專利名稱：用凝血酶派生的肽的治療方法
政府的支持本發(fā)明整體或部分得到了國家健康研究院的R43 HL64508項撥款的資助。該政府部門在本發(fā)明中有一定的權(quán)利。相關(guān)的申請本申請要求保護(hù)2000，7月12日遞交的美國臨時申請?zhí)?0/217,583的權(quán)益，該申請的全部內(nèi)容都通過在此引述而合并于本文。
凝血酶也可以在細(xì)胞從血液到損傷位點(diǎn)的正常的換管術(shù)和遷移和與腫瘤相關(guān)的異常的轉(zhuǎn)移和血管生成中起作用。凝血酶增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和改變血管的屏障作用的能力可能對組織損傷位點(diǎn)的血管生成和炎癥有作用。
對于這一有劇烈作用和中和作用的凝血酶和/或凝血酶受體的活性，如在創(chuàng)傷的治療中，本發(fā)明人已經(jīng)敘述了凝血酶的派生肽。如美國專利號5,500,412或5,352,664，它們的全部內(nèi)容都通過在此引述而合并于本文。但是，該專利沒有涉及凝血酶派生肽在受損傷的心臟組織的治療中，換管術(shù)或血管閉塞和再狹窄的抑制中的新用途。
該肽可以優(yōu)選地在心臟外科的過程中或以后給藥，例如，作為可溶的肽或維持釋放的配方直接或通過導(dǎo)管介導(dǎo)注射進(jìn)受損傷的或局部缺血的心臟組織中。
本發(fā)明也涉及刺激換管術(shù)或血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一個方法，包括對心臟組織給藥治療有效量的血管生成凝血酶派生的肽，如本文所述。
本發(fā)明也涉及防止血管閉塞或再狹窄的一個方法，包括例如通過系統(tǒng)注射對血管給藥治療有效量的血管生成凝血酶受體，通過導(dǎo)管或通過將肽附著于stent來將該肽遞送到血管的損傷位點(diǎn)。
圖2是顯示提高濃度的TP508刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞在塑料上的遷移。該圖顯示了在給藥各種濃度的TP508(表示成ug/ml)后，細(xì)胞的遷移距離。
圖3是顯示在豬的心臟缺血模型中，TP508處理的和對照豬的心臟功能的變化。
本發(fā)明的詳細(xì)說明通常，心血管疾病的特征是血液到心臟或其他靶器官的供應(yīng)有障礙。心臟中的狹窄或封閉的冠狀動脈使心臟缺少需要的營養(yǎng)和氧氣導(dǎo)致心肌梗死(MI)。當(dāng)血液對心臟的供應(yīng)受損，細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生誘導(dǎo)新的血管生長以致增強(qiáng)血液對心臟的供應(yīng)的化合物。這些新的血管稱為側(cè)突血管。誘導(dǎo)現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)長出新的血管的方法稱為血管生成術(shù)，細(xì)胞為誘導(dǎo)血管生成而生產(chǎn)的物質(zhì)是血管生成因子。當(dāng)心臟肌肉由于血管閉塞而缺氧氣和營養(yǎng)時，心臟肌肉組織變成局部缺血并且失去了它收縮和發(fā)揮作用的能力。這一功能的丟失可以通過來自缺血的心臟肌肉的天然信號來恢復(fù)，這些信號通過繞過閉塞的側(cè)突血管的發(fā)育誘導(dǎo)了血管生成的換管過程。這一換血管過程或血管生成過程包括刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和新的血管的遷移和萌芽。但是，在許多情況中，天然的信號不足以引起側(cè)突血管的生長，并且缺血的組織可能變成纖維化或壞死。如果這一過程不通過打開閉塞的血管的方法或進(jìn)一步誘導(dǎo)側(cè)突血管來逆轉(zhuǎn)，那么心臟可能變成完全喪失功能而需要移植。
本文所述的肽可以用于誘導(dǎo)血管生成性的增殖和導(dǎo)致形成新的毛細(xì)血管和側(cè)突血管的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，輔助恢復(fù)損壞或缺血的心臟組織的功能。這些肽可以優(yōu)選地在開胸手術(shù)中注射進(jìn)或應(yīng)用于心臟組織以回避外科或插入心室輔助裝置，或通過導(dǎo)管注射，作為可溶肽或以持續(xù)釋放的配方遞送進(jìn)心臟。
如血管生成中發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖也可用于氣球血管成形術(shù)后防止或抑制再狹窄。氣球成形術(shù)方法經(jīng)常損傷內(nèi)皮細(xì)胞襯里血管的內(nèi)壁和破壞血管壁的完整性。平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞經(jīng)常滲入損傷的血管，在已知為再狹窄的過程中引起二次阻塞。為了用新的內(nèi)皮細(xì)胞單層覆蓋血管的腔表面，內(nèi)皮細(xì)胞在氣球誘導(dǎo)的損傷區(qū)的周圍的增殖和遷移刺激將潛在地恢復(fù)血管的原始結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，內(nèi)皮化包括在成形術(shù)后再內(nèi)皮化，降低，抑制或防止再狹窄。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，用本發(fā)明的方法治療的患者可以用或不用stent治療。
用包衣氣球的肽的可膨脹的氣球?qū)Ч芑蛑苯幼⑸潆牡窖鼙诘膶?dǎo)管也可以用于將物質(zhì)遞送到靶動脈。
氣球成形術(shù)是局部缺血的心臟病的普通治療方法，包括在凝血的血管中膨脹氣球，以打開閉塞的血管。不幸的是，這一治療方法導(dǎo)致了襯里血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，經(jīng)常導(dǎo)致再狹窄。本文所述的肽可以用于誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在氣球誘導(dǎo)的損傷區(qū)的周圍的增殖和遷移，從而用新的內(nèi)皮細(xì)胞單層覆蓋血管的腔表面，可望恢復(fù)血管的原初結(jié)構(gòu)。冠狀動脈成形術(shù)經(jīng)常用展開一個血管內(nèi)的stent來輔助，以維持血管的功能和避免再狹窄。Stent已經(jīng)用肝素包衣，防止發(fā)生凝血直到可以進(jìn)行內(nèi)皮化的stent形成新的通道。本文所述的肽可以直接應(yīng)用于stent，利用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些肽可以局部地應(yīng)用或系統(tǒng)地給藥，以增強(qiáng)血管或血管壁的內(nèi)皮化和/或調(diào)節(jié)其他過程抑制或降低凝血的發(fā)生和再狹窄。
本發(fā)明優(yōu)選地利用了凝血酶受體調(diào)節(jié)的事件中的合成的或天然起源的多肽激動劑。這兩類試劑具有凝血酶受體結(jié)合區(qū)，其中包括能夠選擇性地結(jié)合高親和性的凝血酶受體的多肽的一部分。多肽的這一部分包括與纖維結(jié)合素的三肽細(xì)胞結(jié)合區(qū)同源的氨基酸序列。
除了凝血酶受體結(jié)合區(qū)，刺激性的(激動劑性的)多肽具有的一個氨基酸序列具有從前面已經(jīng)顯示在絲氨酸蛋白酶中高度保守的十二肽的N末端氨基酸派生的序列。但是，抑制性的肽不包括這些絲氨酸酯酶保守序列。
例如，本發(fā)明提供了許多用于促進(jìn)心臟組織修復(fù)的多肽。對于這樣的應(yīng)用，本發(fā)明提供了一個凝血酶的多肽衍生物(或這樣的衍生物的功能等當(dāng)物)，它具有一個凝血酶受體結(jié)合區(qū)以及一個有一個至少12個氨基酸的絲氨酸酯酶保守序列的區(qū)域。本發(fā)明也提供了一個至少23個L-氨基酸的多肽化合物，它具有一個凝血酶受體結(jié)合區(qū)和有一個絲氨酸酯酶保守氨基酸序列的區(qū)域。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有特異的氨基酸序列的幾個多肽，如這樣一個多肽化合物，其中凝血酶受體結(jié)合區(qū)包括L氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO1)以及絲氨酸酯酶保守氨基酸序列Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO2)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽化合物包括L-氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO3)。
本發(fā)明也提供了一個促進(jìn)組織修復(fù)的藥物組合物，它包括治療有效濃度的任何上面所述的化合物和藥物學(xué)可接受的賦形劑。通常，這樣的組合物例如包括，足夠濃度的多肽，以便對凝血酶受體產(chǎn)生刺激作用，如本文所證明的。所以，這樣的組合物通常應(yīng)該包括足夠的濃度，以便在靶位點(diǎn)獲得如體外所示的刺激受體的多肽水平。當(dāng)內(nèi)源性的次級信號的水平確認(rèn)是不恰當(dāng)?shù)?，可以利用多種組合物，其中進(jìn)一步包括加入治療有效濃度的VEGF，α凝血酶，γ凝血酶或其他生長因子。這樣的結(jié)合可以發(fā)揮一個附加的或協(xié)同作用的效果。在一些情況中，如果組織的損傷范圍并不廣泛，細(xì)胞能夠應(yīng)答不是足量存在的多肽，那么可以期望，應(yīng)答細(xì)胞可以同時注射以提供一個治療上的有效的結(jié)合使用方法。
適當(dāng)?shù)妮d體也提供用于在靶位點(diǎn)釋放活性成分，優(yōu)選地在靶位點(diǎn)，在一段時間內(nèi)漫速地持續(xù)地釋放。許多合成性的可生物降解的多聚體可以作為具有持續(xù)釋放特征的載體。這些多聚體的例子包括聚α羥基酯，如聚乳酸/聚乙醇酸同聚物和共聚物，polyphosphazenes(PPHOS)，聚酸酐和聚(丙烯富馬酸)。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同和共聚物是本領(lǐng)域已知的持續(xù)釋放的載體。釋放的速度可以通過技術(shù)人員改變聚乳酸和聚乙醇酸的比例和多聚體的分子量來調(diào)整(參見Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，該文獻(xiàn)全文都通過在此引述而合并于本文。聚(乙二醇)摻入多聚體中作為一個混合體形成微顆粒載體，能允許進(jìn)一步減弱活性成分的釋放過程(參見Cleek et al.，控制釋放雜志48259(1997)，該文獻(xiàn)全文都通過在此引述而合并于本文。PGLA微顆粒經(jīng)常與聚合凝膠或膠原混合，防止凝集，和制造適于直接注射的微顆粒。
PPHOS多聚物交替的氮和磷，在多聚體骨架中沒有碳，如下面的結(jié)構(gòu)式(I)所示
該多聚物的特性可以適當(dāng)改變與多聚體主鏈結(jié)合的側(cè)面基團(tuán)R和R’來調(diào)節(jié)。例如，PPHOS的降解和通過它釋放藥物可以通過改變對水解不穩(wěn)定的側(cè)面基團(tuán)的量來控制。在摻入更多的咪唑或乙基酐氨酸取代的PPHOS，可以觀察到降解速度的增大(參見Laurencin et al.，J Biomed Mater.Res.27963(1993)，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都通過在此引述而合并于本文)，從而增大了藥物釋放的速度。
結(jié)構(gòu)式(II)所示的聚酸酐已經(jīng)明確具有可降解和釋放的特性，這些特性可以通過改變疏水或親水單體如葵二酸和1，3-二(p-羧基酚氧基)丙烷的量來控制(參見Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，該文獻(xiàn)全文都通過在此引述而合并于本文)。 聚(丙烯富馬酸)(PPF)是非常如人所愿的可生物兼容的可植入載體，因為它們是可注射的，可原位聚合的，可生物降解的物質(zhì)?！翱勺⑸洹笔侵缚梢酝ㄟ^用于注射漿液和凝膠的標(biāo)準(zhǔn)針頭的針筒來注射。PPF，帶有乙烯基單體(N-乙烯基單吡咯烷酮)和起始物(芐基過氧物)，形成可以原位聚合的可注射溶液(參見Sugge et al.，大分子304318(1997)，Peter et al.，J.Biomater.Sci.Poly，.Ed.10363(1999)和Yaszemski et al.，Tissue Eng.141(1995)，該文獻(xiàn)全部都通過在此引述而合并于本文)。
如本文所用，一個治療上的有效濃度定義為在修復(fù)或血管生成的速度中提供滿意的增加或提供滿意地降低或抑制再狹窄或血管閉塞的特定試劑的濃度。另外，這樣的濃度確認(rèn)是對應(yīng)于足以引發(fā)在體外刺激高親和力的凝血酶受體的水平。但是，可以相信，當(dāng)刺激(激動劑性)多肽以0.1uM到10uM的濃度存在時，這些組合物是最有效的。
對于本發(fā)明的目的，凝血酶衍生物確定是具有至少部分從體內(nèi)或體外合成的凝血酶派生的氨基酸序列的任何分子。因此，如本文定義，凝血酶衍生物是含有比凝血酶更少的氨基酸的多肽分子。
凝血酶衍生物的生理功能等當(dāng)物包括與凝血酶衍生物不同的，特別是不影響凝血酶受體結(jié)合區(qū)或絲氨酸酯酶保守氨基酸序列的功能的分子。這樣的特殊性包括，但不限于保守氨基酸取代和修飾，例如羧基末端的酰胺化，氨基末端的乙?；嚯呐c生理惰性載體分子的結(jié)合，或根據(jù)絲氨酸酯酶保守序列的序列變化。
凝血酶受體結(jié)合區(qū)被確定為直接結(jié)合凝血酶受體和/或在高親和性凝血酶受體和α凝血酶之間競爭性抑制的多肽序列。
具有絲氨酸酯酶保守序列的區(qū)域包括至少含有前面所示在絲氨酸蛋白酶中是高度保守的十二肽的4-12個N-末端氨基酸的多肽序列(Asp-X1-Cys-X2-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X3-Val-SEQ ID NO4)；其中X1是Ala或Ser；X2是Glu或Gln；和X3是Phe，Met，Leu，His，或Val)。
刺激性的多肽確定為凝血酶的多肽衍生物，或其生理功能等當(dāng)物，具有結(jié)合和刺激凝血酶受體的能力。所以，刺激性肽將包括凝血酶受體結(jié)合區(qū)和具有絲氨酸酯酶保守氨基酸序列的區(qū)域。
本發(fā)明是通過下面的實(shí)施例來進(jìn)一步說明的，但這些實(shí)施例不以任何方式作為限制范圍。示例實(shí)施例1 TP508刺激了體外的人內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移為了確定TP508是否誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從Clonetic購買人的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在組織培養(yǎng)級塑料上，在24孔的培養(yǎng)盤中鋪開，處于血清饑餓狀態(tài)24小時。在有或沒有TP508的培養(yǎng)基中刺激細(xì)胞48小時，在這個時間內(nèi)，用直接的細(xì)胞計數(shù)評估增殖。如

圖1所示，TP508刺激了在培養(yǎng)基中單獨(dú)處理(1.0ug/mlTP508)的那些的30到50％的微管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。這一效果似乎是具有特異性的，因為從小鼠動脈分離的平滑肌細(xì)胞的生長是不受TP508的影響的。
利用體外單層創(chuàng)傷實(shí)驗評估TP508對人內(nèi)皮細(xì)胞的遷移的影響，其中將內(nèi)皮細(xì)胞平鋪在35mm的培養(yǎng)基盤上，并且允許生長3天，到接近融合的程度，這時，用橡皮擦在盤的中央除去一條細(xì)胞帶開“損傷”單層。在這點(diǎn)上拍照，然后，用新鮮的培養(yǎng)基單獨(dú)或含有各種濃度的TP508的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，允許再生長48小時。再對細(xì)胞拍照，測量內(nèi)皮細(xì)胞遷移進(jìn)損傷區(qū)域的距離。如圖2所示，甚至當(dāng)細(xì)胞在塑料上單獨(dú)培養(yǎng)時，TP508也刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
這些研究證明，TP508對人內(nèi)皮細(xì)胞有生成血管的效果，導(dǎo)致體外的增殖和遷移提升。其他研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞與TP508的接觸具有保護(hù)作用，能夠防止氧化接觸引起細(xì)胞的死亡。這一保護(hù)效果也對再內(nèi)皮化和血管生成的過程有作用。
實(shí)施例2 TP508在體外刺激尿囊絨膜模型中的血管生成在大鼠的背部的完全的皮外科切入和開放的外切創(chuàng)傷的研究顯示單個地局部應(yīng)用TP508刺激換血管過程和跨越外科切入點(diǎn)的血管的開放。在小鼠的背上做了兩個外科的切入創(chuàng)傷點(diǎn)。一個創(chuàng)傷電用單獨(dú)應(yīng)用TP508(0.1ug)來處理，另一個不處理。血管就吸引到已處理的創(chuàng)傷點(diǎn)而不是對照上。
在放置于小雞胚胎的尿囊絨膜上的瓊脂盤中加入TP508導(dǎo)致血管中又向外生成血管。
實(shí)施例3 TP508顯示在豬模型中處理心肌缺血時有效果Yucatan小豬在它們的左旋動脈附近放置了彎曲形狀的ameroid咬合器。Ameroid吸水一定的時間，引起血管收縮。在收縮加強(qiáng)的成形術(shù)外科后4星期，證明有閉塞。這時，再打開每個動物的胸，然后，用懸浮于Pluronic凝膠中的TP508的慢釋放配方，即含有TP508的PGLA微球體注射缺血的區(qū)域。PLGA微球體是如實(shí)施例6所述制備的，給出了最初的突發(fā)的藥物的釋放(在24小時中釋放50％的加載量)，然后展示了另外3-4天內(nèi)的控制釋放，這時，80％的加載量已經(jīng)釋放。利用的凝膠是在0.9％的鹽中的30％w/v Pluronic F68。在每微升的凝膠中，在冰上可以降低黏度，在注射之前可以立即加入3.3mg的PLGA微球體。這樣得到了凝膠中100ug/ml的劑量，在缺血的區(qū)域中注射進(jìn)10個位點(diǎn)(100ul/位點(diǎn))。對照接受了沒有TP508的Pluronic凝膠中的PLGA微球體。得到了基準(zhǔn)的，處理后的血管造形片和超聲波心動描述法。
心肌壁厚度和心臟射血部分的指標(biāo)顯示的趨勢是TP508處理的動物耐受多巴丁胺誘導(dǎo)的脅迫比對照更好。在3個星期后，用收縮增強(qiáng)的超聲波心動圖譜評價動物。這一有限數(shù)目的動物的最初的結(jié)果證明，TP508處理的動物在多巴丁胺的脅迫下在射血部分具有比對照稍微更大的增加和更好維持的壁厚度。所以，這一處理似乎能幫助恢復(fù)缺血的心臟肌肉的功能。
實(shí)施例4在兔子模型中TP508刺激心肌的換血管過程將配制成持續(xù)釋放的PLGA微球體的TP508注射進(jìn)缺血的兔子心肌中。將ameroid咬合器放置于兩個兔子的A-V溝后面的左邊的大的冠狀動脈的后側(cè)的分支上。如Operschall et al.，J.Appl.Physiol.881438(2000)中有敘述。在放置后的兩個星期后，再打開動物的胸。在一個動物中，將pluronic凝膠中的TP508微球體(如實(shí)施例3所述)注射進(jìn)閉塞的血管作用的區(qū)域內(nèi)和周圍的8個不連續(xù)的位置中。另一個動物可作為未處理對照。大約在注射后4個星期，將動物殺死，在10％的緩沖富爾馬林中將它們的心臟固定24小時。然后，在感興趣的區(qū)域切開心臟，用蘇木精曙紅染色，并且對Von Willebrand因子(vWF)，一個內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行免疫標(biāo)記。
組織學(xué)證明，在咬合器作用的區(qū)域中，對照動物有明顯的纖維質(zhì)生成。在另一方面，TP508處理的心臟具有健康表現(xiàn)的心肌，其中具有更大數(shù)目的功能毛細(xì)血管，具有明顯的紅細(xì)胞。
實(shí)施例5在血膽固醇過多的兔子模型中TP508抑制再狹窄將這一方法設(shè)計成提供一個在血膽固醇過多的新西蘭白兔的血管成形術(shù)后，測試試驗樣品抑制新內(nèi)膜的形成和血管閉塞的效率的系統(tǒng)。給動物飼喂含有0.5％膽固醇和2.0％花生油的高脂肪食物3個星期。在進(jìn)行外科手術(shù)之前將動物預(yù)處理24小時，用所述的氣球成形術(shù)損傷骼骨的動脈；用TP-508處理動物7天。用高脂肪食物喂養(yǎng)動物4星期。在氣球成形術(shù)之前和在實(shí)驗結(jié)束時進(jìn)行成形照相。收集損傷的和未損傷的骼骨動脈，制備組織學(xué)樣本。對該腔，新內(nèi)膜(如果存在)，和膜介質(zhì)進(jìn)行形態(tài)測定法測量。
在無菌的，無焦精的鹽水中溶解/稀釋TP508的試驗樣品到需要的濃度，并且在外科手術(shù)之前一天，外科手術(shù)的那天，和外科手術(shù)后的6個連續(xù)的日子中用0.2ml體積的靜脈內(nèi)注射給藥。
做5cm的中線頸切入，暴露右邊的頸動脈，貼近連接和切入。然后，在動脈中導(dǎo)入4Fr Berman氣球成形術(shù)導(dǎo)管。在動脈中通過4Fr的Berman氣球成形術(shù)導(dǎo)管導(dǎo)入5Fr的套。收集3ml的血液用于膽固醇計量。然后，用肝素注射兔子，如果需要注射更多的麻醉劑。為了觀察骼骨動脈，通過導(dǎo)管注射6毫升與4毫升無菌鹽水混合的76％的Hypaque。對骼骨動脈成象(用格柵標(biāo)記圖象，剪刀放在右側(cè))。從套中除去4Fr的Berman氣球成形術(shù)導(dǎo)管。然后，通過套，在動脈中插入0.014”/3.0mm X20.0mm/120cm的氣球?qū)Ч?，并且到達(dá)骼骨動脈。在10ATM膨脹氣球3次，各30秒，間隔1分鐘。然后，除去導(dǎo)管和套。將右邊的頸動脈與3.0的絲縫線連接。用PDS閉合頸的切口，縫合皮膚，抹上抗生素油膏。
然后，對兔子給藥試驗樣品或?qū)φ諛悠?。以下面的方法稀釋試驗樣品?.3ml的鹽水吸入帶有23G 1”的針頭的1.0ml的針筒中。將這一體積的液體注射進(jìn)TP508vile中。在TP508溶解后，除去0.25ml的溶液，給藥。然后，用鹽水沖洗該醫(yī)用套管。如果兔子是對照，則注射0.2ml的鹽水，再用鹽水沖洗。兔子也通過皮下注射接受0.3ml的Buprenorphine。
在外科手術(shù)后，在熱墊子上休息后，讓兔子恢復(fù)警覺。然后將兔子放回籠中，給予食物，同時給予水。再喂養(yǎng)兔子4星期，直到殺死。
四星期后，將兩個骼骨動脈原位固定，收集和制備組織學(xué)樣本。然后，對約間隔1毫米的組織學(xué)切片進(jìn)行數(shù)字成象，對損傷的區(qū)域的腔，新內(nèi)膜(如果存在)和膜介質(zhì)進(jìn)行成形態(tài)測定。
組織學(xué)總結(jié)用Image-Pro Plus和Excel軟件完成19個樣品的形態(tài)組織學(xué)分析。在19個樣品中，證明有外側(cè)彈性層受損。19個中的一個似乎需要再切片。所以，比較了16個樣品，其中有7個已處理的和9個鹽水對照。
通過數(shù)字分析新內(nèi)膜的區(qū)域可以確定再狹窄的病灶的厚度。同時測量血管的膜介質(zhì)。然后，總計這兩個區(qū)域的面積和將這一結(jié)果除于相同的組織學(xué)薄片系列內(nèi)發(fā)現(xiàn)的正常(未受損)的介質(zhì)的區(qū)域，將這些值歸一化。證明，在未受損的介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域中的組之間沒有明顯的差異。
當(dāng)比較處理的動物和對照時，通過三個明顯不同的方法分析再狹窄的程度“單個最壞值”方法，“平均損傷厚度”方法，和“平均所有切片”的方法?！皢蝹€最壞值”方法比較了已動手術(shù)的血管之間得到的最大的再狹窄值?！捌骄鶕p傷厚度”方法比較了已手術(shù)的血管之間已經(jīng)定義的損傷區(qū)域內(nèi)的所有的平均異常點(diǎn)。最后，“平均所有的切片”方法比較了所有測量的樣品的平均厚度，不管它們是否表現(xiàn)出部分的損傷。通過Student’s T-實(shí)驗測試了這些結(jié)果的平均值的統(tǒng)計學(xué)表現(xiàn)。數(shù)據(jù)總結(jié)利用兩尾的t-實(shí)驗假設(shè)不等變化完成所有的數(shù)據(jù)分析。α是0.05，平均差異假定是0。每個分析包括n＝7是處理的，n＝9是鹽水對照。結(jié)果歸結(jié)在下面的表1。“差異”值與對應(yīng)的對照相比表現(xiàn)出與處理樣品中的變化百分?jǐn)?shù)相關(guān)。用星號表示的值是有統(tǒng)計學(xué)意義的。
表1
結(jié)論數(shù)據(jù)顯示，在血膽固醇過多的兔子模型中，TP-508明顯抑制再狹窄和血管的閉塞。這一結(jié)果是強(qiáng)有力的，因為它是不依賴為了定量結(jié)果而選擇的技術(shù)的。
實(shí)施例6制備TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球體利用雙乳化技術(shù)制備含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLA/PGA)的微球體。簡要地說，將基質(zhì)成分溶解于二氯甲烷中，將TP508溶解于水中。當(dāng)渦旋形成油中水(W/O)乳化液時，將兩者逐步混合在一起。在乳液中加入聚乙烯醇(水中0.3％)，進(jìn)一步渦旋形成第二個乳液(O/W)，從而形成雙乳化液O/W乳液包括PLA/PGA小滴，在那些小滴中，第二個分散相包括水中的TP508。在相分離的基礎(chǔ)上，PLA/PGA小滴形成含有持有TP508的腔的分散的微球體。為了引起微球體的相分離，加入一個2％的異丙基乙醇溶液。離心收集顆粒，然后，凍干除去殘留的水分。改變基質(zhì)的組成形成釋放動力學(xué)不同的各種微球體(表2)。
表2不同的微球體配方的組成
在Coulter計數(shù)器中測量微球體的平均直徑，通過在276nm的光譜實(shí)驗中測量藥物包埋的效率，接著在二氯甲烷中溶解已稱重的微球體樣品，和將釋放的藥物萃取進(jìn)水(表3)。
表3配方直徑和藥物包埋效率
為了檢測從不同的PLA/PGA基質(zhì)釋放TP508，將20mg的微球體放置于1.5ml的聚丙烯微型離心管中含有的1.0ml的PBS中。將管子在37℃溫育，在60rpm振搖。在不同時間里，離心管子，除去含有釋放的TP508的上清液，冷凍，隨后進(jìn)行分析。加入新鮮的PBS到微球體中，繼續(xù)溫育。在276nm處測量上清液中的TP508的吸光值。對于每個配方，進(jìn)行四次重復(fù)釋放的測定。在37℃，28天的溫育過程中，配方B和D沒有顯示可檢測的藥物釋放。盡管在所有的情況中，在3-4天內(nèi)，釋放的藥物的量內(nèi)落在可檢測的限制范圍以下(＜1ug/mg基質(zhì)/天)，其余的配方都釋放了可檢測量的TP508。配方A和C顯示了TP508的最大釋放，在3-4天內(nèi)釋放60-80％的包埋的藥物。選擇具有最快釋放的動力學(xué)的配方C進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)施例3和實(shí)施例4的體內(nèi)研究實(shí)驗。
本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案被說明和敘述了，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在不脫離權(quán)利要求范圍的情況下，可以作形式和細(xì)節(jié)上的各種變化。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)心臟組織修復(fù)的方法，包括對心臟組織給藥治療有效量的血管生成凝血酶衍生物肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的肽包括具有Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO1)的凝血酶受體結(jié)合區(qū)和絲氨酸酯酶保守序列。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中絲氨酸保守序列包括Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中凝血酶衍生物肽包括氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO3)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中凝血酶衍生物肽包括氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO4)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的肽是在心臟外科過程中或以后給藥的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的肽是通過注射進(jìn)心臟組織給藥的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中包括血管生成凝血酶衍生物肽的持續(xù)釋放配方是對心臟組織給藥的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中持續(xù)釋放配方是包括血管生成的凝血酶衍生物肽的聚乳酸/聚乙醇酸微顆粒。
10.一種刺激換血管過程的方法，包括對心臟組織給藥治療有效量的血管生成凝血酶衍生物肽。
11.一種在需要治療的患者中刺激血管內(nèi)皮增殖的方法，包括對患者給藥治療有效量的血管生成凝血酶衍生物肽。
12.一種在血管生成術(shù)后的患者中抑制再狹窄的方法，所述的方法包括對患者給藥治療有效量的血管生成凝血酶衍生物肽。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中的肽是包衣在氣球血管生成術(shù)的導(dǎo)管上的。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中的血管生成凝血酶衍生物肽是系統(tǒng)給藥的。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中的血管生成凝血酶衍生物肽是局部地對誘導(dǎo)血管的氣球誘導(dǎo)的損傷區(qū)給藥的。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，將血管生成凝血酶衍生物肽包衣的stent插入在氣球誘導(dǎo)的損傷區(qū)域的血管中。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的肽包括一個具有序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO1)；和絲氨酸酯酶保守序列的凝血酶受體結(jié)合區(qū)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中的絲氨酸酯酶保守序列包括Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQID NO2)。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中凝血酶衍生物肽包括氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO3)。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其中凝血酶衍生物肽包括氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO4)。
21.一種用血管生成的凝血酶衍生物肽包衣的stent。
22.一種在患者中抑制血管閉塞的方法，所述的方法包括對患者給藥治療有效量的凝血酶衍生物肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)心臟組織修復(fù)的方法，包括對心臟組織給藥治療有效量的生血管的凝血酶派生的肽和/或抑制或降低血管的閉塞或再狹窄。本發(fā)明涉及刺激換管術(shù)的方法。仍然在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在用于本文所用的方法的藥物的制造過程中使用凝血酶派生的肽。
文檔編號A61F2/06GK1455678SQ01815458
公開日2003年11月12日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月12日
發(fā)明者達(dá)芮爾·H·卡尼 申請人:德克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會