡的制備添加0.5mg實(shí)施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液內(nèi)。加熱混合物5分鐘至80℃，并振蕩。冷卻混合物至環(huán)境溫度并用全氟丙烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并且置于轉(zhuǎn)板上5分鐘。在2000rpm下離心樣品5分鐘，并棄去浮游物質(zhì)換上蒸餾水。再一次用全氟丙烷氣體沖洗液面上空間，并將樣品置于轉(zhuǎn)板上直至出現(xiàn)均相。再次洗滌操作。對所形成的超聲造影劑進(jìn)行Coulter計數(shù)分析，聲學(xué)衰減測量及對外壓的抗性分析確定其特征。如實(shí)施例21a所詳述的方法，用體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合在細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例45-用于導(dǎo)向超聲波造影的包含DSPG和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合脂肽的含六氟化硫微泡的制備添加0.5mg實(shí)施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液內(nèi)。加熱混合物5分鐘至80℃，并振蕩。冷卻混合物至環(huán)境溫度并用六氟化硫氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并且置于轉(zhuǎn)板上5分鐘。在2000rpm下離心樣品5分鐘，并棄去浮游物質(zhì)換上蒸餾水。再一次用六氟化硫氣體沖洗液面上空間，并將樣品置于轉(zhuǎn)板上直至出現(xiàn)均相。再次洗滌操作。對所形成的超聲造影劑進(jìn)行Coulter計數(shù)分析，聲學(xué)衰減測量及對外壓的抗性分析以確定其特征。
實(shí)施例46-含有DSPS(非共價地涂布聚賴氨酸)的導(dǎo)向充氣微泡稱取DSPS(4.5mg)和聚-L-賴氨酸(0.2mg)加入到清潔小瓶內(nèi)。小瓶內(nèi)加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，1000rpm下離心所形成的微泡3分鐘。在用水，PBS及水充分洗滌后，接著用MALDI MS檢測終溶液是否有聚賴氨酸內(nèi)含物。在終溶液未檢測到任何聚賴氨酸材料。然后加入乙腈并超聲處理直到所有小泡破裂。再一次用MALDI MS檢測終溶液是否有聚賴氨酸內(nèi)含物。結(jié)果如下MALDI預(yù)期值 MALDI實(shí)測值聚-L-賴氨酸786，914，1042，1170790，919，1048，1177實(shí)施例47-用于導(dǎo)向超聲波造影的官能團(tuán)化的充氣微泡的制備本例子旨在制備表面具有非特異性導(dǎo)向反應(yīng)基團(tuán)的微泡，其主要利用二硫鍵交換反應(yīng)來結(jié)合到多樣性細(xì)胞靶上。
a)巰基-官能化脂質(zhì)分子的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成上述脂結(jié)構(gòu)。利用HBTU連接化學(xué)法預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到250mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過50分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得24mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1096，實(shí)測值為1099。
c)包含DSPS(摻入了含巰基脂質(zhì)結(jié)構(gòu))的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)(0.5mg，0.4mmol)加入到清潔小瓶內(nèi)。小瓶內(nèi)加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)，仍然熱時用40mm濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，然后置于轉(zhuǎn)板上過夜。用去離子水充分洗滌所形成的微型氣泡幾次，利用Ellmans試劑分析巰基摻入情況。
實(shí)施例48-包含DSPS(摻入了血栓-結(jié)合脂肽)的充氣微泡的制備a)血栓親和性脂肽(二棕櫚酰-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上由Rink酰胺樹脂開始以0.1mmol的規(guī)模合成該脂肽。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小時可從樹脂上同時移走肽及側(cè)-鏈保護(hù)基，得到80mg粗品。用制備性HPLC純化一份20mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得6mg純化物質(zhì)。利用MALDI質(zhì)譜法及分析HPLC進(jìn)一步鑒定該產(chǎn)物。
b)血栓導(dǎo)向超聲波微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂肽(1.0mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，并加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃，然后用40mm濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并用去離子水充分洗滌所形成的微型氣泡。用顯微觀察和Coulter計數(shù)分析法鑒定微泡。如上述實(shí)施例所述，利用MALDI-MS確認(rèn)脂肽的存在情況。
實(shí)施例49-用于導(dǎo)向超聲波造影的涂布運(yùn)鐵蛋白的充氣微泡的制備a)巰基-官能團(tuán)化脂質(zhì)分子的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂開始以0.25mmol的規(guī)模合成上述脂結(jié)構(gòu)。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用，得到250mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過50分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得24mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1096，實(shí)測值為1099。
b)包含DSPS(摻入了含巰基脂質(zhì)結(jié)構(gòu))的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)(0.5mg，0.4mmol)加入到清潔小瓶內(nèi)，并加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)，仍然熱時用40mm濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。加帽混合器振蕩小瓶45秒，然后置于轉(zhuǎn)板上過夜。用去離子水充分洗滌所形成的微型氣泡幾次，利用Ellmans試劑分析巰基摻入情況。
c)具有熒光素-NHS和硫代-SMPB的運(yùn)鐵蛋白的修飾往4mg溶于PBS(1ml)中的運(yùn)鐵蛋白(Holo，人)溶液內(nèi)加入0.5ml含1mg硫代-SMPB和0.5mg熒光素-NHS的DMSO溶液。室溫下攪拌混合物45分鐘，然后利用PBS作為洗脫液流過葡聚糖凝膠200柱。收集蛋白質(zhì)組分，并在使用前存儲在4℃下。
d)微泡與運(yùn)鐵蛋白的綴合添加1ml(c)經(jīng)修飾的運(yùn)鐵蛋白蛋白質(zhì)溶液至(b)的含巰基的微泡中。調(diào)整pH為9，接著讓綴合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時。在用去離子水充分洗滌微泡后，用Coulter計數(shù)器進(jìn)行分析(97％的在1和5mm之間)并用熒光顯微技術(shù)(高熒光性微泡)分析。
實(shí)施例50-包含DSPS摻入了綴合到硫醇化胰蛋白酶熒光素的PE-PEG2000-Mal的充氣微泡a)Boc-NH-PEG2000-DSPE(t-丁基氨基甲酸酯聚(亞乙基乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成將DSPS(31mg)加入到Boc-NH-PEG2000-SC(150mg)的三氯甲烷(2ml)溶液中，隨后加入三乙胺(33μl)。41℃攪拌混合物10分鐘直到原材料溶解。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，用乙腈(5ml)溶解殘余物。冷卻所形成的分散物至4℃并離心，隨后過濾溶液并蒸發(fā)至干。由NMR(核磁共振)確認(rèn)所形成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
b)H2N-PEG2000-DSPE(氨基-聚(亞乙基乙二醇)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的合成在環(huán)境溫度下，攪拌溶解在4M鹽酸二噁烷溶液(5ml)中的Boc-NH-PEG3400-DSPE(167mg)2.5小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用三氯甲烷(1.5ml)溶解殘余物，并以水(2×1.5ml)洗滌。在真空條件下蒸發(fā)有機(jī)相。TCL分析(氯仿/甲醇/水13∶5.0∶0.8)顯示了一個茚三酮陽性點(diǎn)Rf＝0.6；核磁共振證實(shí)其結(jié)構(gòu)。
c)Mal-PEG2000-DSPE(3-馬來酰亞胺丙酸酯聚(亞乙基乙二醇)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的合成添加N-琥珀酰胺-3-馬來酰亞胺丙酸酯(5.6mg，0.018mmol)的四氫呋喃溶液(0.2ml)至溶解在四氫呋喃(1ml)和0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.5(2ml)中的H2N-PEG2000-DSPE(65mg，0.012mmol)溶液。加熱混合物至30℃，接著對反應(yīng)物進(jìn)行TCL分析，隨后在真空中除去溶劑。利用80∶20三氯甲烷∶甲醇作為洗脫液，在閃爍二氧化硅柱上純化標(biāo)題物質(zhì)。由NMR(核磁共振)和質(zhì)譜法確認(rèn)純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
d)摻入PE-PEG2000-Mal的DSPS充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和上述(c)的PE-PEG2000-Mal(0.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，并加入1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加熱混合物5分鐘至80℃，然后用40mm濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，用蒸餾水充分洗滌所形成的微型氣泡三次。
e)熒光素-標(biāo)記的胰蛋白酶的制備往5mg胰蛋白酶的PBS溶液(1ml)中加入0.2ml含有1mg熒光素-NHS的DMSO溶液。室溫下攪拌混合物45分鐘。將葡聚糖凝膠200柱充滿經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)混合物，并利用PBS以1ml/分鐘的流速洗脫產(chǎn)物。收集蛋白質(zhì)組分(5ml)并存儲在4℃下。
f)硫醇化熒光素-標(biāo)記的胰蛋白酶的制備添加1mg Traut試劑至(e)的蛋白質(zhì)組分中，室溫下另攪拌混合物1小時。將葡聚糖凝膠200柱充入4ml經(jīng)Traut修飾的蛋白質(zhì)，并利用PBS洗脫產(chǎn)物。收集具有最大熒光強(qiáng)度的蛋白質(zhì)組分(總量為6ml)。
g)微泡與硫醇化熒光素-標(biāo)記的胰蛋白酶的綴合在轉(zhuǎn)板上將(d)的微泡置于1ml上述(f)的蛋白質(zhì)溶液中溫育。離心并撤除浮游物質(zhì)，接著讓綴合反應(yīng)在pH7.3-7.8條件下進(jìn)行10分鐘。進(jìn)一步重復(fù)三次該過程，接著以水洗滌小泡四次以除去未結(jié)合的蛋白。
D.小泡含有通過在PBS中的Arg-pNA衍生物切割所證實(shí)的活性酶。
E.通過Coulter和回波性測量分析小泡。
PEK-022-015 小泡耐壓總濃度0.83直徑1-3mm 40直徑3-5mm 28直徑5-7mm 13最大衰減頻率 3.32 Mhz時的衰減 4.93.5Mhz時的衰減7.85.0Mhz時的衰減7.2小泡是對壓穩(wěn)定的。
附圖2闡述與陰性對照微泡(左曲線)相比的流動細(xì)胞計數(shù)數(shù)據(jù)。98％的小泡具熒光性。
實(shí)施例51-包含用于診斷和治療的甲巰丙脯酸分子的充氣微泡a)甲巰丙脯酸官能團(tuán)化脂肽的合成 用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。利用DIC預(yù)激活通過Lys側(cè)-鏈連接溴乙酸(作為對稱的酸酐)。將DMF中所溶解的甲巰丙脯酸利用DBU(作為堿)引入固-相。置于TFA(其含有5％EDT，5％水和5％乙甲基硫化物)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過60分鐘)一份10mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得2mg純化的組分(分析型HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測--UV214nm--保留時間＝26分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物實(shí)測值M+H為1265與預(yù)期值相同。
b)包含DSPS和含甲巰丙脯酸的化合物的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清潔小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)。冷卻混合物并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并用去離子水廣泛地洗滌所形成的微泡。MALDI MS證明，在終溶液中未檢測到任何水平的(a)的化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)含甲巰丙脯酸的脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并用MALDI MS進(jìn)行分析，結(jié)果表明該M+H峰值與(a)的脂肽一致。
實(shí)施例52-包含DSPS和用于診斷和治療的腎上腺素能受體的親和性載體的充氣微泡a)適于固相連接的帶保護(hù)基的衍生物的合成i)甲基4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-乙酸苯酯的合成在85℃下，攪拌4-羥乙酸苯酯(4.98g，0.030mol)和環(huán)氧氯丙烷(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，并蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]基乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-乙酸苯酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成
100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氫鈉(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鈉直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物并凍干。產(chǎn)生415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
b)氨酰心安官能團(tuán)化脂肽的合成 用手動起泡法方法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。沉淀醚得到粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC純化(超過60分鐘)一份10mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得38mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測--UV214nm--保留時間＝26分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物測得M+H為1258，期望值為1257。
b)包含DSPS和含氨酰心安脂肽的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清潔小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)的產(chǎn)物(0.5mg)混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并用去離子水充分洗滌所形成的微泡。MALDI MS表明在終溶液中未檢測到任何水平的(b)的化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)含氨酰心安脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，進(jìn)行MALDI MS(ACH-基質(zhì))分析，給出與相應(yīng)的脂肽(b)一致的M+H峰值。
d)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例53-包含DSPS及由結(jié)合肝素硫酸鹽的肽(KRKR)和用于導(dǎo)向的纖連蛋白肽(WOPPRARI)組成的脂肽以及含治療應(yīng)用的氨酰心安的脂肽的充氣微泡a)由結(jié)合肝素硫酸鹽的肽(KRKR)和用于導(dǎo)向的纖連蛋白肽(WOPPRARI)組成的脂肽的合成
利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂開始以0.25mmol的規(guī)模合成上述脂結(jié)構(gòu)。在連接前利用HBTU預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚和5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用，得到150mg粗品。以9ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得16mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 260nm和熒光，Ex280，Em350--產(chǎn)物保留時間＝19.44分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為2198，實(shí)測值為2199。
b)適于固相連接的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和環(huán)氧氯丙烷(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，并蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氫鈉(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鈉直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。通過過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物和凍干。產(chǎn)生415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
c)氨酰心安官能團(tuán)化脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。沉淀醚得到粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)。冷凍干燥后，獲得38mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測--UV214nm--保留時間＝25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1258，期望為1257。
d)包含DSPS及由結(jié)合肝素硫酸鹽的肽(KRKR)和纖連蛋白肽(WOPPRARI)組成的脂肽以及含氨酰心安的脂肽的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清潔小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并80℃下加熱混合物5分鐘(加熱期間振蕩)。過濾并冷卻該溶液。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，并用去離子水充分洗滌所形成的微泡。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)含氨酰心安脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，結(jié)果有兩個M+H峰值2202和1259，其分別對應(yīng)于(a)的脂肽與(c)的脂肽。
d)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例54-包含DSPS和用于診斷和治療的腎上腺素能受體親和性氨酰心安的脂肽衍生物的充氣微泡a)N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰胺的合成i)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量產(chǎn)率的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氫鹽(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鹽直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物和凍干。產(chǎn)生415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
v)N′-Boc，N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的合成將N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸(92mg，0.25mmol)與十六烷胺(60mg，0.25mmol)的DMF溶液(5ml)冷卻至0℃。加入HOBt(39mg，0.25mmol)和N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(水溶性碳二亞胺)(48mg，0.25mmol)。0℃下攪拌反應(yīng)混合物1小時，然后室溫下過夜。將反應(yīng)混合物倒在含有純堿(2.5g)和氯化鈉(4.0g)的水溶液(25ml)上。過濾沉淀物質(zhì)，以水洗滌，用三氯甲烷萃取。以5％純堿和水洗滌氯仿相，并干燥(Na2SO4)。過濾并濃縮溶液得到150mg黃白色的粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，氯仿/甲醇95∶5)，得到118mg(80％)的白色物質(zhì)。通過1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定該產(chǎn)物，所測M+H如預(yù)期值268。
VI)N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的合成添加三氟乙酸(1ml)至N′-Boc-N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺(10mg)的二氯甲烷溶液(9ml)中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時。TCL(二氧化硅，氯仿/甲醇95∶5)顯示原材料的轉(zhuǎn)化是否完成。蒸發(fā)去掉溶劑，用水/乙腈萃取殘余物并凍干，產(chǎn)生定量產(chǎn)率的白色固體物質(zhì)。通過1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定該產(chǎn)物，所測M+H為492以及M+Na為514(符合預(yù)期值)。
b)包含DSPS和用于診斷和治療應(yīng)用的N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺(0.5mg)混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱混合物5分鐘(加熱期間振蕩)。過濾并冷卻該溶液。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，用去離子水充分洗滌所形成的微泡。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(a)的化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，出現(xiàn)492的M+H峰值，其對應(yīng)于N-十六烷基-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的M+H值。
實(shí)施例55-經(jīng)DSPS和含葉酸的化合物(其用于診斷應(yīng)用)包裹的充氣微泡
a)含有葉酸的酯肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及葉酸，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。沉淀醚得到粗物質(zhì)，并利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)行分析，所出現(xiàn)M+H峰值對應(yīng)于該結(jié)構(gòu)1435(預(yù)期值為1430)。通過分析性HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘進(jìn)一步鑒定該物質(zhì)，所出現(xiàn)的峰值的保留時間為27分鐘(檢測UV 368nm)。
b)包含DSPS和含葉酸脂肽的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。接著加入稀氨(pH8)和DMSO(40μl)，超聲處理混合物5分鐘，80℃下加熱混合物5分鐘(加熱期間振蕩)。過濾并冷卻該溶液。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(a)結(jié)構(gòu)摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，出現(xiàn)對應(yīng)于(a)結(jié)構(gòu)的在1238的M+H峰值。
c)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例56-包含DSPS和用于診斷和治療應(yīng)用的苯丁酸氮芥的膽甾醇酯的充氣微泡a)4-[4-二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸膽甾醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干燥二氯甲烷溶液(15ml)中。室溫下攪拌混合物0.5小時，并添加至膽固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后倒在碳酸氫鈉飽和水溶液中，進(jìn)行相分離，以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液并濃縮，用柱色譜純化產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷)獲得560mg(83％)的無色油。MALDI質(zhì)譜法鑒定該結(jié)構(gòu)，其M+H符合預(yù)期值674。利用1H(500MHz)和13C(125MHZ)NMR分析法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，其光譜與該結(jié)構(gòu)一致。
b)包含DSPS和用于診斷和/或治療應(yīng)用的苯丁酸氮芥的膽甾醇酯的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平(a)的化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)苯丁酸氮芥的膽甾醇酯摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，出現(xiàn)對應(yīng)于(a)結(jié)構(gòu)的在668的M+H峰值。
實(shí)施例57-包含DSPS和一種含氨酰心安及苯丁酸氮芥的膽固醇衍生物的脂肽(其用于診斷和治療應(yīng)用)的充氣微泡a)適于固相連接的帶保護(hù)基的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量產(chǎn)率的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]乙酸苯酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氫鹽(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鹽直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物并凍干。產(chǎn)生415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
b)氨酰心安官能團(tuán)化脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡方法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。從醚沉淀粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)。冷凍干燥后，獲得38mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物給出M+H1258，預(yù)期值1257。
c)4-[4-二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸膽甾醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干燥二氯甲烷溶液中(15ml)。室溫下攪拌混合物0.5小時，并添加至膽固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后倒在碳酸氫鈉飽和水溶液中，進(jìn)行相分離，以鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液并濃縮，用柱色譜純化產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷)獲得560mg(83％)的無色油。MALDI質(zhì)譜法鑒定該產(chǎn)物，其M+H符合預(yù)期值674。利用1H(500MHz)和13C(125MHZ)NMR分析法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，其光譜與該結(jié)構(gòu)一致。
d)包含DSPS和一種含氨酰心安及苯丁酸氮芥的膽固醇酯的脂肽的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)的產(chǎn)物(0.5mg)以及(c)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)。過濾該溶液并冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器中振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(b)及(c)的化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，出現(xiàn)668 M+H峰值(其對應(yīng)于脂肽(b)及膽固醇酯(c)的值)。
e)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例58-包含DSPS和含細(xì)胞導(dǎo)向氨酰心安及親脂性甲巰丙脯酸硫醇酯(其具有治療用途)的充氣微泡a)適于固相連接的帶保護(hù)基氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量產(chǎn)率的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氫鹽(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鹽直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物并凍干。產(chǎn)生為415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
b)氨酰心安官能團(tuán)化脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。從醚沉淀粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)。冷凍干燥后，獲得38mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1258，期望為1257。
c)甲巰丙脯酸的膽烷酸硫醇酯的合成攪拌溶解在二氯甲烷(5ml)中的5-β-膽烷酸(361mg，1.00mmol)和DIC(77μl，0.50mmol)的混合物10分鐘，然后添加至甲巰丙脯酸(130mg，0.600mmol)和DBU(180μl，1.20mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后倒在稀鹽酸上。加入三氯甲烷(30ml)。進(jìn)行相分離，以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液并濃縮，接著用色譜儀純化粗產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇/乙酸95∶4∶1)。凍干乙腈/水/乙醇混合物可得到產(chǎn)物。得到137mg(49％)白色固體。利用1H(500MHz)和13C(125 MHZ)NMR分析法鑒定該結(jié)構(gòu)。MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，其正性方式的M+Na峰值為m/z 584。
d)包含DSPS和含細(xì)胞導(dǎo)向氨酰心安及親脂性甲巰丙脯酸硫醇酯(其具有治療用途)的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)產(chǎn)物(0.5mg)以及(c)產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平的化合物的(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(b)及(c)化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS分析，出現(xiàn)分別對應(yīng)(b)和(c)結(jié)構(gòu)的M+H峰值。
e)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例59-包含磷脂酰絲氨酸和生物素酰胺-PEG-β-Ala-膽固醇以及苯丁酸氮芥的膽固醇酯(其具有診斷和治療用途)的充氣微泡a)膽甾醇基N-Boc-β-丙氨酸鹽的合成在惰性氣體條件下，添加DIC(510μl)至Boc-β-Ala-OH(1.25g，6.60mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到盛有溶解了膽固醇(1.16g，3.00mmol)和DMAP(367mg，3.00mmol)的二氯甲烷溶液(15ml)的燒瓶內(nèi)。攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后倒在硫酸氫鉀水溶液中。在進(jìn)行相分離后，用氯仿抽提水相。用硫酸氫鉀水溶液和水洗滌合并的有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液，接著用色譜儀純化粗產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇95∶1)，得到1.63g(97％)白色固體。利用1H(500MHz)NMR分析法鑒定該結(jié)構(gòu)b)β-丙氨酸膽甾醇酯鹽酸鹽的合成室溫下攪拌溶解了(a)的化合物(279mg，0.500mmol)的1M鹽酸1，4-二噁烷溶液(5ml)4小時。濃縮反應(yīng)混合物以獲得定量β-丙氨酸膽甾醇酯鹽酸鹽。用1H(500MHz)NMR分析法和MALDI質(zhì)譜法鑒定該結(jié)構(gòu)，其Na峰值為482，預(yù)期值為481。
c)生物素-PEG3400-β-Ala-膽固醇添加三乙胺(42μl，0.30mmol)至β-丙酸膽固醇酯鹽酸鹽(15mg，0.03mmol)的氯仿/濕甲醇(2.6∶1，3ml)溶液中。室溫下攪拌混合物10分鐘，接著滴加生物素-PEG3400-NHS(100mg，0.03mmol)的1，4-二噁烷溶液(1ml)。室溫下攪拌混合物3小時后，蒸發(fā)混合物至干燥，急驟層析法純化殘余物以獲得白色晶體，產(chǎn)生102mg(89％)。利用MALDI質(zhì)譜法和NMR(核磁共振)分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
d)4-[4-[二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸膽固醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干二氯甲烷(15ml)溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物0.5小時，然后添加至溶解了膽固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)內(nèi)。攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后倒在碳酸氫鈉水溶液上。在進(jìn)行相分離后，用鹽水洗滌合并的有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液并濃縮，接著用柱色譜儀純化產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷)，得到560mg(83％)無色油。利用MALDI質(zhì)譜法鑒定該結(jié)構(gòu)，其M+H符合預(yù)期值674。利用1H(500MHz)和13C(125MHZ)NMR(核磁共振)分析法進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，其光譜對應(yīng)于該結(jié)構(gòu)。
e)充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)產(chǎn)物(0.5mg)以及(c)產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(b)及(c)化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS(ACH-基質(zhì))分析，出現(xiàn)分別對應(yīng)(b)和(c)結(jié)構(gòu)的M+H峰值。
實(shí)施例60-包含DSPS和含苯丁抑制素衍生物的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡a)含苯丁抑制素衍生物的脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。從醚沉淀粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)。冷凍干燥后，獲得12mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1315，期望為1214。
b)包含DSPS和含苯丁抑制素衍生物的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平的(b)化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)含氨酰心安的脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS(ACH-基質(zhì))分析，其M+H峰值為1320(對應(yīng)于(a)的脂肽)，預(yù)期值為1314。
c)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法檢驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例61-包含DSPS和含苯丁酸氮芥的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡a)含苯丁酸氮芥的脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。利用DIC預(yù)激活通過Lys側(cè)-鏈連接苯丁酸氮芥(以作為對稱的酸酐)。置于TFA(其含有5％EDT，5％水，5％乙基甲基硫化物)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)10mg等分試樣的粗產(chǎn)物。冷凍干燥后，獲得30mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1295，期望為1294。
b)包含DSPS和含苯丁酸氮芥的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(a)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平的a)的化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)含苯丁酸氮芥的脂肽摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS(ACH-基質(zhì))分析，其M+H峰值為1300(預(yù)期值為1294)，M+Na峰值為1324(預(yù)期值為1317)。
c)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例62-包含DSPS和含氨酰心安及苯丁酸氮芥的親脂性衍生物的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡a)適于固相連接的帶保護(hù)基的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和環(huán)表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜儀分析(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
ii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量產(chǎn)率的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
iii)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氫鹽(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鹽直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)被抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物并凍干。產(chǎn)率為415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
b)氨酰心安官能團(tuán)化脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。從醚沉淀粗物質(zhì)，并以10ml/分鐘的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制備性HPLC進(jìn)行純化(超過60分鐘)。冷凍干燥后，獲得38mg純化的組分(分析HPLC，梯度70-100％B超過20分鐘，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1258，期望為1257。
c)N-[(s)-3-十六烷基巰-2-甲基丙酰]脯氨酸的合成添加DIEA(188μl，1.10mmol)至溶解了1-碘代十六碳烷(176mg，0.500mmol)和甲巰丙脯酸(120mg，0.550mmol)及DBU(165μl，1.10mmol)的四氫呋喃溶液中(5ml)。70℃下加熱混合物2小時，然后濃縮。將殘余物倒在硫酸氫鉀的飽和水溶液上，用三氯甲烷抽提有機(jī)相。用水洗滌有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。色譜(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH85∶10∶5)純化該產(chǎn)物，凍干可得到105mg(48％)白色固體。利用1H(500MHz)和13C(125MHZ)NMR分析法鑒定該結(jié)構(gòu)。MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，其負(fù)性方式的M-H值為m/z 440(符合預(yù)期值)。
d)包含DSPS和含氨酰心安及苯丁酸氮芥的親脂性衍生物的脂肽(其用于診斷和治療)的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)的產(chǎn)物(0.5mg)以及(c)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平的(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(b)及(c)化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDIMS(ACH-基質(zhì))分析，出現(xiàn)分別對應(yīng)(b)和(c)結(jié)構(gòu)的M+H峰值。
e)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例63-包含DSPS和氨酰心安膽固醇衍生物(其用于診斷和治療)的充氣微泡a)4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，攪拌4-羥苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和環(huán)表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小時。冷卻反應(yīng)混合物，蒸餾去掉過量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取殘余物，以鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。過濾溶液并濃縮。對暗殘余物進(jìn)行色譜處理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)無色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
b)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室溫下，攪拌4-[(2，3-環(huán)氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和異丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物過夜。濃縮溶液，將油殘余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通過過濾及濃縮獲得定量的黃色油，其可用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。通過1H和13C NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
c)4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的合成100℃下加熱溶解在6M鹽酸(15ml)中的4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小時。濃縮反應(yīng)混合物，用水萃取殘余物并凍干。1H和13C NMR譜與該結(jié)構(gòu)對應(yīng)，MALDI質(zhì)譜法顯示M+H如預(yù)期值268。
d)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氫鈉溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氫鹽(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氫鹽直到轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物倒在硫酸氫鉀飽和水溶液中，將有機(jī)物質(zhì)抽提到乙酸乙酯中。以水和鹽水洗滌有機(jī)相，并干燥(Na2SO4)。過濾獲得0.6g粗物質(zhì)。用層析法純化產(chǎn)物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。濃縮溶液，用冰乙酸萃取殘余物并凍干。產(chǎn)生415mg(56％)白色固體。通過1H和13C NMR分析法檢驗(yàn)該結(jié)構(gòu)。
e)N-Boc-β-丙氨酸膽甾醇酯的合成在惰性氣體條件下，添加DIC(510μl)至Boc-β-Ala-OH(1.25g，6.60mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后轉(zhuǎn)換到盛有溶解了膽固醇(1.16g，3.00mmol)和DMAP(367mg，3.00mmol)的二氯甲烷溶液(15ml)的燒瓶內(nèi)。攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后倒在硫酸氫鉀水溶液上。在進(jìn)行相分離后，用氯仿抽提水相。用硫酸氫鉀水溶液和水洗滌混合的有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液，接著用色譜儀純化粗產(chǎn)物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇99∶1)，得到1.63g(97％)白色固體。利用1H(500MHz)NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
f)N-Boc-β-丙氨酸膽甾醇酯鹽酸鹽的合成室溫下攪拌溶解了(a)的化合物(279mg，0.500mmol)的1M鹽酸1，4-二噁烷溶液(5ml)4小時。濃縮反應(yīng)混合物以獲得定量產(chǎn)率的膽甾醇基β-丙氨酸鹽鹽酸鹽。用1H(500MHz)NMR分析法和MALDI質(zhì)譜法鑒定該結(jié)構(gòu)，其M+Na峰值為482，預(yù)期值為481。
g)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰-β-丙氨酸膽甾醇酯的合成添加DIEA(26ml，0.15mmol)至N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸(55mg，0.15mmol)與β-丙氨酸膽甾醇酯鹽酸鹽(74mg，0.15mmol)的DMF溶液(5ml)中。添加HOBT(23mg，0.15mmol)和水溶性碳二亞胺(WSC)(29mg，0.15mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后倒在含純堿(2.5g)和氯化鈉(4.0g)水溶液上。用三氯甲烷提取沉淀物質(zhì)。以水洗滌有機(jī)相，并干燥(MgSO4)。過濾溶液并濃縮，接著用色譜儀(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇/乙酸95∶4∶1)純化粗產(chǎn)物(132mg)。濃縮收集的組分，萃取到冰乙酸中然后凍干。得到83mg(69％)黃白色固體。利用1H NMR分析法證實(shí)該結(jié)構(gòu)。
h)N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰-β-丙氨酸膽甾醇酯三氟乙酸鹽的合成添加三氟乙酸(2ml)至N-Boc-4-[2-羥基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰-β-丙氨酸鹽(40mg，0.05mmol)的干二氯甲烷溶液(4ml)中。攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后濃縮。凍干乙腈/水混合物獲得產(chǎn)物，得到定量產(chǎn)率的白-黃色物質(zhì)。MALDI質(zhì)譜法鑒定該產(chǎn)物，其M+H值如預(yù)期值708。
i)包含DSPS和氨酰心安膽固醇衍生物(其用于診斷和治療)的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(h)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在洗滌終溶液中未檢測到任何水平的(h)的化合物。利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(h)化合物摻入到微泡內(nèi)的情況。j)體外分析如實(shí)施例21所詳述的體外分析法試驗(yàn)微泡。觀察到結(jié)合到細(xì)胞上的微泡逐漸積累。
實(shí)施例64-用于導(dǎo)向超聲波造影的涂布運(yùn)鐵蛋白/抗生物素蛋白的多特異性充氣微泡的制備本例子旨在制備包含可用于導(dǎo)向超聲波/治療的載體的微泡。
a)巰基-官能團(tuán)化脂質(zhì)分子(二棕櫚酰-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH)的合成 利用1mmol氨基酸藥筒，在ABI 433A自動肽合成儀上從Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂開始以0.25mmol的規(guī)模合成上述脂結(jié)構(gòu)。利用HBTU連接化學(xué)法預(yù)活化所有氨基酸和棕櫚酸。將其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用，得到250mg粗品。以9ml/分鐘的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制備性HPLC純化(超過40分鐘)一份40mg的粗物質(zhì)。冷凍干燥后，獲得24mg純化物質(zhì)(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.01％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水檢測-UV 214nm--產(chǎn)物保留時間＝23分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物預(yù)期值M+H為1096，實(shí)測值為1099。
b)包含DSPS(其摻入了含巰基脂質(zhì)結(jié)構(gòu))的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)(0.5mg)加入到清潔小瓶內(nèi)，并加入0.8ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油水溶液。加熱混合物5分鐘至80℃(加熱期間振蕩)，在仍然熱時用40微米濾器進(jìn)行過濾。冷卻樣品至室溫并用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間。在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，然后置于轉(zhuǎn)板上過夜。用去離子水充分洗滌所形成的微型氣泡幾次，利用Ellmans試劑分析巰基摻入情況。
c)用熒光素-NHS和硫-SMPB對運(yùn)鐵蛋白和抗生物素蛋白的修飾往2mg運(yùn)鐵蛋白(Holo，人)和2mg抗生物素蛋白的混合物的PBS溶液(1ml)中加入0.5ml含1mg硫-SMPB和0.5mg熒光素-NHS的DMSO溶液。室溫下攪拌混合物45分鐘，然后以PBS為洗脫液使其流過葡聚糖凝膠200柱。收集蛋白質(zhì)組分，使用前存儲在4℃下。
d)綴合了經(jīng)修飾的運(yùn)鐵蛋白/抗生物素蛋白的微泡添加1ml(c)經(jīng)修飾的運(yùn)鐵蛋白抗生物素蛋白蛋白質(zhì)溶液至(b)的含巰基微泡。調(diào)整溶液pH至9，室溫下讓綴合反應(yīng)進(jìn)行2小時。在用去離子水充分洗滌后，對微泡進(jìn)行Coulter計數(shù)分析(81％的在1-7微米之間)及熒光顯微觀察(觀察到高度熒光性的微泡)。
實(shí)施例65-通過充氣微泡的基因轉(zhuǎn)移本例子旨在制備用于基因轉(zhuǎn)移的導(dǎo)向微泡。
a)包含DSPS和涂布聚-L-賴氨酸的脂肽的充氣微泡的制備稱取DSPS(4.5mg)和實(shí)施例41的脂肽(0.5mg)置于兩個2ml小瓶內(nèi)。往每個小瓶內(nèi)添加0.8ml丙二醇/甘油(4％)水溶液。80℃分別加熱溶液5分鐘并振蕩，然后冷卻溶液至環(huán)境溫度，液面上空間用全氟丁烷沖洗。在加帽混合器中以4450擺動/分鐘振蕩小瓶45秒，并放置在轉(zhuǎn)板上5分鐘?；旌闲∑績?nèi)的內(nèi)含物，對所形成的樣品在2000rpm下離心洗滌5分鐘。除去浮游物質(zhì)，并加入相同量的蒸餾水。重復(fù)一次洗滌操作。將聚-L-賴氨酸HBr(20.6mg)溶解在2ml水中，然后取0.4毫升等分試樣并加水補(bǔ)足為2ml。往1.2ml稀釋的聚-L-賴氨酸溶液中添加0.12mlDSPS-脂肽的微泡懸液。溫育后，用水充分洗滌以除去過量聚賴氨酸。
b)細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6孔平板上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞(ECV 304)至均勻亞匯合層出現(xiàn)。在RPMI基質(zhì)上制備終體積250μl的含50μgDNA(CLONTECH的增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)載體)和50μl(a)的微泡懸液的轉(zhuǎn)染混合物。室溫下放置混合物15分鐘，然后添加1ml完全RPMI基質(zhì)。除去培養(yǎng)皿中的基質(zhì)，添加DNA-微泡混合物至細(xì)胞中。在細(xì)胞培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞(37℃)c)超聲處理溫育15分鐘后，使所選擇的孔暴露在連續(xù)的超聲波下，0.5W/cm2，30秒。
d)培養(yǎng)和檢查在細(xì)胞培養(yǎng)溫箱中進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞約4.5小時(37℃)。抽吸除去含DNA-微泡的基質(zhì)，并添加2ml完全RPMI基質(zhì)。檢查前，培育細(xì)胞40-70小時。然后除去大多數(shù)基質(zhì)，用熒光顯微鏡檢查細(xì)胞。將該結(jié)果與對照實(shí)驗(yàn)(加入DNA或DNA-聚賴氨酸至細(xì)胞中)作比較。
實(shí)施例66-內(nèi)皮細(xì)胞的漂浮(其通過具有特異結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的載體的微泡)實(shí)施本實(shí)驗(yàn)是為了顯示本發(fā)明可用于分離微泡所導(dǎo)向的細(xì)胞。在Nunc培養(yǎng)瓶(chutney 153732)中RPMI 1640基質(zhì)上培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞系ECV 304(其來源于正常臍帶(ATCC CRL-1988))，其中所說的基質(zhì)加入了L-谷酰胺(200mM)，青霉素/鏈霉素(10,000U/ml和10,000μg/ml)和10％胎牛血清。當(dāng)達(dá)到匯合時，用胰蛋白酶消化后，以1∶5至1∶7的分比再次培養(yǎng)細(xì)胞。將2百萬個來自胰蛋白酶化的匯合培養(yǎng)物中的細(xì)胞分別添加至五根離心管內(nèi)。然后將對照微泡或結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的微泡(如實(shí)施例21和實(shí)施例38所述而制備)按照每管2，4，6，8或10百萬個小泡添加至離心管中。400g下離心5分鐘后，用Coulter計數(shù)器計算管底部的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)4個或更多個微泡結(jié)合到細(xì)胞上使得細(xì)胞位于離心法管中頂端液體內(nèi)。通過實(shí)施例38的微泡使得所有細(xì)胞漂浮，而用實(shí)施例21的微泡約50％的微泡漂浮。
實(shí)施例67-包含含內(nèi)皮肽受體親和性載體的脂肽(其用于導(dǎo)向超聲波造影)的二硬脂酰-磷脂酰絲氨酸的充氣微泡a)4′-[(3.4-二甲基-5-異噁唑)-氨磺酰]琥珀酸的合成往磺胺二甲基異噁唑(267mg，1.00mmol)的DMF溶液(10ml)中添加琥珀酐(1.00g，10.0mmol)和4-二甲基氨吡啶(122mg，1.00mmol)。80℃下攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后濃縮。用5％小蘇打水溶液萃取殘余物，以乙酸乙酯提取殘余物。以稀釋的鹽酸酸化水溶液，用乙酸乙酯提取有機(jī)物質(zhì)。利用稀釋的鹽酸，水，及鹽水洗滌有機(jī)相，并用活性炭進(jìn)行處理，干燥(MgSO4)。過濾并濃縮該溶液得到280mg(76％)白色固體。利用1H(300MHz)和13C(75MHZ)NMR(核磁共振)分析法鑒定該結(jié)構(gòu)。利用MALDI質(zhì)譜法(ACH基質(zhì))進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，其M+Na峰值m/z390，其M+H峰值m/z 406(均符合預(yù)期值)。
b)硫代異噁唑官能團(tuán)化脂肽的合成 利用合適的氨基酸，棕櫚酸及(a)的化合物，用手動起泡法從Fmoc-保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹脂開始以0.125mmol的規(guī)模合成上述結(jié)構(gòu)。利用標(biāo)準(zhǔn)的TBTU/HOBt/DIEA方案進(jìn)行連接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小時從樹脂上同時移走肽及去除側(cè)-鏈保護(hù)基的保護(hù)作用。從醚沉淀粗物質(zhì)。通過分析性HPLC分析粗產(chǎn)物(梯度70-100％B超過20分鐘，A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分鐘檢測UV214nm，保留時間25分鐘)。利用MALDI質(zhì)譜法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物觀測M+H為1359，期望為1356。
b)包含(b)的化合物的充氣微泡的制備添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶內(nèi)的DSPS(4.5mg)和(b)的產(chǎn)物(0.5mg)的混合物中。超聲處理混合物5分鐘，并在80℃下加熱5分鐘(加熱期間振蕩)，然后冷卻。用全氟丁烷氣體沖洗液面上空間，在加帽混合器上振蕩小瓶45秒，隨后用去離子水充分洗滌內(nèi)含物。MALDI質(zhì)譜法顯示在終洗滌溶液中未檢測到任何水平(b)化合物。如下述利用MALDI質(zhì)譜分析來確認(rèn)(b)化合物摻入到微泡內(nèi)的情況轉(zhuǎn)移約50μl的微泡至含有90％甲醇(約100μl)的清潔小瓶內(nèi)。超聲處理混合物30秒，并進(jìn)行MALDI MS(ACH-基質(zhì))分析，其M+H峰值為m/z1359(對應(yīng)于(b)的脂肽)。
權(quán)利要求
1.一種可導(dǎo)向的診斷和/或治療活性劑，其含有包含由形成膜的表面活性劑的單分子層穩(wěn)定化的充有氣體的微泡的報道物的含水載液懸液，其中，氣體含有鹵代的氣體或鹵代的低分子量碳?xì)浠衔?，且所述形成膜的表面活性劑含有磷脂，且所述活性劑包含與連接物部分結(jié)合的脂，該連接物部分用于與一種或多種載體的偶聯(lián)，且其中所述一種或多種載體與受體/靶在與血管生成、炎癥、動脈粥樣斑塊和/或凝血相關(guān)的位點(diǎn)結(jié)合；所述連接物部分任選地包含肽連接物部分。
2.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中連接物部分包含兩個或多個賴氨酸分子。
3.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中鹵代氣體包括全氟化的酮，全氟化的醚，部分鹵代的碳?xì)浠衔锘蛉己?或其混合物。
4.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中鹵代氣體包括六氟化硫或全氟丙烷，全氟丁烷或全氟戊烷。
5.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中微泡帶有總的凈電荷。
6.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中總的凈電荷是負(fù)的。
7.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中形成膜的表面活性劑物質(zhì)包含一種或多種選自磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺和磷脂酸的磷脂。
8.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中形成膜的表面活性劑物質(zhì)包括脂肽。
9.按照權(quán)利要求1的活性劑，其還含有為放射性的或作為X光造影劑，光造影探針或旋轉(zhuǎn)標(biāo)記有效的組分。
10.按照權(quán)利要求1的活性劑，其還包含治療化合物。
11.按照權(quán)利要求10的活性劑，其中所說的治療化合物是抗腫瘤劑，血液制品，生物效應(yīng)修飾劑，抗真菌劑，激素或激素類似物，維生素，酶，抗過敏劑，組織因子抑制劑，血小板抑制劑，凝聚蛋白質(zhì)靶抑制劑，血纖蛋白形成抑制劑，纖溶啟動子，抗血管生成藥物，循環(huán)藥物，代謝增強(qiáng)物，抗結(jié)核物，抗病毒物，血管舒張物，抗生素，消炎劑，抗原生動物物，抗風(fēng)濕物，麻醉藥，阿片劑，強(qiáng)心苷，神經(jīng)肌肉阻斷劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，全身麻醉劑或遺傳物質(zhì)。
12.按照權(quán)利要求10的活性劑，其中所說的治療化合物通過二硫化物基團(tuán)與報道物共價偶連或連接。
13.按照權(quán)利要求1的活性劑，其含有偶聯(lián)的聚乙二醇(PEG)元件。
14.按照權(quán)利要求13的活性劑，其含有直接與報道物分子偶聯(lián)的聚乙二醇元件。
15.按照權(quán)利要求13的活性劑，其中PEG元件用作載體和脂之間的間隔基。
16.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中載體分子是血管生成特異性載體。
17.按照權(quán)利要求16的活性劑，其含有與VEGF受體結(jié)合的載體。
18.按照權(quán)利要求16的活性劑，其含有與血管生成因子和其受體的復(fù)合物結(jié)合的載體。
19.按照權(quán)利要求16的活性劑，其中載體結(jié)合于內(nèi)皮素。
20.按照權(quán)利要求16的活性劑，其中載體結(jié)合于整聯(lián)蛋白。
21.按照權(quán)利要求20的活性劑，其中載體是RGD-肽。
22.按照權(quán)利要求20的活性劑，其中載體是非肽RGD類似物。
23.按照權(quán)利要求20的活性劑，其中載體選自結(jié)合于一種或多種如下血管生成靶的載體整合素β1，β3和β5，αvβ3，α6β1，α2β1，αvβ5，α6和α5。
24.按照權(quán)利要求23的活性劑，其中載體結(jié)合于整合素αvβ3。
25.按照權(quán)利要求1的活性劑，其中載體結(jié)合于血栓，即血小板或血纖蛋白。
26.按照權(quán)利要求1的活性劑，其含有結(jié)合于內(nèi)皮肽受體的載體。
27.按照權(quán)利要求1的活性劑，其含有結(jié)合于E-選擇蛋白受體的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一些可導(dǎo)向的診斷和/或治療活性劑(例如超聲造影劑)，這些活性劑具有包含充氣微泡(其由形成膜的表面活性劑單分子層穩(wěn)定化)的報道物，該報道物至少與一種載體相偶連或相連接。
文檔編號A61K49/22GK1440816SQ02160420
公開日2003年9月10日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月28日
發(fā)明者J·卡拉威斯, P·羅格斯德, A·霍斯特, H·托里沙格, A·尼維斯塔德, H·赫里布斯特, L·霍夫, A·庫比特森, D·洛哈格, M·索巴肯 申請人:奈科姆成像有限公司