專利名稱：銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物(gbe)的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物(GBE)的提取分離和制備方法以及銀杏葉聚戊烯醇的用途。
銀杏葉提取物(GBE)及其制劑中藥用活性成分為黃酮甙和萜內(nèi)酯，已廣泛用于心腦血管和外周血管疾病的治療和防治，國內(nèi)外已有大量的專利報(bào)道。用銀杏葉制備聚戊烯醇曾有日本專利報(bào)道。但以銀杏葉為原料，先提取、制備聚戊烯醇，再從提取過的殘?jiān)刑崛?、制備含銀杏萜內(nèi)酯和黃酮甙的銀杏葉提取物未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一種以銀杏葉為原料先以親脂性溶劑提取、制備聚戊烯醇，再以提取后的銀杏葉殘?jiān)鼮樵?，用親水性溶劑制備含銀杏萜內(nèi)酯和銀杏黃酮甙的銀杏葉提取物(GBE)的方法。本發(fā)明提供的制備方法，可同時(shí)生產(chǎn)銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物(GBE)，也可單獨(dú)生產(chǎn)銀杏葉聚戊烯醇。
日本專利(JP昭58-201747和EP0166436A2)報(bào)道可用溶劑提取、柱層析分離、溶劑溶解分級、冷凍沉淀分離、分子精餾等方法制備銀杏葉聚戊烯醇，從實(shí)施例看，主要是用銀杏黃葉為原料，氯仿室溫浸泡、硅膠柱分離制備聚戊烯醇乙酸酯、再經(jīng)水解和硅膠柱分離，制備聚戊烯醇，產(chǎn)品得率僅有0.2％-0.3％。該方法工藝復(fù)雜，成本高，難以工業(yè)化生產(chǎn)；并且該方法旨在通過分離聚戊烯醇來合成多萜醇，從而對多萜醇及其磷酸酯(胺)進(jìn)行相關(guān)藥理研究和藥物開發(fā)，但沒有考慮銀杏葉提取物(GBE)的加工，無法綜合加工銀杏葉的藥用活性成分(如銀杏葉黃酮甙、萜內(nèi)酯和聚戊烯醇等)。
本發(fā)明方法采用的銀杏葉為3-10年的銀杏青葉，采集季節(jié)為8-9月，其聚戊烯醇的含量為0.8％以上，黃酮甙含量1.0％以上，萜內(nèi)酯含量0.25％以上；單獨(dú)制備銀杏葉聚戊烯醇時(shí)，可采用3年以上樹齡的銀杏青葉，也可使用20年以上樹齡的銀杏黃葉，其聚戊烯醇含量為0.8％以上。制備的聚戊烯醇得率約0.3％-1.0％，銀杏葉提取物(GBE)得率約2.0％-3.0％。
在本發(fā)明中，首先用親脂性溶劑例如石油醚和正己烷提取銀杏葉，然后用親水性溶劑例如乙醇-水的混合溶劑提取剩下的銀杏葉，依次提取分離銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物。溶劑用量是銀杏葉重量的5-15倍，熱提取和冷浸提均可，優(yōu)選熱回流提取，真空濃縮回收溶劑，制備親脂性溶劑抽提物軟膏(見表1-2)和親水性溶劑提取物。
在本發(fā)明制備聚戊烯醇的方法中，用無機(jī)強(qiáng)堿的水溶液例如NaOH-H2O、KOH-H2O或醇溶液(NaOH-EtOH/MeOH、KOH-EtOH/MeOH)，優(yōu)選NaOH-H2O和NaOH-EtOH。堿-水溶液的濃度為3％-50％，優(yōu)選10％-30％，堿-醇溶液的濃度為5％-35％，優(yōu)選10％-20％(見表3)。皂化后萃取用非極性溶劑為C5-C7的脂肪烷烴、石油醚(60℃-90℃)、乙醚等，優(yōu)選石油醚(60℃-90℃)和正己烷。溶劑沉淀是用石油醚(60℃-90℃)、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等中的一種或幾種溶劑對萃取相進(jìn)行溶解和沉淀，溫度為-20℃-50℃。去除不溶物，制備聚戊烯醇粗制品，其聚戊烯醇含量為50％-75％。柱層析分離是用氧化鋁、硅膠、硅藻土、活性炭、纖維素等中一種或幾種介質(zhì)為填料對聚戊烯醇粗制品進(jìn)行分離，優(yōu)選氧化鋁、硅膠和活性炭；柱層析分離所用淋冼劑為C5-C7的脂肪烷烴、石油醚(60℃-90℃)、乙醚、丙酮中的一種或幾種，可以單獨(dú)淋洗也可二種混合溶液淋洗。再經(jīng)濃縮、干燥制備聚戊烯醇精制品，其聚戊烯醇的含量為70％-95％(見表4)。
表1.親脂性溶劑對不同葉源銀杏葉的浸提結(jié)果序投入計(jì)量 軟膏得率 聚戊烯醇含量 聚戊烯醇浸出率葉源號(hào)(g) (％)(％) (％)1 邳州苗葉3006.016.877.5(3-5年)2 邳州苗葉15 6.216.176.8(5-10年)3 郯城苗葉50 5.118.775.1(3-5年)4 郯城苗葉3005.018.271.7(5-10年)泰興老樹5 葉(20年 5004.412.075.4以上)從表1可知，選用的親脂性溶劑對銀杏葉中聚戊烯醇的浸出率均高于70％，但幼樹葉中聚戊烯醇含量高，其浸膏中聚戊烯醇的含量也高于老樹葉，同時(shí)根據(jù)我們以前的研究，銀杏苗葉中萜內(nèi)酯和黃酮苷等其它有效成分的含量都較老樹葉高，為目前GBE生產(chǎn)用的主要原料。
因此本發(fā)明實(shí)施方案中，考慮銀杏葉的綜合利用，優(yōu)選苗葉作為生產(chǎn)用葉，其聚戊烯醇＞0.8％，黃酮甙＞1.0％，萜內(nèi)酯＞0.25％。
表2.不同浸提方式下親脂性溶劑對聚戊烯醇浸提結(jié)果序浸提方式 浸提條件 投料量 浸膏得率 聚戊烯醇含量 浸出率號(hào) (g) (％) (％) (％)1 索氏提取 3-8hr300 6.0 16.8 77.560～70℃2 熱回流 2hr-5hr 300 4.4 16.2 54.880℃3 熱回流 4hr-6hr300 5.0614.3 55.750℃4 室溫冷泡 4天/1 300 3.4 27.1 70.9天5 室溫冷泡 2天/1 300 1.8 34.2 47.4天表3.親脂性溶劑抽提物軟膏的皂化和萃取結(jié)果序葉源 軟膏重量 皂化方式聚戊烯醇萃取物收率號(hào) (g)(％)1邳州苗葉15 NaOH-EtOH 382泰興老樹200 NaOH-EtOH 50.5青葉3泰興老樹140 NaOH-EtOH 56黃葉4邳州苗葉10 NaOH-H2O 31表4.聚戊烯醇精制產(chǎn)品序號(hào) 葉源 產(chǎn)品得率(％) 聚戊烯醇含量(％)1邳州苗葉 0.7～1.0 ＞752郯城苗葉 0.7～1.0 ＞753邳州苗葉 0.8～1.3 50～704泰興老樹葉 0.5～0.6 40～505邳州苗葉 0.3～0.6 ＞90
在本發(fā)明制備銀杏葉提取物的實(shí)施方案中，離心沉降是將親水性溶劑提取的濃縮物(比重為1.10-1.20)用水稀釋至原銀杏葉重量的3-6倍進(jìn)行離心，去除不溶物。樹脂吸附是將離心沉降后的澄清液用大孔吸附樹脂(D101、D201、D130、AB-8)和聚酰胺樹脂等介質(zhì)進(jìn)行吸附和解附，優(yōu)選D130、AB-8和聚酰胺等樹脂，分離制備銀杏葉提取物。解附所用的洗脫液用脂肪族低級醇和水的混合溶劑，醇與水的比例為10％-80％，優(yōu)選乙醇；有機(jī)萃取是用極性較小或非極性溶劑對柱層析解附液進(jìn)行萃取，萃取劑為C5-C7的脂肪烷烴、石油醚(60℃-90℃)、乙醚和氯仿等；極性較小溶劑是指乙酸乙酯、乙醚、丁醇和丁酮等。優(yōu)選氯仿、正己烷、乙醚、乙酸乙酯等。目的是控制GBE產(chǎn)品中的有機(jī)酚酸小于5ppm。干燥是對萃取后的水層進(jìn)行濃縮、真空干燥或噴霧干燥。產(chǎn)品為銀杏葉提取物(GBE)，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。
本發(fā)明的另一目的是提供按本發(fā)明制備的銀杏葉聚戊烯醇，作為主要的生物活性成分，用于抗腫瘤和輔助化療腫瘤制劑。
按本發(fā)明方法制備的銀杏葉聚戊烯醇屬樺木聚戊烯醇型，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 ω-單元 trans-單元cis-單元 α-單元其中m＝2，n＝11-18，簡寫為ω-(trans)m-(cis)n-α。
本發(fā)明制備的聚戊烯醇制品以聚戊烯基單元數(shù)為17(C85)、18(C90)的聚戊烯醇為主，其中C85為25-30％，C90為30-40％，C90和C85之和約60-70％左右。不同鏈長聚戊烯醇的相對含量如下C750-3％，C805-10％， C8525-30％， C9030-40％，C9515-20％， C1003-8％， C1053-5％， C1100-3％.
銀杏葉聚戊烯醇與人體中多萜醇(Dolichol)結(jié)構(gòu)和組成相似，在體內(nèi)能代謝為多萜醇磷酸酯(Dolichyl phosphate)，參與細(xì)胞膜糖蛋白的生物合成。人體中多萜醇磷酸酯不足，將影響機(jī)體的免疫功能、細(xì)胞分裂和再生，并導(dǎo)致癌變。腫瘤病人的血、尿中多萜醇含量明顯高于正常人。
在聚戊烯醇生物活性方面，拉脫維亞和俄羅斯報(bào)道了從歐洲赤松、云杉等針葉(RU2,053,992和GB2,310,138)分離制備的聚戊烯醇的毒藥理研究結(jié)果，開發(fā)了聚戊烯醇制劑“ROPREN”，用于免疫功能調(diào)節(jié)。俄羅斯專利RU2005475還報(bào)道了利用西佰利亞云杉針葉聚戊烯醇合成聚戊烯醇磷酸酯，用于制備抗病毒藥物。銀杏葉聚戊烯醇組成和針葉聚戊烯醇有所不同，關(guān)于銀杏葉聚戊烯醇的制劑和藥效未見報(bào)道。
用本發(fā)明制備的聚戊烯醇進(jìn)行的毒、藥理研究表明，銀杏葉聚戊烯醇無毒，其小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，雌雄小鼠LD50值大于21.5g/kg，屬無毒級；對移植性腫瘤具有明顯的抑制作用，與化療常用藥聯(lián)合使用，可提高抑瘤率，可用作腫瘤的防治和輔助化療藥。
聚戊烯醇為脂溶性油狀物，其劑型可為軟膠囊、口服液、注射液、乳劑等，優(yōu)選軟膠囊和乳劑。
以下所述實(shí)施例，詳細(xì)說明了本發(fā)明。實(shí)例1取干燥銀杏葉5kg，加60kg石油醚(60℃-90℃)，熱回流提取，時(shí)間4小時(shí)，第二次提取加30kg石油醚(60℃-90℃)，重復(fù)以上操作。合并提取液，50℃下減壓回收盡溶劑，得石油醚(60℃-90℃)抽提物220g，加3L25％ NaOH-EtOH溶液，70℃下反應(yīng)3小時(shí)，回收盡乙醇，加水至3L，用石油醚和乙醚的混合溶液2L萃取，重復(fù)4次，合并萃取液，回收溶劑，得濃縮物75g；再分別用0.5L石油醚、乙醇和丙酮溶解，過濾去除不溶物，回收溶劑，得濃縮物48g，為聚戊烯醇粗品(50％-75％)。將粗品進(jìn)行柱層析，取氧化鋁0.2kg和硅膠0.5kg，分別用0.8L石油醚和乙醚及丙酮洗脫，將石油醚和乙醚洗脫液進(jìn)行活性炭脫色，回收溶劑，濃縮物為淡棕色油狀物，即為聚戊烯醇精制品30g(75％-95％)。
將石油醚提取后的銀杏葉，加50kg50％乙醇水溶液，加熱回流，溫度為80-90℃，時(shí)間3小時(shí)，過濾，第二次提取加30kg50％乙醇水溶液，時(shí)間2小時(shí)，合并濾液，65℃下減壓濃縮至比重為1.20，加水至30kg，離心沉淀，澄清液用5kgD130大孔樹脂進(jìn)行吸附，分別用15kg水、10kg20％乙醇-水、5kg70％乙醇-水洗脫，65℃下減壓濃縮回收溶劑。將低濃度醇洗脫液濃縮至無醇味，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑為乙酸乙酯濃縮物；再將高濃度醇洗脫液的濃縮物和乙酸乙酯濃縮物合并，用3L氯仿和正己烷萃取3次，水層濃縮后進(jìn)行噴霧干燥，產(chǎn)品為淡黃色粉末130g，即為銀杏葉提取物(GBE)，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。實(shí)例2取干燥銀杏葉1kg，加10kg石油醚(60℃-90℃)，室溫冷浸靜泡3天，第二次加1kg石油醚(60℃-90℃)，重復(fù)以上操作。合并提取液，50℃下減壓回收盡溶劑，得石油醚(60℃-90℃)抽提物30g，加0.2L35％NaOH-H2O溶液，70℃下反應(yīng)4小時(shí)，回收盡乙醇，加水至0.5L，用石油醚和乙醚的混溶液0.3L萃取，重復(fù)4次，合并萃取液，回收溶劑，得濃縮物11g；再分別用0.5L石油醚、乙醇和丙酮溶解，過濾去除不溶物，回收溶劑，得濃縮物7.6g，為聚戊烯醇粗品(50％-75％)。將粗品進(jìn)行柱層析，取氧化鋁50g和硅膠50g，分別用100ML石油醚和乙醚及丙酮洗脫，將石油醚和乙醚洗脫液進(jìn)行活性炭脫色，回收溶劑，濃縮物為淡棕色油狀物，即為聚戊烯醇精制品4g(75％-95％)。
將石油醚提取后的銀杏葉渣轉(zhuǎn)移到提取罐，加入45％乙醇水溶液8L，加熱回流，溫度為80-90℃，時(shí)間3小時(shí)，過濾，第二次提取加6L25％乙醇水溶液，時(shí)間2小時(shí)，合并濾液，65℃下減壓濃縮至比重為1.20，加水至4L，離心沉淀，澄清液用1kgAB-8大孔樹脂和0.5kg聚酰胺樹脂吸附，分別用2L水、2L20％乙醇-水、1L70％乙醇-水洗脫，65℃下減壓濃縮回收溶劑。將低濃度醇洗脫液濃縮至無醇味，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑為乙酸乙酯濃縮物；再將高濃度醇洗脫液的濃縮物和乙酸乙酯濃縮物合并，用0.5L氯仿和正己烷萃取3次，水層濃縮后進(jìn)行噴霧干燥，產(chǎn)品為淡黃色粉末20g，即為銀杏葉提取物(GBE)，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。實(shí)例3取干燥銀杏葉2kg，加正己烷20kg，在60℃-80℃溫度下用索氏提取裝置提取6-8小時(shí)，提取液50℃下減壓回收盡溶劑，得正己烷抽提物105g，加1.2L15％ KOH-EtOH溶液，70℃下反應(yīng)2小時(shí)，冷卻，用正己烷1L萃取，重復(fù)4次，合并萃取液，回收溶劑，得濃縮物44g；再分別用0.5L正己烷、乙醇和丙酮溶解，過濾去除不溶物，澄清液通過裝有硅膠(0.5kg)的填充柱進(jìn)行柱層析，用1L正己烷洗脫，洗脫液中加入0.2kg的活性炭，靜置半小時(shí)，過濾，50℃下減壓濃縮正己烷溶液，其濃縮物為淡黃色油狀物12g，即為銀杏葉聚戊烯醇精制品(75％-95％)。
剩下的葉渣，用于制備銀杏葉提取物(GBE)，其方法同實(shí)例2。精制得60g淺黃色粉末，即為銀杏葉提取物(GBE)，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。銀杏葉聚戊烯醇的藥效試驗(yàn)結(jié)果如下一.銀杏葉聚戊烯醇抗移植性腫瘤的藥效作用1.1 供試樣品銀杏葉聚戊烯醇為橙黃色油狀液體，聚戊烯醇活性成分的含量大于75％，生產(chǎn)批號(hào)991218，簡寫為GP-1。加少量吐溫80，邊研磨邊加蒸餾水配制成所需濃度。1.2 材料氟脲嘧啶(5-Fu)，南通制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)991018；鹽酸阿霉素注射液(ADM)，深圳萬樂藥業(yè)有限公司制造，批號(hào)0001E2；環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥廠，批號(hào)000312；順鉑(PDD)，齊魯制藥廠，批號(hào)000201。以上試劑均以蒸餾水配制，4℃保存?zhèn)溆谩?.3 受試動(dòng)物ICR小鼠雌雄各半，體重18-22克，由江蘇省腫瘤防治研究所動(dòng)物房提供，動(dòng)物合格證號(hào)蘇動(dòng)質(zhì)字第97005號(hào)。1.4 小鼠移植性腫瘤模型肝癌實(shí)體型Heps，肉瘤S180，艾氏癌實(shí)體型EC，均由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供，由江蘇省腫瘤防治研究所動(dòng)物房傳代保種。1.5 實(shí)驗(yàn)方法取健康、腫瘤生長旺盛的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取出瘤塊，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/ml，接種于健康小鼠右前肢下，每只0.2毫升。接種后24小時(shí)隨機(jī)分組，分對照組(給予相應(yīng)溶媒)，給藥組(給予不同劑量的GP-1)和陽性對照組(5-Fu或ADM)并開始分別灌胃給藥(ig)，每日給藥一次，連續(xù)8～10日，停藥24小時(shí)后處死小鼠，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重，對照組平均瘤重1克以上可進(jìn)行結(jié)果分析。按公式計(jì)算抑瘤率，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。抑瘤率≥30％以上判斷為有一定的抗癌作用。
抑瘤率＝(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％1.6 結(jié)果1.6.1 銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)對小鼠移植性肝癌Heps的抑制作用以80mg/Kg，40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃給藥，結(jié)果如表5.
表5 GP-1對小鼠移植性肝癌Heps的抑制作用(n＝30)分組 藥物劑量 給藥 體重變化(克) 瘤重(克)抑瘤mg/kg× 途徑 給藥前 給藥后 x±S 率d (％)H2O25×8ig 19.8±1.5 26.0±4.8 2.8±0.54GP-180×8ig 119.2±1.7 26.1±4.4 1.88±0.51**33.80GP-140×8ig 19.1±1.3 23.3±2.9 1.71±0.63**39.79GP-120×8ig 19.1±1.8 25.1±4.7 2.19±0.48*22.895-Fu25×8ig 19.1±1.8 25.1±4.7 1.04±0.19**61.94H2O 25×8ig 18.4±2.7 23.8±3.0 2.42±0.59GP-140×8ig 18.6±2.8 24.2±2.4 1.63±0.39**32.64GP-120×8ig 18.6±2.3 23.8±2.6 1.77±0.30**26.86GP-110×8ig 18.7±2.6 24.8±2.2 1.62±0.37**33.065-Fu25×8ig 18.2±0.83 19.6±2.2 0.81±0.21**66.53平均值(n＝30)H2O 25×8ig 2.93±0.71GP-140×8ig 1.71±0.56**41.6GP-120×8ig 1.95±0.43**33.45GP-110×8ig 1.96±0.34**33.115-Fu25×9ig 1.21±0.33**58.70H2O 25×9ig 21.4±2.4 27.1±5.8 3.53±0.90GP-140×9ig 21.4±2.9 25.0±3.6 1.79±0.64**49.29GP-120×9ig 21.3±2.5 24.5±3.4 1.89±0.49**46.46GP-110×9ig 21.7±2.1 26.2±2.6 2.29±0.45**35.135-Fu25×9ig 21.8±2.2 24.2±2.1 1.77±0.49**49.86*p＜0.01**p＜0.005表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GP-1對移植性肝癌Heps有較好的抑制作用，實(shí)驗(yàn)最高抑瘤率達(dá)49.29％。給藥劑量為40.0mg/kg，20.0mg/kg和10.0mg/kg的三次實(shí)驗(yàn)平均抑瘤率分別為40.57％，32.07％和34.11％。從表5看，給藥9天較給藥8天的抑瘤率更高并呈明顯的量效關(guān)系，提示用藥時(shí)間增長，似可提高GP-1對移植性肝癌Heps的抑瘤效果。1.6.2 銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)對小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用GP-1以40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃給藥，對移植性肉瘤S180的抑制作用見表6.
表6 GP-1對小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用(n＝10)分組藥物劑 給藥 體重變化(克) 瘤重(克) 抑瘤率量mg/kg 途徑 給藥前 給藥后 x±S (％)×dH2O25×8ig 19.2±2.2 29.3±2.2 2.02±0.96GP-140×8ig 19.7±1.6 30.0±2.6 1.2±0.45**37.13GP-120×8ig 19.4±1.4 30.1±3.0 1.28±0.21*36.63GP-110×8ig 19.0±2.0 29.2±2.4 1.08±0.28*46.535-Fu25×8ig 19.8±1.2 24.5±2.5 0.42±0.05***79.21H2O25×8ig 20.1±3.8 29.9±4.8 2.85±0.59GP-110×8ig 20.0±3.4 27.4±2.0 1.13±0.52***60.35GP-140×8ig 21.5±2.0 29.5±4.5 0.70±0.25***60.895-Fu25×8ig0.60±0.23***66.48平均值(n＝10)H2O25×8ig2.02±0.96GP-140×8ig1.27±0.45**37.13GP-120×8ig1.28±0.21*36.63GP-110×8ig1.08±0.28*46.535-Fu25×8ig0.79±0.28**60.81*p＜0.01**p＜0.005***p＜0.001從表6.看三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組的GP-1對移植性肉瘤S180都有較強(qiáng)的抑制，40mg/Kg和20mg/kg劑量組平均抑瘤率相差不大，均為37％左右，而低劑量組10mg/kg平均抑瘤率可達(dá)46.53％，最高時(shí)可達(dá)60.89％，顯示低劑量的抑瘤率更高。1.6.3 銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)對小鼠移植性艾氏癌EC的抑制作用GP-1以40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃給藥，對移植性艾氏癌EC抑制作用見表7.
表7 GP-1對小鼠移植性艾氏癌EC的抑制作用(n＝30)分組藥物劑量給藥 體重變化(克)瘤重(克) 抑瘤mg/kg×d途徑給藥前 給藥后 x±S率(％)H2O 25×8ig 19.3±1.8 27.0±1.7 1.43±0.33GP-140×8ig 19.0±1.1 24.5±2.2 0.72±0.21**49.65GP-120×8ig 19.2±1.6 26.8±2.0 0.96±0.26**32.87GP-110×8ig 19.1±1.6 25.7±2.3 0.93±0.20***34.965-Fu25×8ig 19.0±1.2 24.4±2.2 0.52±0.16***63.64平均值(n＝30)H2O 25×8ig 1.62±0.61GP-140×8ig 0.77±0.23**52.47GP-120×8ig 1.08±0.32**33.33GP-110×8ig 0.97±0.32***40.125-Fu25×8ig 0.56±0.16***65.43*p＜0.01**p＜0.005***p＜0.001表7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GP-1對移植性艾氏癌EC抑制作用較強(qiáng)，40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg的平均抑瘤率為52.47％、33.33％、40.12％，但量效關(guān)系不明顯，低劑量10mg/Kg抑瘤率高于20mg/Kg劑量抑瘤率，高劑量組40mg/Kg實(shí)驗(yàn)最高抑瘤率達(dá)52.47％(p＜0.005)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)對移植性腫瘤Heps，S180和EC都有較好的抑制效果，其最高抑瘤率分別為49.29％、60.89％和52.47％，且對S180似較敏感。因此GP-1有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。二.銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)輔助化療腫瘤作用1.1 受試樣品、材料、受試動(dòng)物、S180瘤譜和實(shí)驗(yàn)方法見GP-1抗移植性腫瘤的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5。2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇臨床常用化療藥如鹽酸阿霉素(ADM)、環(huán)磷酰胺(CTX)和順鉑(PDD)對移植性腫瘤肉瘤S180進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)，同時(shí)分別聯(lián)合銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)對移植性腫瘤肉瘤S180進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表8。表8 GP-1聯(lián)合化療藥對移植性腫瘤肉瘤S180的抑瘤作用(n＝10)分組 藥物劑量給藥瘤重(克) 抑瘤 抑瘤提高mg/kg×d途徑 x±S 率(％) 率(％)H2O 25×8 ig 1.85±0.59GP-1 10×8 ig 1.13±0.52**60.35GP-1+ADM (20+1)×8 ig 0.65±0.26***77.108.90GP-1+ADM (10+1)×8 ig 1.04±0.30***63.51ADM 1×8ig 0.83±0.35***70.88H2O 25×10 ig 2.09±0.38GP-1 5×10 ig 1.30±0.37***37.80GP-1+CTX (5+25)×10 ig 0.63±0.11***69.8914.10GP-1+PDD (5+1)×10 ig 0.83±0.18***60.2940.01GP-1+5-Fu (5+25)×10 ig 0.90±0.23***56.9422.69CTX 25×10 ig 0.81±0.22***61.24PDD 1×10 ig 1.19±0.22***43.065-Fu 25×10 ig 1.12±0.33***46.41*p＜0.01**p＜0.005***p＜0.001從表8的結(jié)果可知，5mg/kg GP-1聯(lián)合CTX、PDD、5-Fu明顯提高對S180的療效(p＜0.001)，尤其是輔助PDD作用更加明顯，可使1.0mg/kg PDD抑瘤率從43.06％提高到60.29％。同劑量的CTX、PDD、5-Fu對S180抑瘤提高率分別為14.10％、40.01％、22.69％。GP-1與ADM聯(lián)合化療可提高ADM的療效，20.0mg/kg的GP-1可使1.0mg/kg的ADM的抑瘤率從70.88％提高到77.10％(p＜0.001)。
因此，銀杏葉聚戊烯醇對移植性腫瘤具有明顯的輔助化療作用。
權(quán)利要求
1.銀杏葉聚戊烯醇(GPP)和銀杏葉提取物(GBE)的制備方法及其用途，其特征是首先用親脂性溶劑對銀杏葉進(jìn)行提取、皂化反應(yīng)、溶劑萃取、沉淀分離和柱層析等精制方法制備聚戊烯醇，聚戊烯醇的含量為50％～95％；其次用親水性溶劑對剩下的銀杏葉殘?jiān)M(jìn)行提取、離心沉降、樹脂吸附、有機(jī)萃取和干燥，制備銀杏葉提取物(GBE)，其中銀杏黃酮＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。該制備方法可以同時(shí)生產(chǎn)銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物，也可單獨(dú)生產(chǎn)聚戊烯醇。按本法生產(chǎn)的聚戊烯醇具有抗腫瘤活性，可用于制備抑制腫瘤和輔助化療制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，銀杏葉聚戊烯醇具有的分子式為 ω-單元 trans-單元 cis-單元 α-單元其中n為11-18，簡寫為ω-(trans)2-(cis)n-α。其主要組成為n＝13、14、15的聚戊烯醇化合物。即C85為25-30％，C90為30-40％，C90和C85之和為60-70％。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，制備銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物可用3-10年的銀杏青葉，銀杏葉中聚戊烯醇的含量為0.8％以上，黃酮含量1.0％以上，萜內(nèi)酯含量0.25％以上；單獨(dú)制備聚戊烯醇時(shí)，可用3年以上樹齡的銀杏青葉，也可使用20年以上樹齡的銀杏黃葉，聚戊烯醇含量為0.8％以上。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，親脂性溶劑為非極性溶劑，一般為C5-C7的脂肪烷烴或石油醚(60℃-90℃)，親水性溶劑為極性較大的溶劑，一般為C1-C3的脂肪醇或丙酮與水混合溶劑。先用親脂性溶劑提取銀杏葉，再用親水性溶劑提取殘葉。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，皂化反應(yīng)是對親脂性溶劑抽提物軟膏進(jìn)行皂化，皂化劑為無機(jī)強(qiáng)堿的水溶液(如NaOH-H2O、KOH-H2O)或醇溶液(NaOH-EtOH/MeOH、KOH-EtOH/MeOH)，堿-水溶液的濃度為3％-50％，堿-醇溶液的濃度為5％-35％，反應(yīng)溫度50℃-80℃，時(shí)間為0.5-5小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，溶劑沉淀是用石油醚(60℃-90℃)、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等中的一種或幾種溶劑對萃取相進(jìn)行溶解和沉淀，溫度為-20℃-50℃。去除不溶物，制備聚戊烯醇粗制品，其聚戊烯醇含量為50％-75％。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，柱層析分離是用氧化鋁、硅膠、硅藻土、活性炭、纖維素等中一種或幾種介質(zhì)為填料對聚戊烯醇粗制品進(jìn)行分離。淋冼劑為C5-C7的脂肪烷烴、石油醚(60℃-90℃)、乙醚、丙酮中的一種或幾種，可以單獨(dú)淋冼也可二種混合溶液淋冼。制備聚戊烯醇精制品，其聚戊烯醇的含量為70％-95％。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，樹脂吸附是用大孔吸附樹脂(D101、D201、D130、AB-8)和聚酰胺等介質(zhì)中一種或幾種進(jìn)行吸附和解附。有機(jī)萃取是對解附液濃縮后進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取，所選有機(jī)溶劑是指C5-C7的脂肪烷烴、石油醚(60℃-90℃)、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等。再濃縮和干燥，產(chǎn)品為銀杏葉提取物(GBE)，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。
9.如權(quán)利1所述的方法，制備銀杏葉聚戊烯醇，作為主要活性成分的制劑，用于抑制腫瘤和腫瘤的輔助化療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從銀杏葉中制備銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取物(GBE)的方法。該方法通過親脂性溶劑提取、皂化、萃取、沉淀和柱層析等工藝，制備50％－95％銀杏葉聚戊烯醇油狀物；同時(shí)通過親水性溶劑對殘?jiān)~提取、離心沉淀、樹脂吸附、溶劑萃取和干燥等工藝，制備銀杏葉提取物(GBE)干粉，其中黃酮甙＞24％，萜內(nèi)酯＞6％，銀杏酸＜5ppm。本發(fā)明提供的制備方法，可綜合利用銀杏葉原料，生產(chǎn)成本低，宜于規(guī)模型生產(chǎn)。按本發(fā)明制備的銀杏葉聚戊烯醇具有抗腫瘤和輔助化療的作用。
文檔編號(hào)A61K31/045GK1392167SQ0111369
公開日2003年1月22日 申請日期2001年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月18日
發(fā)明者王成章, 沈兆邦, 譚衛(wèi)紅, 郁青, 陳祥 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所