專利名稱：具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和蛋白質(zhì)酶學(xué)領(lǐng)域。具體的講，其涉及一種從尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一種具有止血活性的類凝血酶的結(jié)構(gòu)特征，純化方法和醫(yī)藥領(lǐng)域方面的用途。該止血效應(yīng)的類凝血酶通過激活纖維蛋白原而加強(qiáng)凝血，同時因不激活XIII因子，不會引起血栓形成。在臨床前研究中得出了高效極低毒性效果。尖吻蝮蛇又稱五步蛇或蘄蛇，分布在華南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性較低，無神經(jīng)毒和激肽釋放酶活性。其組份中，有幾種成分在體外能使人或牛纖原凝結(jié)，但在動物體內(nèi)卻引起各種不同的生理效應(yīng)如降纖抗凝、血小板聚集和止血等。F.Kornalic將以纖維蛋白原為底物的蛇毒酶類按其作用方式不同分成三類一類是類凝血酶(Thrombin-like enzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它們僅分解纖維蛋白原的α鏈和/或β鏈的N端肽鏈，釋放A肽(α鏈)和/或B肽(β鏈)，使血液凝固。二類是纖維蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它們直接從纖維蛋白原三條肽鏈(α，β和γ)的C端水解，將纖原分解成碎片，血液不被凝固。三類是纖溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纖維蛋白溶解的間接激活劑，它通過激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，來裂解纖維蛋白或纖維蛋白原。本發(fā)明屬第一類.尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng，H.C.和Ouyang，C.等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個類凝血酶組份，并經(jīng)動物實驗驗證，它們均有不同程度抗凝作用。肖昌華等從1988年起和管錦華等從1992年起，多次償試從尖吻蝮蛇蛇毒中分離使動物凝血時間縮短的組份，但都因無法提純，對其結(jié)構(gòu)無法準(zhǔn)確定性和定量，未成功已放棄。國外相似的產(chǎn)品有Klobusitzky和Konig等從Bothropsjararaca蛇毒中部分純化出一局部和非胃腸使用安全的止血劑，取名Hemocoagulase，由米蘭Ravizzo公司從Bothrops jararaca蛇毒中部分提取的，以商品名Bothropase和由Basle Pentapharm公司從Bothropsatrox蛇毒中提取的，以商品名Reptilase的制劑在歐美有售。其中僅有商品名為立止血(Reptilase)的品種在國內(nèi)由深圳建安醫(yī)藥公司代理銷售，立止血療效確切，付作用小，臨床適應(yīng)癥廣，優(yōu)于其它止血藥等特點(diǎn)，并于1996年進(jìn)入中國國家基本藥物。
本發(fā)明的類凝血酶作用方式與Reptilase相同，但它的分子結(jié)構(gòu)完全不同于立止血(reptilase)。該類凝血酶通過酶切除纖原分子中的酸性A肽，能使人血漿和牛纖維蛋白原在體外凝固，因不激活XIII因子，導(dǎo)致產(chǎn)生非交聯(lián)性纖維蛋白單體復(fù)合物。在傷口處，該單體復(fù)合物與其它凝血因子相互作用產(chǎn)生止血效應(yīng)，在完整血管內(nèi)，該單體半衰期較短，可迅速被纖溶酶降解。該類凝血酶在體外使檸檬酸化血漿凝固，在體內(nèi)可使出凝血時間顯著縮短，同時又不造成血栓形成，達(dá)到傷口部位的止血或預(yù)防出血之目的。
本發(fā)明的目的是提供預(yù)防臨床手術(shù)出血，治療外傷出血及全身和局部止血方面的尖吻蝮蛇類凝血酶，確定其準(zhǔn)確的物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明的目的是提供該酶分子對血液的凝固不受肝素的影響，故可以制成診斷試劑用于臨床上測定某些使用肝素患者的出凝血時間。
本發(fā)明的目的還在于提供純化具有止血效應(yīng)的尖吻蝮蛇類凝血酶的方法，尤其是純化工藝的全面布局和層析條件。
一種具有防治出血的蛇毒類凝血酶，用SDS-PAGE法測得其全分子量為32KD，有相近兩個亞基組成，亞基分子量17KD和15KD，該酶最適溫度為35℃，最使PH 7.5，等電點(diǎn)為5.9。根據(jù)文獻(xiàn)和我們的試驗結(jié)果證實，該類凝血酶結(jié)構(gòu)與立止血完全不同。
用液相色譜法測該類凝血酶氨基酸組成為(％)Asp6.2，Thrl.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
該止血效應(yīng)的蛇毒類凝血酶的純化方法，包括尖吻蝮蛇蛇毒的溶解，Sephedex G75凝膠過濾，DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換，透析和Sephedex G-25脫鹽構(gòu)成。其特征在于該蛇毒類凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色譜填料進(jìn)行純化，流速40ml/min.流動相A10mmol/L磷酸鹽緩沖液PH8.0，B液為含有0.35mol/L氯化鈉的A液.洗脫梯度呈線性0～0.35mol/L的氯化鈉。
具體制備純該酶的方法是取驗證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩沖液溶解后離心。取上清液上Sephdaex G-75層析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，活性峰經(jīng)透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集活性峰，即為純品。
純化后的類凝血酶，用SDS-PAGE法測的全分子量位32KD，有17KD和15KD兩條多肽鏈組成.正相HPLC為單一峰.PAGE為單一帶，在體外能凝結(jié)新鮮人血漿。
體內(nèi)藥效學(xué)驗證純化后的尖吻蝮蛇類凝血酶經(jīng)新西蘭白兔耳靜脈和臀部肌注注射，實驗采用三個劑量組
，結(jié)果均使全血凝固時間(表1)明顯縮短，并使藥效維持6小時立止血以上。各實驗劑量組靜脈注射使纖維蛋白原含量(表2)和血液粘度(表7)不變或減少。對家兔凝血活酶時間(表3)，血小板數(shù)量(表4)無明顯影響。對優(yōu)球蛋白溶解時間(表5)，大劑量可時其縮短，中小劑量無明顯影響。本品耳靜脈注射10分鐘內(nèi)起效，30分鐘達(dá)高峰。試驗設(shè)立立止血陽性對照組和生理鹽水陰性對照組。不論肌注還是靜注，相同劑量的本品組藥效與立止血陽性對照組相近，但優(yōu)于生理鹽水組對照組。實驗小鼠尾靜脈剪斷出血實驗(表6)，該品(0.5U/Kg，1.0U/Kg，2.0U/Kg)腹腔注射，各劑量組小鼠尾靜脈出血時間與生理鹽水組和立止血組相比，均有不同程度的縮短，其中0.5u/kg劑量組與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
本發(fā)明的止血類凝血酶，其特征還在于該酶分子可通過血腦屏障，治療顱出血。
常用適用途徑有肌肉注射，靜脈注射；可局部或全身使用等。
表1.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭兔全血凝固時間的影響(X±SD)
表2.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)新西蘭白兔纖維蛋白原含量的影響(X±SD)表3.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭白兔APTT的影響(X±SD)表4.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對血小板數(shù)量的影響表5.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對兔優(yōu)球蛋白溶解時間的影響。
表6.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對小鼠剪尾出血時間的影響表7.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭兔全血粘度(mPaS)的影響實列一取檢驗了的尖吻蝮蛇蛇毒1克，加磷酸鹽緩沖液溶解蛇毒后，6000轉(zhuǎn)/分離心棄沉淀，取上清液上Sephdaex G-75層析柱(4*80cm)，用磷酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰上DEAE-SepharoseFast Flow層析柱(2*15cm)，用包含0.35M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集活性峰經(jīng)8～10KD截留半透膜透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(2*15cm)，用包含用0.35M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集活性峰，即收得純品10.6mg。
純化后的類凝血酶，用SDS-PAGE法測的全分子量位31849D，兩條亞基分子量16465D和15384D，分子篩HPLC為單一峰，純度100％.PAGE為單一帶，在體外能凝結(jié)新鮮人血漿。蛋白比活15.38U/mg(reptilase unit)。等電點(diǎn)為5.9。用液相色譜法測的純化后的類凝血酶氨基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
藥效學(xué)見表1～7。
實列二取檢驗了的尖吻蝮蛇蛇毒20克，加150ml磷酸鹽緩沖液溶解蛇毒后，6000轉(zhuǎn)/分離心棄沉淀，取上清液分五次上Sephdaex G-75層析柱(7*100cm)，用磷酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(4.5*30cm)，用包含用0.35M氯化納的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集活性峰經(jīng)8～10KD截留半透膜透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(4.5*30cm)，用包含0.35M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集活性峰，即得純品189.9mg。
純化后的類凝血酶，用SDS-PAGE法測的全分子量位32540D，兩條亞基分子量17036D和15504D，分子篩HPLC為單一峰，純度97.5％.PAGE為單一帶，在體外能凝結(jié)新鮮人血漿。酶比活17.5U/mg。
藥效學(xué)見表1～7。
表1.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭兔全血凝固時間的影響(X±SD)
*P＜0.05 by paired t test表2.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)新西蘭白兔纖維蛋白原含量的影響(X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01 by paired t test.
表3.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭白兔APTT的影響(X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01 by paired t test.
表4.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對血小板數(shù)量的影響組別 動物數(shù)血小板數(shù)量(109/L)10min 1h3h生理鹽水組7319.4±72 317.7±79.6 237.1±90.3sTLE組0.025u/kg 7288.0±79.1255.0±59.6 233.0±12.70.05u/kg 7272.0±77.9226.1±46.4*272.2±290.1u/kg 7339.0±88.1330.9±88.7 238.3±70.3立止血0.05u/kg7267.0±73.9306.2±81.2 269.4±62.1與生理鹽水組相比*P＜0.05表5.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對兔優(yōu)球蛋白溶解時間的影響組別 動物數(shù) 優(yōu)球蛋白溶解時間(n) 10min 60min 180min生理鹽水 7246.0±7.7225.1±76.4 191.4±3.8sTLE 0.025u/kg7133.8±7.4**141.7±34.7*235.0±7.6***0.05u/kg 8169.0±96.6 156.3±3.5151.4±3.8***0.1u/kg 885.0±28.3***75.0±28.3***136.3±7.4***立止血0.05u/kg8211.4±85.5 138.8±86.3 286.3±90.4*與生理鹽水組相比*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001表6.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對小鼠剪尾出血時間的影響組別劑量(u/kg) 給藥途徑 動物數(shù)出血時間生理鹽水--- Ip 1034.1±11.1sTLE0.5 Ip 1019.7±7.5**sTLE1.0 Ip 1126.9±12sTLE2.0 Ip 1226±18.0立止血 0.5 Ip 1028.7±17.1**與生理鹽水組相比P＜0.01表7.尖吻蝮蛇類凝血酶(sTLE)對新西蘭兔全血粘度(mPaS)的影響組別 動物數(shù) 切變率38.4s-110min 1h 3h生理鹽水組7 8.22±3.46 7.01±1.20 6.89±2.70sTLE組0.025u/kg 7 6.89±1.00 6.09±0.80 6.29±1.320.05u/kg 7 7.21±1.40 6.08±1.65 5.74±0.900.1u/kg 7 7.28±0.95 7.48±2.02 6.39±1.85立止血0.05u/kg7 7.43±1.88 6.02±0.86 6.46±1.5權(quán)利要求
1.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶.其特征在于其全分子量32KD，有17KD和15KD兩條多肽鏈組成，等電點(diǎn)5.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的止血類凝血酶，其特征在于氨基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的止血類凝血酶，其特征在于在體外，促進(jìn)人枸櫞酸化血漿凝固和能使牛纖維蛋白原凝固，在體內(nèi)使凝血時間縮短。
4.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的純化方法包括取驗證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩沖液溶解后離心，取上清液上Sephdaex G-75層析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，活性峰經(jīng)透析后再上DEAE-Sepharose FastFlow層析柱，收集活性峰，即為純品。
5.包括權(quán)利要求4所述的該類凝血酶的純化方法，其特征在于該蛇毒類凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色譜填料進(jìn)行純化，流速40ml/min.流動相A10mmol/L磷酸鹽緩沖液PH8.0，B液為含有0.35mol/L氯化鈉的A液.洗脫梯度呈線性0～0.35mol/L的氯化鈉.
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的止血類凝血酶，其特征在于可預(yù)防臨床手術(shù)出血，治療外傷出血及全身和局部止血。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的止血類凝血酶，其特征在于不僅可肌肉注射，還可靜脈注射和靜脈滴注。不僅全身，還可局部使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的止血類凝血酶，其特征在于該酶分子對血液的凝固不受肝素的影響，故可以制成診斷試劑用于臨床上測定某些使用肝素患者的出凝血時間。
全文摘要
本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶涉及生物醫(yī)藥和酶學(xué)領(lǐng)域。具體地講，涉及一種從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的結(jié)構(gòu)特征，純化方法和醫(yī)藥領(lǐng)域用途。該酶全分子量為32KD(SDS－PAGE法)，有相近兩個亞基17KD和15KD組成。HPLC為單峰。該酶最適溫度為35℃，最適pH7.5，等電點(diǎn)為5.9。用酸水解測得該酶有18或20種氨基酸組成。血漿凝結(jié)試驗在60±20秒，同時纖原凝結(jié)試驗230±50秒。該酶切除纖原分子中的酸性A肽(α鏈)和不激活XIII因子，在體內(nèi)使全血凝固時間顯著縮短，不造成血栓形成。本發(fā)明的用途是預(yù)防臨床手術(shù)出血、治療外傷出血、全身和局部止血及診斷某些臨床凝血時間。
文檔編號A61K38/48GK1502693SQ02138630
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日
發(fā)明者唐松山 申請人:唐松山