專(zhuān)利名稱(chēng)：用于體外受精的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可被用于體外受精的固體產(chǎn)物。
當(dāng)MAS被保持在含有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基中時(shí)，卵母細(xì)胞變得更加容易受精。然而，使用MAS的主要問(wèn)題在于它們通常具有非常低的溶解度。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是研制一種含有MAS或其一種不需要任何物理干預(yù)如加熱、攪拌或超聲波處理就能溶于水介質(zhì)中的衍生物的組合物。本發(fā)明的詳述優(yōu)選的MAS，即FF-MAS，在水中的溶解度很小，即大約為20皮克/ml(相當(dāng)于2×10-5μg/ml)，而在乙醇中的溶解度相當(dāng)大，即大約為4mg/ml。根據(jù)我們的初步研究，F(xiàn)F-MAS在乙醇和水(1∶2.5)中的最大溶解度大約為0.4mg/ml。幾種其它的MAS在水中也具有類(lèi)似低的溶解度。
令人驚奇地是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有MAS和一種添加劑的固體組合物在水中具有良好的溶解性。所述添加劑是這樣一種組分，當(dāng)添加到MAS中時(shí)，可以提供一種能被用來(lái)制備一種含有MAS的水溶液的組合物。
所述添加劑的實(shí)例是水溶性蛋白質(zhì)如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(本文被稱(chēng)作HSA)，選擇性地以重組的形式存在，酶和磷酸甘油酯如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的含量低于10％，優(yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于1％(重量/重量)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中的有機(jī)溶劑含量低于10％，優(yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于1％(重量/重量)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的MAS含量低于1％，優(yōu)選地低于0.1％，更優(yōu)選地低于0.05％(重量/重量)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的添加劑含量高于99％，更優(yōu)選地高于99.9％。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物是這樣一種組合物，其可以用不含有或只含有低濃度有機(jī)溶劑的水介質(zhì)進(jìn)行處理產(chǎn)生一種含有MAS的溶液。優(yōu)選地，這些水介質(zhì)含有少于1％，優(yōu)選地少于0.5％，更優(yōu)選地少于0.1％的有機(jī)溶劑(重量/重量)。
早期，為了滿足這一要求所進(jìn)行的數(shù)次嘗試都失敗了。
本文中，術(shù)語(yǔ)MAS是指介導(dǎo)卵母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂的化合物。更具體地，MAS是在下述實(shí)施例1中的試驗(yàn)中具有明顯高于對(duì)照的生發(fā)泡裂解(下文被稱(chēng)作GVB)百分率的化合物。優(yōu)選的MAS具有至少50％的GVB百分率，優(yōu)選地至少80％。優(yōu)選的MAS的實(shí)例是4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇(下文稱(chēng)作FF-MAS)；4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇半琥珀酸酯；5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇；5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇半琥珀酸酯；(20S)-膽甾-5-烯-3β，20-二醇；3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-24-酸-N-(甲硫氨酸)酰胺；和膽甾-5-烯-16β-醇。其它的MAS實(shí)例是在WO 96/00235，96/27658，97/00884，98/28323，98/54965和98/55498中提到的MAS，更具體地是在其權(quán)利要求1中提到的MAS。
制備本發(fā)明的組合物的一種方法是將MAS在有機(jī)溶劑如乙醇中的溶液與添加劑的水溶液混合，然后直到所述溶劑蒸發(fā)盡。通過(guò)利用該產(chǎn)物上方持續(xù)流動(dòng)的空氣、真空或任何其它用于除去溶劑的可行方法來(lái)加快蒸發(fā)進(jìn)程。被銷(xiāo)售的該產(chǎn)物可以是一種具有一個(gè)或多個(gè)凹或穴的遞送系統(tǒng)。下文中，這些凹和穴被相互稱(chēng)作穴。這些穴中的至少一個(gè)含有一種本發(fā)明的組合物。放置該固體MAS的合理可行的方法是首先將含有MAS和所述添加劑的溶液放置在穴中，然后使該溶液進(jìn)行蒸發(fā)。以這種方式獲得的蒸發(fā)殘留物，即本發(fā)明的組合物被直接置于所述裝置(遞送系統(tǒng))的穴中。
由于本發(fā)明的組合物被用于卵母細(xì)胞的處理，所以對(duì)于本發(fā)明的組合物來(lái)說(shuō)，不含對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響的組分是相當(dāng)重要的。
使用本發(fā)明組合物的一種方法是在水介質(zhì)如水中溶解該組合物，然后，如果需要，添加其它的對(duì)卵母細(xì)胞的成熟可能具有有益影響的組分。
使用本發(fā)明組合物的另一種方法是在一種通常用于體外成熟的介質(zhì)中溶解該組合物。
本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例得到進(jìn)一步說(shuō)明，然而，這些實(shí)施例并不能被解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。以上說(shuō)明書(shū)和以下實(shí)施例中記載的特征可以以任何結(jié)合的方式成為以不同形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的物質(zhì)。實(shí)施例1 用于測(cè)定一種化合物是否為MAS的方法從體重為13-16克的未成熟雌性小鼠(C57BL/6J x DBA/2J F1，Bomholtgaard，丹麥)中獲得卵母細(xì)胞，然后將該卵母細(xì)胞保存在控制溫度(20-22℃)，光線(以6.00-18.00照射)和相對(duì)濕度(50-70％)下。給所述小鼠腹膜內(nèi)注射0.2ml含20 IU FSH的促性腺激素(Gonal-F，Serono)，并且48小時(shí)后采用頸轉(zhuǎn)位處死所述小鼠。剝離出小鼠的卵巢并且通過(guò)在立體顯微鏡下和Hx-介質(zhì)(如下所示)中使用一對(duì)27號(hào)的針手工刺破卵泡來(lái)分離卵母細(xì)胞。顯示完整生發(fā)泡(下文稱(chēng)作GV)的球形卵母細(xì)胞被分成丘封閉卵母細(xì)胞(下文稱(chēng)作CEO)和裸露卵母細(xì)胞(下文稱(chēng)作NO)并被放置在添加了3mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat.No.A-7030)，5mg/ml人血清白蛋白(HSA，國(guó)家血清研究所(State SerumInstitute)，丹麥)，0.23mM丙酮酸酯(Sigma，Cat.No S-8636)，2mM谷氨酰胺(Flow Cat.No.16-801)，100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Flow，Cat No.16-700)的α-極限必需培養(yǎng)基(不含核糖核苷的α-MEM，Gibco BRL，Cat.No.22561)中。該培養(yǎng)基添加了3mM次黃嘌呤(Sigma Cat.No.H-9377)并被命名為Hx-培養(yǎng)基。
所述卵母細(xì)胞用Hx-培養(yǎng)基沖洗三次并且將大小一致的卵母細(xì)胞分成CEO和NO兩組。將CEO和NO培養(yǎng)在4-孔多孔平皿(multidishes)(Nunclon，丹麥)中，每孔中含有0.4ml Hx-培養(yǎng)基和濃度為10μM的待檢測(cè)化合物。1個(gè)對(duì)照孔(即，在不加待檢測(cè)化合物的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的35-45個(gè)卵母細(xì)胞)總是與3個(gè)測(cè)試孔(每個(gè)添加了待檢測(cè)化合物的孔中35-45個(gè)卵母細(xì)胞)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。
所述卵母細(xì)胞在含5％CO2的潮濕環(huán)境中于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，采用立體顯微鏡(Wildt，Leica MZ 12)分別對(duì)具有GV，GVB和極性體(下文稱(chēng)作PB)的卵母細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。GVB的百分率，被定義為該孔中經(jīng)歷GVB的卵母細(xì)胞相對(duì)卵母細(xì)胞總數(shù)的百分率，如下進(jìn)行計(jì)算％GVB＝((GVB的數(shù)目+PB的數(shù)目)/卵母細(xì)胞的總數(shù))×100。實(shí)施例2 用于測(cè)定一種化合物是否能被用作本發(fā)明組合物中的添加劑的方法用于FF-MAS組合物的添加劑的特征在于改善FF-MAS在乙醇/水(1∶2.5v/v)中的溶解度；在MEMα培養(yǎng)基中重新配制組合物后確保得到FF-MAS的清澄溶液；當(dāng)對(duì)從未成熟雌性小鼠中獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試時(shí)，確保GVB百分率至少為50％。
制備飽和的FF-MAS乙醇溶液。以1∶2.5的比例與添加劑的水溶液混合。通過(guò)目測(cè)控制過(guò)剩的FF-MAS可以在所述溶液中獲得。在室溫下使所述溶液旋轉(zhuǎn)24小時(shí)。通過(guò)0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾所述溶液，通過(guò)HPLC測(cè)定FF-MAS的含量并且計(jì)算溶解度。將350μl轉(zhuǎn)移到4-孔平皿中并在室溫下蒸發(fā)至干。加入500μl MEMα培養(yǎng)基(Gibcobal)。如果在半小時(shí)內(nèi)獲得清澄溶液，用由未成熟雌性小鼠得到的卵母細(xì)胞測(cè)試所述組合物。獲得的％GVB至少為50％，優(yōu)選地80％，參見(jiàn)實(shí)施例1。實(shí)施例3 含有人血清白蛋白(HSA)的組合物在該實(shí)施例中，制備了三種產(chǎn)物。參照以下表格，用于產(chǎn)物1，2和3的FF-MAS原液分別含有50，500和3330μg/ml的FF-MAS。對(duì)于每種產(chǎn)物，HAS原液含20％的HAS。所述原液的使用量如表中所述。例如，對(duì)于產(chǎn)物1，將400μl的FF-MAS原液與1000μl的HAS原液進(jìn)行混合。將這些原液混合后，所得到的溶液清澄，其中沒(méi)有觀察到沉淀?；旌虾?，將表中所示的量轉(zhuǎn)移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麥)中。例如，對(duì)于產(chǎn)物1,350μl的所述混合物最終被轉(zhuǎn)移到多孔平皿中，所述溶液在室溫下蒸發(fā)至于。蒸發(fā)后，一些產(chǎn)物在平皿中呈乳白色、透明薄膜狀，其它一些產(chǎn)物肉眼看不到。在該實(shí)施例中，F(xiàn)F-MAS的最高溶解濃度為0.95mg/ml。
使用前，加入500μl的MEMα培養(yǎng)基(Gibcobal)，室溫下半小時(shí)內(nèi)獲得FF-MAS和HAS的清澄溶液。
實(shí)施例4 含有人血清白蛋白(HAS)的組合物與前面實(shí)施例所述類(lèi)似，通過(guò)在室溫下混合樣品以下述濃度制備含有HSA的FF-MAS的水/乙醇溶液。蒸發(fā)后，溶液清澄，沒(méi)有觀察到沉淀的產(chǎn)生。所述溶液被轉(zhuǎn)移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麥)中。最后，所述溶液在室溫下蒸發(fā)至干。
使用前，加入500μl的MEMα培養(yǎng)基(Gibcobal)，在室溫下半小時(shí)內(nèi)獲得FF-MAS和HAS的清澄溶液。
用由未成熟雌性小鼠獲得的卵母細(xì)胞對(duì)配方進(jìn)行了測(cè)試。各配方的％GVB如下表所示。
實(shí)施例5 含有人血清白蛋白(HAS)的組合物與前面實(shí)施例所述類(lèi)似，通過(guò)在室溫下混合樣品以下述濃度制備含有HSA的FF-MAS的水/乙醇溶液。蒸發(fā)后，溶液清澄，沒(méi)有觀察到沉淀的產(chǎn)生。所述溶液被轉(zhuǎn)移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麥)中。最后，所述溶液在室溫下蒸發(fā)至干。
使用前，加入500μl的MEMα培養(yǎng)基(Gibcobal)，在室溫下半小時(shí)內(nèi)獲得FF-MAS和HAS的清澄溶液。
利用HPLC測(cè)定重新配制后FF-MAS的濃度，其結(jié)果如下所述。用由未成熟雌性小鼠獲得的卵母細(xì)胞對(duì)配方進(jìn)行了測(cè)試。各配方的％GVB如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種含有MAS和一種添加劑的固體產(chǎn)物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其中水的含量低于10％，優(yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于1％(重量/重量)。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于其中有機(jī)溶劑的含量低于10％，優(yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于1％(重量/重量)。
4.一種如上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于其中MAS的含量低于50％，優(yōu)選地低于20％，更優(yōu)選地低于10％，最優(yōu)選地低于5％(重量/重量)。
5.一種如上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于MAS是4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇半琥珀酸酯；5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇；5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇半琥珀酸酯；(20S)-膽甾-5-烯-3β，20-二醇；3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-24-酸-N-(甲硫氨酸)酰胺；和膽甾-5-烯-16β-醇。
6.一種如上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于所述的添加劑是一種蛋白質(zhì)或一種磷酸甘油酯。
7.一種如上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于該組合物可被用于制備一種水溶液，該水溶液具有下列 的任一項(xiàng)權(quán)利要求中所提到的特性。
8.一種如上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于該組合物可被用于制備一種水溶液，當(dāng)MAS是FF-MAS時(shí)，如果該水溶液被用于處理卵母細(xì)胞，將產(chǎn)生至少50％，優(yōu)選地至少80％的生發(fā)泡裂解(GVB)百分率。
9.一種MAS的水溶液，其特征在于MAS的含量至少為0.001μg/ml，優(yōu)選地至少為0.01μg/ml，更優(yōu)選地至少為0.1μg/ml，甚至更優(yōu)選地至少為0.5μg/ml。
10.一種如權(quán)利要求9所述的MAS的水溶液，其特征在于MAS的含量不高于0.1g/ml，優(yōu)選地不高于0.01g/ml。
11.一種如權(quán)利要求9或10所述的MAS的水溶液，其特征在于有機(jī)溶劑的含量低于0.1％，優(yōu)選地低于0.05％，更優(yōu)選地低于0.01％。
12.一種具有一個(gè)穴的裝置，其中所述穴中含有一種如上述 中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的固體產(chǎn)物或溶液。
13.本文所述的任何新特征或特征的組合。
全文摘要
一種含有一種減數(shù)分裂激活物質(zhì)的固體組合物可以通過(guò)添加一種蛋白質(zhì)或一種磷酸甘油酯來(lái)制備。
文檔編號(hào)A61K31/575GK1373675SQ00812882
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月16日
發(fā)明者T·M·安德?tīng)柹?申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司