專利名稱：細胞死亡抑制蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過與caspase-12或其前體結合來抑制caspase-12活化的蛋白，以及含有該蛋白的細胞死亡抑制劑。
caspase是一族在多細胞生物體的編程性細胞死亡中起著關鍵性作用的蛋白酶。至今已從人和鼠中鑒定了Caspase族的十四個成員(Thornberry,N.A.和Lazebnik,Y.,“caspase，內部危害物”，科學281,1312-1316(1998))。通過利用其特異蛋白水解活性裂解一組特異的蛋白來實現Caspase的功能。存在多種caspase的原因之一被認為是因為不同的caspase功能對應于不同的編程性細胞死亡刺激物。
現在正在闡明，當caspase與正常功能如發(fā)育過程中的形態(tài)形成，成人中(體內)穩(wěn)態(tài)的維持，和對身體有害細胞的清除有關時，如果它們被非正?；罨瘎t可能引起嚴重的疾病如神經變性的疾病(Yuan,J.和Yankner,B.A.,Nat.Cell Biol.1,E44-45(1999))。
Caspase被生物合成為非活性前體的形式并通過分子內的特異性裂解(過程)而被活化。因此，如果這一過程被抑制，則有可能抑制由caspase引起的編程性細胞死亡。
本發(fā)明的目的是提供一種抑制caspase-12活化的蛋白和一種含有該蛋白的細胞死亡抑制劑。
為了解決上述問題，本發(fā)明發(fā)明人通過廣泛和深入地研究，結果發(fā)現了一種癌特異蛋白MAGE-3或其被截短的形式與caspase-12或其前體(以下常被稱作“caspase-12前體”)特異結合。因而實現本發(fā)明的目的。
本發(fā)明涉及一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白，或編碼該重組蛋白的基因(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
本發(fā)明的一個技術方案中，上述基因是一種由選自下列(C)和(d)的DNA組成的基因(c)一種由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列組成的DNA，(d)一種在嚴格條件下與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列雜交的DNA并且該DNA編碼一種抑制caspase-12活化的蛋白。
本發(fā)明還涉及一種含有上述基因的重組載體。
本發(fā)明還涉及一種含有上述重組載體的轉化體。
本發(fā)明還涉及一種制備抑制caspase-12活化的蛋白的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉化體并從得到的培養(yǎng)物中回收該蛋白。
本發(fā)明還涉及一種通過將MAGE-3蛋白和/或其截短形式與caspase-12或其前體結合所形成的復合物。
本發(fā)明還涉及一種含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的細胞死亡抑制劑。
在本發(fā)明的一個技術方案中，MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。在本發(fā)明的一個技術方案中，MAGE-3蛋白的截短形式是一種選自上述(a)和(b)的重組蛋白。
在本發(fā)明的一個技術方案中，細胞死亡是至少一種選自編程性細胞死亡、壞死、預定(scheduled)細胞死亡、程序細胞死亡和細胞損傷的細胞死亡。
本發(fā)明還涉及一種用于治療細胞死亡相關疾病的治療劑，該治療劑含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
在本發(fā)明的一個技術方案中，與細胞死亡有關的疾病是至少一種選自阿爾茨海默疾病、神經變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。
本發(fā)明還涉及一種抑制caspase-12的活化的方法，包括將MAGE-3蛋白或其截短形式與caspase-12或其前體結合。
本發(fā)明還涉及一種檢測組織或細胞內的抗編程性細胞死亡活性的方法，包括采用特異識別MAGE-3蛋白或其截短形式的抗體來處理所述組織或細胞，并檢測所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述組織或細胞中的表達，其中檢測到所述MAGE-3蛋白或其所述截短形式的高度表達表明所述細胞組織具有抗編程性細胞死亡活性。
本發(fā)明還涉及一種檢測組織或細胞內抗編程性細胞死亡活性的方法，包括檢測編碼MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在組織或細胞中的表達。


圖1表示純化源自大腸桿菌的MAGE-3蛋白的SDS-聚丙酰胺凝膠電泳圖譜。
圖2表示測定哺乳動物培養(yǎng)細胞中MAGE-3與caspase-12結合的試驗結果。
圖3表示測定哺乳動物培養(yǎng)細胞中MAGE-3與caspase-12的p10區(qū)域結合的試驗結果。
圖4表示MAGE-3的氨基酸序列。
圖5表示MAGE-3與兩種形式的caspase-12(即成熟酶和酶原)之間的結合親合力的比較結果。
圖6表示caspase-12前體的示意圖。
圖7表示測定MAGE-3抑制caspase-12活化的結果。
圖8表示通過MAGE-3的高表達誘導細胞抵抗編程性細胞死亡的實驗結果。
本說明書包括本申請要求了優(yōu)先權的在先日本專利申請NO.2000-41927的說明書和/或附圖的內容。
本發(fā)明涉及一種被命名為“黑素瘤相關抗原3”的癌-特異蛋白及其截短形式和它們的用途?；谏鲜龅鞍拙哂幸种芻aspase-12的加工過程的功能這一發(fā)現而實現了本發(fā)明。
caspase-12前體定位在細胞的內質網(ER)上，并通過ER-特異應力引發(fā)的自我加工過程而成為有活性的caspase-12(Nakagawa,T．等，自然403,98-103(2000))。已提出ER應力是一種阿爾茨海默疾病、人類神經變性疾病的誘因。因此，通過利用MAGE-3抑制從caspase-12前體到成熟caspase-12的活化或成熟caspase-12本身的活化，與ER應力有關的疾病如阿爾茨海默疾病能得到預防或治療。而且，由于MAGE-3蛋白對caspase活化的抑制與caspase-12具有特異性，因此利用MAGE-3的抑制劑是高度特異的，因此預料不會對其它caspase的正常功能產生副作用。
本文使用的表達方式“抑制caspase-12的活化”的意思是通過與caspase-12前體的特異結合來抑制從caspase-12前體到成熟caspase-12的加工過程，或通過與成熟caspase-12的特異結合來抑制從caspase-12前體到成熟(活化)caspase-12的功能。這種抑制的結果使得由成熟caspase-12引起的細胞死亡得到抑制成為可能。然而，本發(fā)明中，優(yōu)選地是讓MAGE-3或其截短形式與caspase-12前體結合。
本發(fā)明中，通過MAGE-3(Caugler,B．等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))蛋白或其截短形式抑制caspase-12的活化是可能的。本發(fā)明中，MAGE-3蛋白被表示為“MAGE-3”，編碼MAGE-3的基因被表示為“MAGE-3”。MAGE-3及其截短形式對caspase-12特異并且不具有結合其它caspase的活性。
本發(fā)明中，通過傳統基因工程技術分離MAGE-3。將得到的基因引入載體來制備重組載體，在將重組載體引入合適的宿主來制備轉化體。如果將重組載體構建成能在宿主中具有功能的表達載體，通過培養(yǎng)轉化體可以獲得MAGE-3。
1．編碼MAGE-3及其截短形式的基因的克隆首先，為了獲得本發(fā)明的MAGE-3而進行MAGE-3的克隆。盡管MAGE-3的核苷酸序列是己知的(Caugler,B．等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))，但它也可通過以下描述的基因工程技術來制備。
(1)MAGE-3的cDNA文庫的構建和篩選可通過傳統技術來制備MAGE-3的mRNA。例如，用胍試劑或酚試劑處理睪丸或腫瘤的組織或細胞來獲得全長RNA。然后，通過采用以寡脫氧胸苷酸(dT)纖維素或采用Sepharose2B的聚尿苷酸-Sepharose(瓊脂糖凝膠)為載體的親和柱方法或通過分批方法獲得聚腺苷?；腞NA(mRNA)。以得到的mRNA為模板，采用寡脫氧胸苷酸引物和反轉錄酶合成單鏈cDNA。然后，從單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。將如此得到的雙鏈cDNA整合到合適的克隆載體中來制備重組載體。用該重組載體轉化諸如大腸桿菌的宿主。以四環(huán)素抗性和氨芐青霉素抗性為標記篩選所產生的轉化體從而獲得cDNA文庫。
或者，本發(fā)明可以使用商品cDNA文庫(例如，人睪丸cDNA文庫；Clontech)。
作為從選擇的轉化體中篩選具有目的DNA的那些克隆的篩選方法，例如可以采用使用抗體的免疫篩選技術或以已知DNA序列為基礎合成引物然后使用該引物進行PCR的方法。
(2)截短的MAGE-3的制備本發(fā)明中，設計并合成編碼截短形式的MAGE-3的基因(下文稱作“截短的MAGE-3”)。截短形式的MAGE-3指的是在MAGE-3的全長氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的N-端或C-端或兩端具有氨基酸缺失的蛋白，最多缺失氨基酸的總數是312。更特別地，截短形式的MAGE-3指的是缺失后至少保留了2個，優(yōu)選地10個或更多的SEQ IDNO:2的氨基酸的多肽或蛋白。本發(fā)明的截短形式的MAGE-3的特定實例包括缺失了從SEQ ID NO:2的位點1至位點81(絲氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了從SEQ IDNO:2的位點1至位點88(絲氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了從SEQ ID NO:2的位點1至位點90(谷氨酰胺)的氨基酸的MAGE-3蛋白；和缺失了從SEQ ID NO:2的位點1至位點93(谷氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白。
本發(fā)明的截短形式的MAGE-3(下文稱作“截短的MAGE-3”)中，缺失了從SEQ ID NO:2的位點1至位點93的氨基酸的MAGE-3蛋白以SEQ ID NO:4表示。與SEQ ID NO:2的部分氨基酸序列對應的這一氨基酸序列跨越位點94至位點314。
通過以MAGE-3(SEQ ID NO:1；Caugler,B．等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))為模板和采用以定位于目的截短蛋白編碼區(qū)以外的SEQ ID NO:1的任何區(qū)域的部分序列為基礎所設計的引物進行PCR能夠獲得這些截短的蛋白。必須指出為了合成截短的MAGE-3將含有翻譯起始密碼的核苷酸序列插入到編碼區(qū)的5’端是有利的。
(3)MAGE-3的突變體和截短MAGE-3的突變體的構建本發(fā)明中，將突變引入MAGE-3或截短MAGE-3的部分氨基酸序列是可能的。因此，本發(fā)明的MAGE-3或截短MAGE-3的還包括這些突變蛋白。為了將突變引進氨基酸，采用一種將突變引進編碼目的氨基酸的基因的核苷酸序列的技術。
通過已知技術如Kunkel的方法或缺口雙鏈體方法，或通過基于這些方法的技術可以將突變引進基因。例如，通過以引進突變的寡核苷酸為引物(Yoshikawa,F．等，生物化學雜志271:18277-18284(1996))的點-特異誘變可以引進突變。這可以采用商品誘變試劑盒如Mutan-K(Takara)或Mutan-G(Takara)或體外誘變系列試劑盒(Takara)中的LA PCR來進行。
例如，合成了由在MAGE-3或截短的MAGE-3的核苷酸序列中發(fā)現的突變核苷酸及其側翼區(qū)(每側大約10個核苷酸)組成的引物。然后，以MAGE-3為模板并使用上述引物進行PCR。純化PCR產物并采用合適的限制酶進行處理，因而獲得想要的MAGE-3或截短的AMAGE-3。
(4)核苷酸序列的測定測定如此獲得的基因的核苷酸序列。通過Maxam-Gilbert的化學修飾法或利用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法進行測序。然而，通常采用自動DNA測序儀進行測序(例如，377A DNA序列儀；Perkin-Elmer)。
SEQ ID NO:1表示MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:2表示MAGE-3的氨基酸序列。SEQ ID NO:3表示截短的MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:4表示截短的MAGE-3的氨基酸序列。只要由這些氨基酸序列組成的多肽具有特異結合caspase-12或caspase-12前體的活性(即，只要它們能夠抑制caspase-12的活化)，那么這些氨基酸序列就可能發(fā)生了突變如缺失、替換或添加了一個或多個(例如，一個或幾個，優(yōu)選地大約一個至十個，更優(yōu)選地一個至五個)氨基酸。
除了編碼含在本發(fā)明的截短MAGE-3(SEQ ID NO:4)中的氨基酸的基因(SEQ ID NO:3)外，本發(fā)明的基因還包括只是簡并密碼不同的編碼相同多肽的簡并異構體。而且，本發(fā)明的基因還包括在嚴格條件下與截短的MAGE-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)雜交并編碼抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。本文使用的“嚴格條件”指的是這樣的條件，即其中發(fā)生了所謂的特異性雜交，但沒有發(fā)生非特異性雜交。例如，可以給出的那些條件，即其中兩個高度同源的核苷酸(即，彼此具有60％或更高，優(yōu)選地80％或更高同源性的DNA)相互雜交，但兩個同源性較低的核苷酸之間不發(fā)生雜交。更特別地是，采用15-900mM，優(yōu)選地15-150mM的鈉濃度，和37-70℃，優(yōu)選地68℃的溫度。
一旦測出了本發(fā)明的截短的MAGE-3的核苷酸序列，就可以通過化學合成或通過采用基于所測核苷酸序列合成的引物而進行的PCR來獲得本發(fā)明的基因。
3．含有本發(fā)明的基因的重組載體和轉化體的制備(1)重組載體的制備通過將本發(fā)明的基因連接(插入)到合適的載體中來獲得本發(fā)明的重組載體。只要能夠在宿主中復制，插入了本發(fā)明基因的載體沒有特別的限制。例如，可以使用質粒DNA、噬菌體DNA等等。
質粒DNA的特定實例包括商品質粒如pBluescript SK+(Stratagene)。本發(fā)明使用的其它質粒的實例包括來源于大腸桿菌的質粒(例如，pBR322,pBR325,pUC118和pUC119)，來源于枯草芽孢桿菌的質粒(例如，pUB110和pTP5)和來源于酵母的質粒(例如，YEp13,YEp24和YCp50)。噬菌體DNA的特定實例包括λ噬菌體(例如，Charon4A Charon21A,EMBL3,EMBL4,λgt10,λgt11和λZAP)。并且，還可以使用動物載體如反轉錄病毒、腺病毒或痘苗病毒；或昆蟲病毒載體如桿狀病毒。并且，可以使用其中連接了基因表達活化蛋白(如B41)的融合質粒(例如，pJG4-5)。本發(fā)明可以使用的融合質粒并不限于上述的pJG4-5。本發(fā)明還可以使用其中連接著GST、GFP、His-tag、Myc-tag等的融合質粒。
為了將本發(fā)明的基因插入載體中，可以采用的方法是用合適的限制酶消化純化的DNA，然后插入到合適的載體DNA的限制酶切位點或多克隆位點中來與載體連接。
本發(fā)明的基因必須與載體進行可操縱性的連接。為了這個目的，除了啟動子和本發(fā)明的基因外，如果需要，本發(fā)明的載體可含有順式元件如一個加強子、一個剪切信號、一個聚腺苷酸插入信號、篩選標記、一個核糖體結合序列(SD序列)等。作為篩選標記，可以列舉出氯霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因等。
(2)轉化體的制備將本發(fā)明的重組載體引入宿主可以獲得本發(fā)明的轉化體，因而進行目的基因的表達。只要能夠表達本發(fā)明的基因，所述宿主沒有特別的限制。本發(fā)明可以使用的宿主的特定實例包括埃希氏桿菌如大腸桿菌；芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌；假單胞桿菌如惡臭假單胞菌；酵母菌如釀酒酵母、粟酒裂殖酵糖母；動物細胞和昆蟲細胞。
如果采用細菌如大腸桿菌作為宿主，那么本發(fā)明的重組載體優(yōu)選地不但能夠在宿主中自我復制而且還由一個啟動子、一個核糖體結合序列、本發(fā)明的基因和一個轉錄終止序列組成。
本發(fā)明可以使用的大腸桿菌的特定實例包括BL21(DE3)、JM109和HB101。本發(fā)明可以使用的枯草芽孢桿菌的特定實例包括WB700和LKS87。
只要能夠指導本發(fā)明的基因在宿主如大腸桿菌中表達，任何啟動子都可以用來作為本發(fā)明的啟動子。例如，可以使用一種來源于大腸桿菌或噬菌體的啟動子如trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子或PR啟動子；或一種來源于大腸桿菌-感染噬菌體的啟動子如T7啟動子。也可以使用人工修飾的啟動子如tac啟動子。
如果以酵母作為宿主，可以使用例如釀酒酵母、粟酒裂殖糖酵母或Pichia pastoris。這種情況下可使用的啟動子沒有受到特別的限制。只要能夠指導本發(fā)明的基因在酵母菌中表達，任何啟動子都可以使用?？梢粤信e，例如，GAL1啟動子、GAL10啟動子、熱休克蛋白啟動子，MFα1啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、AOX1啟動子等。作為將重組載體引入酵母的方法，可以使用任何DNA轉移方法?？梢粤信e，例如，電穿孔方法(Beker,D.M.，酶學方法，194:182-187(1990))，原生質球法(Hinnen,A．等，美國國家科學院院報，75:1929-1933(1978))，醋酸鋰方法(Itoh,H.,J.Bacteriol.,153:163-168(1983))等。
如果以動物細胞作為宿主，可以使用猿COS-7或非洲綠猴腎細胞株系細胞；中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；小鼠L細胞；大鼠GH3,PC12或NG108-15細胞；人FL、HEK293、Hela或Jurkat細胞等。SRα啟動子、SV40啟動子、LRT啟動子、β-肌動蛋白啟動子等可用作啟動子。還可使用人巨細胞病毒的早期基因啟動子。例如，可以采用電穿孔、磷酸鈣方法或脂轉染作為將重組載體引入動物細胞的方法。
如果以昆蟲細胞為宿主，可以使用Sf9細胞、Sf21細胞等。例如，可以采用磷酸鈣方法、脂轉染或電穿孔作為將重組載體引入昆蟲細胞的方法。
4．截短的MAGE-3的制備通過培養(yǎng)上述轉化體和從得到的培養(yǎng)物中回收所述蛋白來獲得本發(fā)明的截短的MAGE-3。術語“培養(yǎng)物”指的是下列任何物質培養(yǎng)物上清液、培養(yǎng)細胞或微生物，或從培養(yǎng)細胞或微生物得到的裂解產物。按照普遍用于培養(yǎng)宿主的傳統方法進行本發(fā)明轉化體的培養(yǎng)。
只要含有可被微生物同化的碳源、氮源和無機鹽并能有效培養(yǎng)轉化體，無論是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基都可用作培養(yǎng)由微生物宿主如大腸桿菌或酵母菌獲得的轉化體的培養(yǎng)基。
碳氫化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉；有機酸如乙酸、丙酸；和醇如乙醇和丙醇可以用作碳源。氨，無機或有機酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨；其它含氮化合物；胨；肉抽提物；玉米漿等可用作氮源。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵(Ⅱ)，硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等可用作無機物。
通常，在有氧條件(如振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng))和37℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)過程中，PH保持在6.5至7.5。用無機或有機酸、堿溶液等進行PH調節(jié)。培養(yǎng)過程中，如果需要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素如氨芐青霉素或四環(huán)素。
當對用含有誘導啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養(yǎng)時，如果需要，可以往培養(yǎng)基中添加誘導物。例如，當對用含有由異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養(yǎng)時，可以往培養(yǎng)基中添加IPTG。當對用含有由吲哚乙酸(IAA)誘導的trp啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養(yǎng)時，可以往培養(yǎng)基中添加IAA。
可以采用通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，或一種補充了胎牛血清的這些培養(yǎng)基等作為培養(yǎng)從動物宿主細胞中獲得的轉化體的培養(yǎng)基。通常，在5％CO2的條件下和37℃下培養(yǎng)1至30天。培養(yǎng)過程中，如果需要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素如卡那霉素或青霉素。
培養(yǎng)后，如果蛋白產生于微生物或細胞內，則通過諸如超聲處理、反復凍融、或勻漿器處理的方法裂解微生物或細胞來獲得本發(fā)明截短的MAGE-3。如果本發(fā)明截短的MAGE-3產于微生物或細胞外，則直接采用培養(yǎng)液或進行離心去除微生物或細胞。然后，采用傳統分離/純化蛋白的生化技術處理得到的上清液。這些技術包括硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析和親合層析，并且這些技術可以單獨使用，也可以進行適當的組合來使用。因此，從上述培養(yǎng)物中可以分離和純化到本發(fā)明的蛋白。
5．細胞死亡抑制劑MAGE-3或其截短的MAGE-3與caspase-12或其前體發(fā)生特異反應，因而抑制了從前體到成熟酶的轉變過程。因此，MAGE-3或其截短的MAGE-3可用作細胞死亡抑制劑。MAGE-3或其截短的MAGE-3還可用于治療或預防與細胞死亡有關的疾病(細胞死亡相關疾病)。而且，MAGE-3或其截短的MAGE-3被用作基因治療的治療劑。另外，通過測定細胞中的MAGE-3含量，能夠檢測細胞或組織抵抗編程性細胞死亡的能力。
細胞死亡相關疾病的特定實例包括阿爾茨海默疾病、神經變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。不論這些疾病是單獨發(fā)生還是以并發(fā)癥的形式發(fā)生，都可以采用本發(fā)明的治療劑進行治療。所述并發(fā)癥也包括上述疾病與其它疾病的結合。
本發(fā)明的治療劑或用于基因治療的治療劑可以經口服或非腸道和系統或局部給藥。
如果本發(fā)明的所述蛋白或基因被用作細胞死亡相關疾病的預防劑或治療劑(包括基因治療劑)，則沒有特別限制靶位。例如，本發(fā)明的治療劑可用于治療或預防發(fā)生在神經系統(如大腦、脊髓)、血管系統(如動脈、靜脈、心臟)、呼吸系統(如氣管、肺)、消化系統(如唾液腺、胃、腸、肝、胰腺)、淋巴系統(如淋巴節(jié)、脾、胸腺)、泌尿系統(如腎)，或生殖系統(如睪丸、卵巢、子宮)的組織中的細胞死亡相關疾病的特定目的。這種疾病可能是一種獨立的疾病，也可能與其它細胞死亡相關疾病并發(fā)，或者甚至與細胞死亡相關疾病之外的疾病并發(fā)。
如果本發(fā)明的治療劑是口服用藥，則可將該治療劑制成任何劑型如片劑、膠囊、粒劑、粉劑、丸劑、錠劑、內服液劑、懸浮液、乳化液或糖漿?；蛘?，所述治療劑可以制成使用前才再次溶解的干燥產品。如果本發(fā)明的治療劑是非腸道給藥，則可將該治療劑配制成靜脈注射液(包括點滴液)、肌內注射液、腹膜注射液、皮下注射液、栓劑等。注射液可以單位劑量安瓿或多劑量容器的形式提供。
通過傳統方法采用醫(yī)藥制劑中通常使用的合適賦形劑、填充劑、結合劑、增濕劑、崩解劑、潤滑劑、表面活性劑、分散劑、緩沖液、保藏劑、溶解輔佐劑、抗菌劑、調味劑/香料、止痛劑、穩(wěn)定劑、等滲劑等來制備這些配方藥。
上述每一種配方藥可含有藥學上可接受的載體或添加劑。這種載體或添加劑的特定實例包括水、藥學上可接受的有機溶劑、膠原、聚乙烯乙醇、聚乙烯吡咯酮、羧基乙烯聚合物、藻酸鈉、水溶葡聚糖、羧甲(基)淀粉鈉、果膠、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙烯甘醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨醇和乳糖。根據制劑的劑型可以選擇一種或多種這些添加劑或適當地進行結合。
本發(fā)明治療劑的劑量大小取決于如對象的年齡、給藥途徑和給藥次數這樣因素，并且變化幅度很大。當本發(fā)明的有效量的所述蛋白與合適的稀釋劑和藥學上可接受的載體一起給藥時，每次給藥時的蛋白有效量范圍為0.0001至1000mg/體重。治療劑可以一天給藥一次或每天幾個劑量。
當本發(fā)明的基因被用作基因治療的藥劑時，則本發(fā)明的基因可以通過注射直接給藥?；蛘撸越Y合了本發(fā)明基因的載體的形式給藥。用于這一目的的合適載體的特定實例包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體和反轉錄病毒載體。通過采用這一病毒載體，本發(fā)明的基因可以有效的給藥?；蛘?，本發(fā)明的基因可以包裹在磷脂泡囊如脂質體中，并且得到的脂質體能夠對對象進行給藥。由于脂質體是含有生物降解物質的封閉泡囊，所以將本發(fā)明的基因和脂質體混合以便基因保留在脂質體的內液層和雙層脂膜中(形成了脂質體-基因復合物)。接著，當這一復合物與細胞一起培養(yǎng)時，復合物中的基因就被細胞吸收(脂轉染)。然后，得到的細胞通過下述方法進行給藥。
作為本發(fā)明的基因治療劑的給藥方法，除了傳統系統給藥如靜脈或動脈內給藥外，還可以對神經中樞系統(如大腦、脊髓)、血管系統(如動脈、靜脈、心臟)、呼吸系統(如氣管、肺)、消化系統(如唾液腺、胃、腸、肝、胰)、淋巴系統(如淋巴結、脾、胸腺)、泌尿系統(如腎)、生殖系統(如睪丸、卵巢、子宮)等進行局部給藥。而且，還可以采用結合導管技術和外科手術的方法。
本發(fā)明基因治療劑的使用劑量根據諸如對象的年齡、性別和條件、給藥的途徑、給藥的次數和配方的類型這些因素而變化。通常，本發(fā)明基因的合適使用劑量是每天0.1-100mg/成人。
6．抗編程性細胞死亡活性的檢測測定本發(fā)明適用于細胞或組織內抗編程性細胞死亡活性的檢測。主要是，那些作為MAGE-3的檢測結果顯示出高效表達MAGE-3(包括其截短的形式)的細胞或組織被判斷為具有抗編程性細胞死亡活性。MAGE-3或其截短形式的檢測和定量可以通過將其與特異識別MAGE-3或其截短形式的抗體(多克隆或單克隆)進行反應來進行。將從細胞或組織制備的提取物點在一張膜如硝酸纖維素膜上以便制備斑點印跡，或將提取物進行電泳并轉移到一張膜如硝酸纖維素膜上以便制備蛋白印跡。然后，抗MAGE-3的抗體和第二抗體與印跡進行反應以便檢測MAGE-3?；蛘?，采用如ELISA(酶聯免疫親合測定)這種技術對提取物直接進行MAGE-3定量檢測。也可以用抗MAGE-3的抗體直接對細胞或組織進行免疫染色來檢測那些具有獲得性抗編程性細胞死亡活性的細胞或組織。
而且，還可以通過檢測組織或細胞中編碼MAGE-3或其截短形式的mRNA來檢測組織或細胞的抗編程性細胞死亡活性?？梢酝ㄟ^對組織采用原位雜交或位點PT-PCR(反轉錄/聚合酶鏈反應)來檢測mRNA或通過對從組織或細胞中得到的提取物采用RNA印跡法或PT-PCR來進行mRNA的檢測。
以下將參照實施例更加詳細地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明的技術范圍并不限于這些實施例。這些實施例中使用的核苷酸相關試劑和酶是從Takara生物化學公司(Takara Biochemicals(日本))和新英格蘭生物試驗室(New England Biolabs(美國))購買的。培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基物質是從Difco(美國)購買的。培養(yǎng)哺乳動物細胞的培養(yǎng)基物質是從Gibco-BRL(美國)購買的。除非另有說明，其它試劑是由Sigma-Aldrich(美國)生產的。
實施例1MAGE-3的克隆以人睪丸cDNA文庫(Clontech，美國)為模板進行PCR(聚合酶鏈反應)來獲得用于大規(guī)模表達實驗的MAGE-3蛋白的編碼區(qū)。整個操作過程如下所述。不僅是本實施例中，后面的實施例中DNA和RNA的整個處理過程都按照Sambrook等描述的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F,和Maniatis,T.，等編寫的分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，美國，紐約，冷泉港(1989))進行。
盡管在包括黑素瘤的許多癌細胞中觀察到了MAGE-3的高表達，但是，MAGE-3在正常細胞中的表達只限于睪丸(Van Pel,A，等，免疫周報(Immunol.Rev.)145,229-250(1995))。PCR中使用的引物(例如，NTOP77,NBOT68,NTOP79和NBOT65)具有下述序列。為了便于以下克隆，5’引物(NTOP79)含有可被EcoRV酶切割的GATATC序列，3’引物(NBOT65)含有可被XhoI酶切割的CTCGAG序列。
NTOP77:GCCCAGCTCCTGCCCACACT(SEQ ID NO:5)NBOT68:GGATGCGGCCCCGGAAGGT(SEQ ID NO:6)NTOP79:CTCGATATCGCACCATGCCTCTTGAGCAGAGG(SEQID NO:7)NBOT65:CTCCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCT(SEQ ID NO:8)用于PCR的一套DNA聚合酶和反應緩沖液(擴展的高保真PCR系統)是從Boehringer Mannheim(德國)購買的。PCR的反應條件如下所述。主要是，以1ng的睪丸cDNA為模板和采用引物NTOP77進行第一次PCR。這第一次反應循環(huán)40次，一個循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(56℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。一千分之一的PCR產物用于第二次PCR。采用引物NTOP79和NBOT65，第二次PCR循環(huán)35次，一個循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(50℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。
PCR反應結果，大約900bp的DNA片斷被特異擴增。采用EcoRV和XhoI酶(兩者購自于Takara Biochemicals)切割該片斷的兩端后，經瓊脂凝膠電泳，再提取DNA(采用美國的Bio101生產的Geneclean試劑盒)來純化所述片斷。將純化的DNA片斷插入到普通載體pBluescriptSK(-)的EcoRV和XhoI位點來得到質粒pBN178。
實施例2MAGE-3的大規(guī)模生產采用大腸桿菌大規(guī)模生產MAGE-3首先，通過PCR擴增克隆在pBN178中的MAGE-3。將可被限制性酶NheI切割的序列加到5’引物，將可被限制性酶XhoI切割的序列加到3’引物。反應循環(huán)25次，一個循環(huán)過程由變性(94℃保持1分鐘)，引物退火(51℃保持1分鐘)和DNA延伸(72℃保持1分鐘)組成。
以實施例1中所述的相同方式純化擴增DNA片斷，然后，插入到大腸桿菌表達質粒載體pRSET-A(Invitrogen，美國)的EcoRV和XhoI位點來得到質粒pBN202。使用pRSET-A載體在克隆基因的5’端加上含有His-His-His-His-His-His(Met-Arg-Gly-His-His-His-His-His-His-Gly-Met-Ala-Ser:SEQ ID NO:9)的標記序列。這樣能夠利用帶有鎳離子的親合樹脂(例如，Probond；Invitorogen)進行表達蛋白的親合純化。
用pNB202轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS株。采用含有氨芐青霉素(100ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的轉化體(Sambrook,J.,Fritsch,E.F，和Maniatis,T.，等編寫的分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，美國，紐約，冷泉港(1989))。通過向含有處于對數生長期的轉化體的培養(yǎng)基中加入0.2mM的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)來誘導MAGE-3的表達。按照Novagen的說明書(美國)采用Probond親合樹脂(Invitrogen)純化通過強制性表達產生的MAGE-3蛋白。
結果，從1升培養(yǎng)液中獲得了大約100ug的純MAGE-3。通過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳證實了該純MAGE-3的純度很高(圖1)。
實施例3MAGE-3和Caspase-12前體之間的結合實驗在COS-1細胞中超表達Caspase-12前體和MAGE-3蛋白。然后，通過免疫沉淀技術檢測源自于COS-1細胞的提取物中它們的結合。
通過免疫兔子來制備用于免疫沉淀檢測的抗MAGE-3的抗體。主要是，將代表MAGE-3的C-末端序列的多肽(CHISYPPLHEWVLREGEE；SEQ ID NO:10；Tana Laboratories，美國)連接到載體蛋白(活化的血藍蛋白；Pierce，美國)上，然后與佐劑一起給兔子注射。在上述多肽的氨基末端人工加上“C”以便多肽與載體蛋白和所使用的親合樹脂結合。另一方面，將與上述序列相同的多肽偶聯到活化的FMP-Cellulofine樹脂上(Seikagaku公司，日本)來制備多肽柱，該多肽柱用于以下的親合純化。將從免疫兔中得到的抗血清上樣到多肽柱以使特異抗體與多肽結合。用甘氨酸溶液(PH2.6)從所述柱上洗脫特異抗體。通過加入1M的Tris將洗脫液的PH值提高到中性。這樣獲得的特異抗體被用于下面的實驗。
編碼caspase-12前體的cDNA和編碼MAGE-3的cDNA分別被克隆到哺乳動物細胞表達質粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen，美國)中，然后通過瞬時共轉染被轉移到COS-1細胞中?；蚬こ袒虮挥糜贑aspase-12前體，其中將FLAG序列(Hopp,T.P．等，生物/技術6,1204-1210(1988))插入表達產物的氨基末端。為了將這些基因轉移到COS-1細胞中，使用了優(yōu)質轉染試劑盒(Superfect Transfection Kit)(Qiagen,德國)。
轉染兩天后，回收COS-1細胞來制備細胞提取物。通過采用抗FLAG親合凝膠(Sigma-Aldrich，美國)，將插入了FLAG的Caspase-12有選擇地從細胞提取物中免疫沉淀出來。采用ELC-plus試劑盒(Amersham-Phamacia)通過蛋白印跡檢測蛋白(Harlow,E.和Lane,D.,抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，美國，紐約，冷泉港(1989))。
結果如圖2所示。圖2中，泳道1表示MAGE-3共存于免疫沉淀中。這一結果的發(fā)生是由于MAGE-3通過抗FLAG親合凝膠與Caspase-12前體進行了結合。如果以在COS-1細胞中只有MAGE-3超表達作為對照實驗，就不能通過抗FLAG親合凝膠來免疫沉淀MAGE-3(泳道2)。
因而表明在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中MAGE-3蛋白和Caspase-12前體形成了一種穩(wěn)定的復合物。
實施例4Caspase-12中的MAGE-3結合區(qū)域和其特異性的檢測按照美國的R.Brent等建立的酵母兩次雜交方法(Gyuris,J．等，細胞75,791-803(1993))檢測Caspase-12中的MAGE-3結合區(qū)域。按照這一方法，當含有這兩種蛋白基因的酵母菌株顯示β-半乳糖苷酶活性時，則可檢測到兩種蛋白的結合。
主要是，將編碼MAGE-3的cDNA克隆到載體pJG4-5中以便構建一種由MAGE-3和編碼基因表達-活化蛋白B42的基因組成的融合基因。含有這種融合基因的質粒被命名為pNB321。
將對應于含在成熟Caspase-12中的p10亞基(Thornberry,N.A．和Lazebnik,Y.，科學281,1312-1316(1998))的cDNA片斷克隆到載體Peg202中以便構建一種由p10和LexA的DNA-結合區(qū)域組成的融合基因。含有這種融合基因的質粒被命名為pNB316。
將質粒pNB321和pNB316以及含有一個β-半乳糖苷酶報道基因的pSH18-34引入一株用于分析目的的芽殖酵母菌株EGY48來構建NMY307菌株。用合成培養(yǎng)基(0.67％的酵母氮源(Difco，美國)；組氨酸-，色氨酸-和不含尿嘧啶的氨基酸/核苷酸混合物(Bio-101，美國)，2％的半乳糖)培養(yǎng)NMY307。然后，按照Gyuris等的方法(Gyuris等，細胞75,791-803(1993))檢測NMY307中的β-半乳糖苷酶活性。
另外，以所述同樣的方法檢測這樣一些酵母菌株中的β-半乳糖苷酶活性，該酵母菌株中含有編碼其它Caspase(即，Caspase-1,、-2、-3和-8)的p10區(qū)域(單獨克隆到pEG202中)和MAGE-3(克隆到pJG4-5)的基因片斷。
結果如圖3所示。圖3中，“1”,“2”,“3”,“8”和“12”分別代表含有編碼Caspase-1、-2、-3-8和-12的p10區(qū)域和MAGE-3的基因片斷的酵母菌株?！癙”代表通過將編碼活化轉錄因子的基因(克隆到pSH17-4)和β-半乳糖苷酶報道基因(克隆到pSH18-34)引進EGY48所制備的陽性對照菌株?！癗”代表通過將編碼Caspase-12的p10區(qū)域的基因片斷和β-半乳糖苷酶報道基因(克隆到pSH18-34)引進EGY48所制備的陰性對照菌株。
結果表明，其中具有β-半乳糖苷酶活性的酵母細胞產生了一種來源于物質X-Gal的有色物質(5-溴-4-氯-3-吲哆-β-D-硫代半乳糖苷)(下面板圖中的“12”)。這意味著成熟Caspase-12的p10區(qū)域結合了MAGE-3蛋白。這一β-半乳糖苷酶活性幾乎與在陽性對照菌株(下面板圖中的“P”)中觀察到的活性在強度上相同。然而，在陰性對照菌株(下面板圖中的“N”)中沒有觀察到顏色的產生。并且，在任何其它進行試驗的Caspase(即，Caspase-1、-2、-3和-8)中象陰性對照菌株“N”一樣沒有產生顏色(圖3，下面的板圖)。因此，沒有檢測到這些Caspase與MAGE-3的結合。
因此表明定位于Caspase-12的C-末端側鏈上的p10區(qū)域(在成熟Caspase-12中其變?yōu)榇蠹s10kDa的亞基)對于Caspase-12與MAGE-3的結合是必需的，并且還表明MAGE-3與Caspase-12的結合是特異的。
實施例5Caspase-12和截短形式的MAGE-3之間的結合實驗采用HeLa細胞cDNA文庫對能與Caspase-12前體的p10區(qū)域結合的因子進行研究。
將編碼Caspase-12前體的p10區(qū)域的基因片斷克隆到pEG202中并采用由R.Brent等建立的相互作用捕獲技術(Gyuris,J．等，細胞75，791-803(1993))進行處理。得到的全部結合蛋白都是截短形式的MAGE-3。這些截短形式如下所述。最短的截短形式(截短形式1)由跨越全長MAGE-3蛋白的位點94的Gly殘基到C-末端的Glu殘基的氨基酸序列組成(以SEQ ID NO:2表示)。
截短形式1由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-93位點的氨基酸截短形式2由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-90位點的氨基酸截短形式3由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-88位點的氨基酸截短形式4由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-81位點的氨基酸按照上述Gyuris等的方法檢測每一種截短形式與Caspase-12的結合。主要是，將一種編碼Caspase-12前體的p10區(qū)域的基因片斷和一種編碼截短的MAGE-3的基因片斷和一種lacZ報道基因轉化到芽殖酵母菌株EGY48中。在半乳糖合成培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)所得到的轉化體。將平板上形成的克隆轉移到一張尼龍膜上(Hybond-N+；Amersham-Pharmacia)，然后浸入液氮中來裂解酵母細胞。將上面載有裂解細胞的尼龍膜浸入一種含有X-Gal的磷酸緩沖液中(Gyuris,J．等，細胞75,791-803(1993))并在30℃下保持4-6小時。結果，證實了通過Caspase-12前體的p10區(qū)域與截短的MAGE-3的結合導致了lacZ基因在酵母細胞中進行表達時產生了半乳糖苷酶的酶活性，膜表面則發(fā)生了產生藍色的反應。
所有截短的形式呈現出很強的顏色反應。因此表明即使是跨越Gly94到Glu314的MAGE-3的部分長度的多肽(C-末端)[圖4中的所示區(qū)域跨越“”標記(位點94)到C-末端(位點314)]也具有結合Caspase-12的能力。
實施例6MAGE-3蛋白和Caspase-12之間的結合實驗(成熟Caspase-12的結合)在這個實施例中，通過GST-融合蛋白結合試驗分別測定Caspase-12的前體和活化形式與MAGE-3蛋白的結合程度。
用于這些試驗的成熟Caspase-12(下文常稱作“p30”)是通過從Caspase-12前體中去除不含在成熟(活化)Caspase-12中的N-末端結構域序列前體，然后將His-His-His-His-His-His-序列插入到N-末端來制備的。將一種編碼這個p30蛋白的eDNA片段克隆到大腸桿菌質粒載體pRSET-A中(Invitrogen)。當p30在大腸桿菌中大規(guī)模表達時，通過自我加工，該蛋白被轉化為成熟的形式。
另外，用在這些試驗中的未成熟Caspase-12如下制備。主要是，為了穩(wěn)定未成熟Caspase-12(即，防止自我加工)，采用Ser殘基替換定位在Caspase-12的活化位點的Cys殘基以便構建一個突變體p30(命名為“p30C/S”)。單獨在大腸桿菌中大規(guī)模地表達這一突變體。根據Invitrogen的說明書進行大腸桿菌的培養(yǎng)和p30蛋白的誘導合成。利用N-末端6x(His)序列、通過鎳柱親合色譜(Probond親合樹脂；Invitrogen)來純化p30和p30C/S。
為了容易地回收Caspase-12-回收產物，制備了編碼由MAGE-3和融合到其末端的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)組成的融合蛋白的cDNA(pNB341)。主要是，將編碼MAGE-3的cDNA克隆到大腸桿菌表達質粒載體pGEX-4T-3(Amersham-Pharmacia；瑞典)中以便前者的讀框與后者的讀框重合，因而構建一個融合基因。將pNB341引進大腸桿菌XL-2Blue MRF’，按照Amersham-Pharmacia的說明書進行細胞培養(yǎng)和GST-MAGE-3融合蛋白的誘導合成。使用谷胱甘肽樹脂(谷胱甘肽Sepharose4B；Amersham-Pharmacia)從大腸桿菌細胞的提取物中純化GST-MAGE-3融合蛋白。按照Amersham-Pharmacia的說明書進行純化。
將純化的GST-MAGE-3蛋白與p30(成熟Caspase-12)或p30C/S(未成熟Caspase-12)混合，然后利用谷胱甘肽樹脂從溶液中進行回收。通過蛋白印跡分析與GST-MAGE-3蛋白共沉淀的蛋白。
結果見圖5。本圖中的每條泳道如下說明泳道1其中成熟Caspase-12與GST進行了混合的對照實驗(不含MAGE-3)泳道2與GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的成熟Caspase-12泳道3其中Caspase-12前體與GST進行了混合的對照實驗(不含MAGE-3)泳道4與GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的未成熟Caspase-12從圖5所見，盡管認為p30(成熟Caspase-12)和p30C/S(未成熟Caspase-12)是共沉淀的，但認為p30C/S比p30的沉淀要早得多。因此，盡管兩者都能進行結合，但發(fā)現未成熟Caspase-12比成熟Caspase-12更能有效地與GST-MAGE-3蛋白結合。
實施例7MAGE-3抑制Caspase的活化本實施例中，體外合成的Caspase-12前體(48kDa)被裂解為成熟的Caspase-12，從而在體外再現體內活性。
Caspase-12的前體裂解為成熟Caspase-12的位點是特異的。這個裂解位點是一個特定Asp殘基，該Asp殘基定位在成熟Caspase-12中的大約20kDa到10kDa亞基(分別稱作p20和p10)之間的邊緣上(圖6；泳道2，圖7)。這一特異裂解可能會通過向裂解反應中加入MAGE-3蛋白而被抑制。實驗如下進行。
主要是，采用編碼Caspase-12前體的cDNA和體外蛋白合成試劑盒(TNT體外轉錄/轉譯試劑盒；Promega，美國)合成Caspase-12前體。合成反應中加入35S-標記的甲硫氨酸(Amersham-Pharmacia)以使產生的酶原被放射性標記。
在含有20mM Tris-HCl(PH7.0)和10mM二硫蘇糖醇的緩沖液中將放射性標記的Caspase-12前體、成熟Caspase-12和MAGE-3蛋白進行混合。然后，在37℃下進行45分鐘的裂解反應。通過加入等體積的2X電泳樣品緩沖液[100mM Tris-HCl(PH6.8),2％月桂基硫酸鈉，10％巰基乙醇，0.2％溴酚藍，20％甘油]并在100℃下將溶液加熱4分鐘來終止反應。
將該反應溶液制成SDS-聚丙酰胺凝膠(14％)。所得到的凝膠采用致敏物(Ampify；Amersham-Pharmacia)進行處理、干燥并進行放射自顯影。采用BAS2500檢測系統(Fuji膜，日本)檢測干膠含有的放射性蛋白。
結果見表7。每一泳道說明如下。
(1)板圖A泳道1在有放射性甲硫氨酸存在的條件下體外合成的Caspase-12前體泳道2-7由Caspase-12前體裂解為的成熟Caspase-12(0.28μg)。裂解反應是在MAGE-3蛋白存在的條件下進行的，MAGE-3蛋白的用量如下所示泳道2(0μg)，泳道3(0.3μg)，泳道4(1.5μg)，泳道5(3μg)，泳道6(6μg)，泳道7(12μg)。
泳道8由Caspase-12前體裂解為的成熟Caspase-12(1.1μg)。裂解反應是在有12μgMAGE-3蛋白存在的條件下進行的。
泳道9由Caspase-12前體裂解成的成熟Caspase-12(1.1μg)。對照樣品。裂解反應是在以12μg牛血清清蛋白替換MAGE-3蛋白的條件下進行的。
(2)板圖B泳道1類似于板圖A中泳道7的樣品的樣品(即，反應混合物中加入兩倍量的底物(Caspase-12前體))泳道2類似于板圖A中泳道7的樣品的樣品(即，裂解反應在有24μgMAGE-3存在的條件下進行的)泳道3與板圖A中的泳道9的樣品相同的樣品圖7A中的泳道2至7顯示了實驗的結果，該實驗中逐漸增大存在于反應中的MAGE-3蛋白的量(0到12μg)。加入12μg的MAGE-3幾乎能夠完全抑制生成Caspase-12的裂解反應。當以加入12μg的牛血清清蛋白替換MAGE-3作為對照實驗時，沒有觀察到抑制作用(泳道9，圖7A)。抑制作用主要是由MAGE-3與Caspase-12結合導致的結果。
而且，在12μg的MAGE-3就能幾乎完全抑制裂解反應的條件下加入過量的成熟Caspase-12(即，1.1μg；4倍于用于泳道2-7的量，圖7A)并不能恢復裂解反應(泳道8，圖7A)。然而，在相同的條件下，加入過量(即，0.4μl的體外翻譯蛋白溶液；兩倍于用于泳道1，板圖B和泳道1至9，板圖A的量)的底物(Caspase-12前體)，則又可檢測到特異性的裂解(泳道2，圖7B)。
這些結果表明Caspase是通過特異性分子內的裂解被活化的。還表明MAGE-3與Caspase-12前體的有力結合抑制了Caspase-12的活化。
實施例8培養(yǎng)細胞中MAGE-3的抗編程性細胞死亡效應這個實施例證實了MAGE-3在細胞中的高表達增強了細胞對內質網(ER)應力-依賴編程性細胞死亡的抗性。
為了檢測在細胞水平上MAGE-3對Caspase-12活化的抑制，構建了能高表達MAGE-3的細胞克隆。然后，檢測細胞對于編程性細胞死亡刺激物的反應。在除睪丸以外的組織中測定MAGE-3的表達水平(Van,Pel,A.等，免疫周報(Immunol.Rev.145,229-250(1995))。
主要是，采用優(yōu)質轉染試劑盒(Superfect Transfection Kit)，將含有編碼MAGE-3的cDNA的質粒pNB179引入鼠成肌細胞株C2C12中。由于pNB179含有抗藥基因neo，所以含有這個組合到染色體中的質粒的轉化細胞選擇性地生長在含有抗菌素Geneticin(Gibco-BRL)的培養(yǎng)基中。經過兩個星期的選擇培養(yǎng)，挑出培養(yǎng)平板上形成的抗性細胞的菌落，分別進行培養(yǎng)，然后進行克隆。通過蛋白印跡檢測每個克隆中表達量(采用抗MAGE-3蛋白的抗體)。
Caspase-12被細胞中的ER-依賴、編程性細胞死亡-誘導刺激物所活化(Nakagawa,T.，等，自然403,98-103(2000))。然后本發(fā)明發(fā)明人以0.4μM的濃度向上述高表達克隆的培養(yǎng)基中加入了毒胡蘿卜素(24小時)，所述毒胡蘿卜素是ER-特異性鈣ATP酶的抑制劑，(Calbiochem，美國；Thastrup,O．等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2466-2470(1990))。
結果，胞內鈣平衡被打破，促進了Caspase-12的活化。因此，誘導了細胞內的編程性細胞死亡。更特別地是，當用0.4μM濃度的毒胡蘿卜素對C12C12細胞進行(親本株)24小時處理時，50％或更多的細胞死亡，并顯示出編程性細胞死亡的形態(tài)(圖8中的右上板圖)。
另外，當以相同方式、采用毒胡蘿卜素處理C2/MA13和C2MA21克隆時，細胞顯示出抗性。據顯微鏡觀察，這些克隆的90％或更多的細胞保持正常形態(tài)(圖8中的右中板圖和右下板圖)。左側板圖顯示了對照實驗的結果，其中細胞是用0.1％的二甲基磺酸處理的。
因此，為了定量分析對毒胡蘿卜素處理的抗性，計算了每個細胞克隆的存活率。采用細胞計數試劑盒-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司，日本)測定的結果表明在用毒胡蘿卜素處理24小時后，C12C12的存活率降低到50％，而C2/MA13和C2MA21的存活率仍保持在很高水平(75％)。因而表明在MAGE-3高表達的情況下，細胞對ER-特異性應力具有抗性。這意味著MAGE-3抑制編程性細胞死亡的發(fā)生和發(fā)展。
本說明書中的所有出版物、專利和申請都是以全文的形式在本說明書中引用參考。
根據本發(fā)明，提供了一種蛋白和含有該蛋白的細胞死亡抑制因子，該蛋白通過與Caspase-12特異結合來抑制Caspase-12的活化。該蛋白被用作抑制細胞死亡如編程性細胞死亡的藥物。
正文中沒有提到的序列表SEQ ID NO:5合成DNASEQ ID NO:6合成DNASEQ ID NO:7合成DNASEQ ID NO:8合成DNASEQ ID NO:9合成多肽SEQ ID NO:10合成多肽序列表<110>RIKEN<120>細胞死亡抑制蛋白質<130>PH-1154<140><141><150>JP2000-41927<151>18-FEB-2000<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4204<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(2465)..(3409)<400>1acgcaggcag tgatgtcacc cagaccacac cccttccccc aatgccactt cagggggtac 60tcagagtcag agacttggtc tgaggggagc agaagcaatc tgcagaggat ggcggtccag 120gctcagccag gcatcaactt caggaccctg agggatgacc gaaggccccg cccacccacc 180cccaactccc ccgaccccac caggatctac agcctcagga cccccgtccc aatccttacc 240ccttgcccca tcaccatctt catgcttacc tccaccccca tccgatcccc atccaggcag 300aatccagttc cacccctgcc cggaacccag ggtagtaccg ttgccaggat gtgacgccac 360tgacttgcgc attggaggtc agaagaccgc gagattctcg ccctgagcaa cgagcgacgg 420cctgacgtcg gcggagggaa gccggcccag gctcggtgag gaggcaaggt aagacgctga 480gggaggactg aggcgggcct cacctcagac agagggcctc aaataatcca gtgctgcctc 540tgctgccggg cctgggccac cccgcagggg aagacttcca ggctgggtcg ccactacctc 600accccgccga cccccgccgc tttagccacg gggaactctg gggacagagc ttaatgtggc 660cagggcaggg ctggttagaa gaggtcaggg cccacgctgt ggcaggaatc aaggtcagga 720ccccgagagg gaactgaggg cagcctaacc accaccctca ccaccattcc cgtcccccaa 780cacccaaccc cacccccatc ccccattccc atccccaccc ccacccctat cctggcagaa 840tccgggcttt gcccctggta tcaagtcacg gaagctccgg gaatggcggc caggcacgtg 900agtcctgagg ttcacatcta cggctaaggg agggaagggg ttcggtatcg cgagtatggc 960cgttgggagg cagcgaaagg gcccaggcct cctggaagac agtggagtcc tgaggggacc 1020cagcatgcca ggacaggggg cccactgtac ccctgtctca aaccgaggca ccttttcatt 1080cggctacggg aatcctaggg atgcagaccc acttcagcag ggggttgggg cccagccctg 1140cgaggagtca tggggaggaa gaagagggag gactgagggg accttggagt ccagatcagt 1200ggcaaccttg ggctggggga tgctgggcac agtggccaaa tgtgctctgt gctcattgcg 1260ccttcagggt gaccagagag ttgagggctg tggtctgaag agtgggactt caggtcagca 1320gagggaggaa tcccaggatc tgcagggccc aaggtgtacc cccaaggggc ccctatgtgg 1380tggacagatg cagtggtcct aggatctgcc aagcatccag gtgaagagac tgagggagga 1440ttgagggtac ccctgggaca gaatgcggac tgggggcccc ataaaaatct gccctgctcc 1500tgctgttacc tcagagagcc tgggcagggc tgtcagctga ggtccctcca ttatcctagg 1560atcactgatg tcagggaagg ggaagccttg gtctgagggg gctgcactca gggcagtaga 1620gggaggctct cagaccctac taggagtgga ggtgaggacc aagcagtctc ctcacccagg 1680gtacatggac ttcaataaat ttggacatct ctcgttgtcc tttccgggag gacctgggaa 1740tgtatggcca gatgtgggtc ccctcatgtt tttctgtacc atatcaggta tgtgagttct 1800tgacatgaga gattctcagg ccagcagaag ggagggatta ggccctataa ggagaaaggt 1860gagggccctg agtgagcaca gaggggatcc tccaccccag tagagtgggg acctcacaga 1920gtctggccaa ccctcctgac agttctggga atccgtggct gcgtttgctg tctgcacatt 1980gggggcccgt ggattcctct cccaggaatc aggagctcca ggaacaaggc agtgaggact 2040tggtctgagg cagtgtcctc aggtcacaga gtagaggggg ctcagatagt gccaacggtg 2100aaggtttgcc ttggattcaa accaagggcc ccacctgccc cagaacacat ggactccaga 2160gcgcctggcc tcaccctcaa tactttcagt cctgcagcct cagcatgcgc tggccggatg 2220taccctgagg tgccctctca cttcctcctt caggttctga ggggacaggc tgacctggag 2280gaccagaggc ccccggagga gcactgaagg agaagatctg taagtaagcc tttgttagag 2340cctccaaggt tccattcagt actcagctga ggtctctcac atgctccctc tctccccagg 2400ccagtgggtc tccattgccc agctcctgcc cacactcccg cctgttgccc tgaccagagt 2460catc atg cct ctt gag cag agg agt cag cac tgc aag cct gaa gaa ggc 2509Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly1 5 10 15ctt gag gcc cga gga gag gcc ctg ggc ctg gtg ggt gcg cag gct cct 2557Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro
20 25 30gct act gag gag cag gag gct gcc tcc tcc tct tct act cta gtt gaa 2605Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu35 40 45gtc acc ctg ggg gag gtg cct gct gcc gag tca cca gat cct ccc cag 2653Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln50 55 60agt cct cag gga gcc tcc agc ctc ccc act acc atg aac tac cct ctc 2701Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu65 70 75tgg agc caa tcc tat gag gac tcc agc aac caa gaa gag gag ggg cca 2749Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro80 85 90 95agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc agt agg 2797Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg100 105 110aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga gcc agg 2845Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg115 120 125gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga aat tgg 2893Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp130 135 140cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc ttg cag 2941Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Sar Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln145 150 155ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc cac ttg 2989Leu Val Phe Gly Ile Glu Lau Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu160 165 170 175tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg ctg ggt 3037Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly180 185 190gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc ctg gcc 3085Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala195 200 205ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc tgg gag 3133Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu210 215 220gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt atc ttg 3181Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu225 230 235ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa aac tac 3229Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr240 245 250 255ctg gag tac cgg cag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat gaa ttc 3277Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe260 265 270ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa gtc ctg 3325Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu275 280 285cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac cca ccc 3373His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro290 295 300ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga gtctgagcac3419Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310 315gagttgcagc cagggccagt gggagggggt ctgggccagt gcaccttccg gggccgcatc 3479ccttagtttc cactgcctcc tgtgacgtga ggcccattct tcactctttg aagcgagcag 3539tcagcattct tagtagtggg tttctgttct gttggatgac tttgagatta ttctttgttt 3599cctgttggag ttgttcaaat gttcctttta acggatggtt gaatgagcgt cagcatccag 3659gtttatgaat gacagtagtc acacatagtg ctgtttatat agtttaggag taagagtctt 3719gttttttact caaattggga aatccattcc attttgtgaa ttgtgacata ataatagcag 3779tggtaaaagt atttgcttaa aattgtgagc gaattagcaa taacatacat gagataactc 3839aagaaatcaa aagatagttg attcttgcct tgtacctcaa tctattctgt aaaattaaac 3899aaatatgcaa accaggattt ccttgacttc tttgagaatg caagcgaaat taaatctgaa 3959taaataattc ttcctcttca ctggctcgtt tcttttccgt tcactcagca tctgctctgt 4019gggaggccct gggttagtag tggggatgct aaggtaagcc agactcacgc ctacccatag 4079ggctgtagag cctaggacct gcagtcatat aattaaggtg gtgagaagtc ctgtaagatg 4139tagaggaaat gtaagagagg ggtgagggtg tggcgctccg ggtgagagta gtggagtgtc 4199agtgc 4204<210>2<211>314<212>PRT<213>人類<400> 2Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu1 5 10 15Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala20 25 30Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
35 40 45Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser50 55 60Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp65 70 75 80Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser85 90 95Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys100 105 110Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu115 120 125Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln130 135 140Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu145 150 155 160Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr165 170 175Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp180 185 190Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile195 200 205Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu210 215 220Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly225 230 235 240Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu245 250 255Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu260 265 270Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His275 280 285His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu290 295 300His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310<210>3<211>666<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(666)<400>3ggg cca agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc 48Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15agt agg aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga 96Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30gcc agg gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga 144Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45aat tgg cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc 192Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60ttg cag ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc 240Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80cac ttg tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg 288His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95ctg ggt gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc 336Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110ctg gcc ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc 384Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125tgg gag gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt 432Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140atc ttg ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa 480Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160aac tac ctg gag tac cgg Gag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat 528Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175gaa ttc ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa 576Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190gtc ctg cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac 624Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205cca ccc ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga 666Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>4<211>221<212>PRT<213>人類<400>4Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述分成DNA<400>5gcccagctcc tgcccacact20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>6ggatgcggcc ccggaaggt19<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>7ctcgatatcg caccatgcct cttgagcaga gg32<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400> 8ctcctcgagt cactcttccc cctctct 27<210>9<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400> 9Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser1 5 10<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>10Cys His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly1 5 10 15Glu Glu
權利要求
1．一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
2．一種編碼選自下列(a)和(b)的重組蛋白的基因(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
3．一種由選自下列(c)和(d)的DNA組成的基因(c)一種由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列組成的DNA，(d)一種在嚴格條件下與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列雜交并編碼抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。
4．一種含有權利要求2或3所述基因的重組載體。
5．一種含有權利要求4所述的重組載體的轉化體。
6．一種生產抑制caspase-12活化的蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求5所述轉化體并從所得到的培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
7．一種由MAGE-3蛋白和/或其截短形式結合caspase-12或其前體所形成的復合物。
8．一種含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的細胞死亡抑制劑。
9．一種如權利要求8所述的細胞死亡抑制劑，其中MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。
10．一種如權利要求8所述的細胞死亡抑制劑，其中MAGE-3蛋白的截短形式是一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
11．一種如權利要求8至10中任意一項權利要求所述的細胞死亡抑制劑，其中細胞死亡至少是一種選自編程性細胞死亡、壞死、預定細胞死亡、程序細胞死亡和細胞損傷的細胞死亡。
12．一種用于細胞死亡相關疾病的治療劑，含有作為活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
13．如權利要求12所述的治療劑，其中MAGE-3蛋白是一種選自下列(e)和(f)的重組蛋白(e)一種由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白，(f)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白。
14．如權利要求12所述的治療劑，其中截短形式的MAGE-3蛋白是一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列組成的蛋白。
15．如權利要求12至14中的任何一項權利要求所述的治療劑，其中與細胞死亡有關的疾病是至少一種選自阿爾茨海默疾病、神經變性疾病、自體免疫疾病、肌萎縮和器官紊亂的疾病。
16．一種抑制caspase-12活化的方法，包括將MAGE-3蛋白和/或其截短形式結合到caspase-12或其前體上。
17．一種檢測組織或細胞內的抗編程性細胞死亡活性的方法，包括采用特異識別MAGE-3蛋白或其截短形式的抗體來處理所述組織或細胞，并檢測所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述組織或細胞中的表達，其中檢測到所述MAGE-3蛋白或其截短形式的高度表達表明所述細胞組織具有抗編程性細胞死亡的活性。
18．一種檢測組織或細胞內的抗編程性細胞死亡活性的方法，包括檢測編碼MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在組織或細胞內的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制caspase－12活化的蛋白以及該蛋白的用途。本發(fā)明涉及一種選自下列(a)和(b)的重組蛋白(a)一種由SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列組成的蛋白，(b)一種由具有缺失、替換或添加了一個或幾個氨基酸并且抑制caspase－12活化的SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列組成的蛋白。
文檔編號A61P37/00GK1316432SQ0111651
公開日2001年10月10日 申請日期2001年2月18日 優(yōu)先權日2000年2月18日
發(fā)明者森島信裕, 柴田武彥 申請人:理化學研究所