專利名稱：治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療阿爾茨海默病和腦缺血等腦部疾病的藥物。具體地是以廣東海風(fēng)藤為主要原料制備的藥物，本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
廣東海風(fēng)藤，別名大葉風(fēng)沙藤、過山龍?zhí)?，為木蘭科植物異型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.) Craib的干燥或新鮮的藤莖或根，是廣東省地方習(xí)用藥材，具有祛風(fēng)散寒，行氣止痛，舒筋活絡(luò)之功效，廣泛分布于廣東、廣西、云南、貴州等地。化學(xué)成分研究表明，異型南五味子含有五味子素(schisandrin)、內(nèi)南五味子素(kadsurin)、異型南五味子素A-G(heteroclitin A-G)以及戈米辛A，B，G，J，H，M(gomisin A，B，G，J，H，M)等一系列木脂素類成分。異型南五味子的乙醇提取物能顯著降低小鼠肝細(xì)胞中四氯化碳誘導(dǎo)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量，明顯增強(qiáng)肝細(xì)胞中超氧化物歧化酶活性。廣東海風(fēng)藤臨床主要用于治療風(fēng)濕痹痛、胃脘痛、骨痛及急慢性腸胃炎等證，在云南省廣東海風(fēng)藤還作為滇雞血藤膏的主要原料之一用于治療婦科疼痛。目前沒有應(yīng)用于腦部疾病的治療。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人經(jīng)過探索性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其木脂素類成分具有抗氧化和血小板活化因子(PAF)拮抗作用，其中的戈米辛J和異型南五味子素D能抑制Kcl、Cacl2和NA產(chǎn)生的血管收縮，且具有鈣拮抗活性。
本發(fā)明的目的在于提供一種治療阿爾茨海默病和腦缺血等腦部疾病的藥物。
本發(fā)明的目的還在于提供該治療阿爾茨海默病和腦缺血等腦部疾病的藥物的制備方法。
本發(fā)明的治療阿爾茨海默病和腦缺血等腦部疾病的藥物是由廣東海風(fēng)藤為主要原料制成的。例如直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料制成?；蛴脧V東海風(fēng)藤的提取物作為原料制成。
所述藥物是任何一種藥學(xué)上所說的劑型。
直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料制成的藥物，其制備方法包括將廣東海風(fēng)藤藥材單獨(dú)粉碎或配合其他中草藥或西藥共同粉碎后制成20～200目細(xì)粉，直接制成散劑、片劑、膠囊劑；或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以蜂蜜、食用油等制成蜜丸劑；或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以水、乙醇或其他粘合劑制成水丸劑；
或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以粘合劑或濕潤劑，該粘合劑或潤濕劑包括水、含水乙醇、0.5～70％羧甲基纖維素鈉水溶液、糖漿、淀粉糊等；以一步制粒法或二步制粒法制成8～60目顆粒，干燥后制成顆粒劑；或?qū)⒃擃w粒配以助流劑、崩解劑、控釋劑等添加劑后灌制成膠囊劑或壓制成片劑。
用廣東海風(fēng)藤的提取物作為原料制成的藥物，其提取液的制備包括用水、酸性水、堿性水、含水乙醇、無水乙醇、含水甲醇、無水甲醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丁醇、丙酮、其他含有12個以下碳原子的有機(jī)溶劑其中一種或兩種及以上混合物提取，或超臨界CO2提取得到。
一般情況下，廣東海風(fēng)藤的提取物含有至少0.1％重量的木脂素類成分，所述提取方法可以采用加熱或不加熱方式，加熱方式是指每公斤廣東海風(fēng)藤加入1～20升溶劑，加熱回流提取0.5～8小時，加熱溫度為50～120℃。不加熱方式是指用溶劑將廣東海風(fēng)藤冷浸、滲漉或超聲提取0.5～48小時，或以超臨界CO2提取。
提取得到的提取液還可以進(jìn)一步精制，精制方法是將廣東海風(fēng)藤的提取液以水-醇法、醇-水法、大孔樹脂法、硅膠柱層析法、聚酰胺柱層析法或溶劑萃取法等去除水溶性雜質(zhì)，使提取物中總木脂素含量達(dá)到0.1～50％。
用廣東海風(fēng)藤的提取物制備藥物時，將提取液直接或濃縮成1∶0.5～1∶4(藥液體積生藥質(zhì)量)濃度后加以矯味劑、抑菌劑及其他添加劑制成口服液；或?qū)⑸鲜鎏崛∫簼饪s成流浸膏，配以適宜的賦形劑、填充劑后按直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料的藥物的制備方法制成制劑；或?qū)⑸鲜鎏崛∫阂约訜峄蚶鋬龅姆椒ǔM溶劑后粉碎成20～200目細(xì)粉，按直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料的藥物的制備方法制成制劑。
本發(fā)明還可以以廣東海風(fēng)藤為原料制備藥物注射劑將藥材加入8～15倍量的水煎煮0.5～2小時，藥液趁熱抽濾，重復(fù)2～3次，合并濾液，加熱濃縮至每毫升含1～2g生藥材，冷卻至室溫，加入乙醇使含醇量達(dá)60～70％，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液減壓濃縮至幾無醇味，加入4～8倍量蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液加熱濃縮至每毫升含1～2g生藥材，冷卻至室溫，加入乙醇使含醇量達(dá)75～85％，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液用20～40％NaOH調(diào)pH至8.0～10.0，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱靜置12～48小時，濾除沉淀，濾液減壓回收乙醇得流浸膏，真空、噴霧或冷凍干燥得疏松粉末。將該粉末以注射用水及0.5～2％吐溫-80(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯-80)溶解，加入0.1～0.5％活性炭充分?jǐn)嚢栉?，濾除活性炭，濾液加入0.5～1.5％苯甲醇，以枸櫞酸鈉調(diào)pH至6.5～7.0，灌裝，密封，流通蒸汽滅菌30min即得藥物成品。
本發(fā)明還可以將廣東海風(fēng)藤與其他中草藥搭配組成中藥復(fù)方后制成各種藥物制劑治療腦缺血性疾病、阿爾茨海默病等腦部疾病。
現(xiàn)有技術(shù)中沒有涉及到將廣東海風(fēng)藤藥材制成含有穩(wěn)定量有效成分的穩(wěn)定提取物，也沒有涉及到將廣東海風(fēng)藤藥材及其提取物制成藥物制劑的方法，也沒有涉及到將廣東海風(fēng)藤應(yīng)用于阿爾茨海默病和腦缺血等腦部疾病藥物的治療。本發(fā)明將廣東海風(fēng)藤藥材制成含有穩(wěn)定量有效成分的質(zhì)量穩(wěn)定的提取物臨床常用制劑，便于臨床應(yīng)用治療疾病。同時考慮到口服制劑生物利用度相對較低，起效也較慢，尤其不適合急性腦缺血性疾病和重度阿爾茨海默病病人，本發(fā)明還將海風(fēng)藤制備成注射液。注射液具有作用迅速、療效確切的特點(diǎn)。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1取廣東海風(fēng)藤于烘箱中60℃干燥4小時，用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，過100目篩。稱取100g，加入20g煉制好的蜂蜜和5g藥用植物油，手工揉制成軟材。將軟材置于制丸機(jī)中制成重量約為12g的丸劑。封上蠟殼即得廣東海風(fēng)藤的蜜丸劑。
實(shí)施例2取廣東海風(fēng)藤于烘箱中60℃干燥4小時，用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，過100目篩。稱取100g置于快速制粒機(jī)中，加入2％羧甲基纖維素鈉水溶液12ml，一步制粒法制成12目顆粒。顆粒于烘箱中60℃干燥6小時，以搖擺式顆粒機(jī)12目篩網(wǎng)整粒，按5g/袋分裝于鋁箔袋中，密封即得廣東海風(fēng)藤的顆粒劑。
實(shí)施例3取廣東海風(fēng)藤于烘箱中60℃干燥4小時，用粉碎機(jī)粉碎成粗粉。稱取200g置于圓底燒瓶中加入2000ml 95％乙醇，加熱回流提取1h，趁熱抽濾。重復(fù)操作兩次，濾液合并共5600ml。減壓濃縮至無醇味，用乙酸乙酯分次萃取至幾無色，萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干溶劑，得到6.8g干浸膏。干法上硅膠柱，以石油醚-二氯甲烷梯度洗脫，收集二氯甲烷流份，蒸干溶劑，得到1.2g干粉。
實(shí)施例4取廣東海風(fēng)藤于烘箱中60℃干燥4小時，用粉碎機(jī)粉碎成粗粉。稱取200g置于圓底燒瓶中加入2000ml蒸餾水，加熱回流提取1h，趁熱抽濾。重復(fù)操作兩次，合并濾液，常壓濃縮至200ml，4℃冰箱靜置24h，濾除沉淀，濾液加入甜蜜素2g，苯甲酸鈉2g，灌裝至20ml玻璃瓶中，密封即得廣東海風(fēng)藤口服液。
實(shí)施例5取干燥的廣東海風(fēng)藤粉碎成粗粉。稱取5Kg加入95％乙醇50L于提取罐中加熱提取2h，過濾。藥渣再加入95％乙醇50L提取1h，合并兩次濾液。減壓濃縮得到干浸膏670g，用蒸餾水250ml混懸，上DA101大孔樹脂柱，以水-乙醇梯度洗脫，收集乙醇洗脫部分，減壓回收溶劑得到124g干浸膏。將干浸膏加入120g淀粉和50g糊精和2％羧甲基纖維素鈉水溶液40ml，在攪拌器中充分混勻，制成軟材。軟材用搖擺式顆粒機(jī)制成20目顆粒，流化床60℃沸騰干燥1h，干顆粒以高速整粒機(jī)整粒后加入硬脂酸鎂3g，羥丙基纖維素3g，于V型混合機(jī)中充分混合，壓片機(jī)壓制成7mm素片。包裝即得廣東海風(fēng)藤的片劑。
實(shí)施例6取20g廣東海風(fēng)藤粗粉加250ml蒸餾水煮沸30min。離心煎劑(3000r/min，15min)，取上清液過濾后，濃縮，在濃縮液中加4倍量乙醇(含醇量在80％以上)以將淀粉、多糖、蛋白質(zhì)除去，放置，濾去沉淀，再用40％NaOH溶液調(diào)pH值8.0，析出糅質(zhì)，濾過。重新調(diào)整pH值，熱處理冷藏法除盡高分子雜質(zhì)，灌裝，封口，流通蒸汽滅菌30min，即得海風(fēng)藤注射液。若熱處理冷藏法除盡高分子雜質(zhì)的藥液，經(jīng)除菌濾過，在無菌條件下灌裝，冷凍干燥，熔封即得凍干粉針劑。
實(shí)施例7將廣東海風(fēng)藤干燥藤莖加工成粗粉，重30kg，加95％乙醇浸泡72小時(粗粉、乙醇之比為1∶10)過濾。藥渣再加乙醇浸泡(1∶6)24小時，過濾，重復(fù)上述步驟3次，將4次所得的過濾液合并，放進(jìn)減壓濃縮罐中減壓濃縮成棕色膏狀物，帶有明顯的芳香味?？偦厥章蕿?6∶1，即海風(fēng)藤26g回收浸膏1g。最后將浸膏與二甲基亞砜(DMSO)混合，溶解，制成濃度為10％的海風(fēng)藤注射液(DMSO10ml中含10g浸膏)。
實(shí)施例8廣東海風(fēng)藤腦缺血損傷的保護(hù)作用。1.動物分組及模型建立犬45只，♀♂不拘，體重(9.8±1.5)kg，隨機(jī)分為假手術(shù)組，生理鹽水對照組(NS組)，廣東海風(fēng)藤用藥組(PW組)。后兩組又分別分為缺血0.5，3，6，12h組，每組5只。30g·L-1戊巴比妥鈉(2mg·kg-1)靜脈麻醉，股靜脈插管建立靜脈通道，氣管切開插入氣管套管，PaCO2升高時給予人工呼吸，股動脈插管監(jiān)測動脈血壓，間斷分析血?dú)?，PaCO2維持在4.0～5.3kPa之間。室溫控制在24～26℃，維持肛溫在37.0～38.0℃之間。犬實(shí)驗(yàn)性腦干缺血模型的建立經(jīng)頸前旁正中入路，暴露顱底枕骨大孔并分離硬腦膜，從其腹側(cè)緣向前咬骨窗直至基底動脈遠(yuǎn)心端，打開硬腦膜，暴露基底動脈，銀夾夾閉上、中、下端，依次縫合至皮膚。假手術(shù)組除不進(jìn)行基底動脈夾閉外，其余操作同缺血組。2.給藥方法及途徑缺血3h前行十二指腸造瘺。廣東海風(fēng)藤處理組于基底動脈夾閉前3h灌入廣東海風(fēng)藤溶液(5ml·kg-1，5ml相當(dāng)于生藥1g)。生理鹽水對照組灌入生理鹽水(5ml·kg-1)。3.遞質(zhì)性氨基酸測定腦干缺血達(dá)規(guī)定時相點(diǎn)迅速開顱取一側(cè)缺血腦干耳蝸前庭核區(qū)組織約1g，立即低溫下稱濕重，加入50g·L-1三氯乙酸溶液4ml，內(nèi)切式勻漿機(jī)勻漿，低溫下15000r·min-1離心，取上清液2ml，-70℃保存待測。應(yīng)用6300黃金系列高效氨基酸分析儀(美國Beckman公司)測定谷氨酸(Glu)，門冬氨酸(Asp)，結(jié)果用μmol·g-1濕重組織表示。4.組織病理學(xué)觀察在腦干缺血規(guī)定時相點(diǎn)取另一側(cè)缺血腦干耳蝸前庭核區(qū)組織部分標(biāo)本100ml·L-1中性甲醛液固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色，Olympus顯微鏡觀察并照相。部分標(biāo)本修成1mm3小塊，30g·L-1戊二醛固定，常規(guī)處理及切片，鈾-鉛雙重染色，H300透射電鏡觀察并照相。5.結(jié)果腦干缺血后各時間點(diǎn)興奮性氨基酸含量的變化，見表1。
表1腦干缺血各時間點(diǎn)興奮性氨基酸含量的變化μmol·g-1，n＝5，x±sGlu AspNS組 PW組 NS組PW組假手術(shù)組 3.25+0.73 3.25±0.73 1.56±0.41 1.56±0.41缺血0.5h 4.25±0.573.64±0.44 1.99±0.34 1.71±0.50缺血3h5.46±0.412)4.25±0.634)2.24±0.211)1.86±0.33缺血6h6.20+0.692)4.82±0.774)2.83±0.383)2.13±0.334)缺血12h 6.89±0.363)5.36+0.474)3.08±0.243)2.33±0.414)與假手術(shù)組比1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.001；與NS組比4)P＜0.05NS組在缺血0.5h后，Glu及Asp與假手術(shù)組相比，皆有輕度增加，但無顯著差異(P＞0.05)。缺血3h，Glu及Asp都顯著升高(分別P＜0.01；P＜0.05)。缺血6h，Glu及Asp分別增加近1倍。缺血12h，兩者仍有升高趨勢(P＜0.001)。PW組在缺血0.5h時，Glu及Asp與NS組相比，增加幅度即開始降低，但無顯著差異(P＞0.05)。缺血3h，Glu升高明顯受抑(P＜0.05)。缺血6h，Asp升高幅度顯著下降(P＜0.05)，至缺血12h，兩者升高仍受抑制。假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)正常。NS組缺血0.5h，神經(jīng)元呈輕度缺血改變，線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，核仁正常。缺血3h，光鏡下，大多數(shù)神經(jīng)元胞體縮小，核形態(tài)基本正常，電鏡下可見細(xì)胞膜缺損，線粒體高度腫脹，嵴斷裂，大量空泡形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成扁平狀，核染色質(zhì)聚集，核仁模糊，邊界不清。缺血6h，大部分神經(jīng)元嚴(yán)重縮小，核周體濃縮，核形狀不規(guī)則，電鏡下可見核膜連續(xù)性中斷，染色質(zhì)周邊化，部分神經(jīng)元壞死。缺血12h，神經(jīng)元尼氏體溶解，核固縮呈三角形，核溶解。PW組，缺血0.5h，神經(jīng)元無缺血表現(xiàn)。缺血3h，神經(jīng)元呈輕度缺血表現(xiàn)，線粒體輕度腫脹。缺血6h，神經(jīng)元胞體輕度縮小，細(xì)胞膜正常，線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，核正常。缺血12h，胞膜連續(xù)性中斷，線粒體明顯腫脹，空泡形成，核膜連續(xù)性存在，染色質(zhì)聚集，核仁模糊。
實(shí)施例91.模型制作雄性Wistar大鼠48只，月齡26個月，體重340～560g，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組各12只，其中A組在光照前后腹腔注射廣東海風(fēng)藤注射液各1次，每次劑量1ml/100g體重，B組單純注射DMSO，用法及劑量同A組，C組不注射藥物。A、B、C組制成光化學(xué)誘導(dǎo)的永久性局灶性腦皮質(zhì)缺血模型，即實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)0.4％戊巴比妥鈉32mg/kg體重腹腔內(nèi)麻醉后，消毒并縱向切開頭皮，暴露右側(cè)顱骨，小心分離骨膜，表面覆以中間帶圓孔的避光紙，孔徑4mm，圓心位于前囟后約1.8mm，中線旁右側(cè)2.5mm處。切開股部皮膚，暴露股靜脈，用一次性皮試針管從股靜脈緩慢注入2％玫瑰紅B(30mg/100g體重)后，將大鼠固定于立體定位儀上，冷光源探頭貼近顱骨表面，照射強(qiáng)度為300～320klx，照射時間30分鐘。D組為對照組，不給予光照，其他處理過程同C組。2.一般狀態(tài)觀察所有大鼠缺血誘導(dǎo)期生命體征穩(wěn)定，心率(261±42)次/分，呼吸(68±24)次/分，無缺氧征象，肛溫36.8～37.2℃，照射局部顱骨表面溫度38.0～38.8℃。均無明顯肢體癱瘓。缺血組較未缺血組精神萎縮，活動及攝食減少，廣東海風(fēng)藤干預(yù)后上述癥狀及體征未見明顯變化。3.血腦屏障完整性及梗死面積觀察每組取6只大鼠，于光照缺血或單純注射熒光染料后24小時迅速斷頭取腦，觀察皮質(zhì)梗死灶及玫瑰紅外滲情況，評價血腦屏障破壞程度。隨后立即置于37℃、2％的氯化四唑氮(TTC)生理鹽水中，避光孵育15分鐘，測量梗死灶直徑。結(jié)果對照組所有大鼠血腦屏障完整，無玫瑰紅滲出，TTC染色后未見梗死灶。實(shí)驗(yàn)組大鼠于光照24小時后可見光照區(qū)淡紅色染料滲出，以A組滲出較輕。TTC染色后于右頂葉光照區(qū)出現(xiàn)圓形蒼白色梗死灶，部位恒定，其中A組病灶直徑與B、C兩組相比，無明顯差異。提示對照組無血腦屏障破壞，缺血組血腦屏障破壞明顯，廣東海風(fēng)藤干預(yù)后破壞減輕。4.組織學(xué)觀察每組另外6只大鼠于同一缺血時間點(diǎn)，4％多聚甲醛灌注固定，斷頭、取腦、后固定、脫水透明、石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察。對照組血管、細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，無血栓形成。實(shí)驗(yàn)組光照缺血后病灶中心存在明顯的腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞脫失及神經(jīng)細(xì)胞壞死，而病灶周圍除神經(jīng)細(xì)胞脫失、壞死外，尚存在可逆性缺血細(xì)胞。廣東海風(fēng)藤干預(yù)后，每高倍視野壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量極顯著減少。5.原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標(biāo)記(TUNEL)4μm厚腦冠狀石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，以H2O2、復(fù)合消化液處理后，加含TdT和DIG-D-UTP反應(yīng)液，37℃孵育2小時，連接生物素化抗地高辛抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)不加TdT的陰性對照，光鏡下觀察被DAB染成棕色的凋亡細(xì)胞。對照組(B)及陰性對照組(C)均見陽性表達(dá)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組(A)的病灶周圍可見陽性細(xì)胞，每高倍視鏡下，A組陽性細(xì)胞數(shù)較B、C兩組極明顯減少。表2是各組大鼠缺血灶直徑、缺血灶周圍壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞數(shù)量的比較(x±s)。
表2 各組大鼠缺血灶直徑、缺血灶周圍壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞數(shù)量的比較(x±s)組別 n病灶直徑壞死細(xì)胞 凋亡細(xì)胞(mm)(個數(shù)) (個數(shù))A組 12 8.0+0.4 64.3±8.6*15.0±2.1*B組 12 8.4+0.4Δ74.8±11.3Δ22.0±3.1ΔC組 12 8.3±0.3 78.4±10.5 20.5±2.4注*與B、C組相比P＜0.01，Δ與C組相比P＞0.05實(shí)施例10淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，β-AP)是大腦老年斑的主要成份，β-AP與阿爾茨海默病的發(fā)病密切相關(guān)。β-AP的生物活性部位是從第25個氨基酸到第35個氨基酸(β-AP25-35)。本研究探討了廣東海風(fēng)藤對β-AP25-35升高神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子的影響。1.方法細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系列(LaN1)。培養(yǎng)液由95％DMEM和5％胎牛血清組成，培養(yǎng)箱內(nèi)含5％CO2潮濕空氣和保持37℃恒溫。實(shí)驗(yàn)前12～24h收集細(xì)胞，接種在無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞在指數(shù)分裂期進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。測定細(xì)胞存活率與乳酸脫氫酶(LDH)。細(xì)胞集落計數(shù)用胰蛋白酶將廣東海風(fēng)藤培養(yǎng)過的細(xì)胞從培養(yǎng)皿上分離下來，然后稀釋、計數(shù)。每500個細(xì)胞接種到25cm2的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)10d后用甲酚紫染色，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)(含50個細(xì)胞以上者)。最后計算出接種有效率(細(xì)胞集落/500×100％)，以評價廣東海風(fēng)藤對細(xì)胞的遠(yuǎn)期作用。神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子測定神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)低滲處理后，導(dǎo)入水母發(fā)光蛋白，水母發(fā)光蛋白與鈣離子結(jié)合放出藍(lán)光，用血小板胞漿鈣離子測定儀測定并計算神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子濃度。導(dǎo)入水母發(fā)光蛋白的神經(jīng)細(xì)胞分實(shí)驗(yàn)組和對照組。每一標(biāo)本為含細(xì)胞1×106的1ml細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組首先加入廣東海風(fēng)藤溶液10μl，37℃預(yù)熱2min，再加入β-AP25-35(10mmol/L)10μl測量胞漿鈣離子濃度變化(β-AP25-35最終濃度100μmol/L)。對照組細(xì)胞不接觸廣東海風(fēng)藤，首先加入生理鹽水10μl預(yù)熱2min(消除廣東海風(fēng)藤溶劑的作用)，再加入β-AP25-35(100μmol/L)。觀察廣東海風(fēng)藤對神經(jīng)細(xì)胞作用時，100μl廣東海風(fēng)藤水溶液加入到10ml培養(yǎng)液中；觀察廣東海風(fēng)藤對神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子影響時，10μl廣東海風(fēng)藤水溶液加入到1ml細(xì)胞懸液中，廣東海風(fēng)藤最終濃度分別為25g/L、10g/L、5g/L、2.5g/L。2結(jié)果在廣東海風(fēng)藤實(shí)驗(yàn)濃度內(nèi)(2.5g～25g/L)，LaN1接觸廣東海風(fēng)藤24h光鏡下無形態(tài)學(xué)改變。LaN1接觸廣東海風(fēng)藤6h和24h細(xì)胞存活率、LDH和細(xì)胞集落監(jiān)測均未發(fā)現(xiàn)異常，可見廣東海風(fēng)藤對神經(jīng)細(xì)胞無毒性作用。此外，廣東海風(fēng)藤可抑制β-AP25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞(LaN1)胞漿鈣離子升高，并隨廣東海風(fēng)藤濃度增加而增強(qiáng)。
現(xiàn)在普遍認(rèn)為，β-AP在AD的發(fā)病過程中起到了共同通路的作用，各種原因最終造成β-AP在腦內(nèi)沉積誘發(fā)AD。β-AP誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞變性過程進(jìn)一步被證實(shí)為細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡中鈣離子濃度升高起到了觸發(fā)作用。胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣/鎂依賴的核酸內(nèi)切酶，進(jìn)一步降解DNA而啟動細(xì)胞凋亡。抑制神經(jīng)細(xì)胞鈣離子濃度升高，有可能阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。
實(shí)施例11淀粉樣蛋白(βAP)是大腦老年斑的核心成分，現(xiàn)代研究證實(shí)它與阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病有著密切的關(guān)系，甚至有人認(rèn)為βAP的沉積是AD的病因。βAP來源于淀粉樣前體蛋白(βAPP)。βAPP基因位于21號染色體長臂中段，它編碼的βAPP由695-770個氨基酸組成，是一個跨膜糖蛋白。βAP是βAPP的一個片斷，由細(xì)胞膜外的28個氨基酸和跨膜部分的12個氨基酸組成，分子量大約4KD，三維結(jié)構(gòu)呈β型折疊，因而稱βAP。體內(nèi)外試驗(yàn)均顯示βAP能造成AD樣病理改變，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞變性?；谏鲜鲅芯?，如果βAPP基因表達(dá)受到抑制，βAP在腦內(nèi)的沉積就會減少，AD有可能得到有效防治。1.方法 細(xì)胞培養(yǎng)人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系列(LaN1)，培養(yǎng)液由95％DMEM和5％胎牛血清組成，培養(yǎng)箱內(nèi)保持含5％CO2的潮濕空氣和恒溫37℃。試驗(yàn)前12h～24h收集細(xì)胞，接種在無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞呈指數(shù)分裂期進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率測定當(dāng)細(xì)胞膜損壞時允許臺盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞被染成藍(lán)色(死細(xì)胞)，未受損的細(xì)胞不被染色(活細(xì)胞)。經(jīng)過染色的細(xì)胞用血細(xì)胞計數(shù)器分別計數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，然后計算出細(xì)胞存活率(活細(xì)胞/(活細(xì)胞+死細(xì)胞)×100％)。用以評價廣東海風(fēng)藤對細(xì)胞的作用。乳酸脫氫酶(LDH)測定當(dāng)細(xì)胞死亡時，胞內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中，利用比色法測量培養(yǎng)液中的LDH濃度，作為細(xì)胞死亡的一項(xiàng)指標(biāo)，亦用以評價廣東海風(fēng)藤對細(xì)胞的作用。細(xì)胞集落的計算用胰蛋白酶把細(xì)胞從培養(yǎng)皿上分離下來，然后稀釋、計數(shù)。每500個細(xì)胞接種到25cm2的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)10d后用甲酚紫染色，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)(含50個細(xì)胞以上者)。最后計算出接種有效率(細(xì)胞集落/500×100％)。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過10d的培養(yǎng)，可評價廣東海風(fēng)藤對細(xì)胞的遠(yuǎn)期作用。Northern印跡雜交試驗(yàn)采用鹽酸胍有機(jī)溶劑法提取細(xì)胞全部RNA，15μgRNA瓊脂電泳后轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后用P32標(biāo)記的βAPP cDNA雜交，最后通過放射自顯影顯示βAPPmRNA的量。同一塊雜交膜用1％SDS處理后再分別用β肌動蛋白c DNA(β Actin cDNA)和微管蛋白c DNA(Tubulin cDNA)雜交作為對照。2.結(jié)果廣東海風(fēng)藤實(shí)驗(yàn)濃度內(nèi)(2.5g/L～25.0g/L)，各種實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞的毒性作用。LaN1接觸廣東海風(fēng)藤24h光鏡下無形態(tài)學(xué)改變。LaN1接觸廣東海風(fēng)藤6h和24h，細(xì)胞存活率，LDH和細(xì)胞集落監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)異常。Northern印跡雜交顯示廣東海風(fēng)藤抑制βAPP基因表達(dá)。廣東海風(fēng)藤減少βAPPmRNA隨作用時間的延長和濃度的增加而增強(qiáng)。
廣東海風(fēng)藤抑制βAPP基因表達(dá)有以下特點(diǎn)①廣東海風(fēng)藤減少βAPPmRNA隨時間的延長和濃度的增加而增強(qiáng)；②廣東海風(fēng)藤抑制βAPP表達(dá)具有選擇性。
權(quán)利要求
1.一種治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物，其特征在于是以廣東海風(fēng)藤為主要原料制成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物，其特征在于直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物，其特征在于用廣東海風(fēng)藤的提取物作為原料制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物，其特征在于所述藥物是任何一種藥學(xué)上所說的劑型。
5.權(quán)利要求2所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于將廣東海風(fēng)藤藥材單獨(dú)粉碎或配合其他中草藥或西藥共同粉碎后制成20～200目細(xì)粉，直接制成散劑、片劑、膠囊劑；或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以蜂蜜、食用油等制成蜜丸劑；或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以水、乙醇或其他粘合劑制成水丸劑；或?qū)⑸鲜黾?xì)粉加以粘合劑或濕潤劑，該粘合劑或潤濕劑包括水、含水乙醇、0.5～70％羧甲基纖維素鈉水溶液、糖漿、淀粉糊；或以一步制粒法或二步制粒法制成8～60目顆粒，干燥后制成顆粒劑；或?qū)⒃擃w粒配以助流劑、崩解劑、控釋劑等添加劑后灌制成膠囊劑或壓制成片劑。
6.權(quán)利要求3所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于包括——制備提取液用水、酸性水、堿性水、含水乙醇、無水乙醇、含水甲醇、無水甲醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丁醇、丙酮、其他含有12個以下碳原子的有機(jī)溶劑其中一種或兩種及以上混合物提取，或超臨界CO2提取；——提取液直接或濃縮成1∶0.5～1∶4(藥液體積生藥質(zhì)量)濃度后加以矯味劑、抑菌劑及其他添加劑制成口服液
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于將提取液濃縮成流浸膏，配以適宜的賦形劑、填充劑后按權(quán)利要求5所述的方法制成制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于將提取液以加熱或冷凍的方法除盡溶劑后粉碎成20～200目細(xì)粉，按權(quán)利要求5所述的方法制成制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于所述制備提取液方法可以采用加熱或不加熱方式，加熱方式是指每公斤廣東海風(fēng)藤加入1～20升溶劑，加熱回流提取0.5～8小時，加熱溫度為50～120℃；不加熱方式是指用溶劑將廣東海風(fēng)藤冷浸、滲漉或超聲提取0.5～48小時，或以超臨界CO2提??；
10.權(quán)利要求4所述的治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物的制備方法，其特征在于其注射劑的制備方法包括將藥材加入8～15倍量的水煎煮0.5～2小時，藥液趁熱抽濾，重復(fù)2～3次，合并濾液，加熱濃縮至每毫升含1～2g生藥材，冷卻至室溫，加入乙醇使含醇量達(dá)60～70％，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液減壓濃縮至幾無醇味，加入4～8倍量蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液加熱濃縮至每毫升含1～2g生藥材，冷卻至室溫，加入乙醇使含醇量達(dá)75～85％，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱放置12～48小時，濾除沉淀，濾液用20～40％NaOH調(diào)pH至8.0～10.0，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱靜置12～48小時，濾除沉淀，濾液減壓回收乙醇得流浸膏，真空、噴霧或冷凍干燥得疏松粉末。將該粉末以注射用水及0.5～2％吐溫-80(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯-80)溶解，加入0.1～0.5％活性炭充分?jǐn)嚢栉剑瑸V除活性炭，濾液加入0.5～1.5％苯甲醇，以枸櫞酸鈉調(diào)pH至6.5～7.0，灌裝，密封，流通蒸汽滅菌30min。
全文摘要
一種治療阿爾茨海默病和腦缺血腦部疾病的藥物,是以廣東海風(fēng)藤為主要原料制成的;即直接以廣東海風(fēng)藤粉末作為原料制成;或用廣東海風(fēng)藤的提取物作為原料制成;本發(fā)明將廣東海風(fēng)藤藥材制成含有穩(wěn)定量有效成分的質(zhì)量穩(wěn)定的提取物臨床常用制劑,便于臨床應(yīng)用治療疾病。同時考慮到口服制劑生物利用度相對較低,起效也較慢,尤其不適合急性腦缺血性疾病和重度阿爾茨海默病病人,本發(fā)明還將海風(fēng)藤制備成注射液。
文檔編號A61P25/28GK1349816SQ0112982
公開日2002年5月22日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者羅煥敏, 李曉光 申請人:暨南大學(xué)