專利名稱：嵌合的抗cd25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及嵌合的抗CD25單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明的抗體對于移植排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療非常有用。
背景技術(shù)：
目前，器官移植技術(shù)已成為臟器功能衰竭終末期的有效、常規(guī)性治療手段。隨著干細胞的研究的深入，干細胞的移植，以及用干細胞發(fā)育成器官的組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，移植手術(shù)必將迅猛發(fā)展，其市場前景和經(jīng)濟效益無法估量。
但是，器官移植最大的問題是免疫排斥反應(yīng)?；颊咝g(shù)后每年單用于抗排斥反應(yīng)藥物的費用高達1-2萬元。因此，在器官移植，特別是腎、肝、心臟、肺和骨髓移植中，減小免疫系統(tǒng)的移植排斥反應(yīng)是非常必要的。
目前已經(jīng)研制出許多免疫抑制劑，而且在臨床上也獲得了成功，比如包括類固醇、咪唑硫嘌呤和環(huán)孢菌素A。但是它們都必須嚴(yán)格進行控制，以避免產(chǎn)生不必要的副作用。另外還有一個難點，就是免疫抑制作用使移植器官易被細菌或病毒感染，而這類細菌或病毒感染在正常情況下是能夠由個體的免疫系統(tǒng)消除的。
除了使用免疫抑制劑，還可以使用一些單克隆抗體(MAbs)來抑制免疫反應(yīng)，特別是那些可以識別T細胞表面不同抗原的單克隆抗體。這些單克隆抗體通常根據(jù)相應(yīng)的CD數(shù)命名，如CD3的抗體描述為“抗CD3”。但在應(yīng)用于臨床時出現(xiàn)一些問題這些抗體不是作用過強就是不足以產(chǎn)生效果，甚至還可能引發(fā)嚴(yán)重的副作用，比如高燒。
T細胞膜上的抗原(如CD3抗原)的單克隆抗體是非常有應(yīng)用潛力的抗體，它具有全面的免疫系統(tǒng)抑制活性。但是，一旦發(fā)生感染，人體將喪失由記憶T細胞介導(dǎo)的瞬時免疫應(yīng)答，這在治療移植排斥時是不希望出現(xiàn)的情況。一個可預(yù)防上述情況發(fā)生的途徑是保持記憶T細胞的活性，同時使直接涉及排斥反應(yīng)的T細胞失活，從而抑制同種異體排斥反應(yīng)。
另一個途徑是通過T細胞膜表面的高親和力白介素2受體(IL-2R)抑制免疫系統(tǒng)活性。IL-2R高親和力受體包含至少兩條不同的多肽鏈α鏈和β鏈。IL-2R是異多聚體糖蛋白，分子量約為140KD，其中α鏈55kD(p55)，β鏈70-75kD(p75)。
IL-2R的α鏈即CD25抗原，又稱TAC，是活化T淋巴細胞的重要標(biāo)志，并且它是IL-2特異性的，只與IL-2結(jié)合。人IL-2Rα鏈基因位于染色體10p14-15，長度25kB，有7個外顯子，抗CD25單克隆抗體能夠特異性結(jié)合α鏈，從而阻斷IL-2與α鏈的相互作用。
休眠狀態(tài)的T細胞不表達高親和力受體，但是低表達或間歇表達包含α-β鏈同源二聚物的親和受體。CD25抗體能夠干擾IL-2結(jié)合到其高親和受體上，有效地與IL-2競爭，抑制IL-2啟動的T細胞增殖反應(yīng)，從而選擇性地抑制了免疫應(yīng)答，防止了同種異體排斥反應(yīng)。因此，CD25抗體是一種可用于預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)的抗體。
雖然在國內(nèi)外已經(jīng)建立了許多針對CD25抗原的單克隆抗體，但是這些單克隆抗體的特異性及中和能力均不夠理想。
因此，本領(lǐng)域迫切需要建立既能夠保持或提高抗體的親和力和特異性，又能夠降低或基本消除抗體免疫原性的單克隆抗體，從而可以用于臨床治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性的、人鼠嵌合抗CD25單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種所述特異性的、人鼠嵌合抗CD25單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含所述人鼠嵌合抗CD25單克隆抗體的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種單克隆抗體VH鏈，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5或29所示的CDR1，SEQ ID NO6、16或37所示的CDR2，SEQ ID NO7、30、或38所示的CDR3。
較佳地，所述的單克隆抗體VH鏈具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種單克隆抗體VL鏈，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8、33、或41所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，
SEQ ID NO10、34或42所示的CDR3。
較佳地，所述的單克隆抗體VL鏈具有SEQID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種單克隆抗體，其VH鏈具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列；且其VL鏈分別具有SEQ ID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
較佳地，所述的單克隆抗體的Fc區(qū)為人IgG的恒定區(qū)。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的多肽本發(fā)明所述的單克隆抗體VH鏈、單克隆抗體VL鏈或單克隆抗體。較佳地，所述的DNA分子，具有選自下組的DNA序列SEQ ID NO1、3、11、13、27、31、35、和39。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO5或29所示的CDR1，SEQ ID NO6、16或37所示的CDR2，以及SEQ ID NO7、30、或38所示的CDR3；且所述單克隆抗體的VL鏈具有SEQ ID NO8、33、或41所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，以及SEQ ID NO10、34或42所示的CDR3。
較佳地，在所述的藥物組合物中，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列；且其VL鏈分別具有SEQ ID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。


圖1顯示了混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)抑制試驗的結(jié)果。
圖2顯示了抗原特異性HPBM反應(yīng)的抑制試驗的結(jié)果。
圖3顯示了pMG18結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過篩選人源抗體庫，成功獲得了對CD25高特異性的單克隆抗體，并且對抗CD25人源化單克隆抗體基因和抗體可變區(qū)位點進行了獨特的人工設(shè)計，即構(gòu)建全人源的抗體庫，篩選表達量高的抗體，并且將之與人IgGl-Fc相連和人源化，因此該抗體是全人源的。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種嵌合或重組抗CD25人源化單克隆抗體，它包括人源恒區(qū)(如人源恒區(qū)IgGl-Fc)，經(jīng)過人工設(shè)計后的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)具有獨特的不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了嵌合抗CD25單克隆抗體的氨基酸序列及其其可變區(qū)鏈，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。
抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描述，稱為超變區(qū)域(CDR)，將該段間隔成4個框架區(qū)域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的CDR和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了FR或CDR區(qū)域。
此外，最近還發(fā)現(xiàn)由輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的相關(guān)結(jié)構(gòu)，與相應(yīng)的重鏈可變區(qū)相比，其結(jié)合的動力學(xué)比較小，分離的重鏈可變區(qū)域自身具有抗原結(jié)合活性。
此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementarity determiningregion，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有；大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、COS7、293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種治療移植排斥的藥物組合物，它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于預(yù)防和治療移植排斥。本發(fā)明的藥物組合物還可用于治療白癜風(fēng)、免疫調(diào)節(jié)紊亂如自身免疫疾病(包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、某種類型的腸胃炎、紅斑狼瘡等)。此外，還可同時使用其他治療劑，如類固醇、咪唑硫嘌呤和環(huán)孢菌素A等。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的突出優(yōu)點在于本發(fā)明的單克隆抗體的具有很高的親和力且是人源化的抗體。這種高親和力的單克隆抗體在臨床上具有重要的價值。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1抗CD25抗體的克隆篩選1.免疫小鼠采用白癜風(fēng)病人的血清作為免疫原，加入完全佐劑，充分研磨至完全乳化后皮下多點注射10日齡Bal b/c小鼠，每點注射50微升，共6點。然后以1周間隔共5次重復(fù)注射以加強免疫反應(yīng)，并用常規(guī)ELISA方法對血清抗體水平進行監(jiān)測。最后一次靜脈注射100ul血清/PBS混合液，3日后殺死小鼠，取出脾臟。
2.細胞融合常規(guī)方法分離脾臟單細胞，并確定細胞活性大于90％。將脾臟細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞10∶1混合離心共沉淀，在37度水浴鍋中加入PEG(1400MW)進入細胞融合，融合時間為1分鐘、2分鐘、5分鐘和10分鐘。在不同時間點加入新鮮無血清培養(yǎng)基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。離心沉淀后將細胞加入到20％FCS RPM1-1640培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)入96孔板進行培養(yǎng)。24小時后加入選擇培養(yǎng)液，每3天更換新鮮培養(yǎng)基1次，至長出克隆。
3.克隆篩選選擇單克隆形成孔，在第14天取出上清液，用ELISA法測定抗體的表達情況，陽性孔保留，亞克隆3次后選擇3個高表達細胞株。3個克隆生長穩(wěn)定，表達量大于1mg/L，在96孔培養(yǎng)條件下，穩(wěn)定至第5代克隆。
經(jīng)過鑒定，3個克隆的類型為GH0為IgG1；GH1為IgG2a，GH2為IgG1。根據(jù)ELISA的測定結(jié)果，GH0和GH2細胞系的產(chǎn)率最高，可作為基本材料進行嵌合和人源化設(shè)計并進行改造。
實施例2抗CD25抗體基因的克隆1.引物的合成根據(jù)人抗體基因的保守性，設(shè)計并合成以下引物以克隆該單克隆抗體的可變區(qū)編碼序列VL-sense5’-tcctctagacagctgacccagtctcca-3’(SEQ ID NO21)含Xba I位點；VL-antisense5’-gttgctagcccagcttggtacchscdccgaa-3’(SEQ ID NO22)含NheI位點；VH-sense5’-aggaagctttgcagsagtcwgg-3’(SEQ ID NO23)含HindIII位點；VH-anti sense5’-tgacgtacgggtgaccgtggtcccttggccccat-3’(SEQ ID NO24)含BsiWI位點。
上述引物中，H＝A，C或T；S＝C或G；D＝a，g或t；R＝A或G；W＝A或T。
2.總RNA的抽提、純化與反轉(zhuǎn)錄從上述獲得的GH0和GH2高親和力雜交瘤細胞株中抽提純化總RNA，采用Invitrogen公司的Trizol，整個操作工程按照廠家的說明書進行。
上述純化的總RNA在1％瓊脂糖電泳上鑒定質(zhì)量后，采用Pharmacia的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得總RNA的cDNA。
3.小鼠抗人CD25單抗VL和VH基因的獲得以上述引物和cDNA分別進行PCR擴增VL和VH片段。具體條件如下反應(yīng)體系VL(ul) VH(ul)10×PCR反應(yīng)緩沖液 5 5dNTP(10mmol/L) 5 5MgCl2(25mmol/L) 6 6cDNA 10 10有義引物(10umol/L) 5 5反義引物(10umol/L) 5 5Pfu(5U/ul) 1 1加水至 50ul 50ul溫度循環(huán)預(yù)變性94度2分鐘；主循環(huán)94度45秒，55度45秒，70度1分鐘，共30循環(huán)；后延伸70度5分鐘。
上述溫度循環(huán)完成后，將擴增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖電泳上進行鑒定，發(fā)現(xiàn)VL和VH反應(yīng)體系均出現(xiàn)一條分子量約300～350bp的單一條帶。用Promega公司的膠回收試劑盒回收兩種擴增產(chǎn)物后連接于pUC18克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進行藍白斑篩選，再經(jīng)過酶切鑒定，獲得8個陽性克隆。經(jīng)測序驗證，分別確認(rèn)3個克隆為正確克隆。
對上述正確克隆進行DNA測序，獲得GH0和GH2細胞株抗體基因的DNA序列和推測的氨基酸序列如下對于GH0細胞株而言，SEQ ID NO1和SEQ ID NO3分別是其CD25單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列；SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分別是根據(jù)上述DNA編碼序列推測的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQ IDNO5-7分別為重鏈的CDR1、CDR2和CDR3。SEQ ID NO8-10分別為輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。
對于GH2細胞株而言，SEQ ID NO11和SEQ ID NO13分別是其CD25單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列；SEQ ID NO12和SEQ ID NO14分別是根據(jù)上述DNA編碼序列推測的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQID NO15-17分別為重鏈的CDR1、CDR2和CDR3。SEQ ID NO18-20分別為輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。
序列(相應(yīng)位置) SEQ ID NO鼠GH0重鏈 CDR1RYWMH(31-35) 5(SEQ ID NO1和2) CDR2AIYPGNSDTSYNQKFEG(50-66) 6CDR3DYGYYFDF(99-106) 7鼠GH0輕鏈 CDR1SASSSISYMQ(24-33)8(SEQ ID NO3和4) CDR2DTSKLAS(49-55) 9CDR3HQRSSYT(88-94) 10鼠GH2重鏈 CDR1RYWMH15(SEQ ID NO11和12)CDR2AIYPGNTDTSYNQKFEG16CDR3DYGYYFDF 17鼠GH2輕鏈 CDR1SASSSISYMQ(24-33)18(SEQ ID NO13和14)CDR2DTSKLLS(49-55) 19CDR3HQRSSYT(88-94) 20值得注意的是，兩種抗體的重鏈和輕鏈CDR1和CDR3是相同的，即SEQ ID NO5＝SEQ ID NO15，SEQ ID NO7＝SEQ ID NO17，SEQ ID NO8＝SEQ ID NO18，SEQ IDNO10＝SEQ ID NO20。
實施例3嵌合基因表達載體的構(gòu)建通過以下過程，分別將上述測序驗證過的GH0和GH2的VH和VL基因克隆到pMG18載體上，使兩個基因與相應(yīng)的恒定區(qū)構(gòu)成全長的抗體重鏈和輕鏈基因。
1.在重鏈可變區(qū)基因的5’-端加上Xba I，3’-端加上Nhe I切點；2.在輕鏈可變區(qū)基因的5’-端加上Hind III和EcoR I切點；3.用Xba I和Nhe I、Hind III和Bsi WI分別對重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆進行酶切并對酶切片段進行1％瓊脂糖電泳純化。然后，分別克隆到pMG18載體的XbaI/Nhe I位點和Hind III/Bsi WI位點。
pMG18結(jié)構(gòu)見圖3。圖中，Ck表示抗體kappa輕鏈的恒定區(qū)基因；IgG1恒定區(qū)表示人抗體IgG1的重鏈恒定區(qū)基因；pA表示SV40加poly A位點。
通過上述操作，獲得了GH0VH/VL-Fc融合基因和GH2VH/VL-Fc融合基因表達載體。經(jīng)過酶切鑒定，獲得的是完全正確的克隆。將上述兩個克隆送上?；倒具M行DNA測序。驗證全序列是正確的。
嵌合的鼠輕鏈-人Fc的編碼序列如SEQ ID NO25所示。
嵌合的鼠重鏈-人Fc的編碼序列如SEQ ID NO26所示。
實施例4VL和VH基因的人源化參照已經(jīng)發(fā)表的方法將上述克隆的鼠源抗體基因的VL和VH編碼區(qū)進行人源化設(shè)計，將整個基因分成6套長度為28～85的寡核苷酸片段，在每個寡核苷酸的兩端各有8～9個與模板互補良好的重疊區(qū)域。將上述各套寡核苷酸分別與模板進行變性和復(fù)性后用T4 DNA連接酶進行連接，然后用T7 DNA聚合酶進行延伸，用T4 DNA連接酶再次連接。最后用Dpn I將上述的雜合分子進行消化，除去模板DNA后用突變鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。經(jīng)過酶切篩選和測序后篩選出序列正確的克隆。[參照文獻humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3.HumAntibod Hybridoma，1994，5(1，2)41]。上述人源化基因的基因如同嵌合基因一樣，克隆至表達載體并進行酶切鑒定。
序列(相應(yīng)位置)SEQ ID NO人源化的GH0重鏈 CDR1 RYAMH(31-35)29(SEQ ID NO27和28) CDR2 AIYPGNSDTSYNQKFEG(50-66)6CDR3 DYGYAFDF(99-106)30人源化的GH0輕鏈 CDR1 SASSSISAMQ(24-33) 33(SEQ ID NO31和32) CDR2 DTSKLAS(49-55) 9CDR3 HQASSYT(88-94) 34人源化GH2重鏈 CDR1 RYWMH 5(SEQ ID NO35和36) CDR2 AIYPGNTDTSYNQKAEG 37CDR3 DYGAAFDF38人源化GH2輕鏈 CDR1 SASSSISAMQ(24-33) 41(SEQ ID NO39和40) CDR2 DTSKLLS(49-55) 19CDR3 HQRSSAT(88-94) 42實施例5重組單克隆抗體細胞株的構(gòu)建接著將上述構(gòu)建的含有嵌合和人源化抗體基因的表達載體在大腸桿菌DH5α菌株接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進行擴增，用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CH0細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉(zhuǎn)化的CH0細胞在選擇培養(yǎng)基上進行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進行極度稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進行3次，進行單克隆化。通過上述操作獲得了兩個嵌合抗體細胞株cGH0和cGH4。
挑出的單克隆細胞系在RPM1641培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對上清進行WesternBlotting實驗，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的表達重組單克隆抗體的細胞株具有明顯較高的表達強度，分別表達人鼠嵌合抗體，分子量約150KDa。
實施例6重組單克隆抗體的純化采用硫酸銨沉淀法進行純化，將上面得到的表達重組單克隆抗體的細胞的培養(yǎng)上清過濾，經(jīng)過簡單離心，除去細胞殘片后即可直接進行親和層析。用protein A親和層析。先在protein A柱按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后，在4度慢速攪拌24小時。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4緩沖液中漂洗4次后，用含250mM氯化鈉的同樣緩沖液洗脫后進行硫酸銨分步沉淀，起始濃度為35％飽和度，終止?jié)舛?3％飽和度。4度處理12小時后高速離心，取沉淀，重新溶于上述不含氯化鈉的緩沖液中，并于同樣緩沖液透析過夜后濃縮10倍，待用。
上述步驟獲得的純化單抗用SDS-PAGE檢定純度，F(xiàn)ollin酚法定量蛋白質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其純度達到了90％以上，并保留了高的生物活性。
實施例7嵌合抗體的生理活性試驗1.特異性熒光染色(競爭試驗)用實施例6中獲得的細胞株純化的抗體對T淋巴細胞進行染色，發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞可以被特異性染色，而對照細胞(成纖細胞，CD25陰性)株對染色無反應(yīng)。嵌合抗體與陽性對照具有競爭性，說明它們結(jié)合的是同一個抗原決定簇。
2.沉淀實驗檢測將獲得的單克隆抗體進行Western Blotting試驗，以Simulect為對照。結(jié)果表明，4種抗體(即鼠源GH0VH/VL-人Fc嵌合抗體，鼠源GH2VH/VL-人Fc嵌合抗體，人源化GH0VH/VL-人Fc抗體，和人源化GH2VH/VL-人Fc抗體)，與對照Simulect一樣，可以與CD25蛋白發(fā)生特異性沉淀和結(jié)合。
3.混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)抑制試驗用常規(guī)方法分離人外周血淋巴細胞(HPBM)，調(diào)整細胞密度為1_106細胞/毫升。加入不同濃度的純化抗體，濃度范圍從0到300ng/ml。然后將每一樣品與100ul HLA不相容性X照射的HPBM混合。將混合物在37℃下放置6天，然后加入終濃度為0.02uCi/ml的3H-TdR。6小時后通過放射性測定來確定細胞的增殖情況。
結(jié)果見圖1，樣品在低濃度(0.5ng/ml)就顯示了體外免疫調(diào)節(jié)活性，而在樣品濃度為4ng/ml時，50％細胞的生長受到了抑制。
4.抗原特異性HPBM反應(yīng)的抑制本發(fā)明的抗體能夠有效的抑制結(jié)合菌素(PPD)特異性的、HLA II限制性的T細胞反應(yīng)的產(chǎn)生，也即具有抑制內(nèi)源性IL-2與其受體結(jié)合的能力。
準(zhǔn)備細胞濃度為106細胞/mlHPBM樣品，加入不同濃度的純化抗體，濃度范圍從0到300ng/ml，加入終濃度為30ug/ml的PPD。將混合樣品在37℃下放置6天，然后加入終濃度為0.02uCi/ml的3H-TdR，6小時后通過放射性測定來確定細胞的增殖情況。
結(jié)果見圖2所示。被測抗體從8ng/ml濃度時開始顯示出免疫調(diào)節(jié)活性，約在40ng/ml時50％細胞的生長受到了抑制。這說明該CD25抗體具有調(diào)節(jié)免疫活性的功能，因此有可能用于免疫功能紊亂相關(guān)的疾病，也有可能用于需要抑制免疫功能的臨床治療方案，如器官抑制。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體明顯具有與CD25結(jié)合的能力。由于CD25在白癜風(fēng)病人中具有異常表達，因此施用該上述這些單克隆抗體有可能治療這種疾病。
5.小鼠器官移植試驗正常昆明種小白鼠，不分性別，每組12只。其中6只為受體，6只為供體進行心臟移植。將上述抗體用于小鼠心臟抑制試驗，該試驗的結(jié)果如下表所示，表明可以明顯提高受試動物的存活率和平均存活天數(shù)。

其中，抗體為0＝陰性對照抗人CD20單抗，1＝鼠源GH0VH/VL-人Fc嵌合抗體，2＝鼠源GH2VH/VL-人Fc嵌合抗體，3＝人源化GH0VH/VL-人Fc抗體，4＝人源化GH2VH/VL-人Fc抗體。
從上述實驗中可以看出，鼠源和人源化的抗人CD25單克隆抗體都能顯著提高器官移植受體的30日存活率和平均存活天數(shù)。
此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>馬，菁<120>抗CD25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用<130>027426<160>42<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(351)<223>抗CD25抗體重鏈的編碼序列<400>1gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggctaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60tcctgcaagg cttctggcta cagctttacc aggtactgga tgcactggat aaaacagagg 120cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatagtga tactagttac 180aaccagaagt tcgagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240atggagctca gcagcctgac acatgaggac tctgcggtct attactgttc aagagactac 300ggctactact ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351<210>2<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(117)<223>抗CD25抗體重鏈的氨基酸序列<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr20 25 30Trp Met His Trp Ile tys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Leu Thr Val Ser Ser115<210>3<211>312<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(312)<223>抗CD25抗體輕鏈的編碼序列<400>3caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatgcagt ggtaccagca gaagccaggc 120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240gatgctgcca cttattactg ccatcagcgg agtagttaca cgttcggagg ggggaccaaa 300ctggaaataa aa 312<210>4<21l>104<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(104)<223>抗CD25抗體輕鏈的氨基酸序列<400>4Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met20 25 30Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
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ggctactact tcgacttctg gggcctgcag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc 354<210>12<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
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ctggagatca ag 312<210>14<211>104<212>PRT<213>人工序列<220>
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tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300agcttcaaca ggggagagtg ttgacaaatt gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct 360gcatctccag gggagaaggt caccatgacc tgcagtgcca gctcaagtat aagtgctatg 420cagtggtacc agcagaagcc aggcacctcc cccaaaagat ggatttatga cacatccaaa 480ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttattctctc 540acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccatca ggccagtagt 600tacacgttcg gaggggggac caaactggaa ataaaa 636<210>26<211>1344<212>DNA<213>人工序列<220>
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met20 25 30Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ala Ser Ser Tyr Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(10)<223>CDR1<400>33Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met Gln1 5 10<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(7)<223>CDR3<400>34His Gln Ala Ser Ser Tyr Thr1 5<210>35<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(354)<223>人源化GH2的重鏈編碼序列
<400>35gaggtgcagc tgcagcagtc cgagaccgtg ctggcccgcc ccggcgcctc cgtgaagatg 60tcctgcaagg cctccgacta ctccttcacc cgctactgga tgcactggat caagcagcgc 120cccggccagg gcctggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacaccga cacctcctac 180aaccagaagg ctgagggcaa ggccaagctg accgccgtga cctccgcctc caccgcctac 240atggagctgt cctccctgac ccacggcgac tccgccgtgt actactgctc ccgcgactac 300ggcgcagcat tcgacttctg gggcctgcag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc 354<210>36<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(118)<223>人源化GH2的重鏈<400>36Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr20 25 30Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ala50 55 60Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asp Tyr Gly Ala Ala Phe Asp Phe Trp Gly Leu Gln Gly Thr100 105 110Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>37<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(17)<223>CDR2
<400>37Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ala Glu1 5 10 15Gly<210>38<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(8)<223>CDR3<400>38Asp Tyr Gly Ala Ala Phe Asp Phe1 5<210>39<211>312<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(312)<223>人源化GH2的輕鏈編碼序列<400>39cagatcgtgc tgacccagtc ccccgccatc atgtccgcct cccccggcga gaaggtgacc 60atgacctgct ccgcctcctc ctccatctcc gccatgcagt ggtaccagca gaagcccggc 120acctccccca agcgctggat ctacgacacc tccaagctgc tgtccggcgt gcccgcccgc 180ttctccggct ccggctccgg cacctcctac tccctgacca tctcctccat ggaggccgag 240gacgccgcca cctactactg ccaccagcgc tcctcctaca ccttcggcgc cggctccaag 300ctggagatca ag 312<210>40<211>104<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(104)<223>人源化GH2輕鏈<400>40Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met20 25 30Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Leu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Clu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Ala Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys100<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(10)<223>CDR1<400>41Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met Gln1 5 10<210>42<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(7)<223>CDR3<400>42His Gln Arg Ser Ser Ala Thr1 權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體VH鏈，其特征在于，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5或29所示的CDR1，SEQ ID NO6、16或37所示的CDR2，SEQ ID NO7、30、或38所示的CDR3。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈，其特征在于，它具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列。
3.一種單克隆抗體VL鏈，其特征在于，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8、33、或41所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，SEQ ID NO10、34或42所示的CDR3。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體VL鏈，其特征在于，它具有SEQ ID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
5.一種單克隆抗體，其特征在于，其VH鏈具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列；且其VL鏈分別具有SEQ ID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于，其Fc區(qū)為人IgG的恒定區(qū)。
7.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的多肽權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈；權(quán)利要求3所述的單克隆抗體VL鏈；權(quán)利要求5所述的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列SEQID NO1、3、11、13、27、31、35、和39。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO5或29所示的CDR1，SEQ ID NO6、16或37所示的CDR2，以及SEQ ID NO7、30、或38所示的CDR3；且所述單克隆抗體的VL鏈具有SEQ ID NO8、33、或41所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，以及SEQ ID NO10、34或42所示的CDR3。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO2、12、28、或36所示的氨基酸序列；且其VL鏈分別具有SEQ ID NO4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了嵌合的抗CD25單克隆抗體。該單克隆抗體穩(wěn)定性好、特異性強，特別適用于預(yù)防和治療移植排斥反應(yīng)。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體的制備方法以及含有所述單克隆抗體的藥物組合物。
文檔編號A61P37/06GK1506376SQ0215124
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者馬菁, 馬 菁 申請人:馬菁, 馬 菁