專利名稱：9－0－乙酰酯酶基因編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域。
二
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述9-O-乙酰酯酶基因(9-O-acetylesterase I)是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用差異篩選方法篩選獲得，通過比較單倍體和四倍體生精細(xì)胞功能基因的表達(dá)，獲得差異表達(dá)克隆，經(jīng)序列測定證明為全長cDNA，為1990bp；其開放閱讀框架為1467bp，編碼488個氨基酸。查閱基因庫，該基因?yàn)樾禄颉Ｓ捎谠摶蛟谒谋扼w生精細(xì)胞高表達(dá)，因此發(fā)現(xiàn)的9-O-乙酰酯酶基因可能與精子發(fā)生有關(guān)，用該基因克隆可制備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片。融合蛋白也可能成為相關(guān)疾病治療的基因藥物。
由于9-O-乙酰酯酶基因在Genbank數(shù)據(jù)庫中尚無人的同源基因，本發(fā)明人對于該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果全都是開創(chuàng)性的。美國國家生物技術(shù)情報中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)已正式接受該基因?yàn)镚enbank的新成員，接受號為AF300796。
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1381 catggctgta gctatggatc tctgtgatag agactcgcct tttggcagca tccaccctcg1441 agataaacag actgtggctt atcggctgca tttgggggcc cgtgctctgg cttatggtga1501 gaagaatttg acctttgaag gaccactgcc tgagaagata gaactcttgg ctcacaaggg1561 gctgctcaat ctcacatatt accagcaaat ccaggtgcag aaaaaggaca acaagatatt1621 tgagatctcc tgttgcagtg accatcgatg caagtggctt ccagcttcta tgaacaccgt1681 ctccacccag tccctgaccc tggcgatcga ttcttgtcat ggcactgtgg ttgctctccg1741 ctatgcttgg accacgtggc cttgtgaata taagcagtgt cccctatacc accccagtag1801 tgccctgcca gcccctccct tcattgcttt cattacagac cagggtcctg gacatcagag1861 caatgttgct aaatgactgt ttcagtatga tcagaactta gatataagga tgggtccttc1921 agattttagc atttaggagt ttcaataata accattgctt ttaaaggaaa gtaaaaaaaa1981 aaaaaaaaaa9-O-乙酰酯酶基因cDNA序列MVLQKEPAGAVIWGFGTPGATVTVTLRQGQETIMKKVTSVKAHSDTWMVVLDPMKPGGPFEVMAQQTLEKINFTLRVHDVLFGDVWLCSGQSNMQMTVLQIFNATRELSNTAAYQSVRILSVSPIQAEQELEDLVAVDLQWSKPTSENLGHGYFKYMSAVCWLFGRHLYDTLQYPIGLIASSWGGTPIEAWSSGRSLKACGVPKQGSIPYDSVTGPSKHSVLWNAMIHPLCNMTLKGVVWYQGESNINYNTDLYNCTFPALIEDWRETFHRGSQGQTERFFPFGLVQLSSDLSKKSSDDGFPQIRWHQTADFGYVPNPKMPNTFMAVAMDLCDRDSPFGSIHPRDKQTVAYRLHLGARALAYGEKNLTFEGPLPEKIELLAHKGLLNLTYYQQIQVQKKDNKIFEISCCsDHRCKWLPASMNTVSTQSLTLAIDSCHGTVVALRYAWTTWPCEYKQCPLYHPSSALPAPPFIAFITDQGPGHQSNVAK9-O-乙酰酯酶基因開放閱讀框架氨基酸序列本發(fā)明的目的是鑒于9-O-乙酰酯酶基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明人所做的科學(xué)研究工作。由于該基因是與睪丸精子發(fā)生相關(guān)的基因，其異常表達(dá)可能影響男性的生殖功能，因此該基因的研究可用于①通過制備該基因的融合蛋白，用于進(jìn)一步研究該基因與精子發(fā)生的關(guān)系，還可能成為一種治療男性睪丸相關(guān)疾病的生物藥品。
②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的不可缺少的重要工具，9-O-乙酰酯酶基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學(xué)染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據(jù)免疫學(xué)原理設(shè)計的檢測方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細(xì)胞中的定位和定量研究，也可用于各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與9-O-乙酰酯酶基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的診斷試劑盒，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因診斷芯片將功能基因用于制備基因診斷芯片是基因開發(fā)研究的一個重要方面，在疾病診斷(如男性不育)和藥物篩選等方面均具有重要意義。本發(fā)明技術(shù)方案1.9-O-乙酰酯酶基因融合蛋白的制備以9-O-乙酰酯酶基因開放閱讀框的核苷酸序列與質(zhì)粒pDESTTM15制備成GST-SP2-pDEST15表達(dá)質(zhì)粒，在無NaCl的LB中30℃培養(yǎng)到0.5OD600，經(jīng)0.3M NaCl誘導(dǎo)，超聲粉碎后經(jīng)GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。2.9-O-乙酰酯酶基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于三個月后取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進(jìn)一步用抗原作競爭抑制免疫試驗(yàn)確定抗體的特異性。根據(jù)ELISA結(jié)果確定其用于免疫組織化學(xué)染色的稀釋倍數(shù)為1∶200～500。3.9-O-乙酰酯酶基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內(nèi)注射)，隔周一次，連續(xù)2-3次，融合前靜脈加強(qiáng)一次，用ELISA方法證實(shí)抗體的產(chǎn)生后，取脾臟分離脾細(xì)胞，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。陽性克隆經(jīng)多次亞克隆，直至獲得分泌抗9-O-乙酰酯酶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。4.9-O-乙酰酯酶基因用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片(1)以獲取的9-O-乙酰酯酶基因的核苷酸序列設(shè)計引物，擴(kuò)增全長的9-O-乙酰酯酶基因序列，用作點(diǎn)膜的樣品。(2)用英國BioRobotics自動點(diǎn)膜儀將標(biāo)本點(diǎn)在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點(diǎn)2個點(diǎn)，每點(diǎn)的DNA量約幾ng。；陽性對照為8個housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h. ubiquitin carboxy I-ferminal esterase L I)。陰性對照為λ噬菌體DNA和P-blue質(zhì)粒。(3)將含有該基因的芯片用于9-O-乙酰酯酶基因缺失的診斷和藥物篩選33P標(biāo)記抽提待檢標(biāo)本mRNA或DNA，用Random Primer標(biāo)記法標(biāo)記待檢標(biāo)本mRNA或DNA，作為雜交的探針。雜交
將點(diǎn)制好的尼龍膜標(biāo)記探針雜交后，雜交爐(68℃)內(nèi)烘干，用磷屏壓片。信號掃描和分析用記錄儀分析雜交信號。根據(jù)雜交信號的強(qiáng)弱分析影響9-O-乙酰酯酶蛋白表達(dá)水平或9-O-乙酰酯酶基因的缺失。
9-O-乙酰酯酶基因編碼蛋白9-O-乙酰酯酶基因cDNA序列1 ggagtgccca ggatggagtg cagtggctat tcacaggttt aatcatagct cactaccgtc61 ttgaatccct gggctcaagt gatcctcctg cctcagcccc tgagtagctg gtactaaagt121 taccttccac gctgtatgtc cgtgagaaat acaatgaaga cggtctgaat aatgaactgg181 taatcttcga taatatgaaa cgaatttaag agaacatatc aaagagaagg ctctcaaaat241 aggctgctgc aaaagctggt atattgtccg gttgctctct cagaatctcg cgtgtcagcc301 cttcaagaag attcccaaat ccttgtggaa ttcggtagtg ggtgttggag aatggaatcg361 acatcttctt ggtattggtt ttcgctttgc ttcatacatc aataatgata tggtgctgca421 gaaggagcct gctggggcag tgatatgggg cttcggtaca cctggagcca cagtgaccgt481 gaccctgcgc caaggtcagg aaaccatcat gaagaaagtg accagtgtga aagctcactc541 tgatacgtgg atggtggtac tggatcctat gaagcctgga ggacctttcg aagtgatggc601 acaacagact ttggagaaaa taaacttcac cctgagagtt catgacgtcc tgtttggaga661 tgtctggctc tgtagtgggc agagtaacat gcagatgact gtgttacaga tatttaatgc721 tacaagggag ttgtctaaca ctgcggcata tcagtctgtc cgcatcctct ctgtctctcc781 cattcaagca gagcaggagc tggaggacct tgttgcggtt gacttgcagt ggtctaagcc841 cacctcagaa aacttaggcc atggatattt caagtacatg tcagcagtgt gctggctctt901 tggacgtcac ctttatgaca ctctgcagta tcccatcggg ctgatcgcct ccagctgggg961 cgggacaccc attgaagcct ggtcatctgg acggtcactg aaagcctgtg gggtccctaa1021 acaagggtcc attccatacg attctgtaac tggtcccagt aagcactctg ttctctggaa1081 tgccatgatc catccactgt gcaatatgac tctgaaaggg gtagtatggt accaggggga1141 gtccaatata aattataaca cggatctgta caattgcaca ttccctgcac tcatcgaaga1201 ctggcgtgaa accttccacc gtggttccca ggggcagacg gagcgtttct tcccatttgg1261 acttgtccag ttatcttcag atttgtctaa gaagagctca gacgatggat ttccccagat1321 ccgttggcat caaacagcag acttcggcta tgtccccaac ccaaagatgc ccaatacttt1381 catggctgta gctatggatc tctgtgatag agactcgcct tttggcagca tccaccctcg1441 agataaacag actgtggctt atcggctgca tttgggggcc cgtgctctgg cttatggtga1501 gaagaatttg acctttgaag gaccactgcc tgagaagata gaactcttgg ctcacaaggg1561 gctgctcaat ctcacatatt accagcaaat ccaggtgcag aaaaaggaca acaagatatt1621 tgagatctcc tgttgcagtg accatcgatg caagtggctt ccagcttcta tgaacaccgt1681 ctccacccag tccctgaccc tggcgatcga ttcttgtcat ggcactgtgg ttgctctccg1741 ctatgcttgg accacgtggc cttgtgaata taagcagtgt cccctatacc accccagtag1801 tgccctgcca gcccctccct tcattgcttt cattacagac cagggtcctg gacatcagag1861 caatgttgct aaatgactgt ttcagtatga tcagaactta gatataagga tgggtccttc1921 agattttagc atttaggagt ttcaataata accattgctt ttaaaggaaa gtaaaaaaaa1981 aaaaaaaaaa9-O-乙酰酯酶基因開放閱讀框架氨基酸序列MVLQKEPAGAVIWGFGTPGATVTVTLRQGQETIMKKVTSVKAHSDTWMVVLDPMKPGGPFEVMAQQTLEKINFTLRVHDVLFGDVWLCSGQSNMQMTVLQIFNATRELSNTAAYQSVRILSVSPIQAEQELEDLVAVDLQWSKPTSENLGHGYFKYMSAVCWLFGRHLYDTLQYPIGLIASSWGGTPIEAWSSGRSLKACGVPKQGSIPYDSVTGPSKHSVLWNAMIHPLCNMTLKGVVWYQGESNINYNTDLYNCTFPALIEDWRETFHRGSQGQTERFFPFGLVQLSSDLSKKSSDDGFPQIRWHQTADFGYVPNPKMPNTFMAVAMDLCDRDSPFGSIHPRDKQTVAYRLHLGARALAYGEKNLTFEGPLPEKIELLAHKGLLNLTYYQQIQVQKKDNKIFEISCCSDHRCKWLPASMNTVSTQSLTLAIDSCHGTVVALRYAWTTWPCEYKQCPLYHPSSALPAPPFIAFITDQGPGHQSNVAK
權(quán)利要求
1.一種睪丸功能特異基因(9-O-acetylesterase I)克隆制備的融合蛋白，其特征是9-O-acetylesterase I基因全部開放閱讀框氨基酸，序列為MVLQKEPAGAVIWGFGTPGATVTVTLRQGQETIMKKVTSVKAHSDTWMVVLDPMKPGGPFEVMAQQTLEKINFTLRVHDVLFGDVWLCSGQSNMQMTVLQIFNATRELSNTAAYQSVRILSVSPIQAEQELEDLVAVDLQWSKPTSENLGHGYFKYMSAVCWLFGRHLYDTLQYPIGLIASSWGGTPIEAWSSGRSLKACGVPKQGSIPYDSVTGPSKHSVLWNAMIHPLCNMTLKGVVWYQGESNINYNTDLYNCTFPALIEDWRETFHRGSQGQTERFFPFGLVQLSSDLSKKSSDDGFPQIRWHQTADFGYVPNPKMPNTFMAVAMDLCDRDSPFGSIHPRDKQTVAYRLHLGARALAYGEKNLTFEGPLPEKIELLAHKGLLNLTYYQQIQVQKKDNKIFEISCCSDHRCKWLPASMNTVSTQSLTLAIDSCHGTVVALRYAWTTWPCEYKQCPLYHPSSALPAPPFIAFITDQGPGHQSNVAKKVVIREQALPLRYPRRRGKGIHSNAHLVL
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對9-O-acetylesterase I基因開放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對9-O-acetylesterase I基因開放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對將9-O-acetylesterase I基因開放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片，其特征是PCR擴(kuò)增9-O-acetylesterase I基因cDNA，點(diǎn)于芯片用于芯片制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，針對9-O-acetylesterase I基因開放讀框氨基酸序列用于制備融合蛋白，其特征是融合蛋白可作為制備治療相關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域,所述的9－0－乙酰酯酶(9－O－acetylesteraseI)基因全長cDNA序列為1990bp,其開放閱讀框序列為1467bp,其編碼488個氨基酸,該基因在基因庫(Genbank)中的編號為AF300796。本發(fā)明利用9－0－乙酰酯酶基因克隆制備融合蛋白,并用該蛋白免疫動物制備單克隆和多克隆抗體,同時將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達(dá)芯片的制備。
文檔編號A61K38/17GK1344736SQ01127198
公開日2002年4月17日 申請日期2001年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月13日
發(fā)明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)