專利名稱：水蛭素口服緩(控)釋劑型的制作方法
本專利涉及一種水蛭素的口服緩(控)釋新劑型的設(shè)計及制備工藝。
水蛭素(Himdin)是由環(huán)節(jié)動物門蛭綱醫(yī)蛭屬(Himdomedicinalis)水蛭唾液腺分泌的一種小分子蛋白質(zhì)，是迄今所知天然存在的最強(qiáng)的凝血酶抑制劑。由于水蛭素能直接有效地抑制凝血酶活性，它被認(rèn)為是一種有望成為用于防治心腦血管疾病的新藥。但天然水蛭素來源有限而且產(chǎn)量太少，所以近年來利用基因工程合成重組水蛭素得到廣泛的重視。目前為止，人們已經(jīng)從大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)中得到了具有生物活性的重組水蛭素。
水蛭素是由65或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，是一種由多種異型體組成的“家族”。異型體間高度的同源性，僅有幾個氨基酸殘基的差異，平均分子量為7,000D。氨基酸序列分析表明，水蛭素分子中含Arg，Met，Trp富含Glu，Asp，Gln，Asn。其C端富含Glu，Asp，形成酸性末端；Tyr63被硫酸化；肽中部有Pro46-Lys47-Pro48特異序列片段，不易被一般蛋白酶水解，且在與凝血酶作用中發(fā)揮重要作用。重組水蛭素Tyr63未被硫酸化，活性比天然水蛭素稍低。根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究報告，水蛭素在生物體內(nèi)有多種生物功能它能夠高效抗凝血，抗血栓形成，阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板聚集反應(yīng)，抑制凝血酶誘導(dǎo)的多種細(xì)胞增殖。根據(jù)與其它抗凝藥物對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明水蛭素抗凝效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其他常規(guī)抗凝藥物，如肝素、阿司匹林、檸檬酸三鈉等。水蛭素和肝素比較，抗凝效果水蛭素比肝素強(qiáng)幾百倍，且用量少得多。
國內(nèi)外已經(jīng)有較多的水蛭素類藥物應(yīng)用于臨床上對心腦血管疾病的治療。國內(nèi)僅有一些以水蛭素為主要成分的中成藥制品，如重慶多泰制藥公司生產(chǎn)的“脈血康”等。它們都是以水蛭直接入藥制成胃腸道直接釋解給藥方式的膠囊等口服制劑。國外已經(jīng)有好幾家基因工程重組水蛭素類藥物進(jìn)入臨床或上市銷售，如德國的Hoest Marion公司的Leprudin、美國HMR公司的水蛭素、歐洲Novartis公司的水蛭素等，但他們在劑型設(shè)計上都是肌肉注射或靜脈滴定。
本專利針對水蛭素在臨床應(yīng)用上的一些特點(diǎn)，發(fā)明了對大多數(shù)慢性高凝狀態(tài)患者長期抗凝治療相適應(yīng)的水蛭素口服緩(控)釋新制劑?？诜?控)釋制劑是指口服藥物在胃腸道中按設(shè)計要求緩慢非恒速(或恒速)釋放，每日用藥次數(shù)與響應(yīng)普通制劑比較至少減少一次或用藥時間間隔有所延長的制劑。理想的緩(控)釋制劑應(yīng)該是這樣藥物迅速在作用部位(受體)達(dá)到理想的有效濃度，并維持該濃度適當(dāng)?shù)臅r間，在機(jī)體其它部位則無藥物分布或藥物濃度僅在最低濃度范圍，一旦達(dá)到治療目的，藥物立即從作用部位消除。為達(dá)到此目的，須根據(jù)藥物動力學(xué)原理，對緩(控)釋制劑的釋藥速度，速釋和緩釋部分的劑量比例加以合理的設(shè)計、計算，使制劑具有長久的、平衡的血藥濃度。
本專利所涉及緩釋制劑的工藝原理主要基于使主藥溶解度減少和使主藥擴(kuò)散速度減慢。1.減少溶出度為主要原理的工藝。
1-1.在保持水蛭素活性的前提下，修飾成溶解度小的鹽或脂。
1-2.在保持水蛭素活性的前提下，將水蛭素與某些大分子載體通過共價鍵結(jié)合，可以得到具有緩釋功能的水蛭素釋放系統(tǒng)。
1-3.藥物的表面積與藥物的溶出速度有關(guān)，增大藥物粒子的表面積可以減緩藥物的釋放。
1-4.將水蛭素包藏于溶蝕性骨架中，即用脂肪、蠟、氫化植物油、硬脂酸丁脂等主要基質(zhì)制成緩釋片。水蛭素溶于或混懸于這些熱的基質(zhì)中，冷后粉碎成粉末或小粒，裝在膠囊中或制成片劑，其中脂肪酸酯被水解難易程度決定釋放速度。
1-5.將水蛭素包藏于親水性膠體物質(zhì)中。即以親水性膠體為骨架，加入乳糖等稀釋劑，制成片劑在胃腸道溶液中，藥片逐漸吸水膨脹，水蛭素逐漸擴(kuò)散到表面而溶于胃腸液中。常用的親水性膠體用甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基淀粉、PVP、卡波普等。2.減小擴(kuò)散系數(shù)為主要原理的工藝2-1.包衣。這是制備緩釋制劑的主要方法，即將含水蛭素的小丸或片劑用包衣阻滯材料包衣。包衣阻滯材料可分為兩類腸溶材料和阻滯劑。
2-1-1.腸溶材料包衣。用鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、EudragitL、EudragitS、聚乙烯醚/馬來酸酐半脂等腸溶材料包衣包被在水蛭素主藥表面上，這些材料可以抵抗胃酸的作用而在腸液中卻可以溶解。
2-1-2.阻滯劑包衣。用蟲膠等疏水性高分子物質(zhì)與水蛭素主藥混合制粒壓片或者用賦形劑制備成小丸，在包衣鍋內(nèi)撒入水蛭素藥物細(xì)粉，成為藥物衣小丸，然后再用阻滯劑包衣。
2-2.使用微囊技術(shù)制備緩(控)釋制劑是較新的方法。微囊膜為半透膜，在胃腸道中，水分可以滲透進(jìn)入囊內(nèi)，溶解囊內(nèi)水蛭素藥物，形成飽和溶液，然后擴(kuò)散于囊外的消化液中而被機(jī)體吸收，釋放速度由囊厚度、微孔孔徑、微孔彎曲度等因素決定。
2-3.制備成不溶性骨架片劑。把水蛭素主藥與不溶性塑料(無毒聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯乙酸酯、聚甲基丙烯酸酯、硅橡膠等)混勻，加入塑料的有機(jī)溶劑溶液潤濕、拌勻，制備成軟材，制粒。藥物的溶解度、骨架的孔率、孔徑和孔的彎曲度影響釋放藥物的速度。
2-4.如制劑為液體劑型，可以加入明膠、PVP等增加溶液粘度以延長藥物作用時間。
2-5.如制劑為液體劑型，可以制備成水/油型乳劑，在體內(nèi)有長效作用。
實(shí)例說明I酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建水蛭素基因經(jīng)化學(xué)合成三段DNA，應(yīng)用遞歸PCR法連成全長基因序列，序列以日本醫(yī)蛭唾液腺水蛭素HV2為基礎(chǔ)，將編碼47位Asn序列改為編碼Lys的序列。選用酵母編好密碼子，以分泌型表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過多次篩選后得到了可高效表達(dá)重組水蛭素的Pichia酵母菌種。Pichia酵母分泌型表達(dá)系統(tǒng)通過甲醇誘導(dǎo)水蛭素的高效表達(dá)，在經(jīng)72小時的發(fā)酵后，每升發(fā)酵液可獲得重組水蛭素1.5g。經(jīng)過離心、超濾后分泌液中的水蛭素濃度可提高10倍。以離心交換和反相高效液相純化后，水蛭素純度大于95％，比活力在11000ATU/mg左右，收率大于60％。熱原含量小于2EU/mg蛋白。純化水蛭素經(jīng)過8M尿素SDS-PAGE電泳測定其分子量為7000道爾頓左右，與理論值相符；聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳顯示其等電點(diǎn)為3.5～4.0之間，符合理論值；N-末端15個氨基酸序列分析證明其序列完全正確，氨基酸組份分析、肽圖、HPLC等分析也與設(shè)計值一致，并且其抑制凝血酶的比活力較高，均提示重組水蛭素的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的正確性。實(shí)例說明II緩釋措施的建立國外(Hoechst公司)的水蛭素劑型為凍干粉劑，靜脈滴注?；谒嗡胤肿恿啃?，可被腸中蛋白酶水解等特點(diǎn)，針對大多數(shù)慢性高凝狀態(tài)患者長期抗凝治療的需要，本研究為了達(dá)到應(yīng)用水蛭素方便、有效并可長期預(yù)防凝血、血栓的效果，采用了獨(dú)特的口服劑型。首先，研究了普通的口服腸溶膠囊劑型，進(jìn)行大鼠體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血液凝血指標(biāo)有明顯改善，不過所需的劑量較大，這可能是水蛭素體內(nèi)半衰期相對短的緣故。為此，改用緩釋有保護(hù)腸衣的腸溶膠囊，其釋放時間約在10-12小時左右，可大大提高藥物的利用效率。水蛭素經(jīng)凍干后，用腸溶材料包被在水蛭素主藥表面上，可以抵抗胃酸的作用而在腸液中得以溶解。實(shí)例說明III動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照衛(wèi)生部抗凝血藥物的動物實(shí)驗(yàn)要求和國內(nèi)外相應(yīng)文獻(xiàn)，我們進(jìn)行重組水蛭素的體內(nèi)動物藥效初步實(shí)驗(yàn)(委托華西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室完成)?？诜亟M水蛭素給藥劑量分別為100和400ATU/kg，3天后7天內(nèi)血液的抗凝指標(biāo)明顯改善，給藥組動物的靜脈血栓形成大大減少，并且藥效與劑量正相關(guān)。急性毒性實(shí)驗(yàn)以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)口服劑量為10mg/kg時是安全的。實(shí)驗(yàn)證明其安全性和有效性，口服新型重組水蛭素劑型胃腸利用度佳，穩(wěn)定性好，口服后體內(nèi)抗凝抗栓作用明顯。
權(quán)利要求
1.一種以天然水蛭素或基因工程重組水蛭素為主藥，輔以必要的輔料，經(jīng)過緩(控)釋制劑工藝所得的具有緩(控)釋作用的口服水蛭素緩(控)釋劑型。
2.條款1中所述天然水蛭素包括從環(huán)節(jié)動物門蛭綱所有能分泌水蛭素的水蛭中所提取的水蛭素；該水蛭素可以是純品，也可以是以該水蛭素為必要或主要成分的一定純度的混合物。
3.條款1中所述的重組水蛭素包括各種水蛭素的變異型和突變型，其表達(dá)宿主包括細(xì)菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞系，昆蟲細(xì)胞系及動植物。
4.條款1中所述必要的輔料包括以下方面4.1.油脂性滲入劑。如單硬脂酸甘油脂、氫化蓖麻油、礦油、聚硅氧烷、二甲基聚硅氧烷等。4.2.親水膠體。如纖維素衍生物(CMC-Na，HPC，HPMC)，PVP，阿拉伯膠，海藻酸鈉，卡波譜等。4.3.包衣阻滯劑。如EC，HPMC，PVP，CAP，丙烯樹脂。4.4.PVA(聚乙烯醇)。4.5.EVA(乙烯-醋酸乙烯共聚物)。4.6.聚丙烯。4.7.聚乳酸。4.8.其他聚合物。如聚乙二醇，聚醋酸，聚乙醇酸，聚氨基酸等。4.9.其它常用輔料。如糖等。
5.條款1所述緩(控)釋制劑工藝包括以下方面5.1.制成溶解度小的復(fù)合物；5.2.與高分子化合物生成難溶性化合物；5.3.控制藥物粒子大小，增大粒子表面積；5.4.將藥物包藏于溶蝕性骨架中；5.5.將藥物包藏于親水性膠體中；5.6.用包衣阻滯劑包衣；5.7.制成微囊；5.8.制成不溶性骨架片劑；5.9.增加粘度，減少擴(kuò)散系數(shù)；5.10.制成乳劑；5.11.制成滲透泵控釋片。
6.條款1中所述口服緩(控)釋作用指口服藥物在指定的溶劑中按要求緩慢地非恒速(或恒速)地釋放每日用藥次數(shù)與相對普通制劑比較至少減少一次或用藥時間間隔有所延長。
7.條款1中所述緩(控)釋作用時間范圍為6～24小時。
8.條款1中所述口服緩(控)釋劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、微球劑、微囊劑、膠束、水劑、乳劑、脂質(zhì)體、糊精包合物等口服制劑。
9.條款1中所述天然水蛭素和重組水蛭素具體體內(nèi)功能為抗凝血，抗血栓形成的作用。
全文摘要
水蛭素是迄今為所知最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，天然水蛭素和應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組水蛭素都已經(jīng)應(yīng)用于臨床上心腦血管方面疾病的治療?，F(xiàn)存的國內(nèi)外水蛭素類藥物在劑型設(shè)計上都是胃腸道直接溶解給藥和注射給藥。給藥后藥物在體內(nèi)壽命較短，有效血藥濃度僅能維持1小時左右，難以適應(yīng)大多數(shù)慢性高凝狀態(tài)疾病患者長期抗凝治療的需要。本專利發(fā)明的口服水蛭素緩(控)釋新劑型延長了水蛭素在體內(nèi)的壽命，有效血藥濃度維持可達(dá)6－24，并有較好的生物利用度，具有潛在新一代口服抗凝藥物的價值。
文檔編號A61K38/58GK1393266SQ0112159
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月26日
發(fā)明者游自立, 黃秀東, 張俊山, 呂志強(qiáng), 張高俠, 肖建國 申請人:梅伯皋