專利名稱：以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成分的組合藥物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，尤其是涉及一種以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成份的組合藥物及其制備方法、質(zhì)量檢測方法和其在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、病毒性感冒、肝炎等疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物是阿司匹林等非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等。但是糖皮質(zhì)激素劑量較大時易導(dǎo)致人體免疫抑制、蛋白質(zhì)份解及對腎上腺皮質(zhì)的負(fù)反饋?zhàn)饔?；阿司匹林等非甾體抗炎藥又會加強(qiáng)糖皮質(zhì)激素的致潰瘍作用。目前現(xiàn)有的垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物注射液雖無上述副作用，但注射疼痛病人會拒絕使用。而本發(fā)明藥物取自動物體內(nèi)，無毒性，無上述副作用，不僅能治療炎癥，更重要的是能提高人體免疫功能，根治炎癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供兩種以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成份的組合藥物。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述組合藥物水針劑及凍干針劑的制備方法。
本發(fā)明還涉及上述組合藥物在制備治療風(fēng)濕、預(yù)防及緩解病毒性感冒、關(guān)節(jié)炎、腫瘤及肝炎輔助用藥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的可以通過下面的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成份的組合藥物之一種是由以下原料按重量配比制成的①促腎上腺皮質(zhì)激素 8mg-12mg②免疫核糖核酸 4mg-20mg③胸腺肽8mg-50mg④還原型谷胱甘肽0.5mg-1.0mg無菌注射用水 2000mg-5000mg該組合藥物的水針劑的制備方法包括如下步驟
(1)制備促腎上腺皮質(zhì)激素①原料處理將合格豬腦垂體及豬腎上腺皮質(zhì)取出，去除結(jié)締組織，投入分析純丙酮中，浸泡后脫去水份，至垂體及豬腎上腺皮質(zhì)變硬為止；將垂體中腺垂體、神經(jīng)垂體分開，分別貯于丙酮中備用；取出腺垂體及腎上腺皮質(zhì)，其中腎上腺皮質(zhì)占二者總重的1/4至1/2，置于室溫下真空干燥，磨粉，過80目篩，得水份含量低于5％的腺垂體干粉；②提取將腺垂體干粉1Kg，加入預(yù)熱到50℃的0.5mol/L乙酸20L中攪拌，緩慢滴加50％的檸檬酸液直至調(diào)PH值為2.0-2.4，在膠體磨中磨至粒子直徑為0.5-1.5μm，加入100g胃蛋白酶，加熱至40-45℃，保溫20min，再加熱到75℃維持20min，使酶失活后，漸冷至20℃以下，用50％的檸檬酸液調(diào)PH值值為2.0-2.4，加入針劑用活性炭100g-150g助濾，用0.45μm膜濾2次，將2次濾液合并，用10％氫氧化鈉液調(diào)PH值為3.1-3.4，用6L冷凍離心機(jī)于4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，離心溫度為0-2℃，上層清液用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為1000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為8000的超濾膜超濾；超濾液冷凍干燥成水份≤3％的促腎上腺皮質(zhì)激素干品備用；(2)制備胸腺肽①原料處理用去離子水浸泡經(jīng)冷凍的小牛胸腺，化凍后剔除結(jié)締組織及膜和殘肉，并用去離子水反復(fù)清洗，甩凈水，將10Kg胸腺用10Kg注射用水混合在絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，在10℃以下于膠體磨中磨碎勻漿2-3次，直至粒子直徑為0.5-1.5μm，將磨碎的勻漿液用50％檸檬酸液調(diào)PH值為1.5-2.0，加入胃蛋白酶800g，升溫至40-50℃，保溫20-30min后，再升至75℃維持20min使酶失活后，迅速降至室溫，裝入帶蓋不銹鋼桶內(nèi)在無菌室內(nèi)于-28℃冷凍24小時，取出后室溫緩化8小時，重新在-28℃速凍24小時，再在室溫緩化8小時后，加熱至60-70℃，再迅速降至30℃以下，放入6L冷凍離心機(jī)中于0-2℃、4000-8000轉(zhuǎn)/分離心35分鐘，取上清液，離心上清液先經(jīng)截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行精濾，精濾液冷凍干燥成水份≤3％的胸腺肽干品備用；(3)制備免疫核糖核酸①原料處理選擇1周歲的羊，檢查無傳染病、布氏桿菌和包囊蟲之后，將2-3mg/ml死的或過期失效的卡介苗加費(fèi)時佐劑制成油包水狀乳化劑，于羊淋巴結(jié)內(nèi)注射，每只羊注射1ml，12-14天后屠殺，取肝、脾、心、肺和腎，作提取免疫核糖核酸的原料，用生理鹽水洗凈，絞成碎塊，按體積比1∶1∶1∶1加入1-2倍量體積0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L檸檬酸三鈉、0.001％聚乙烯硫酸酯、0.1％PH值為9的TritonX-100(TritonX-100為表面活性劑，國外商品名)，用膠體磨勻漿2-3次，磨成直徑為0.5-1.5μm粒子，于0-2℃、3500轉(zhuǎn)/分離心20min，取上層清液，在離心清液中加入等體積0.2mol/L的三乙醇胺、10g/L十二烷基硫酸鈉、0.002mol/L PH值為9的乙二胺四乙酸二鈉，攪拌均勻后加等體積90％苯酚、等體積氯仿，于室溫下振蕩30min，3500轉(zhuǎn)/分離心20min，提取清液，再加入等量氯仿振搖，至中間層界面無明顯蛋白層為止，得到除去蛋白的提取液，上清液加入1/10體積的200g/L乙酸鉀和兩倍體積、冷至-20℃的無水乙醇，于0℃放置1小時，離心，得白色沉淀，將沉淀溶解于含有0.001mol/L的乙二胺四乙酸二鈉至0.01mol/L的乙酸鈉中，加入等體積2.5mol/L磷酸氫二鉀，于不斷攪拌下再加等體積的乙二醇甲醚，0℃放置半小時，離心，得到除去糖原的提取液，清液在0℃不斷攪拌下，加入等體積0.2mol/L乙酸鈉液和1/4體積10g/L溴化十六烷基三甲基胺，0℃放置半小時，離心，取沉淀，用0.1mol/L含0.001mol/L乙二胺四乙二酸二鈉的乙酸鈉液、70％乙醇反復(fù)洗滌，至無泡沫為止，將沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二鈉，先用截留分子量為8000的中空纖維柱超濾，再用0.22μm膜除菌過濾，測定含量，無菌罐裝，冷凍干燥，得水份≤3％的免疫核糖核酸干燥品；(4)按上文所述的①～④的編號順序?qū)⒏鞣N原料在滅菌注射用水中溶解完全，用8％鹽酸調(diào)PH值為2.5-3.0后，用0.22μm膜濾除菌，無菌罐裝，用7ml亞林瓶每瓶灌裝3-4ml，并用丁基膠塞進(jìn)行半加塞，送入干燥箱中在真空壓力為40Pa-1.5Pa下冷凍干燥，使其殘留水份≤2％，按多肽為垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物標(biāo)示量的95％-120％、免疫核糖核酸為標(biāo)示量的95％-120％的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
該水針劑的制備過程中起始和終點(diǎn)PH值均為2.5-3.0。
本發(fā)明的以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成份的另一種組合藥物是由以下原料按重量配比制成的①促腎上腺皮質(zhì)激素8mg-12mg②免疫核糖核酸4mg-20mg③胸腺肽 8mg-50mg④還原型谷胱甘肽 0.5mg-2.0mg⑤低分子右旋糖酐-40 2mg-4mg
⑥甘露醇7mg-9mg無菌注射用水3000mg-4000mg。
該組合藥物的凍干針劑的制備方法包括如下步驟(1)制備促腎上腺皮質(zhì)激素①原料處理將合格豬腦垂體及豬腎上腺皮質(zhì)取出，去除結(jié)締組織，投入分析純丙酮中，浸泡后脫去水份，至垂體及豬腎上腺皮質(zhì)變硬為止；將垂體中腺垂體、神經(jīng)垂體分開，分別貯于丙酮中備用；取出腺垂體及腎上腺皮質(zhì)，其中腎上腺皮質(zhì)占二者總重的1/4至1/2，置于室溫下真空干燥，磨粉，過80目篩，得水份含量低于5％的腺垂體干粉；②提取將腺垂體干粉1Kg，加入預(yù)熱到50℃的0.5mol/L乙酸20L中攪拌，緩慢滴加50％的檸檬酸液直至調(diào)PH值為2.0-2.4，在膠體磨中磨至粒子直徑為0.5-1.5μm，加入100g胃蛋白酶，加熱至40-45℃，保溫20min，再加熱到75℃維持20min，使酶失活后，漸冷至20℃以下，用50％的檸檬酸液調(diào)PH值為2.0-2.4，加入針劑用活性炭100g-150g助濾，用0.45μm膜濾2次，將2次濾液合并，用10％氫氧化鈉液調(diào)PH值為3.1-3.4，用6L冷凍離心機(jī)于4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，離心溫度為0-2℃，上層清液用截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為8000的超濾膜超濾；超濾液冷凍干燥成水份≤3％的促腎上腺皮質(zhì)激素干品備用；(2)制備胸腺肽①原料處理用去離子水浸泡經(jīng)冷凍的小牛胸腺，化凍后剔除結(jié)締組織及膜和殘肉，并用去離子水反復(fù)清洗，甩凈水，將10Kg胸腺用10Kg注射用水混合在絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，在10℃以下于膠體磨中磨碎勻漿2-3次，直至粒子直徑為0.5-1.5μm，將磨碎的勻漿液用50％檸檬酸液調(diào)PH值為1.5-2.0，加入胃蛋白酶800g，升溫至40-50℃，保溫20-30min后，再升至75℃維持20min使酶失活后，迅速降至室溫，裝入帶蓋不銹鋼桶內(nèi)在無菌室內(nèi)于-28℃冷凍24小時，取出后室溫緩化8小時，重新在-28℃速凍24小時，再在室溫緩化8小時后，加熱至60-70℃，再迅速降至30℃以下，放入6L冷凍離心機(jī)中于0-2℃、4000-8000轉(zhuǎn)/分離心35分鐘，取上清液，離心上清液先經(jīng)截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行精濾，精濾液冷凍干燥成水份≤3％的胸腺肽干品備用；(3)制備免疫核糖核酸
①原料處理選擇1周歲的羊，檢查無傳染病、布氏桿菌和包囊蟲之后，將2-3mg/ml死的或過期失效的卡介苗加費(fèi)時佐劑制成油包水狀乳化劑，于羊淋巴結(jié)內(nèi)注射，每只羊注射1ml，12-14天后屠殺，取肝、脾、心、肺和腎，作提取免疫核糖核酸的原料，用生理鹽水洗凈，絞成碎塊，按體積比1∶1∶1∶1加入1-2倍量體積0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L檸檬酸三鈉、0.001％聚乙烯硫酸酯、0.1％PH值為9的TritonX-100，用膠體磨勻漿2-3次，磨成直徑為0.5-1.5μml粒子，于0-2℃、3500轉(zhuǎn)/分離心20min，取上層清液，在離心清液中加入等體積0.2mol/L的三乙醇胺、10g/L十二烷基硫酸鈉、0.002mol/L PH值為9的乙二胺四乙酸二鈉，攪拌均勻后加等體積90％苯酚、等體積氯仿，于室溫下振蕩30min，3500轉(zhuǎn)/分離心20min，提取清液，再加入等量氯仿振搖，至中間層界面無明顯蛋白層為止，得到除去蛋白的提取液，上清液加入1/10體積的200g/L乙酸鉀和兩倍體積、冷至-20℃的無水乙醇，于0℃放置1小時，離心，得白色沉淀，將沉淀溶解于含有0.001mol/L的乙二胺四乙酸二鈉至0.01mol/L的乙酸鈉中，加入等體積2.5mol/L磷酸氫二鉀，于不斷攪拌下再加等體積的乙二醇甲醚，0℃放置半小時，離心，得到除去糖原的提取液，清液在0℃不斷攪拌下，加入等體積0.2mol/L乙酸鈉液和1/4體積10g/L溴化十六烷基三甲基胺，0℃放置半小時，離心，取沉淀，用0.1mol/L含0.001mol/L乙二胺四乙二酸二鈉的乙酸鈉液、70％乙醇反復(fù)洗滌，至無泡沫為止，將沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二鈉，先用8000K中空纖維柱超濾，再除菌過濾，測定含量，無菌罐裝，冷凍干燥，得水份≤3％的免疫核糖核酸干燥品；(4)按上文所述的①～⑥的編號順序?qū)⒏鞣N原料在滅菌注射用水中溶解完全，用8％鹽酸調(diào)PH值為2.5-3.0后，用0.22μm膜濾除菌，無菌罐裝，用7ml亞林瓶每瓶灌裝3-4ml，并用丁基膠塞進(jìn)行半加塞，送入干燥箱中在真空壓力為40Pa-1.5Pa下冷凍干燥，使其殘留水份≤2％，按多肽為垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物標(biāo)示量的95％-120％、免疫核糖核酸為標(biāo)示量的95％-120％的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
該水針劑的制備過程中起始和終點(diǎn)PH值均為2.5-3.0。
促腎上腺皮質(zhì)激素、胸腺肽、免疫核糖核酸易受光氧化，易受熱以及放置時間延長而致使其活性降低，若在它們?nèi)芤褐屑尤脒€原型的谷胱甘肽，則可以長期保持它們活性不變(見表一)。
表一活性保持對比表

本品水針劑的性狀為微黃色澄明液體，凍干針劑的性狀為白色塊狀或粉末狀。
本發(fā)明的組合藥物不僅能長期保持其活性，而且對治療關(guān)節(jié)炎、病毒性感冒等疾病作用顯著，對預(yù)防癌癥、預(yù)防注射疼痛等也十分有效(見表二)。
表二臨床應(yīng)用對比試驗(yàn)


制劑質(zhì)量檢測方法本品為豬腦垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物加上小牛胸腺提取的胸腺肽、免疫羊的肝、脾、心、肺、腎中提取的免疫核糖核酸組成的無菌水溶液針劑或凍干針劑。含多肽應(yīng)為垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物標(biāo)示量的95％-120％；含免疫核糖核酸應(yīng)為標(biāo)示量的95％-120％。
鑒別1.多肽鑒別(1)取本品2ml，加雙縮脲試劑(取硫酸銅0.75g和酒石酸鉀鈉3g，加水250ml使其溶解，在攪拌下加入10％氫氧化鈉溶液150ml，加水至500ml)4ml，放置，應(yīng)顯紫色或紫紅色。
(2)取本品，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VI H)測定，在268nm波長處有最大吸收。
2.免疫核糖核酸鑒別取本品加水制成每1ml中含100μg免疫核糖核酸的溶液，取適量，加等體積的3，5-二羥基甲苯試液(取三氯化鐵和3，5-二羥基甲苯各0.1g，加鹽酸100ml溶解)，混勻，置沸水浴中加熱10分鐘，即顯黃綠色。
檢查PH應(yīng)為2.5-3.0(中國藥典2000年版二部附錄VI H)吸收度(1)多肽精密量取本品2ml，置100ml瓶中，加水至刻度，搖勻，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VI H)測定，在268nm波長處，吸收度為0.288以上。
(2)免疫核糖核酸取本品3支，分別加0.9％氯化鈉液制成每支每毫升中含20μg核糖核酸液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VI A)測定，在(260±2)nm波長處應(yīng)有最大吸收，260nm與280nm波長處吸收度比值不得小于2.0。
精氨酸與賴氨酸照高效液相色譜法(中國藥典2000年版二部附錄V D)測定，用適宜的氨基酸分析儀測定，每1ml含精氨酸應(yīng)為0.20-0.30mg，賴氨酸應(yīng)為0.40-0.60mg。
脫氧核糖核酸對照品溶液的制備稱取DNA對照品適量，用0.005mol/L氫氧化鈉溶液制成每1ml中含0.1mg的溶液。
供試品溶液的制備取本品，用0.005mol/L氫氧化鈉溶液制成每1ml中含核糖核酸1.00mg的溶液。
測定法精密量取DNA對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置具塞試管中，各加二苯胺試液(取二苯胺1g，加冰醋酸100ml及高氯酸10ml，溶解，臨用前加入1.6％的乙醛溶液1ml)4.0ml，置60℃水溶液中加熱50分鐘，迅速冷卻，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)，在600nm的波長處測定吸收度，供試品的溶液吸收度應(yīng)不大于對照品溶液的吸收度。
免疫核糖核酸的活力測定Hanks液，稱取氯化鈉16g，磷酸氫二鈉0.304g，磷酸二氫鉀0.136g，氯化鉀0.8g，葡萄糖2g，加水溶解成為200ml，滅菌，4℃存放，臨用前稀釋10倍，用10％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)PH為7.2-7.4?？乖芤河肏anks液將乙肝抗原配成每1ml中含有5-10μg的溶液，冷凍保存。
小鼠脾細(xì)胞懸液制備采集新鮮的健康小鼠脾，放在Hanks液中，輕壓擠出淋巴細(xì)胞經(jīng)紗布過濾除去粗塊，將濾液輕輕加在裝有4ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層，使界面平整，以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心15分鐘后，吸收界面的白細(xì)胞層，再用Hanks液洗2次，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，用培養(yǎng)液制成每1ml中含(1×101)～(2×102)個白細(xì)胞的溶液待用。
測定法在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，供試品孔及對照品孔各做3孔，將供試品用Hanks液制成每1ml中含有核糖核酸1mg的溶液，作為供試品溶液，每孔各加150μl，對照孔中加Hanks液150μl，然后每孔加入小鼠脾細(xì)胞懸液150μl，再加抗原液150μl，將培養(yǎng)板于87℃保溫2小時，使細(xì)胞在培養(yǎng)板底部黏附。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用恒溫振蕩培養(yǎng)箱在一定強(qiáng)度下?lián)u5min，將未黏附細(xì)胞搖起，吸出上清夜，每孔再加入Hanks液450μl，按上法洗一次，將洗液與上清夜合并混勻，在415nm的波長處測定每孔的吸收度值作為黏附后細(xì)胞的吸收度值。另取供試品溶液150μl，加Hanks液450μl及小鼠脾細(xì)胞懸液150μl，再加抗原溶液150μl混勻，在415nm的波長處測定吸收度值作為黏附前細(xì)胞的吸收度值，另用Hanks液150μl代替供試品溶液10μl，同法操作，作為對照黏附前細(xì)胞的吸收度值。
按下式計算
只有對照黏附率≥40％，吸收度值在0.1-0.4之間本試驗(yàn)結(jié)果有效。供試品的黏附抑制率不得小于30％。
多肽的活性測定取本品適量，照T細(xì)胞活性測定法一脫E受體法測定，供試品的E玫瑰花結(jié)百分率與對照管E玫瑰花結(jié)的百分率之差不得低于10.0％。
此測定法國家藥委員會有專門的測定規(guī)定。
胸腺肽a1在高分子量物質(zhì)項(xiàng)下記錄的色譜 圖中，按面積歸一法計算，供試品中對應(yīng)于胸腺肽a1保留時間的峰的含量不得低于1.0％。
高分子量物質(zhì)照高效液相色譜法測定(中國藥典2000年版二部附錄V D)。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用凝膠色譜柱(如TSK GEL2000SWX17.8mm×300mm，5μm)；次三氟醋酸一乙腈一水(0.05∶10∶90)為流動相；流速為每分鐘0.7ml；檢測波長為214nm。理論塔板數(shù)按核糖核酸酶A計算應(yīng)不得低于5000，分離度按相鄰峰高與峰谷之比計算均不得小于3.0。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取核糖酸酶A(分子量13700)、胰島素(分子量5808)、胸腺肽a1(分子量3108)、生長激素釋放抑制因子(分子量1521)適量，用流動相制成每1ml中的各含1mg的溶液作為分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液20ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣，其保留時間相對偏差不得大于2.0％。以各峰的保留時間為橫坐標(biāo)，分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，系數(shù)不得小于0.99。
測定法取供試品適量，加流動相制成每1ml中含多肽1mg的溶液，取20μg注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以面積歸一化法計算，供試品中分子量大于10000道爾頓的組分不得超過5.0％。
過敏試驗(yàn)取本品，加氯化鈉注射液，制成每1ml中含有1mg免疫核糖核酸的溶液，作為致敏液及供試品液。依國家藥典委員會專門規(guī)定檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml含免疫核糖酸0.5mg的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版二部附錄XI C)，按腹腔注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。
熱原取本品，用氯化鈉注射液制成每1mt中含1mg免疫核糖核酸的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版二部附錄XI D)，劑量按家兔體重每1kg注射1ml，應(yīng)符合規(guī)定。
其他應(yīng)符合注射劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(中國藥典2000年版二部附錄I B)。
免疫核糖核酸含量測定取本品3支，分別加0.9％氯化鈉溶液制成每1ml中含20μg核糖核酸的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)，在260nm的波長處測定吸收度，按核糖核酸的吸收度系數(shù)E1％1cm為220計算，使含量不得低于標(biāo)示量的90％。如有1支不符合規(guī)定，另取3支，結(jié)果均應(yīng)符合規(guī)定。
多肽含量測定取本品適量，加水制成每1ml中含多肽0.15mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取1ml，照福林酚法測定。
福林酚法國家藥典委員會有專門規(guī)定。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
制備本發(fā)明3種活性物質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素、胸腺肽及免疫核糖核酸實(shí)施例1促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的制備(1)原料處理將合格豬腦垂體及豬腎上腺皮質(zhì)取出，迅速去除結(jié)締組織(筋膜)，迅速投入分析純丙酮中，浸泡脫水3次，每次約24小時，至垂體及豬腎上腺皮質(zhì)變硬為止。將垂體中腺垂體、神經(jīng)垂體分開，分別貯于丙酮中備用。本法使用腺垂體，取出腺垂體及腎上腺皮質(zhì)(其中腎上腺皮質(zhì)占二者總重的1/4-1/2)，置于室溫下真空干燥，磨粉，過80目篩，得腺垂體干粉，水份含量應(yīng)低于5％。
(2)提取將腺垂體干粉1Kg(包括腎上腺皮質(zhì)占重量比例1/4-1/2)，加入預(yù)熱到50℃的0.5mol/L乙酸20L，攪拌，緩慢滴加50％檸檬酸液直至調(diào)PH值為2.0-2.4，在膠體磨中磨至粒子直徑為1μm左右加入100g胃蛋白酶，加熱使溫度達(dá)40-45℃，保溫20min，再加熱到75℃維持20min，使酶失活后，漸冷20℃以下，用50％檸檬酸液(檸檬酸為分析純)調(diào)PH值為2.0-2.4，加入針劑用活性炭100g-150g助濾，用0.45μm膜濾。將2次濾液合并，用10％氫氧化鈉(分析純)液調(diào)PH為3.1-3.4。用6L冷凍離心機(jī)于4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘(離心溫度為0-2℃)，上層清夜用100K中空纖維超濾柱超濾，濾液再用10K中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為8000的超濾膜超濾，超濾液冷凍干燥成干品備用(水份≤3％)。
實(shí)施例2胸腺肽的制備用純化水(去離子水)浸泡經(jīng)冷凍的小牛胸腺(重量比2∶1)，化凍后剔除結(jié)締組織及膜和殘肉，并用純化水反復(fù)清洗4次，甩凈水，將10Kg胸腺用10Kg注射用水混合在絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，在10℃以下于膠體磨中磨碎勻漿2-3次，直至粒子大小1μm左右，將磨碎的勻漿液用50％檸檬酸液調(diào)PH值為1.5-2.0，加入胃蛋白酶800g，升溫至40-50℃，保溫20-30min后，再升至75℃維持20min使酶失活后，迅速降至室溫，用316不銹鋼桶(帶蓋)在無菌室內(nèi)于-28℃冷凍24小時，取出后室溫緩化8小時，重新在-28℃速凍24小時，再在室溫緩化8小時后，加熱至60-70℃，再迅速降至30℃以下，放入6L冷凍離心機(jī)中于0-2℃、4000-8000轉(zhuǎn)/分離心35分鐘，取上清夜。
離心上清夜先經(jīng)截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行精濾，精濾液冷凍干燥成干品備用(水份≤3％)。
實(shí)施例3免疫核糖核酸(iRNA)的制備選擇一年齡的羊，檢查有無傳染病、布氏桿菌和包囊蟲之后，將2-3mg/ml死的或過期失效的卡介苗加費(fèi)時佐劑(羊毛脂1份，液體石蠟1份，混合，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?制成油包水狀乳化劑，于羊淋巴結(jié)內(nèi)注射，每只羊注射1ml，12-14天后屠殺，取肝、脾、心、肺和腎，作提取iRNA的原料，用生理鹽水洗凈，用絞肉機(jī)絞成碎塊，加入1-2倍量體積0.1mol/L氯化鈉-0.05mol/L檸檬酸三鈉、0.001％聚乙烯硫酸酯(PVS)、0.1％TritonX-100(PH7)，用膠體磨勻漿2-3次，磨成1μm左右粒子，于0-2℃、3500轉(zhuǎn)/分離心20min，取上層清夜。
在離心清夜中加入等體積0.2mol/L的三乙醇胺、10g/L(1％)十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.002mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(PH9)，攪拌均勻后加等體積90％苯酚(含0.2％8-羥基喹啉)、等體積氯仿，于室溫下振蕩30min，3500轉(zhuǎn)/分離心20min，得提取清夜，再加入等量氯仿振搖，反復(fù)2-3次，至中間層界面無明顯蛋白層為止，離心除去蛋白，收集清夜，得到除去蛋白的提取液。
上清夜加入1/10體積的200g/L(20％)乙酸鉀和兩倍體積、冷至-20℃得無水乙醇，于0℃放置1小時，離心，得白色沉淀，將沉淀溶解于含有0.001mol/L得乙二胺四乙酸二鈉至0.01mol/L得乙酸鈉中，加入等體積2.5mol/L磷酸氫二鉀，于不斷攪拌下再加等體積的乙二醇甲醚，0℃放置半小時，離心，得到除去糖原的提取液。
清夜在0℃不斷攪拌下，加入等體積0.2mol/L乙酸鈉液和1/4體積10g/L(1％)溴化十六烷基三甲基胺(CTAB)，0℃放置半小時，離心，取沉淀，用0.1mol/L乙酸鈉液(含0.001mol/L乙二胺四乙二酸二鈉)、70％乙醇反復(fù)洗滌5次，至無泡沫為止。
將沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二鈉(含0.14mol/L氯化鈉)。先用8000K中空纖維柱超濾，再除菌過濾(用0.22μm膜濾)，測定含量，無菌罐裝，冷凍干燥，得iRNA干燥品(水份≤3％)。
制備本發(fā)明水針劑實(shí)施例1按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素 8mg×1000②免疫核糖核酸 4mg×1000③胸腺肽 8mg×1000④還原型谷胱甘肽 0.5mg×1000無菌注射用水 2000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為20mg)生產(chǎn)操作1.將8000mg促腎上腺皮質(zhì)激素溶解在1600mlPH為2.5-3.0的無菌注射用水中，攪拌溶解完全，再加入(攪拌下)免疫核糖核酸4000mg，攪拌溶解完全；再加入(攪拌下)胸腺肽8000mg，溶解完全；再加入還原型谷胱甘肽500mg，攪拌溶解完全；再加入PH為2.5-3.0無菌注射用水至總量為2000ml，用8％鹽酸液重調(diào)PH為2.5-3.0；
2.將藥液用0.22μm膜濾除菌；3.在無菌(100級)條件下，用經(jīng)過滅菌除熱原的2.0ml西林瓶灌裝，每支裝量2.0ml，并用經(jīng)過滅菌除熱原的丁基膠塞密封；4.按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
實(shí)施例2按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素 10mg×1000②免疫核糖核酸 15mg×1000③胸腺肽 20mg×1000④還原型谷胱甘肽 0.75mg×1000無菌注射用水 5000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為45mg)生產(chǎn)操作步驟與實(shí)施例1相同，但本實(shí)施例每支灌裝量為5.0ml。
實(shí)施例3按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素 12mg×1000②免疫核糖核酸 20mg×1000③胸腺肽 50mg×1000④還原型谷胱甘肽 1.0mg×1000無菌注射用水 5000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為82mg)生產(chǎn)操作步驟與實(shí)施例1相同，但本實(shí)施例每支灌裝量為5.0ml制備本發(fā)明凍干針劑實(shí)施例1按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素8mg×1000②免疫核糖核酸4mg×1000③胸腺肽 8mg×1000④還原型谷胱甘肽 0.5mg×1000⑤低分子右旋糖酐-40 2mg×1000
⑥甘露醇 7mg×1000無菌注射用水 3000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為20mg)生產(chǎn)操作1.將8000mg促腎上腺皮質(zhì)激素在攪拌下，加入1600ml的無菌注射用水中，無菌注射用水預(yù)先調(diào)PH為2.5-3.0(用8％鹽酸調(diào)PH值)，攪拌溶解完全；再加入(攪拌下)免疫核糖核酸4000mg，攪拌溶解完全；再加入(攪拌下)胸腺肽8000mg，溶解完全；再加入還原型谷胱甘肽500mg，攪拌溶解完全；再加入2000mg低分子右旋糖酐-40，在攪拌下溶解完全；再加入7000mg甘露醇，在攪拌下溶解完全；再用8％鹽酸液調(diào)藥液PH為2.5-3.0；2.將藥液用0.22μm膜濾除菌；3.在無菌(100級)條件下，用經(jīng)過滅菌除熱原的7.0ml西林瓶灌裝，每支裝量3.0ml，并用經(jīng)過滅菌除熱原的丁基膠塞進(jìn)行半加塞；4.將灌裝并加塞的藥瓶送入冷凍干燥箱中在-40℃～+40℃、真空壓力為40Pa-1.5Pa下冷凍干燥，使其殘留水份≤2％，軋蓋；5.按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
實(shí)施例2按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素 10mg×1000②免疫核糖核酸 15mg×1000③胸腺肽 20mg×1000④還原型谷胱甘肽 1.5mg×1000⑤低分子右旋糖酐-40 3mg×1000⑥甘露醇 8mg×1000無菌注射用水 3000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為45mg)生產(chǎn)操作步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3按重量比備好原料如下①促腎上腺皮質(zhì)激素 12mg×1000②免疫核糖核酸 20mg×1000
③胸腺肽50mg×1000④還原型谷胱甘肽2.0mg×1000⑤低分子右旋糖酐-40 4mg×1000⑥甘露醇9mg×1000無菌注射用水4000mg×1000(起始和終點(diǎn)PH均為2.5-3.0)分裝1000支(每支含3種活性成份總量為82mg)生產(chǎn)操作步驟與實(shí)施例1相同，但本實(shí)施例每支灌裝量為4.0ml。
權(quán)利要求
1.一種以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成分的組合藥物，其特征在于它是由以下原料按重量配比制成的①促腎上腺皮質(zhì)激素8mg-12mg②免疫核糖核酸4mg-20mg③胸腺肽 8mg-50mg④還原型谷胱甘肽 0.5mg-1.0mg無菌注射用水 2000mg-5000mg。
2.如權(quán)利要求1所述的組合藥物的水針劑的制備方法，其特征在于依次包括下列步驟(1)制備促腎上腺皮質(zhì)激素①原料處理將合格豬腦垂體及豬腎上腺皮質(zhì)取出，去除結(jié)締組織，投入分析純丙酮中，浸泡后脫去水份，至垂體及豬腎上腺皮質(zhì)變硬為止；將垂體中腺垂體、神經(jīng)垂體分開，分別貯于丙酮中備用；取出腺垂體及腎上腺皮質(zhì)，其中腎上腺皮質(zhì)占二者總重的1/4至1/2，置于室溫下真空干燥，磨粉，過80目篩，得水份含量低于5％的腺垂體干粉；②提取將腺垂體干粉1Kg，加入預(yù)熱到50℃的0.5mol/L乙酸20L中攪拌，緩慢滴加50％的檸檬酸液直至調(diào)PH值為2.0-2.4，在膠體磨中磨至粒子直徑為0.5-1.5μm，加入100g胃蛋白酶，加熱至40-45℃，保溫20min，再加熱到75℃維持20min，使酶失活后，漸冷至20℃以下，用50％的檸檬酸液調(diào)PH值為2.0-2.4，加入針劑用活性炭100g-150g助濾，用0.45μm膜濾2次，將2次濾液合并，用10％氫氧化鈉液調(diào)PH值為3.1-3.4，用6L冷凍離心機(jī)于4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，離心溫度為0-2℃，上層清液用截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為8000的超濾膜超濾；超濾液冷凍干燥成水份≤3％的促腎上腺皮質(zhì)激素干品備用；(2)制備胸腺肽①原料處理用去離子水浸泡經(jīng)冷凍的小牛胸腺，化凍后剔除結(jié)締組織及膜和殘肉，并用去離子水反復(fù)清洗，甩凈水，將10Kg胸腺用10Kg注射用水混合在絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，在10℃以下于膠體磨中磨碎勻漿2-3次，直至粒子直徑為0.5-1.5μm，將磨碎的勻漿液用50％檸檬酸液調(diào)PH值為1.5(1)制備促腎上腺皮質(zhì)激素①原料處理將合格豬腦垂體及豬腎上腺皮質(zhì)取出，去除結(jié)締組織，投入分析純丙酮中，浸泡后脫去水份，至垂體及豬腎上腺皮質(zhì)變硬為止；將垂體中腺垂體、神經(jīng)垂體分開，分別貯于丙酮中備用；取出腺垂體及腎上腺皮質(zhì)，其中腎上腺皮質(zhì)占二者總重的1/4至1/2，置于室溫下真空干燥，磨粉，過80目篩，得水份含量低于5％的腺垂體干粉；②提取將腺垂體干粉1Kg，加入預(yù)熱到50℃的0.5mol/L乙酸20L中攪拌，緩慢滴加50％的檸檬酸液直至調(diào)PH值為2.0-2.4，在膠體磨中磨至粒子直徑為0.5-1.5μm，加入100g胃蛋白酶，加熱至40-45℃，保溫20min，再加熱到75℃維持20min，使酶失活后，漸冷至20℃以下，用50％的檸檬酸液調(diào)PH值值為2.0-2.4，加入針劑用活性炭100g-150g助濾，用0.45μm膜濾2次，將2次濾液合并，用10％氫氧化鈉液調(diào)PH值為3.1-3.4，用6L冷凍離心機(jī)于4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，離心溫度為0-2℃，上層清液用截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，濾液再用截留分子量為8000的超濾膜超濾；超濾液冷凍干燥成水份≤3％的促腎上腺皮質(zhì)激素干品備用；(2)制備胸腺肽①原料處理用去離子水浸泡經(jīng)冷凍的小牛胸腺，化凍后剔除結(jié)締組織及膜和殘肉，并用去離子水反復(fù)清洗，甩凈水，將10Kg胸腺用10Kg注射用水混合在絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，在10℃以下于膠體磨中磨碎勻漿2-3次，直至粒子直徑為0.5-1.5μm，將磨碎的勻漿液用50％檸檬酸液調(diào)PH值為1.5-2.0，加入胃蛋白酶800g，升溫至40-50℃，保溫20-30min后，再升至75℃維持20min使酶失活后，迅速降至室溫，裝入帶蓋不銹鋼桶內(nèi)在無菌室內(nèi)于-28℃冷凍24小時，取出后室溫緩化8小時，重新在-28℃速凍24小時，再在室溫緩化8小時后，加熱至60-70℃，再迅速降至30℃以下，放入6L冷凍離心機(jī)中于0-2℃、4000-8000轉(zhuǎn)/分離心35分鐘，取上清液，離心上清液先經(jīng)截留分子量為100000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為10000的中空纖維超濾柱超濾，再用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行精濾，精濾液冷凍干燥成水份≤3％的胸腺肽干品備用；(3)制備免疫核糖核酸①原料處理選擇1周歲的羊，檢查無傳染病、布氏桿菌和包囊蟲之后，將2-3mg/ml死的或過期失效的卡介苗加費(fèi)時佐劑制成油包水狀乳化劑，于羊淋巴結(jié)內(nèi)注射，每只羊注射1ml，12-14天后屠殺，取肝、脾、心、中在真空壓力為40Pa-1.5Pa下冷凍干燥，使其殘留水份≤2％，按多肽為垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物標(biāo)示量的95％-120％、免疫核糖核酸為標(biāo)示量的95％-120％的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
3.如權(quán)利要求2所述的組合藥物的水針劑的制備方法，其特征在于在制備過程中起始和終點(diǎn)PH值均為2.5-3.0。
4.一種以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成分的組合藥物，其特征在于它是由以下原料按重量配比制成的①促腎上腺皮質(zhì)激素8mg-12mg②免疫核糖核酸4mg-20mg③胸腺肽 8mg-50mg④還原型谷胱甘肽 0.5mg-2.0mg⑤低分子右旋糖酐-40 2mg-4mg⑥甘露醇 7mg-9mg無菌注射用水 3000mg-4000mg。
5.如權(quán)利要求4所述的組合藥物的凍干針劑的制備方法，其特征在于依次包括下列步驟(1)按權(quán)利要求2所述步驟(1)～(3)的方法分別制備促腎上腺皮質(zhì)激素、胸腺肽、免疫核糖核酸；(2)按權(quán)利要求4中所述編號①～⑥的順序?qū)⒏鞣N原料在滅菌注射用水中溶解完全，用8％鹽酸調(diào)PH值為2.5-3.0后，用0.22μm膜濾除菌，無菌罐裝，用7ml亞林瓶每瓶灌裝3-4ml，并用丁基膠塞進(jìn)行半加塞，送入干燥箱中在真空壓力為40Pa-1.5Pa下冷凍干燥，使其殘留水份≤2％，按多肽為垂體前葉與腎上腺皮質(zhì)提取物標(biāo)示量的95％-120％、免疫核糖核酸為標(biāo)示量的95％-120％的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測合格后、包裝進(jìn)庫。
6.如權(quán)利要求5所述的組合藥物的凍干針劑的制備方法，其特征在于在制備過程中起始和終點(diǎn)PH值均為2.5-3.0。
7.權(quán)利要求1或4所述的組合藥物在制備治療風(fēng)濕、預(yù)防及緩解病毒性感冒、關(guān)節(jié)炎、腫瘤及肝炎輔助用藥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩種以垂體前葉腎上腺皮質(zhì)提取物為主要成分的組合藥物，它們含有共同的活性物質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素、胸腺肽及免疫核糖核酸；并且提供了上述組合藥物水針劑及凍干針劑的制備方法；本發(fā)明的組合藥物不僅能長期保持其活性，而且對治療關(guān)節(jié)炎、病毒性感冒等疾病作用顯著，對預(yù)防癌癥、預(yù)防注射疼痛等也十分有效。
文檔編號A61K38/33GK1686534SQ200510063218
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者蔡海德 申請人:蔡海德